بررسی تأثیر سوراخ کردن مصنوعی بلاستوسیست موش بر زنده­مانی و میزان بیان ژن Wnt3a

سمانه قریب¹، مجتبی دشتی­زاد^2*، فرح فرخی¹، مهدی شمس­آرا²

¹ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی

² تهران، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، گروه زیست فناوری دامی 

تاریخ دریافت: 26/11/93              تاریخ پذیرش: 6/2/94 

چکیده

امروزه جهت افزایش میزان لانه­گزینی و حاملگی پس از انتقال رویانهای حاصل از لقاح آزمایشگاهی، از تکنیکهای مختلف هچینگ کمکی از جمله سوراخ کردن مصنوعی بلاستوسیست استفاده می­شود. در این مطالعه با سوراخ کردن مصنوعی بلاستوسیست با استفاده از ریز سوزنهای تزریق کننده، کیفیت بلاستوسیستهای موش با بررسی نرخ زنده­مانی، خروج بلاستوسیست از زونا و میزان بیان ژن Wnt3a مورد ارزیابی قرار گرفت. بلاستوسیستها در دو گروه درون­تنی و برون­تنی مورد مطالعه قرار گرفتند. در هر گروه  تعدادی از بلاستوسیستها با استفاده از ریز سوزنهای تزریق­کننده به روش مکانیکی سوراخ شدند و تعدادی دیگر بدون هیچ تیماری به عنوان گروه کنترل در نظر گرفته شدند. نرخ زنده­مانی و قابلیت خروج بلاستوسیستها از زونا و همچنین میزان بیان ژن Wnt3a توسط تکنیک واکنش زنجیره­ای پلیمراز در زمان واقعی در هر گروه ارزیابی گردید. بر اساس نتایج به دست آمده در بلاستوسیستهای درون­تنی و برون­تنی گروه تیمار در مقایسه با کنترل میزان زنده­مانی کاهش نیافت در مقابل میزان خروج بلاستوسیست از زونا افزایش معنی­داری نشان داد. در گروه بلاستوسیستهای درون­تنی میزان بیان ژن Wnt3a افزایش معنی­دار و در گروه بلاستوسیستهای برون­تنی کاهش معنی­دار یافت.

سوراخ کردن مصنوعی بلاستوسیست می­تواند یک روش مطمئن در هچینگ کمکی به کار رود.

واژه های کلیدی: هچینگ کمکی، سوراخ کردن مصنوعی، بلاستوسیت موش، ژن Wnt3a

* نویسنده مسئول، تلفن: 02144787323، پست الکترونیکی:dashtizad@nigeb.ac.ir

مقدمه

پیش شرط یک لانه­گزینی موفق، خروج رویان از زونا پلوسیدا یا همان لایه محاطی شفاف اطراف جنین می­باشد (30). در شرایط طبیعی اطراف تخمک با لایه­ای از مولکولهای قندی پروتئینی پوشیده شده است که پس از ورود اولین اسپرم به تخمک با تغییر در ساختار به گونه­ای عمل می­نماید که مانع ورود اسپرمهای بعدی و پلی­اسپرمی می­گردد (3 و 17). این لایه علاوه بر محافظت تخمک و رویان، مانع از جدا شدن سلولهای رویانی از یکدیگر شده و به عنوان یکی از عوامل مؤثر در هدایت رویان به سمت رحم ایفاء نقش می­نماید (3 و 25). زونا پلوسیدا در روز پنجم پس از لقاح، با رسیدن رویان در مرحله بلاستوسیست به حفره رحمی، به کمک آنزیمهای مترشحه از سلولهای تروفواکتودرمی رویان و دیواره رحم، نازک شده و با بالا رفتن فشار درونی رویان، از ناحیه­ای پاره می­شود تا امکان چسبیدن و نفوذ رویان به دیواره رحمی فراهم گردد. به این فرآیند پاره شدن  و خروج رویان از زوناپلوسیدا، هچینگ گفته می­شود، هر تغییری که بتواند در این خروج اختلال ایجاد نماید نرخ باروری را به طور جدی تحت تأثیر قرار خواهد داد (1 و 22).

