نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

هیات علمی گروه زیست شناسی/ دانشگاه فردوسی مشهد

چکیده

باکتریها فراوان ترین و غنی ترین گروه از موجودات زنده اند که در بسیاری از فرایندهای مهم اکوسیستم نقش دارند. با وجود اهمیت اکولوژیکی آنها اطلاعات در مورد تنوع زیستی به ویژه در محیط های آبی ناچیز می باشد. ایران دارای دریاچه های متنوعی در نقاط مختلف می باشد که هر کدام به دلیل اقلیم ویژه ای که در آن قرار دارند، از نظر اکولوژی دارای ویژگیهای منحصر به فردی می باشد. دریاچه بزنگان تنها دریاچه مهم و طبیعی استان خراسان رضوی است که جزء آبهای کم شور محسوب می شود و تاکنون پژوهشی درباره میکروارگانیسم های آن انجام نشده است. پژوهش حاضر به بررسی تنوع فیلوژنتیکی باکتریهای قابل کشت موجود در دریاچه بزنگان پرداخته است. نمونه برداری در آبان 1391 صورت گرفت و غربالگری باکتریها منجر به جداسازی 51 باکتری گرم منفی و 15 باکتری گرم مثبت گردید. 30 جدایه به منظور شناسایی مولکولی با استفاده از ژنS rRNA 16، بررسی ویژگیهای مورفولوژی، بیوشیمیایی و آنزیم های هیدرولازی انتخاب شدند. سویه های شناسایی شده متعلق به گروههای beta-Gamma-Proteobacteria و Bacteroidetes و Firmicutes می باشند. تنوع جنس های متعلق به گرم منفی بیشتر بوده و شامل Pseudomonas، Xanthomonas، Luteibacter، Varivorax، Collimonas و Flavobacterium می باشند. در حالی که باکتریهای گرم مثبت از تنوع و تعداد کمتری برخوردار بوده و شامل جنس های Bacillus، Fictibacillus، Staphylococcus و Paenibacillus می باشند. بیشترین فراوانی مربوط به جنس Pseudomonas می باشد. بررسی آنزیم های هیدرولازی در بین سویه های گرم مثبت و گرم منفی تفاوت معنی داری را نشان نمی دهد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Phylogenetic diversity of cultivable bacteria in Lake Bazangan and their ecological role

نویسندگان [English]

  • Bahar Shahnavaz
  • Fereshteh Ghassemzadeh

چکیده [English]

Bacteria are the most abundant and richest groups of organisms that are involved in many important ecosystem processes. Despite their ecological importance, there is little literature about biodiversity, especially in aqueous environments. Iran has a variety of lakes in different locations, each of which have a special climate, with unique ecological features. Bazangan Lake, only natural lake with little salty is located in Khorasan Razavi and so far, there has not been researched on its microorganisms. The present study examined the phylogenetic diversity of cultivable bacteria in the Bazangan Lake. Sampling was conducted in November 2010. The bacterial screening led to isolation of 51 gram-positive and 15 gram-negative. 30 isolates were selected to molecular identification using 16S rRNA, studying Morphology, biochemistry and hydrolase enzymes. Identified strains belonged to beta, Gamma-Proteobacteria, Bacteroidetes and Firmicutes. Variety of Gram-ngative genus was more including Luteibacter, Xanthomonas, Varivorax, Collimonas and Flavobacterium. While Gram-positive bacteria is of less diversity including Bacillus, Fictibacillus, Staphylococcus and Paenibacillus. The maximum frequency is related to the genus Pseudomonas. The significant difference was not observed in gram-positive and gram-negative strains by checking hydrolase enzymes.

کلیدواژه‌ها [English]

  • biodiversity
  • Lake Bazangan
  • cultivable bacteria
  • 16S rRNA gene

تنوع فیلوژنتیکی باکتریهای قابل کشت دریاچه بزنگان و نقش اکولوژی آنها

بهار شهنواز1،2* و فرشته قاسم زاده2،1

1 مشهد، دانشگاه فردوسی مشهد، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی 

2 مشهد، دانشگاه فردوسی مشهد، مرکز پژوهشی جانورشناسی کاربردی، گروه نوآوری‌های زیستی جانوری 

