نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد میکروبیولوژی

2 دانشیار گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه شهید باهنر کرمان، کرمان، ایران

3 دانشگاه شهید باهنر کرمان

چکیده

پروتئازها از جمله مهم‌ترین آنزیم‌های صنعتی هستند که حدود 65 درصد از بازار جهانی آنزیم های صنعتی و حدود 25 درصد از تولید کل آنزیم ها را به خود اختصاص داده‌اند. پروتئازها در صنایع مختلف از جمله افزودنی‌های شوینده‌ها، تیمار فاضلاب، بازیافت نقره و در صنایع غذایی، چرم‌سازی، بازیافت نقره از فیلم‌های عکس برداری با اشعه ایکس و داروسازی کاربرد دارند. در این تحقیق باکتری مولد آنزیم پروتئاز از پساب کارخانه شیر پگاه کرمان جداسازی شد. ایجاد هاله در اطراف کلنی‌های رشد کرده در محیط حاوی اسکیم میلک آگار) 5 درصد( نشانگر فعالیت پروتئولیتیک می‌باشد. سویه دارای بالاترین فعالیت پروتئازی از لحاظ بیوشیمیایی و مولکولی (توالی‌یابی ژن 16S rRNA) شناسایی شد کهChryseobacterium indologenes می‌باشد. پروتئاز تولیدی توسط این سویه در سه مرحله رسوب‌گذاری با آمونیوم سولفات، دیالیز در بافر تریس 35 میلی مولار و کروماتوگرافی تعویض یونی Q-سفاروز به طور نسبی خالص شد. میزان فعالیت پروتئازی با استفاده از روش زایموگرافی مورد تایید قرار گرفت. این آنزیم دارای بیشترین فعالیت در دمای °C 40، 8 pH و بیشترین پایداری در دمای °C 40‌، 9-8 pH می‌باشد. تریتون X-100 و شوینده تجاری تاژ باعث افزایش فعالیت و پایداری فعالیت پروتئازی شدند. آنزیم پروتئاز تولید شده در غلظت شوری 1% بیشترین فعالیت پروتئازی را نشان می‌دهد. این نتایج خاطرنشان می‌سازد که این آنزیم قابلیت استفاده در بیوتکنولوژی از جمله در صنایع شوینده، فرآوری گوشت و سنتز ترکیبات با ارزش را دارا می‌باشد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Isolation and characterization of protease producing Chryseobacterium indologenes strain BYK27 from Kerman,s dairy industry sewage

نویسندگان [English]

  • Yasamin Beinabadi 1
  • Abdalhamid Namaki-Soushtari 2
  • Arastoo Badoei-Dalfard 3

چکیده [English]

Proteases are one of the most important groups of industrial enzymes, constituting 65% of worldwide industrial enzyme marketing and around 25% of the total global enzyme production. Their use encompasses a great number of applications in different industrial sectors, such as detergent additives, in waste treatment processes, silver recovery and the food, leather, photographic and pharmaceutical industries. Protease producing bacteria were isolated from Kerman,s dairy industry sewage with clear zone surrounding colony in Skimmed milk agar plate. Its biochemically tests and 16S rRNA gene sequencing showed that it is Chryseobacterium indologenes strain BYK27. The extracellular protease secreted by this strain partially purified by a combination of ammonium sulfate precipitation, dialysis in Tris-HCl buffer 35 mM and ion-exchange chromatography. The temperature and pH optima for activity of produced protease were 40˚C, pH 8 and for stability were 40˚C, pH 8-9. This enzyme was activated by K+, Triton X-100 and commercial detergent Tage. It was also active in 1% concentration of salinity. These results showed that protease BYK27 can be used in detergent industry, meat tenderization and peptide synthesis.