در دهه­های اخیر، با توجه به افزایش میزان ناباروری در بین زوجین، نیاز به روشهای کمک باروری بیش از پیش احساس می­شود. از شایع ترین روشهای ART، می­توان به تولید رویان آزمایشگاهی اشاره نمود (11). در مواردی که لقاح و کشت جنین در شرایط برون تنی به وقوع می­پیوندد برخی استرسهای محیطی نظیر دما، pH و  مجاورت با محیطهای کشت می­توانند با تغییر در ساختار زونا موجب افزایش الاستیسیته (23) و کاهش در نرخ خروج و لانه­گزینی رویان و در نهایت باروری گردد    (9و10). کاهش ضخامت و یا ایجاد شکاف در لایه محاطی رویانهای برون­تنی، قبل از انتقال به رحم فرد گیرنده، می­تواند روند خروج رویان از زونا و لانه­گزینی را بهبود بخشد که این امر امروزه در آزمایشگاهها با استفاده از روشهای مکانیکی، شیمیایی (آنزیمی) و یا لیزر تحت عنوان هچینگ کمکی صورت می­پذیرد (2، 6 و 21).

با توجه به تهاجمی بودن این روش تنها موارد ضخامت زونای بالای 17 میکرومتر، رویانهای کمتر از 5 سلول در روز سوم و فراگمنتیشن بالای 20 درصد، کاندیدای مناسبی برای انجام هچینگ کمکی می­باشند. همچنین به بیماران بالای 38 سال و دارای سابقه چندین شکست در انتقال رویان، استفاده از این روش توصیه می­شود (8 و 22).

امروزه پروتکل رایج در بسیاری از آزمایشگاهها انتقال دو تا سه رویان 4 تا 8 سلولی به ازاء هر دوره درمانی می­باشد. دلیل این امر انتقال و برگشت سریع تر رویانهای برون­تنی به شرایط درون­تنی، آسان و ایمن­تر بودن روش هچینگ کمکی در این مرحله با توجه به وجود فاصله کافی بین بلاستومرها و زونا و نیز شانس بقای بالاتر رویانها بعد از انجماد می­باشد (4، 24 و 28). اما مطالعات نشان داده­اند بلاستوسیست به دلیل بالا بودن تعداد سلولها از قدرت ترمیم بیشتری برخوردار است. همچنین با توجه به افزایش در نسبت سطح به حجم سلولها، امکان تبادل مواد سرما محافظ با آب درون سلولی افزایش  می­یابد و پتانسیل رویان برای بقاء و مقاومت در برابر شوکهای دمایی بهبود می­یابد (14 و 15). بنابراین انتقال رویان در مرحله بلاستوسیست علاوه بر بالا بردن شانس حاملگی، خطر ابتلاء به سندرم تحریک بیش از حد تخمدان را نیز کاهش می­دهد (13) و از جمله درمانهای پیشنهاد شده در باب شکست مکرر در لانه­گزینی مطرح می­باشد. اما در بلاستوسیست به واسطه چسبیده بودن سلولهای لایه تروفواکتودرم به لایه زونا، هچینگ کمکی ریسک آسیب به سلولهای رویان را افزایش می­دهد. همچنین حفره بلاستوسل مملو از مایع درون بلاستوسیست با افزایش احتمال تشکیل کریستال یخ حین انجماد، باعث کاهش نرخ زنده­مانی، در رویانهای یخ­گشایی شده می­گردد. علاوه بر این، حضور حفره مملو از مایع می­تواند به عنوان یک سد، مانع از رسیدن مواد سرما محافظ به سلولهای درونی رویان گردد و باعث آسیب سلولهای درونی به واسطه مواجه با شوک سرمایی گردد (20)

تا کنون روشهای مختلفی برای کاهش حجم مایع درون حفره بلاستوسل معرفی شده­اند که از جمله آنها می­توان به ایجاد سوراخ در بلاستوسیست با استفاد از یک سوزن بسیار نازک شیشه­ای اشاره کرد، علاوه بر استفاده از ریز سوزن شیشه­ای، روشهای دیگری همچون استفاده از سوزن با درجه 29، پیپت شیشه­ای (8)، لیزر (19) و غلظت بالای ساکارز (11) نیز برای کاهش مایع حفره بلاستوسل مورد بررسی قرار گرفته است. با ایجاد سوراخ در بلاستوسیست با استفاد از یک سوزن بسیار نازک شیشه­ای می توان ضمن کاهش حجم مایع بلاستوسل، امکان دسترسی سلولهای درونی رویان را به مواد سرما محافظ در غلظتهای معمول تسهیل نمود و هم با تحریک سلولهای تروفواکتودرم باعث فعال شدن مسیر ترشح آنزیم لایزین گردد که خود می­تواند با تسهیل در خروج رویان از زونا به عنوان هچینگ کمکی عمل نماید (4، 10، 12 و 13).