تاریخ دریافت: 8/2/93                  تاریخ پذیرش: 19/4/94 

چکیده

باکتریها فراوان ترین و غنی ترین گروه از موجودات زنده اند که در بسیاری از فرآیندهای مهم اکوسیستم نقش دارند. با وجود اهمیت اکولوژیکی آنها اطلاعات در مورد تنوع زیستی به ویژه در محیطهای آبی ناچیز می باشد. ایران دارای دریاچه های متنوعی در نقاط مختلف می باشد که هر کدام به دلیل اقلیم ویژه ای که در آن قرار دارند، از نظر اکولوژی دارای ویژگیهای منحصر به فردی می باشد. دریاچه بزنگان تنها دریاچه مهم و طبیعی استان خراسان رضوی است که جزء آبهای کم شور محسوب می شود و تاکنون پژوهشی درباره میکروارگانیسم های آن انجام نشده است. پژوهش حاضر به بررسی تنوع فیلوژنتیکی باکتریهای قابل کشت موجود در دریاچه بزنگان پرداخته است. نمونه برداری در آبان 1391 صورت گرفت و غربالگری باکتریها منجر به جداسازی 51 باکتری گرم منفی و 15 باکتری گرم مثبت گردید. 30 جدایه به منظور شناسایی مولکولی با استفاده از ژن
S rRNA16، بررسی ویژگیهای مورفولوژی، بیوشیمیایی و آنزیمهای هیدرولازی انتخاب شدند. سویه های شناسایی شده متعلق به گروههای beta-Gamma-Proteobacteria و Bacteroidetes و Firmicutes می باشند. تنوع جنسهای متعلق به گرم منفی بیشتر بوده و شامل Pseudomonas، Xanthomonas، Luteibacter، Varivorax، Collimonas و Flavobacterium می باشند. در حالی که باکتریهای گرم مثبت از تنوع و تعداد کمتری برخوردار بوده و شامل جنسهای Bacillus، Fictibacillus، Staphylococcus و Paenibacillus می باشند. بیشترین فراوانی مربوط به جنس Pseudomonas می باشد. بررسی آنزیمهای هیدرولازی در بین سویه های گرم مثبت و گرم منفی تفاوت معنی داری را نشان نمی دهد.

واژه های کلیدی: تنوع زیستی، دریاچه بزنگان، باکتریهای قابل کشت، ژن S rRNA16

*  نویسنده مسئول، تلفن: 38805506-051 ، پست الکترونیکی: shahnavaz@um.ac.ir

مقدمه

 

میکروارگانیسم ها و به ویژه باکتریها نقش مهمی را در چرخه های بیوژئوشیمیایی مانند کربن و نیتروژن برعهده دارند. از سویی دیگر اهمیت آنها در فرآیندهای تجزیه زیستی مواد پلیمری و آلاینده های نفتی، حشره کشها و سایر مواد سمی به خوبی شناخته شده است. با وجود این که میکروارگانیسم ها به دلیل ویژگیهای منحصر به فرد خود تقریباً در همه اکوسیستمها پراکنده می باشند، تنوع زیستی آنها به دلیل اندازه کوچکی که دارند، مغفول مانده است، در حالی که اثرات آنها در چرخه مواد غذایی کاملاً شناخته شده است (10، 11 و 20). مطالعه تنوع این گروه موجب شناخت بهتر فلور طبیعی این زیستگاهها و افزایش ذخیره ژنتیکی و جداسازی گونه هایی می گردد که پتانسیل استفاده در بیوتکنولوژی را دارا می باشند، تا به عنوان گامی در جهت استفاده صنعتی از این دانش برداشته شود.

پژوهشگران روشهای متعدد بررسی تنوع جمعیت باکتریایی را مقایسه کرده اند (5، 8 و 9). نتیجه این تحقیقات نشان می دهد که روشهای موجود کامل نمی باشد، و هر یک از آنها دارای ویژگیهایی می باشند. برای بررسی تنوع زیستی میکروارگانیسم ها روشهای مختلفی شامل روشهای مستقل از کشت و یا وابسته به کشت بررسی شده است. در روشهای مستقل از کشت DNA کل از نمونه محیطی استخراج شده و ژنهای مورد نظر تکثیر و آنالیز می شوند. یکی از مهم ترین ویژگیهای این روشها درک ساختار و ترکیب جمعیت میکروبها، صرف نظر از فعالیتهای عملکردی آنها در محیط می باشد. البته هر یک از روشهای مذکور دارای ضعفهایی می باشند که نتیجه حاصل از آن تنوع جمعیت میکروبی را تحت تأثیر قرار می دهد. به عنوان مثال روش استخراج DNA (18 و 21)، انتخاب ژن و یا انتخاب آغازگرهای فرآیند تکثیر ژن که در نهایت ممکن است به حذف برخی گروههای میکروبی و یا تخمین بیش از اندازه گروهی دیگر منجر شود (26). با استفاده از روشهای وابسته به کشت دستیابی به ژنوم کامل میکروارگانیسم ها، بررسی نقش اکولوژی و قابلیت تجزیه زیستی ترکیبات مضر در طبیعت امکان پذیر می باشد. باید در نظر داشت که در این روشها بخشی از میکروارگانیسم ها به دلیل غیرقابل کشت بودن در نظر گرفته نمی شود، و یا انتخاب روش کشت و شرایط فیزیکی و نوع محیط کشت انتخابی می تواند بر نتیجه نهایی تأثیر گذار باشد (12).

کشور ایران دارای دریاچه های متنوعی در نقاط مختلف می باشد که هر کدام به دلیل وضعیت خاص آب و هوایی آن، می تواند از نظر اکولوژیکی دارای ویژگیهای منحصر به فردی باشد. بسیاری از این دریاچه ها مانند ارومیه، آران بیدگل،...... که جمعیت میکروارگانیسم های آن در سالهای اخیر مورد بررسی قرار گرفته است، دارای غلظت نمکی بالایی می باشند (3، 16 و 22). دریاچه بزنگان تنها دریاچه مهم و طبیعی استان خراسان رضوی است که جزء آبهای کم شور محسوب می شود و تاکنون پژوهشی درباره میکروارگانیسم های آن انجام نشده است. هدف اصلی از انجام پژوهش حاضر بررسی تنوع فیلوژنتیکی باکتریهای قابل کشت موجود در دریاچه بزنگان و مقایسه آن با باکتریهای مشابه به دست آمده در سایر محیطهای طبیعی می باشد.