کلیدواژه‌ها [English]

  • activity
  • Chryseobacyerium indologenes
  • Protease
  • Sewage and stability

جداسازی و شناسایی باکتری کریزئوباکتریوم ایندولوجنس سویه BYK27 مولد پروتئاز از پساب کارخانه شیر پگاه کرمان

یاسمین بین­آبادی، عبدالحمید نمکی­شوشتری* و ارسطو بدویی­دلفارد

کرمان، دانشگاه شهید باهنر کرمان، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی

تاریخ دریافت: 30/9/93                تاریخ پذیرش: 27/11/93 

چکیده

پروتئازها از جمله مهم­ترین آنزیمهای صنعتی هستند که حدود 65 درصد از بازار جهانی آنزیمهای صنعتی و حدود 25 درصد از تولید کل آنزیمها را به خود اختصاص داده­اند. پروتئازها در صنایع مختلف از جمله افزودنیهای شوینده­ها، تیمار فاضلاب، بازیافت نقره و در صنایع غذایی، چرم­سازی، بازیافت نقره از فیلمهای عکس­برداری با اشعه ایکس و داروسازی کاربرد دارند. در این تحقیق باکتری مولد آنزیم پروتئاز از پساب کارخانه شیر پگاه کرمان جداسازی شد. ایجاد هاله در اطراف کلنیهای رشد کرده در محیط حاوی اسکیم میلک آگار) 5 درصد( نشانگر فعالیت پروتئولیتیک می­باشد. سویه دارای بالاترین فعالیت پروتئازی از لحاظ بیوشیمیایی و مولکولی (توالی­یابی ژن 16S rRNA) شناسایی شد کهChryseobacterium indologenes  می­باشد. پروتئاز تولیدی توسط این سویه در سه مرحله رسوب­گذاری با آمونیوم سولفات، دیالیز در بافر تریس 35 میلی مولار و کروماتوگرافی تعویض یونی Q-سفاروز به طور نسبی خالص­سازی شد. میزان فعالیت پروتئازی با استفاده از روش زایموگرافی مورد تایید قرار گرفت. این آنزیم دارای بیشترین فعالیت در دمای 40 درجه سانتی گراد، 8 pH و بیشترین پایداری در دمای 40 درجه سانتی گراد، 9-8 pH می­باشد. تریتون X-100 و شوینده تجاری تاژ باعث افزایش فعالیت و پایداری فعالیت پروتئازی شدند. آنزیم پروتئاز تولید شده در غلظت شوری 1 درصد بیشترین فعالیت پروتئازی را نشان می­دهد. این نتایج خاطرنشان می سازد که این آنزیم قابلیت استفاده در بیوتکنولوژی از جمله در صنایع شوینده، فرآوری گوشت و سنتز ترکیبات با ارزش را دارا می­باشد.

واژه های کلیدی: پروتئاز، پساب، کریزئوباکتریوم ایندولوجنس، فعالیت و پایداری

* نویسنده مسئول، تلفن: 03433222032، پست الکترونیکی:  badoei@uk.ac.ir

مقدمه

 

پروتئازها از جمله آنزیمهای هیدرولیز کننده هستند که پیوند پپتیدی بین دو اسید­آمینه در یک زنجیره پلی پپتیدی را می­شکنند. این آنزیمها از منابع گیاهی، جانوری و میکروبی قابل دست­یابی هستند ولی به علت رشد سریع میکروبها، رشد و کشت آنها در فضای کم و امکان دستکاری ژنتیکی آنها برای تولید آنزیمهایی با خواص جدید ارجحیت با منابع میکروبی است (8). پروتئاز­ها بر اساس محل واکنش، جایگاه فعال و شرایط محیطی واکنش

تقسیم­بندی می­شوند (11، 12 و 13).