مطالعات قبلی نشان داده­اند که کاهش حجم مایع بلاستوسل قبل از انجماد شیشه­ای می­تواند نرخ زنده مانی رویانهای ذوب شده را بهبود بخشد ولی این مایع در تغذیه، جا به جایی و جهت دهی بلاستومرها در حین تکامل و لایه­زایی، نقش دارد. در طی تکامل رویان، سلولهای ICM در بلاستوسیست توانایی تبدیل به هر سه لایه زاینده جنینی (اکتودرم، مزودرم و آندودرم) را دارا می­باشند. سلولهای ترفواکتودرم نیز که در معرض مستقیم فشار ناشی از پارگی بلاستوسیست می باشند نقش اساسی در لانه­گزینی رویان ایفاء می­نماید. بنابراین هر گونه تغییر در میزان بیان ژنهای تأثیرگذار در تکوین رویان می­تواند در کیفیت بلاستوسیست و در نهایت توان لانه­گزینی رویان تأثیرگذار باشد. از میان این ‍ژنها می­توان به ژنهای خانواده Wnt اشاره کرد که از مراحل اولیه رشد رویان بیان می­شوند و به ICM و سپس به اپی­بلاست و بعد از گاسترولاسیون به رده سلولی زاینده محدود می­گردند و نقش عمده­ای در رشد و تکامل جنین ایفاء می­نمایند. بنابراین، نقص در بیان آنها منجر به تولید بلاستوسیستهایی خواهد شد که ICM آنها قدرت تمایز به سایر سلولها را ندارد و حتی در صورت لانه­گزینی نیز در مراحل اولیه تکامل جنینی از بین می­روند (16).

با توجه به نقش  مایع بلاستوسل آیا خروج مایع و نیز آسیب و استرس اعمال شده به رویان در حین سوراخ کردن مصنوعی می­تواند با تأثیر بر بیان ژنهای دخیل در تکوین بلاستوسیست و پرتوانی توده سلولی داخلی برتوسعه و عملکرد جنین تأثیر گذار باشد؟ جهت پاسخ به این پرسش در این تحقیق کیفیت بلاستوسیستهای درون­تنی و برون­تنی موش را پس از سوراخ کردن مصنوعی از لحاظ مورفولوژیک با سنجش نرخ     زنده­مانی، بازگشت رویانها به شکل طبیعی و خروج از زونا و نیز از طریق روشهای مولکولی با بررسی میزان بیان ژن Wnt3a، ارزیابی گردید.

مواد و روشها

در این تحقیق از موشهای سوری، نژاد NMRI (موشهای ماده با سن 8-7 هفته و موشهای نر با سن 12-10 هفته) استفاده شد. حیوانات در شرایط 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی و دمای 23-18 درجه سانتی­گراد نگهداری شدند و محدودیتی از نظر دسترسی به آب و غذا نداشتند.

تولید بلاستوسیست برون­تنی:تحریک تخمک­گذاری: جهت تحریک تخمک­گذاری، در روز اول به میزان 8 واحد بین­المللی هورمونﮔﻨﺎدوﺗﺮوﭘﻴﻦ ﺳﺮم ﻣﺎدﻳﺎن آﺑﺴﺘﻦ ((Folligon®, A007A02, Intervet به صورت داخل صفاقی به موشهای ماده تزریق شد. پس از گذشت 48-46 ساعت، تزریق داخل صفاقی هورمون گنادوتروپین جفتی انسان (Pregnyl®, 111, Darou Pakhsh) جهت آزادسازی تخمکها، به میزان  IU8 صورت پذیرفت.

استحصال تخمک: حداقل چهار ساعت قبل از استحصال، جهت جمع­آوری و شست و شوی تخمکها محیط M2 به همراه سدیم پیرووات (P4562,Sigma) و آلبومین سرم گاوی (10106, GibcoBRL) در یک پتری دیش 15×60 میلی­متری (150288, Nunc, Denmark) گذاشته و سطح آنها با روغن معدنی استریل (M-5310, Sigma) پوشانده شد و پتری دیش در انکوباتور (Memmert, Germany) با درجه حرارت 37 درجه سانتی گراد، رطوبت 97 درصد و CO₂ به میزان 5 درصد قرار گرفت. حدود 16-14 ساعت بعد از تزریق hCG، موش ماده نیز به روش جابه­جایی  مهره­های گردنی کشته شد و پس از نمایان شدن حفرۀ شکمی، اویداکتها با قیچی از رحم و تخمدانها جدا و به قطرۀ M2 منتقل شدند. در زیر استرئومیکروسکوپ (smz1000, Nikon, Japan) ناحیۀ آمپولای توسط یک سوزن پاره شد و توده­های تخمک-کومولوس آزاد گشتند. این توده­ها بعد از شستشو در قطره­های M2، درون انکوباتور با درجه حرارت 37 درجه سانتی گراد، رطوبت 97 درصد و CO₂ به میزان 5 درصد نگهداری گردیدند.