مواد و روشها

نمونه برداری و ویژگیهای محل نمونه برداری: دریاچه بزنگان در فاصله 120 کیلومتری شرق شهرستان مشهد و 94 کیلومتری جنوب­غربی شهرستان سرخس در 36 درجه و 18 دقیقه و 48 ثانیه شمالی و 60 درجه و 28 دقیقه و 53 ثانیه شرقی واقع شده است. ارتفاع دریاچه از سطح دریا 860 متر، متوسط ژرفای دریاچه 8 متر و بیشینه آن در زمستان 12 متر و مساحت دریاچه 80-70 هکتار برآورد گردیده است. آب دریاچه لب­شور و دریاچه الیگوتروف است (2). منابع تأمین آب دریاچه بزنگان آبهای فصلی و سطحی می­باشد که شامل سیلابهای بهاره و مازاد آبهای کشاورزی است. علاوه بر آن تعدادی چشمه که در زیر آب قرار دارند، شامل 4 چشمه دائمی (چشمه النگ- چشمه زیوکهر- چشمه شمال دریاچه- چشمه زیارتگاه) و دو چشمه فصلی (چشمه ضلع جنوبی و چشمه نی­زار) از منابع تأمین آب دریاچه می­باشند. به دلیل عمق بالا و املاح کلر و سدیم سطح دریاچه در طول سال یخ نمی­بندد. دریاچه از دیدگاه اکولوژی dimictic (دارای دو چرخه آبی در فصول پاییز و بهار) می باشد (1). رنگ آب دریاچه برحسب میزان مواد محلول، رنگ محیط اطراف، عمق، تراکم و نوع پلانکتونها و ذرات معلق در آب تغییر می­کند. در بهار با ورود سیلابها به دریاچه رنگ آب مایل به زرد، در تابستان همزمان با شکوفایی پلانکتونها سبزرنگ و در زمستان مایل به آبی می باشد. ویژگیهای فیزیکی و شیمیایی آب در زمان نمونه برداری و در سالهای گذشته در جدول 1 نشان داده شده است. درباره پوشش گیاهی اطراف دریاچه بزنگان و فون جانوران آن پژوهشهایی در سالهای اخیر صورت گرفته است (2).

نمونه برداری در آبان ماه 1391 از سه ضلع مختلف دریاچه انجام پذیرفت. در هر ناحیه نمونه برداری در سه نقطه مختلف صورت گرفته، سپس نمونه ها با یکدیگر ادغام و در نهایت سه نمونه مورد بررسی قرار گرفت که شامل آب دریاچه و رسوبات آن بوده است. نمونه برداری در ظروف شیشه ای استریل با رعایت شرایط نمونه برداری انجام پذیرفت. نمونه ها تا زمان انجام آزمایش در دمای محیطی و شرایط تاریکی نگهداری شدند.

 

جدول 1- ویژگیهای فیزیکی و شیمیایی آب دریاچه در سال 1391 و سالهای قبل

سال نمونه برداری

1390

1391 (فصل بهار)

1391 (فصل پاییز)

وضعیت آب و هوا در روز نمونه­برداری

آفتابی و گرم

ابری و خنک

ابری و خنک

دمای آب (C°)

6/17

18

18

اسیدیته (pH)

54/9

89/9

67/8

هدایت الکتریکی (EC) (ms/cm)

98/1

22/42

33/50

مقدار کل ذرات جامد حل شده (TDS) (ppt)

87/0

26/21

23/25

درصد شوری

-

-

3


جداسازی نمونه ها: به منظور حداکثر جداسازی باکتریهای هتروتروف محیط کشتهای (TSB)Tryptic Soy Broth  و R2A به همراه 3 درصد نمک انتخاب گردید. محیط کشتها با 15 گرم/لیتر آگار جامد شده و 7pH:  تنظیم گردید. از نمونه آب تا 6-10 سری رقت تهیه گردید و به محیطهای کشت جامد تلقیح گردید و در درجه حرارت 20 و 30 درجه سانتی گراد به مدت 2 تا 7 روز گرماگذاری شدند. آزمایش برای هر سری رقت و درجه حرارت با سه تکرار صورت پذیرفت.

بررسی فنوتیپی و ویژگیهای بیوشیمیایی: بررسی ویژگیهای جدایه های به دست آمده مانند فرم و اندازه کلنی، مورفولوژی سلول و تولید رنگدانه با کشت مجدد هر یک از آنها در محیط TSA انجام گرفت. جدایه های به دست آمده براساس ویژگیهای فنوتیپی به گروههای متفاوتی دسته بندی شده و به صورت تصادفی برای مطالعات بعدی انتخاب شدند. به منظور بررسی بیشتر جدایه های انتخاب شده، رنگ آمیزی گرم، تست حرکت و آزمونهای بیوشیمیایی مانند وجود آنزیمهای هیدرولازی سیتراتاز، ژلاتیناز، آمیلاز و پروتئاز صورت گرفت (جدول 2).