آنزیمهای پروتئولیتیک مهم­ترین آنزیمهای صنعتی هستند که حدود 60 درصد از بازار جهانی آنزیم صنعتی را به خود اختصاص داده­اند (14). پروتئازها آنزیمهایی با پیشینه تاریخی در کاربردهای غذایی و دارویی هستند و در صنایع دیگری چون چرم­سازی، شوینده­های تجاری، سنتز پپتیدهای زیست فعال (36) و بازیافت نقره از فیلم عکس برداری با اشعه X (22) کاربرد دارند. آنزیم پروتئازی که در شوینده­ها به کار می­رود باید نسبت به عوامل سفیدکننده، اکسید کننده و سورفاکتانت هایی که در ترکیب شوینده قرار دارند مقاوم باشد و در گرما تخریب نشود. این آنزیم با قدرت تجزیه لکه­های پروتئینی سبب بهبود کیفیت شستشو می­گردد. باسیلوس سوبتیلوس با تولید آنزیم پروتئاز قلیایی به نام سابتیلیزین در این صنعت پیشرو است (19، 20 و 21). ترکیب عمده مو و پوست، پروتئین می­باشد. روند تهیه چرم شامل مراحل مختلفی چون خیساندن، موزدایی و دباغی است که در گذشته از مواد شیمیایی چون سولفید سدیم استفاده می­شده که سبب آلودگی می­گردیده است. هدف از خیساندن، تورم پوست حیوان بوده که با قلیا انجام می­شده است. پروتئازهای قلیایی جذب آب را تسریع کرده و زمان لازم برای خیساندن را کاهش می­دهند و با تجزیه پروتئین فولیکول مو، سبب جداسازی مو از پوست می­شوند. پروتئاز مورد استفاده در این صنعت می­بایست به شرایط قلیایی سازگار باشد زیرا گاهی از مواد قلیایی برای کمک به روند انحلال پروتئین ریشه مو استفاده می­شود. باسیلوس سرئوس از جمله میکروارگانیسمهای مورد استفاده در این صنعت است (4، 12، 34 و 39). آنزیم پروتئاز در صنایع غذایی بسیار پر­کاربرد است. کازئین پروتئین اصلی شیر است. برای تهیه فرآورده­های لبنی چون پنیر، پروتئین باید لخته شود. بنابراین از عوامل کواگوله کننده شیر مثل پروتئازها استفاده می­شود. این آنزیمها در دسته آسپارتیک پروتئازها هستند (33). در صنایع نان این آنزیم کاربرد دارد زیرا پروتئین عمده گندم، گلوتن است و این پروتئین توسط آنزیم پروتئازی که از آسپرژیلوس تولید می­شود هیدرولیز شده و به صورت پروتئین فرآوری شده در نان مورد استفاده قرار می­گیرد که جذب آن برای انسان راحت­تر است (16 و 17). یک مثال از کاربرد آنزیم پروتئاز در داروسازی محلول شستشوی لنزهای تماسی است. در محلولهای شستشوی لنزهای تماسی از آنزیم سابتیلیزین استفاده می­شود که از باکتری Bacillus sp. 158 به دست می­آید (31). لجن فعال، یکی از روشهای تصفیه پساب خانگی و صنعتی است. در فرآیند لجن فعالWAS  (Waste activated sludge) محصول جانبی اصلی می­باشد. هزینه فرآوری و حذف WAS 50 درصد از کل هزینه فرآیند تصفیه را شامل می­شود. پروتئینها ترکیب آلی عمده WAS هستند (19). آنزیم پروتئاز می تواند محتوای جامد WAS را کاهش داده و از تشکیل بیوفیلم جلوگیری کند و حذف پاتوژنها را با شکستن سلولها تسریع بخشد (28). از پساب صنایع مختلف که غنی از پروتئین باشد می­توان به عنوان سوبسترای ارزان قیمت برای تحریک و القای تولید آنزیم پروتئاز توسط باکتریها استفاده کرد، به عنوان مثال از پساب صنایع کشاورزی جهت تولید پروتئاز استفاده می شود (37). همچنین حضور باکتریهای مولد آنزیمهای هیدرولیتیک مثل پروتئاز­ها در پساب سبب احیای ترکیبات مفیدی چون آمینواسیدها، افزایش روند تجزیه ذرات آلی و افزایش میزان تولید بیوگاز در روند تجزیه بی­هوازی می گردد (29). 