استحصال اسپرم: جهت جداسازی و ظرفیت­پذیری اسپرم، از محیط TCM 199 حاوی 2/2 گرم بر میلی لیتر سدیم بی­کربنات، 25 میلی­مولار بافرهیپس (12340-030, GibcoBRL) به همراه 10 درصد آلبومین سرم گاوی استفاده گردید. حدود 15-13 ساعت بعد از تزریق hCG به موش ماده، موش نر به روش جا­به­جایی مهره­های گردنی کشته و به پشت خوابانده شد و با ایجاد برش در پوست و لایه صفاقی، حفره شکمی نمایان گردید. اسپرمها از دم اپیدیدیم استخراج و به مدت یک ساعت در محیط ظرفیت­پذیری اسپرم در درجه حرارت 37 درجه، رطوبت 97 درصد و CO₂ به میزان 5 درصد قرار گرفتند.

لقاح آزمایشگاهی: برای انجام لقاح آزمایشگاهی از محیط HTF به همراه 33/5 میلی­مولار سدیم پیرووات و 30 میلی­گرم بر میلی ­لیتر آلبومین سرم گاوی و گلوتاتیون (071M1804V, Sigma) استفاده شد. در پتری دیش 10×35 میلی متری (153066, Nunc, Denmark) قطره­هایی با حجم تقریبی 50  ماکرولیتر از محیط HTF گذاشته و سطح آنها با روغن معدنی استریل پوشانده شد و حداقل چهار ساعت قبل از شروع لقاح در انکوباتور قرار گرفت.

در هر قطرۀ HTF، ده الی پانزده عدد COCs که از لحاظ ظاهری طبیعی بودند قرار داده شد و 3-4 ماکرولیتر اسپرم با غلظت یک میلیون در حجم یک میلی­لیتر به هر قطره اضافه گردید و به مدت چهار ساعت درون انکوباتور با درجه حرارت 37 درجه سانتی گراد، رطوبت 97 درصد و CO₂ به میزان 5 درصد نگهداری گردیدند.

کشت رویان: جهت کشت رویان از محیط  KSOM(J.D, 1993) حاوی سدیم پیرووات، 5 میلی­گرم بر میلی­لیتر آلبومین سرم گاوی، 50 میلی­گرم بر میلی ­لیتر جنتامایسین Bio-West, L0011-010)) و 50 نانو­گرم بر میلی­لیتر فاکتور رشد اپیدرمی (E4127, Sigma) استفاده شد. چهار قطره با حجم تقریبی250 ماکرولیتر از محیط KSOM درون پتری دیش 60×15 میلی­متری گذاشته و سطح آنها با روغن معدنی استریل پوشانده شد. همچنین 400 ماکرولیتر از محیط KSOM در هر چاهک از پلیت چهار حفره­ای (176740, Nunc,Denmark) ریخته و سطح آن با همین حجم از روغن معدنی استریل پوشانده گردید. تخمکهای لقاح یافته پس از شست­وشو به دیش چهار­خانه­ی حاویKSOM  منتقل و به مدت 72 ساعت درون انکوباتور با درجه حرارت 37 درجه ورطوبت 95 درصد و  CO₂به میزان 5 درصد قرار گرفتند.

استحصال بلاستوسیست درون­تنی: تزریق هورمونهای PMSG و hCG مشابه گروه قبل صورت گرفت. بلافاصله پس از تزریق هورمون hCG یک موش ماده با یک موش نر جهت جفت­گیری در یک قفس قرار گرفتند، صبح روز بعد، پلاک واژنی بررسی شد و موشهای پلاک مثبت به عنوان روز نیم بارداری به مدت سه روز جهت استحصال بلاستوسیست نگهداری شدند. موشهای سه و نیم روزه به روش جابه­جایی مهره­های گردنی کشته شدند. لوله­های رحمی موشها جدا و با تزریق محیط M2 به لوله­های رحمی، بلاستوسیستها جمع­آوری و در قطره­های مختلف M2 و KSOM شست­وشو داده شدند و به پلیت چهار خانه حاوی KSOM  منتقل شدند و در انکوباتور با دمای 37 درجه، CO2 5 درصد و رطوبت 97 درصد قرار گرفتند.