تکثیر ژن S rRNA16 و توالی سکانس: حدود 250 میلی گرم از هر سویه باکتری در μl 500 آب دیونیزه سوسپانسیون شده و به مدت h 24 در دمای 20- درجه سانتی گراد قرار گرفت. پس از ذوب شدن مجدد،  μl1 از سوسپانسیون باکتری به عنوان الگوی DNA به منظور تکثیر ژن 16S rRNA با استفاده از پرایمرهای عمومی F27 ('3- AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-'5) (17) و R1492 ('3-GGTTACCTTGTTACGACTT-'5) (13) استفاده شد. با این روش غالباً دیواره سلولی باکتریها در اثر شوک سرمایی آسیب دیده و می توان از سوسپانسیون حاصل به عنوان الگوی DNA استفاده کرد. در مواردی که دسترسی به DNA با این روش میسر نبود، استخراج با استفاده از کیت (MP Biomedicals, Qbiogene)FastDNA® SPIN Kit  براساس روش توضیح داده شده انجام پذیرفت. PCR با استفاده از 5/1 میلی مولار MgCl2، 5/1 میلی مولار KCl، 10 میلی مولار Tris-HCl، 2/0 از هر dNTP، 5/0 میکرومولار از هر پرایمر و 6/0 واحد از Taq polymerase انجام پذیرفت. واکنش PCR با دمای واسرشت کننده اولیه 95 درجه سانتی گراد به مدت 2 دقیقه و سپس 30 سیکل با دمای واسرشت 95 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه، اتصال پرایمرها در دمای 57 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه، سنتز قطعه مورد نظر در دمای 72 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه و گسترش نهایی در دمای 72 درجه سانتی گراد به مدت 7 دقیقه انجام شد. محصول PCR استفاده از روش رسوب دهی سدیم استات و الکل اتانول خالص گردید و به منظور تعیین توالی به شرکت MACROGEN کره جنوبی ارسال شد.

 

 

جدول 2- ویژگیهای فنوتیپی، خصوصیات بیوشیمیایی سویه های جداسازی و شناسایی شده از دریاچه بزنگان

 