جنس باکتریChryseobacterium  متعلق به خانواده Flavobacteriaceae می­باشد و گونه­های مختلفی از آن تا­کنون شناسایی شده­اند مانند: C. indologenes، C. gleum، C. indolotheticum، C. meningosepticu، C. bovis،
C. scophthalmum، C. taeanense (26). این باکتری گرم منفی، نا­متحرک، فاقد اسپور و گرانول درون سلولی، هوازی، شموارگانوتروفیک و دارای رنگدانه زرد متمایل به نارنجی و کلنیهای کروی، درخشان و صاف است. برخی از گونه­های این باکتری مقاوم به سرما هستند (18). در مورد باکتری C. gleum علاوه بر تولید متالوپروتئاز گزارش شده است که این باکتری توانایی تولید سولفوباکتینA را نیز دارا می­باشد (30). C. taeanense TKU001 توانایی تولید پروتئاز مقاوم به حلال آلی و سورفاکتانت را دارد (42).
C. indologenes TKU014 پروتئازی با فعالیت کراتینولیتیکی و الاستولیتیکی تولید می­کند که برای استفاده در صنعت کاراست (41). در تحقیق انجام شده باکتری
C. indologenes strain BYK27 که از پساب صنایع شیر و لبنیات جدا شده است به عنوان باکتری تولید کننده پروتئاز شناخته شده که قابلیت استفاده در بیوتکنولوژی را داراست.

مواد و روشها

جداسازی میکروارگانیسمهای مولد آنزیم پروتئاز: نمونه­های پساب کارخانه شیر پگاه کرمان با مختصات جغرافیایی (30˚14'39''N 57˚5'33''E) که از شش محل متفاوت جمع آوری شده در فلاسکهای حاوی یخ به آزمایشگاه منتقل شد، سپس در رقتهای 10/1، 100/1 و 1000/1 با آب مقطر استریل رقیق گردید و در ارلنهای حاوی محیط کشت نوترینت براث (لیوفلیچم) در دمای 30 درجه سانتی گراد انکوباتور JISL10)-(JAL TAJHIZ با دور 150 غنی­سازی شد. به میزان 100 میکرولیتر از این کشتها روی پلیتهای حاوی محیط کشت اسکیم میلک (کیولب) کشت داده شد. پلیتها به مدت 48 ساعت در انکوباتور 30 درجه انکوبه شدند و ارگانیسمی که بزرگترین هاله را در اطراف خود ایجاد کرده بود برای مطالعات بیشتر انتخاب شده و استوکهایی از آن در دمای 20- درجه نگهداری شد.

شناسایی سویه باکتریایی انتخاب شده: سویه باکتریایی انتخاب شده بر اساس شاخصه­های مورفولوژیکی و بیوشیمیایی از جمله رنگ­آمیزی گرم، تست کاتالاز و اکسیداز، آزمون SIM و تخمیر قند، هیدرولیز نشاسته، ژلاتین و کازئین تعیین ویژگی شد. برای شناسایی دقیق­تر باکتری از طریق مولکولی اقدام شد، بدین صورت که با استفاده از روش PCR، ژن 16S rRNA با استفاده از پرایمرهای Forward : 5' -AGT TTG ATC CTG GCT CAG – 3'  باTm = 53/7 ºC  و پرایمر Reverse : 5–GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3  با Tm = 53/4 ºC (8)  تکثیر شد. مراحل انجام PCR به صورت زیر می­باشد: دمای اولیه 94 درجه سانتی گراد، 45 ثانیه و  دمای اتصال پرایمرها 54 درجه سانتی گراد، 45 ثانیه و دمی فعالیت آنزیم پلی مراز 72 درجه سانتی گراد، 90 ثانیه و برای تکثیر نهایی از دمای 72 درجه سانتی گراد برای مدت 8 دقیقه استفاده شد. سپس محصول PCR توالی­یابی گردید و با دیگر توالیهای موجود در بانک ژنی از طریق الگوریتم NCBI BLAST مقایسه شد.