سوراخ کردن مصنوعی بلاستوسیست: برای سوراخ کردن بلاستوسیستهای درون­تنی و برون­تنی از میکروسکوپ معکوس Nikon eclipe Ti-U, Japan)) که مجهز به یک سیستم میکرومنیپولیتورNarishige, 10291, Japan) ) و صفحه گرم­کنندهNikon TI-SR, Japan) ) می­باشد، استفاده گردید. بلاستوسیستها درون قطره­های M2 با حجم 4 ماکرولیتر قرار گرفتند. سپس بلاستوسیستها در زیر میکروسکوپ و با استفاده از سوزنهای تزریق و نگهدارنده نصب شده بر روی دستگاه، به گونه­ای مهار گردید که سلولهای ICM در راستای حرکت ورود و خروج سوزن به درون رویان نباشند. سوزن تزریق به آرامی از بین سلولهای تروفواکتودرم وارد رویان گردید (تا نزدیکی سوزن نگهدارنده). بعد از چند ثانیه سوزن به آرامی در حالی که رویان همچنان توسط فشار منفی سوزن نگهدارنده ثابت مانده است، بیرون کشیده شد. این مراحل برای تمامی بلاستوسیستها بر روی صفحه گرم در دمای 37 درجه صورت پذیرفت. در این مطالعه تعداد 136 بلاستوسیست درون­تنی و 124 بلاستوسیست برون­تنی توسط سوزن دستگاه ریزدستکاری سوراخ گشتند و مایع بلاستوسل آنها خارج شد و سپس به محیط KSOM انتقال یافتند. حدود 3 و 12 ساعت بعد بلاستوسیستها از نظر کیفیت بررسی گشتند.

استخراج RNA تام از بلاستوسیت: برای استخراج RNA تام از بلاستوسیستها از کیت استخراج RNeasy Plus Micro Kit® (74034, Qiagen) استفاده شد و طبق پروتوکل نوشته شده در کیت، RNA استخراج گردید. میزان غلظت  RNAاستخراج شده با استفاده از دستگاه نانودراپ (Thermo Scientific, America) به روش اسپکتروفتومتری سنجیده شد. نسبت جذب280/A260A معیاری برای بررسی عدم وجود آلودگی پروتئین در نظر گرفته ­شد.

سنتز رشته اول DNA  مکمل: برای سنتز cDNA از کیت AccuPower RocketScript RT PreMix (Bioneer) استفاده گردید. واکنش مطابق با دستورالعمل موجود در کیت با استفاده از پرایمرهای تصادفی تهیه شد و واکنش سنتز cDNA در دستگاه ترموسایکلر  (Peqlab, Germany) در شرایط دمایی 15 درجه سانتی گراد برای 3 دقیقه، 50 درجه برای 60 دقیقه و 95 درجه برای مدت 5 دقیقه انجام گردید.

طراحی پرایمر: توالی پرایمرهای رفت و برگشت ژن  Wnt3و β2M توسط برنامه Oligo5 طراحی شد و اختصاصی بودن آن توسط Primer-BLAST مورد ارزیابی قرار گرفت

جدول 1). ژن  β2Mبه عنوان ژن کنترل داخلی (Housekeeping) در نظر گرفته­ شد.

جدول 1- توالی پرایمرهای رفت و برگشت ژنهای  Wnt3و β2M

واکنش زنجیره­ای پلیمراز کیفی: این واکنش در حجم نهایی 15 ماکرولیتر با استفاده از کیت شرکت Ampliqon انجام شد. به منظور تهیه واکنش 5/7 ماکرولیتر از مخلوط اصلی x2 (2x Master Mix)، 4 پیکومول از هر آغازگر و 1 ماکرولیتر cDNA با یکدیگر ترکیب شدند و حجم نهایی با آب تنظیم شد. واکنش PCR کیفی در دستگاه ترموسایکلر (Peqlab, Germany) در 32 چرخه حرارتی شامل مرحله واسرشت در دمای 94 درجه سانتی­گراد به مدت 15 ثانیه، مرحله اتصال در دمای 58 درجه سانتی­گراد به مدت 15 ثانیه، مرحله تکثیر در دمای 72 درجه سانتی­گراد به مدت 5 دقیقه انجام شد. همچنین مرحله واسرشتگی اولیه در دمای 94 درجه سانتی­گراد به مدت 3 دقیقه لحاظ گردید. در پایان محصولات  PCRبا استفاده از ژل آگارز یک درصد الکتروفورز شدند. ژل در ظرف حاوی اتیدیوم بروماید به مدت 10 دقیقه قرار داده شد و پس از شستشو در آب، در دستگاه Transilluminator تحت اثر اشعه UV باندها مشاهده شدند.