نمونه 

مورفولوژی و واکنش گرم 

تولید رنگدانه  

حرکت 

 پروتئاز 

آمیلاز 

ژلاتیناز 

سیتراتاز 

بیشترین باکتری مشابه در Ez-Taxon

درصد شباهت 

1 

A6

میله ای گرم مثبت

سفید

مثبت

مثبت

مثبت

مثبت

منفی

Bacillus thuringiensis

64/99

2 

A33

میله ای گرم مثبت

سفید

منفی

منفی

منفی

منفی

منفی

Bacillus oceanisediminis

23/99

3 

A9

میله ای گرم مثبت

سفید

مثبت

مثبت

مثبت

منفی

مثبت

Bacillus simplex

100

4 

A12

میله ای گرم مثبت

زرد

منفی

مثبت

مثبت

منفی

منفی

Bacillus simplex

65/98

5 

A20

میله ای گرم مثبت

سفید

منفی

مثبت

منفی

مثبت

منفی

Bacillus thuringiensis

100

6 

B9

میله ای گرم مثبت

سفید

منفی

مثبت

منفی

منفی

مثبت

Bacillus simplex

43/99

7 

A29

میله ای گرم مثبت

سفید

مثبت

مثبت

منفی

منفی

منفی

Bacillus muralis

54/99

8 

B1

میله ای گرم مثبت

نارنجی

منفی

منفی

مثبت

منفی

منفی

Fictibacillus barbaricus

71/99

9 

A10

میله ای گرم مثبت

سفید

منفی

منفی

مثبت

منفی

منفی

Fictibacillus barbaricus

5/99

10 

B18

کوکسی گرم مثبت

سفید

مثبت

منفی

منفی

منفی

منفی

Staphylococcus epidermidis

100

11 

B21

میله ای گرم مثبت

سفید

منفی

مثبت

مثبت

منفی

منفی

Paenibacillus terrae

82/98

12 

A24

میله ای گرم منفی

نارنجی

منفی

منفی

مثبت

منفی

منفی

Pseudomonas chlororaphis

99.45

13 

A23

میله ای گرم منفی

نارنجی

مثبت

منفی

منفی

منفی

منفی

Pseudomonas thivervalensis

98.86

14 

B3

میله ای گرم منفی

نارنجی

مثبت

مثبت

مثبت

منفی

منفی

Pseudomonas prosekii

99.54

15 

B29

میله ای گرم منفی

سفید

مثبت

منفی

منفی

منفی

منفی

Pseudomonas prosekii

99.38

16 

A14

میله ای گرم منفی

سفید

منفی

منفی

منفی

منفی

مثبت

Pseudomonas trivialis

98.9

17 

A15

میله ای گرم منفی

نارنجی

منفی

منفی

مثبت

منفی

منفی

Pseudomonas rhodesiae

15/99

18 

A7

میله ای گرم منفی

سفید

منفی

مثبت

منفی

مثبت

مثبت

Pseudomonas simiae

98/98

19 

A18

میله ای گرم منفی

سفید

منفی

منفی

منفی

منفی

منفی

Pseudomonas asturiensis

26/98

20 

B16

میله ای گرم منفی

سفید

منفی

منفی

مثبت

منفی

منفی

Pseudomonas frederiksbergensis

3/99

21 

B33

میله ای گرم منفی

نارنجی

مثبت

مثبت

منفی

منفی

منفی

Xanthomonas hyacinthi

100

22

B6

میله ای گرم منفی

نارنجی

مثبت

منفی

مثبت

منفی

منفی

Luteibacter rhizovicinus

32/99

23

B8

میله ای گرم منفی

سفید

منفی

مثبت

منفی

منفی

مثبت

Luteibacter rhizovicinus

86/99

24

B10

میله ای گرم منفی

سفید

منفی

مثبت

منفی

منفی

مثبت

Luteibacter rhizovicinus

19/97

25

B11

میله ای گرم منفی

سفید

منفی

مثبت

منفی

منفی

مثبت

Variovorax boronicumulans

04/98

26

B22

میله ای گرم منفی

سفید

مثبت

منفی

منفی

منفی

منفی

Collimonas pratensis

02/99

27

B7

میله ای گرم منفی

نارنجی

مثبت

منفی

مثبت

منفی

منفی

Flavobacterium frigiddimaris

32/98

28

B23

میله ای گرم منفی

نارنجی

مثبت

منفی

مثبت

منفی

منفی

Flavobacterium oncorhynchi

03/99

29

A31

میله ای گرم منفی

زرد

مثبت

مثبت

منفی

منفی

منفی

Flavobacterium hydatis

8/98

30

B28

میله ای گرم منفی

سفید

منفی

منفی

مثبت

منفی

منفی

Flavobacterium aquidurense

72/98


آنالیز فیلوژنتیک: توالی های به دست آمده در بانک ژنی NCBI ثبت و شماره ژنی مربوط به هر کدام دریافت گردید که از شماره KT188790 تا KT188819 می باشند. قرابت فیلوژنتیکی جدایه های به دست آمده با یکدیگر و با سویه های موجود در پایگاههای اطلاعاتی NCBI و Ez-taxon مورد بررسی گرفت. توالیهای موجود با استفاده از نرم افزار ClustalW همراستاسازی شدند (25). آنالیز داده های به دست آمده با استفاده از نرم افزار MEGA (Vrsion 6) و با استفاده از الگوی Maximum Likelihood انجام شد (24). بررسی اعتبار شاخه های درخت با استفاده از نرم افزار bootstrap analysis با تکرار 1000 صورت گرفت.

بحث و نتیجه گیری

شمارش و ویژگیهای فنوتیپی جدایه ها: بخش عمده ای از کره زمین توسط میکروارگانیسم ها اشغال شده است. بررسی تنوع میکروبی اکوسیستمهای مختلف اجازه می دهد شناخت بهتری از فلور طبیعی این زیستگاهها در دسترس قرار گیرد. ایران دارای دریاچه های متنوعی در نقاط مختلف می باشد که هر کدام به دلیل وضعیت خاص آب و هوایی آن، می تواند دارای ویژگیهای منحصر به فردی باشد. از طرفی علی رغم تنوعی که این مناطق دارند، مطالعات محدودی درباره جمعیت میکروبی آنها صورت گرفته است. یکی از این مناطق دریاچه بزنگان می باشد که تنها دریاچه طبیعی در شمال شرقی ایران است که تاکنون گزارشی مبنی بر تنوع میکروارگانیسم های آن ارائه نشده است. ویژگیهای اکولوژی دریاچه مانند pH، Electrical conductivity: EC (ms/m) و Total dissolved solid: TDS (mg/l) اندازه گیری شد که به ترتیب 0.05±8.67، 0.58±50.33 و 0.42 ±25.23 به دست آمدند (جدول 1).

در پژوهش اخیر، نمونه برداری در فصل پاییز و در یک روز ابری صورت پذیرفته است، مقایسه داده های موجود با اطلاعات مربوط به سالهای گذشته کاهش حجم آب، افزایش درجه شوری و تغییرات pH آب را نشان می دهد که بیشتر می تواند به دلیل خشکسالیهای اخیر در منطقه باشد. بنابراین میزان یونهای محلول و هدایت الکتریکی، مقدار کل ذرات جامد معلق و کدورت آن و درصد شوری آب افزایش یافته است که می تواند روی جمعیت میکروبی تأثیرگذار باشد، هر چند در مورد جمعیت میکروبی در سالهای گذشته هیچ گونه اطلاعاتی در دسترس نمی باشد.

گرچه باکتریهای قابل کشت درصد ناچیزی از مجموعه باکتریهای موجود را تشکیل می دهند، جداسازی و شناسایی این باکتریها به جهت دستیابی به ژنوم کامل آنها و بررسی فعالیت فیزیولوژی آنها از اهمیت ویژه ای برخوردار می باشد. به منظور شمارش و جداسازی باکتریها از دو محیط کشت TSB و R2A استفاده گردید. در مجموع 195 کلنی (110 کلنی از رسوبات و 85 کلنی از آب) در محیط R2A و 201 کلنی (115 کلنی از رسوبات و 86 کلنی از آب) در محیط TSA جداسازی شد. نتایج شمارش باکتریها نشان می دهد که تعداد کلی باکتریها در دو محیط نامبرده تفاوت معنی داری با یکدیگر ندارند و به صورت میانگین CFU/ml 103× 2.73 می باشد. تنوع مورفولوژی در کلنیهای به دست آمده از نمونه های آبی بیشتر از رسوبات می باشد.