تولید پروتئاز: برای بهینه­سازی تولید پروتئاز از محیط کشتی با ترکیب عصاره مخمر 06/0 درصد، NaCl 1/0 درصد و گلوکز 1 درصد در دمای 40 درجه سانتی گراد و 9 pH استفاده شد. 50 میلی­لیتر از این محیط کشت را در ارلنهای 250 میلی­لیتری ریخته و 5 میلی­لیتر از کشت مایع نوترینت براث حاوی باکتری را به آن تلقیح کرده و در انکوباتور 40 درجه با 150 دور قرار گرفت. هر 12 ساعت یکبار در طول 96 ساعت از محیط کشت برداشت شد. این محلول به مدت 5 دقیقه در دمای 4 درجه با دور 10000 سانتریفیوژ (MPW-35IR)  شده و سوپ رویی محلول برای سنجش فعالیت آنزیم مورد استفاده قرار گرفت. تمام این اندازه­گیریها سه بار تکرار شده و میانگین آنها در نظر گرفته شد. تأثیر pH، دما، نمک، منبع نیتروژن و کربن بر روی میزان تولید پروتئاز در آزمایشات جداگانه­ای سنجیده شده­اند. تنظیم pH با pHمتر (720P) قبل از اتوکلاو شدن (اتوکلاو ایران طب زعیم) صورت گرفت. منبع کربن جداگانه استریل شده و پس از اتوکلاو شدن محیط کشت به آن اضافه شد.

سنجش پروتئاز: اندازه­گیری فعالیت پروتئاز با روش Todd (40) صورت گرفت: 200 میکرولیتر از سوپ رویی محیط کشت سانتریفیوژ شده با 100 میکرولیتر محلول کازئین 1 درصد به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه بن ماری قرار گرفت. برای متوقف کردن فعالیت آنزیم، 300 میکرولیتر TCA (تری کلرواستیک اسید) 10 درصد به مخلوط واکنش اضافه شد و به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد قرار گرفت. پس از آن مخلوط واکنش در دمای 4 درجه سانتی گراد با دور 10000 به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شده تا تمام پروتئینهای تجزیه نشده شده رسوب کنند. جذب سوپ رویی در طول­موج nm 280 با دستگاه اسپکتروفتومتر (WPA Biowave II) خوانده شد. در نمونه شاهد، آنزیم در پایان واکنش و پس از افزودن TCA به محیط واکنش اضافه شد. هر واحد فعالیت آنزیم مقدار آنزیم مورد نیاز برای آزاد کردن 1 میکروگرم تیروزین در 1 دقیقه است (24 و 25).

جداسازی و خالص سازی نسبی پروتئاز: پیش­کشت نوترینت براث حاوی باکتری به یک لیتر از محیط کشت بهینه تلقیح شده و 48 ساعت در انکوباتور 40 درجه با دور rpm 150 قرار گرفت. سپس در دمای 4 درجه با دور 10000 سانتریفیوژ شده تا سلولهای باکتری جدا شود. برای جداسازی پروتئینها از سوپ رویی باید تغلیظ صورت بگیرد به این صورت که به ازای هر 100 میلی­لیتر محلول، 57 گرم سولفات­آمونیوم (مرک) جهت رسوب گذاری پروتئینها اضافه شد و به مدت یک شب در دمای 4 درجه قرار گرفت تا کاملاً پروتئینها نشست کنند، سپس در دمای 4 درجه و دور 10000 سانتریفیوژ صورت گرفته، رسوب جدا شده و در بافر حل شد. برای جداسازی نمک آمونیوم سولفات از پروتئینها دیالیز در بافر تریس mM 35 در 5/7 pH صورت گرفت. محلول دیالیز شده از ستون کروماتوگرافی Q-سفاروز به (cm 1×5) عبور داده شد. فرکشنهای کروماتوگرافی جمع آوری شده و فعالیت آنزیمی آنها بررسی شد. برای جداسازی فرکشن حاوی پروتئین با فعالیت آنزیمی آن را در معرض سوبسترا قرار داده و فعالیت آنزیمی سنجیده شد و فرکشن حاوی بیشترین میزان آنزیم تحت مطالعات بعدی قرار گرفت.

زایموگرافی: زایموگرافی یک تکنیک مبتنی بر الکتروفورز برای آنزیمهای هیدرولیز کننده است. میزان خلوص پروتئاز با روش SDS-PAGE اندازه­گیری شد. ژل الکتروفورز با سوبسترای کازئین (1/0 درصد) غنی شده و با انجام الکتروفورز پروتئینها از هم جدا می­شوند. پروتئین دارای فعالیت پروتئازی سبب هیدرولیز کازئین موجود در ژل شده و باند روشن ایجاد می­کند.