واکنش زنجیره­ای پلیمراز در زمان واقعی: بیان دو ژن Wnt3a و β2m با استفاده از کیت (25344, Intron) حاوی رنگ  SYBR Green Iاز طریق روش مقایسه­ای CT واکنش real time- PCR در دستگاه ترموسیکلر (Applied Bio Systems StepOne, USA) ارزیابی گردید. تعداد 40 سیکل تکثیر در دمای Annealing 55 درجه سانتی گراد صورت پذیرفت. این واکنش برای هر یک از تیمار­ها با 3 بار تکرار انجام شد.

طراحی آزمایش: بلاستوسیستها در دو گروه درون­تنی و برون­تنی مورد بررسی قرار گرفتند. در هر گروه رویانها به طور تصادفی به دو بخش تقسیم شدند. گروهی با استفاده از دستگاه ریزدستکاری به روش مکانیکی سوراخ شدند و مابقی بدون هیچ تیماری به عنوان گروه کنترل در نظر گرفته شدند. نرخ زنده­مانی، قابلیت خروج بلاستوسیستها از زونا و میزان بیان ژن Wnt3a در هر گروه ارزیابی گردید.

تجزیه و تحلیل داده­ها: با استفاده از تست  One-Way ANOVAو به دنبال آن تست Duncan، آنالیز داده­های سلولی و مولکولی صورت پذیرفت و تفاوتها در 05/0P< معنی­دار در­نظر گرفته شدند. برای این منظور از نرم­افزار آماری SPSS, ver. 16.0  استفاده گردید.

نتایج

بخش سلولی: براساس نتایج به دست آمده در

جدول 2 میزان زنده­مانی بلاستوسیتهای درون­تنی در گروه تیمار در مقایسه با کنترل، تفاوت معنی­داری نداشت (84/1 ± 93/98 در مقابل 100 درصد) اما میزان خروج از زونا افزایش معنی­داری نشان داد (72/1 ± 46/83 در مقابل 01/0 ± 6/70 درصد). در مورد بلاستوسیست­های برون­تنی نیز (جدول 3)، با استفاده از تکنیک سوراخ کردن مصنوعی، در کنار میزان زنده­مانی بالا (91/0± 97%)، افزایش معنی­داری نیز در میزان خروج از زونا بدست آمد (^b53/3 ± 8/75 در مقابل^a4/10± 4/63).

جدول 2- اثر سوراخ نمودن مصنوعی حفره بلاستوسل بر کیفیت بلاستوسیستهای درون­تنی موش

جدول 3- اثر سوراخ نمودن مصنوعی حفره بلاستوسل بر کیفیت بلاستوسیستهای برون­تنی موش

بخش مولکولی: نتایج حاصل از نمودار 1 نشان می­دهد که میزان بیان ژن Wnt3a در بلاستوسیستهای درون تنی موش حاصل از فرآیند سوراخ کردن مصنوعی نسبت به گروه کنترل افزایش معنی­دار و در بلاستوسیستهای برون­تنی موش کاهش معنی­دار داشته است. همچنین نتایج حاصل نشان می­دهد میزان بیان ژن Wnt3a در بلاستوسیستهای برون­تنی موش حاصل از فرآیند سوراخ کردن مصنوعی نسبت به بلاستوسیستهای درون­تنی موش، کاهش معنی­دار  پیدا کرده است.

نمودار 1- اثر سوراخ کردن مصنوعی در الف: بلاستوسیستهای درون­تنی موش بر میزان بیان ژن Wnt3a نسبت به گروه کنترل ب: بلاستوسیستهای برون­تنی موش بر میزان بیان ژن  Wnt3a نسبت به گروه کنترل

داده­ها حاصل از 3 تکرار real time- PCR می­باشند.   aو b نسبت به هم تفاوت معنی­دار دارند (05/0P< در تست ANOVA و Duncan).