تنوع سویه های شناسایی شده: درک ساختار و عملکرد گروههای باکتریها به منظور درک بهتر اکوسیستمهای آبی ضروری می باشد. با وجود مطالعاتی که در سالهای اخیر صورت گرفته است، فهم اکولوژیکی آنها مغفول مانده است. از مجموع باکتریهای به دست آمده، 66 جدایه براساس تفاوتهای فنوتیپی و مورفولوژی انتخاب شدند. از این تعداد 56 درصد (37) میله ای گرم منفی، 6/10 درصد (7) کوکسی گرم منفی و 6 درصد (4) کوکوباسیلی گرم منفی می باشند. تعداد جدایه های گرم مثبت به صورت معنی داری کمتر می باشد و شامل 18/18 درصد (12) میله ای گرم مثبت، 03/3 درصد (7) کوکسی گرم مثبت و 06/6 درصد (4) کوکوباسیلی گرم مثبت می باشند (شکل 1). در نهایت 30 سویه که تفاوت بیشتری را در مورفولوژی کلنی (سطح کلنی، اندازه و تولید پیگمان) و شکل و آرایش میکروسکوپی نشان می دادند، به منظور بررسی و تکثیر با ژن SrRNA16 انتخاب شدند. ویژگیهای مورفولوژی، واکنش گرم و بررسی آنزیم های هیدرولازی سویه هایی که به روش مولکولی شناسایی شده اند، در جدول 2 نشان داده شده است. باکتریهای گرم منفی به دست آمده، دارای تنوع بالاتری بوده و متعلق به سه شاخه باکتریایی beta-Gamma-Proteobacteria، Bacteroidetes می باشند. در حالی که تنوع در باکتریهای گرم مثبت کمتر و تمامی جنسهای به دست آمده مربوط به شاخه Firmicutes می باشند. در مجموع 10 جنس مختلف به صورت مولکولی شناسایی شدند که جنسهای متعلق به باکتریهای گرم منفی شامل Pseudomonas، Xanthomonas، Luteibacter، Varivorax، Collimonas و Flavobacterium (شکل 2) وگرم مثبت شامل Bacillus، Fictibacillus، Staphylococcus و Paenibacillus می باشند (شکل 3). برخی سویه های شناسایی شده مانند A12 (Bacillus sp.)، A18 (Pseudomonas sp.)، B10 (Luteibacter sp.)، B11 (Varivorax sp.)، و B6 (Flavobacterium sp.) درصد مشابهت کمتر از 7/98 را در مقایسه با داده های موجود در پایگاههای اطلاعاتی نشان می دهند که ممکن است معرف گونه جدیدی باشند. برای رسیدن به این منظور شناسایی تکمیلی ویژگیهای فنوتیپی، بیوشیمیایی و مولکولی ضروری می باشد.

شاخه Gamma-Proteobacteria دارای بیشترین میزان فراوانی بوده و Pseudomonas به عنوان جنس غالب می باشد. در این شاخه جنسهای Luteibacter و Xanthomonas با فراوانی کمتری دیده می شوند. پروتئوباکتریها در بسیاری از چرخه های بیوشیمیایی چرخه های محیطهای آبی نقش دارند و غالب بودن آنها در اکوسیستمهای برخی محیطهای آبی گزارش شده است (14 و 23). Pseudomonas از تجزیه کنندگان مهم ترکیبات آلی به شمار می رود و نقش مؤثری در چرخه کربن دارد. جنسهای Collimonas و Varivorax در شاخه بتاپروتئوباکتریها دارای فراوانی کمتری می باشد. بررسی رسوبات دریاچه Dongping با روش T-RFLP و آنالیز ژن S rRNA16، شانزده شاخه باکتری به دست آمد که پروتئوباکتریها غالب بودند (23). در شاخه Bacteroidetes تنها جنس Flavobacterium شناسایی شد. جنسهای Pseudomonas و Flavobacterium دارای گونه هایی هستند که ارتباط نزدیکی با چرخه نیتروژن دارند (19).

 

 

شکل 1- فراوانی باکتریهای گرم منفی و گرم مثبت براساس مورفولوژی آنها

 

شکل 2- درخت فیلوژنی باکتریهای گرم منفی با استفاده از الگوی Maximum Likelihood انجام شد. بررسی اعتبار شاخه های درخت با استفاده از آنالیزbootstrap  با تکرار 1000 صورت گرفت. سویه های به دست آمده در این پژوهش با دایره های سیاه نشان داده شده اند. توالی باکتری Bacillus simplex به عنوان گروه بیرونی آورده شده است.

 

 

برخی مطالعات نشان داده اند که حضور برخی از گروهها با حالت تعادل دریاچه در ارتباط می باشد. در دریاچه های گل آلود بیشتر Cyanobacteria و در دریاچه های صاف Bacteroidetes غالب می باشند (27). در این پژوهش، باکتریهای به دست آمده از نظر متابولیسمی هتروتروف می باشند و بسیاری از آنها مانند Pseudomonas، Flavobacterium، Xanthomonas و Bacillus از تجزیه کنندگان سوبستراهای مختلف در طبیعت به شمار می روند (6). نتیجه حاصل می تواند به دلیل موقعیت مکانی و فصل نمونه برداری باشد. نمونه برداری در فصل پاییز در حاشیه دریاچه انجام پذیرفت. در این زمان گیاهان موجود در حاشیه به تدریج از بین می روند و سوبسترای حاصل از آنها منبع غذایی مناسبی به منظور تقویت باکتریهای تجزیه کننده مواد می باشد. ساختار جمعیت میکروارگانیسم ها می تواند با بسیاری از متغیرهای محیطی دیگر مانند شوری، میزان مواد آلی و معدنی یا مواد غذایی در دسترس در ارتباط باشد (15).