تعیین ویژگیهای بیوشیمیایی آنزیم پروتئاز: تأثیر pH و دما بر روی فعالیت و پایداری آنزیم: pH بهینه برای آنزیم با اندازه­گیری فعالیت و پایداری آن در pHهای مختلف از 3 تا 11 و در دمای 37 درجه سانتی گراد مشخص شد. بافرهای مورد استفاده برای pHهای مختلف شامل گلایسین (3-4 و 11-12)، سدیم استات (5-4)، سدیم فسفات (5-7)  و تریس (10-8)  می­باشند. دمای بهینه برای آنزیم پروتئاز از طریق اندازه­گیری فعالیت و پایداری آنزیم در 8 pH و در محدوده دمایی 90-20 تعیین گردید.

تأثیر یونهای فلزی روی فعالیت و پایداری آنزیم: برای بررسی تأثیر یون روی فعالیت و پایداری آنزیم پروتئاز، محلولهای یونی زیر با غلظت mM 10 استفاده شد: FeSO4-NaCl-KCl-MnSO4-ZnSO4-CaCl2-CuSO4-CoCl2. برای سنجش فعالیت، محلول یونی به مخلوط در حال واکنش آنزیم اضافه گردید و سپس فعالیت آنزیم سنجیده شد. برای اندازه­گیری میزان فعالیت باقیمانده یا پایداری آنزیم، ابتدا آنزیم را با محلول یونی در دمای اتاق به مدت 30 دقیقه انکوبه گردیده، سپس سوبسترا اضافه شد و واکنش صورت گرفت. فعالیت باقیمانده آنزیم میزان پایداری آن را نشان می­دهد (38).

تأثیر ترکیبات مختلف و شوینده­های تجاری روی فعالیت و پایداری آنزیم: با توجه به بازدارنده­ای که روی آنزیم اثر می­کند نوع آنزیم را می­توان تخمین زد. متالوپروتئاز با EDTA، سرین پروتئاز با PMSF، سیستئین پروتئاز با IAA و آسپارتیک پروتئاز با  Pepstatin Aمهار می­شوند (42). روش سنجش تأثیر این عوامل مشابه محلولهای یونی است. ترکیبات ­EDTA، Triton X100و SDS  در غلظت 01/0 درصد، عامل اکسید کننده H2O2 در غلظت 1 درصد و شوینده­های تجاری دریا، برف، تاژ، کف، بانو و شوما در غلظت 1 درصد مورد استفاده قرار گرفتند. برای بررسی فعالیت آنزیم، محلولها به مخلوط واکنش اضافه شده و سپس فعالیت آنزیم اندازه­گیری شد. برای سنجش میزان فعالیت باقیمانده ابتدا آنزیم با محلول مورد نظر به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق انکوبه گشت، سپس با افزودن سوبسترا مسیر واکنش­ ادامه یافته و با اندازه­گیری فعالیت باقیمانده میزان پایداری مشخص شد.

نتایج

جداسازی و شناسایی باکتری تولید­کننده پروتئاز: سویه BYK27هاله شفاف بزرگی روی محیط اسکیم میلک تولید کرده که نشان­دهنده تولید آنزیم پروتئاز می­باشد (شکل1). سویه BYK27 به لحاظ مورفولوژیکی، فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی تعیین ویژگی شد که نتایج آن در جدول 1 آمده است. برای شناسایی دقیق این سویه ژن 16S rRNA توالی­یابی شد که 100 درصد یکسانی با Chryseobacterium indologenes داشته و با دیگر گونه­ها مانند C. arthrosphaerae و C. ginsengisoli 98 درصد شباهت دارد. توالی ژن 16S rRNA سویه C. indologenes BYK27 در بانک ژنی Gene bank  تحت عدد دسترسی KM878674 ثبت شد.