 

 

شکل 3- درخت فیلوژنی باکتریهای گرم مثبت با استفاده از الگوی Maximum Likelihood انجام شد. بررسی اعتبار شاخه های درخت با استفاده از آنالیزbootstrap  با تکرار 1000 صورت گرفت.سویه های به دست آمده در این پژوهش با دایره های سیاه نشان داده شده اند. توالی باکتری Pseudomonas orientalis به عنوان گروه بیرونی آورده شده است.

 

از طرفی حاشیه اطراف دریاچه به تدریج و به دلیل کاهش بارندگی در سالهای اخیر عقب نشینی کرده و به نظر می رسد غلظت نمک موجود در آن رو به افزایش باشد. در دریاچه Bafa در غرب ترکیه پس از ساخت و سازهایی که در سال 1985 به منظور کنترل سیل صورت پذیرفت، شوری دریاچه افزایش یافت. جمعیت میکروارگانیسم ها در طول یک سال مورد بررسی قرار گرفتند که نشان می دهد این جمعیت تغییر یافته و ترکیبی از جمعیت آبهای شیرین و محیطهای شور می باشد (7). بنابراین با اینکه جمعیت میکروبی دریاچه بزنگان کاملاً شناخته نشده است، به نظر می رسد به دلیل افزایش درجه شوری و تغییر در سایر عوامل اکولوژیکی این اکوسیستم با تغییر کلیماکس مواجه شده است که نیازمند بررسیهای بیشتر می باشد. بررسی آنزیمهای خارج سلولی در باکتریهای شناسایی شده نشان می دهد که در باکتریهای گرم منفی 6/26، 3/23، 7/16 و 3/3 درصد سویه ها به نسبت تعداد کل شناسایی شده به ترتیب دارای فعالیت آمیلازی، پروتئازی، سیتراتازی و ژلاتینازی می باشند. در حالی که در باکتریهای گرم مثبت 20، 3/23، 7/6 و 7/6 درصد دارای فعالیت آنزیمهای نامبرده می باشند (شکل 4). بنابراین، 7/56 درصد باکتریهای گرم مثبت و 70 درصد باکتریهای گرم منفی قابلیت تولید آنزیمهای خارج سلولی را دارا می باشند. این نتیجه نشان می دهد که در تولید آنزیم های هیدرولازی تفاوت معناداری بین باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی مشاهده نمی شود. بررسی تنوع زیستی میکروارگانیسم های حاضر در اکوسیستمهای مختلف می تواند نقش اکولوژی این سویه ها را در محیط زیست خود و اثر آنها را در سایر زنجیره های غذایی موجود آشکارتر سازد. این سویه ها دارای توانایی تولید آنزیمهای هیدرولازی می باشند، که می توانند در چشم انداز زیست فناوری در نظر گرفته شوند.

 

 

 

شکل 4- درصد فراوانی آنزیم های خارج سلولی در سویه های شناسایی شده


تشکر و قدردانی: انجام این طرح تحقیقاتی با حمایت مالی معاونت پژوهشی دانشگاه فردوسی مشهد در قالب طرح شماره 2/22220 انجام شده است. از دست اندرکاران و پرسنل آزمایشگاه میکروبیولوژی دانشگاه فردوسی مشهد و به ویژه سرکار خانم پردلی قدردانی می شود.