بررسی تولید پروتئاز در طی زمان: برای به دست آوردن زمان لازم برای رسیدن به میزان حداکثر تولید آنزیم پروتئاز توسط باکتری رسم منحنی تولید لازم است. در شکل 2 منحنی تولید باکتری طی 96 ساعت آورده شده است. بر این اساس باکتری از زمان تلقیح (ساعت صفر) به مدت 48 ساعت روند صعودی در میزان تولید پروتئاز خود داشت. طبق نتایج حاصل از پنجمین برداشت از محیط کشت در 48 امین ساعت از دوره رشد، میزان جذب سوسپانسون باکتریایی در طول موج nm 280 به بالاترین میزان خود رسید. فعالیت آنزیم خام در این مرحله (U/ml) 370 بود.

 

شکل 1- هاله شفاف پیرامون سویه BYK27 حاصل از فعالیت پروتئولیتیک در محیط اسکیم میلک آگار

جدول1- ویژگیهای بیوشیمیایی و مورفولوژیکی

نتایج

تستهای بیوشیمیایی

-

رنگ آمیزی گرم

+

کاتالاز 

+

اکسیداز 

+

تخمیر گلوکز 

-

تولید SH2 

-

حرکت 

-

هیدرولیز ژلاتین 

+

هیدرولیز نشاسته

+

هیدرولیز کازئین 

میله ای

شکل باکتری 

زرد متمایل به نارنجی

رنگدانه 

جداسازی پروتئاز: سوپ رویی محیط کشت سانتریفیوژ شده، حاوی آنزیم خام بوده که با استفاده از نمک آمونیوم سولفات رسوب­گذاری می­شود. سپس با دیالیز در بافر تریس mM­30 در 5/7 pH و پس از آن با عبور از ستون کروماتوگرافی Q-سفاروز جداسازی صورت گرفت. محلول دیالیز شده با سرعت ml/min­2 بر روی ستون ریخته شد. ستون کروماتوگرافی با بافرTris-HCl  35 میلی مولار با 8/7 pH به تعادل رسیده بود. ستون دارای بار مثبت است پس ابتدا پروتئینهای متصل نشده جمع­آوری شدند. با اعمال شیب غلظت نمکی 1 مولار (0-100 درصد) پروتئینهای متصل شده که بار منفی داشتند جدا شدند. از فرکشنهای 2 میلی­لیتری در طول موج  nm280 جذب گرفته شد و فرکشنهای حاوی پروتئین مشخص شدند. 40 فرکشن جمع­آوری شد که 12 عدد از آنها حاوی پروتئین بودند (شکل 3). از فرکشنهای حاوی پروتئین، فعالیت آنزیمی گرفته شد. فعالیت پروتئولیتیکی آنزیم با تکنیک زایموگرافی نیز بررسی شد (32).

ویژگیهای آنزیم پروتئاز: تأثیر دما بر فعالیت و پایداری پروتئاز: آنزیمها به طور عمده ماهیت پروتئینی دارند و درجه حرارت روی عملکرد و ساختار آنها مؤثر است. جهت تعیین درجه حرارت مناسب برای عملکرد آنزیم، محلول واکنش در دماهای مختلف از 90-20 درجه قرار گرفته و میزان فعالیت آنزیم اندازه­گیری شد. دمای بهینه برای فعالیت پروتئاز سویه BYK27، 40 درجه سانتی گراد بود (شکل 4) و در دماهای 20، 50، 70 و 90 درجه دارای 2/0±73 درصد، 1/0±84 درصد، 2/0±52 درصد و 3/0±26 درصد فعالیت پروتئازی می­باشد.

همان طور که پیشتر ذکر شد میزان حرارت روی ساختار آنزیمها اثر دارند و ممکن است در اثر حرارت ساختمان پروتئینی آنزیم به هم ریخته و کارایی­اش را از دست بدهد. برای بررسی میزان پایداری آنزیم در برابر حرارت آنزیم به مدت 30 دقیقه در دماهای مختلف از 90-20 درجه قرار گرفته و فعالیت باقیمانده آنزیم سنجیده شد (9 و 10). پروتئاز BYK27 در دمای 40 درجه سانتی گراد بیشترین مقاومت حرارتی را نشان داد (شکل 5). در دمای 50 درجه 2/0±73 درصد از فعالیت اولیه خود را حفظ کرد و در دماهای بالاتر از 70 درجه بیش از 3/0±50 درصد از پایداری خود را از دست داد.