  1. بهروزی راد، ب.، 1387، تالابهای ایران، انتشارات سازمان جغرافیایی نیروهای مسلح
  2. غلامی، ع.، اجتهادی، ح.، قاسم زاده، ف.، قرشی الحسینی، ج.، 1385، تنوع زیستی گونه های گیاهی اطراف منطقه حفاظت شده دریاچه بزنگان، مجله زیست شناسی ایران، 19(4): 407-398.
  3. زرپرور، پ.، آموزگار، م. ع.، فلاحیان، م. ر.، بررسی تنوع زیستی باکتریهای نمک دوست و تحمل کننده نمک قابل کشت در تالاب پرشور اینچه برون، مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران)، 27 (1): 56 ـ 44
    1. Babavalian, H., Amoozegar, M.A., Zahraei, S.,Rohban, R., Shakeri, F., Moghaddam, M.M., 2014, Comparison of bacterial biodiversity and enzyme production in three hypersaline lakes; Urmia, Howz-Soltan and Aran-Bidgol, Indian Journal of Microbiology. 54: 444-9.
    2. Chandler, D.P., Li, S.M., Spadoni, C.M., Drake, G.R., Balkwill, D.L., Fredrickson, J.K., Brockman, F.J., 1997, A molecular comparison of culturable aerobic heterotrophic bacteria and 16S rDNA clones derived from adeep subsurface sediment, FEMS Microbiology Ecology. 23:131-144.
    3. Cottrell, M.T., Kirchman, D.L., 2000, Natural assemblages of marine proteobacteria and members of the Cytophaga-Flavobacter cluster consuming low- and high-molecular-weight dissolved organic matter, Applied and Environmental Microbiology. 66: 1692-1697.
    4. Demir, N., 2007, Changes in the phytoplankton community of a coastal, hyposaline lake in western Anatolia, Turkey, Limnology. 8: 337–342.
    5. Dunbar, J., Takala, S., Barns, S.M., Davis, J.A., and Kuske C.R., 1999, Levels of Bacterial Community Diversity in Four Arid Soils Compared by Cultivation and 16S rRNA Gene Cloning, Applied and Environmental Microbiology. 65: 1662–1669.
    6. Ellis, R.J., Morgan, P., Weightman, A.J., Fry, J.C., 2003, Cultivation-Dependent and -Independent Approaches for DeterminingBacterial Diversity in Heavy-Metal-Contaminated Soil, Applied and Environmental Microbiology. 69: 3223–3230
    7. Hayward, C.A., 2006, Microorganisms. In: Encyclopedia of Life Sciences (ELS). John Wiley & Sons, Ltd: Chichester.
    8. Fenchel, T., 2007, Bacterial Ecology. In: Encyclopedia of Life Sciences (ELS). John Wiley & Sons, Ltd: Chichester.
    9. Kirk, J.L., Beaudette L.A., Hart, M., Moutoglis, P., Klironomos, J.N., Lee, H., Trevors, J.T., 2004, Methods of studying soil microbial diversity. Journal of Microbiological Methods. 58:169–188
    10. Lane, D.J., 1991, 16S/23S rRNA sequencing. In: Stackebrandt E, Goodfellow M, editors. Nucleic acid techniques in bacterial systematics. Chichester, United Kingdom: John Wiley and Sons. 115–175.
    11. Liu, L., Peng, Y., Zheng, X., Xiaoa, L., Yang, L., 2010, Vertical Structure of Bacterial and Archaeal Communities within the Sediment of a Eutrophic Lake as Revealed by Culture-Independent Methods. Journal of Freshwater Ecology. 25: 565-573.
    12. Liu, Y., Zhang, J., Zhao, L., Zhang, X., Xie, S.,2014, Spatial distribution of bacterial communities in high-altitude freshwater wetland sediment. Limnology. 15:249–256
    13. Makhdoumi-Kakhki, A., Amoozegar, M.A., Kazemi, B., Pašić, L., Ventosa, A., 2012, Prokaryotic diversity in Aran-Bidgol salt lake, the largest hypersaline playa in Iran. Microbes and Environments. 27: 87-93.
    14. Marchesi, J.R., Sato, T., Weightman, A.J., Martin, T.A., Fry, J.C., Hiom, S.J., Wade, W.G., 1998, Design and Evaluation of Useful Bacterium-Specific PCR Primers That Amplify Genes Coding for Bacterial 16S rRNA. Applied and Environmental Microbiology. 64: 795–799
    15. Martin-Laurent, F., Philippot, L., Hallet, S., Chaussod, R., Germon, J. C., Soulas, G., and Catroux, G., 2001, DNA extraction from soils: Old bias for new microbial diversity analysis methods, AppliedandEnvironmental Microbiology. 67: 2354-2359.
    16. Pearce, D.A., Gast, C.J., Lawley, B., Ellis-Evans, J.C., 2003, Bacterioplankton community diversity in a maritime Antarctic lake, determined by culture-dependent and culture-independent techniques, FEMS Microbiology Ecology. 45: 59-70. 
    17. Philp, J.C., Atlas, R., and Cunningham, C.J., 2009, Bioremediation. In: Encyclopedia of Life Sciences (ELS). John Wiley &Sons, Ltd: Chichester.
    18. Prosser, J. I., 2002, Molecular and functional diversity in soil micro-organisms, Plant and Soil, 244: 9-17.
    19. Rohban, R., Amoozegar, M.A., Ventosa, A., 2009, Screening and isolation of halophilic bacteria producing extracellular hydrolyses from Howz Soltan Lake, Iran, Journal of industrial microbiology & biotechnology. 36: 333-340.
    20. Song, H., Li1, Z., Du1, B., Wang, G., Ding, Y., 2011, Bacterial communities in sediments of the shallow Lake Dongping in China. Journal of Applied Microbiology.112: 79–89.
    21. Tamura, K., Peterson, D., Peterson, N., Stecher, G., Nei, M., and Kumar, S., 2011, MEGA 5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods, Molecular Biology and Evolution. 28: 2162-2169.             
    22. Thompson, J.D., Higgins, D.G., Gibson T.J., 1994, Clustal-W - Improving The Sensitivity Of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position-Specific Gap Penalties And Weight Matrix Choice, Nucleic Acids Research. 22: 4673-4680.
    23. Ulrich, A., Klimke, G., Wirth, S., 2008, Diversity and activity of cellulose-decomposing bacteria, isolated from a sandy and a loamy soil after long-term manure application, Microbial Ecology, 55: 512-522.
    24. Van der Gucht, K., Vandekerckhove, T., Vloemans, N., Cousin, S., Muylaert, K., Sabbe, K., Gillis, M., Declerk, S., De Meester, L., Vyverman, W., 2005, Characterization of bacterial communities in four freshwater lakes differing in nutrient load and food web structure, FEMS Microbiology Ecology. 53: 205-20.