 

شکل 2- منحنی زمان بهینه تولید آنزیم توسط باکتری


 

شکل 3- منحنی کروماتوگرام حاصل از بارگذاری محتویات کیسه دیالیز روی ستون Q-سفاروز


 

شکل 4- دمای بهینه برای فعالیت آنزیم

 

شکل 5- دمای بهینه برای پایداری آنزیم

تأثیر pH بر فعالیت و پایداری پروتئاز: برای بررسی تأثیر pH روی فعالیت پروتئازی، این آنزیم به همراه سوبسترا به مدت 20 دقیقه در دمای 37 درجه در معرض pHهای مختلف در محدوده 11-3 قرار گرفت و میزان فعالیت آن سنجیده شد. پروتئاز BYK27  در محدوده 9-7 pH فعالیت داشته و pH بهینه برای فعالیت آن 8 بود (شکل 6). فعالیت آنزیم در محدوده pH اسیدی 3 و 4 به میزان 3/0±52 درصد و 2/0±46 درصد و در گستره pH>9  بیش از 3/0±20 درصد کاهش یافت. برای سنجش میزان پایداری آنزیم در pHهای مختلف، فعالیت باقیمانده آنزیمی را که در معرض pHهای مختلف به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق قرار گرفته، اندازه­گیری شد. پایداری آنزیم مورد آزمایش در گستره 9-8 بوده و در pHهای 10 و 11 به ترتیب فعالیت باقی­مانده آنزیم به میزان 3/0±18 درصد و 2/0±35 درصد کم شد. در محدوده pH اسیدی 3 و 4 نیز پایداری آنزیم پروتئاز به میزان 4/0±56 درصد و 3/0±45 درصد کاهش یافت (شکل 7).

تأثیر یونهای فلزی بر فعالیت و پایداری پروتئاز: تأثیر یونهای فلزی در غلظتmM  10روی فعالیت آنزیم پروتئاز BYK27 در 8 pH و دمای 40 درجه سانتی گراد در مقایسه با شاهد بدون محلول یونی بررسی شد. بر اساس نتایج حاصل، یون K+ دارای بیشترین اثر محرک بر روی فعالیت آنزیم با افزایش 3/0±58 درصد بود. یونهای Ca2+ وCo2+ نیز سبب افزایش 1/0±35 درصد و 2/0±11 درصد فعالیت آن شدند. این در حالی است که یونهای Na+ و Cu2+  اثر بازدارندگی به میزان 2/0±12 درصد و 4/0±18 درصد داشته و یون Zn2+  به میزان 2/0±30 درصد کاهنده فعالیت آنزیم بود (جدول 2). Ca2+ متالوآنزیمها را در برابر تخریب حرارتی حفظ کرده، ساختمان سوم آنزیم را پایدار کرده و از آن در برابر اتوپروتئولیز محافظت می­کند. یونهای Ca2+ و Zn2+ القاء کننده و بازدارنده هستند (32).

جدول 2- تأثیر یونهای فلزی بر روی فعالیت و پایداری آنزیم

یونهای فلزی 

فعالیت 

پایداری 

No Ion

100

100

NaCl

88.24±0.2

114.29±0.3

KCl

158.82±0.3

147.62±0.4

MnSO4

70.59±0.3

85.71±0.1

MgSO4

76.47±0.5

95.24±0.3

ZnSO4

70.59±0.2

80.95±0.5

CaCl2

135.29±0.1

119.05±0.4

CuSO4

82.35±0.4

90.48±0.3

CoCl2

111.76±0.2

95.24±0.2

FeSO4

94.12±0.3

119.05±0.2

 

 

شکل 6- pH بهینه برای فعالیت آنزیم

 

شکل 7- pH بهینه برای پایداری آنزیم

میزان پایداری آنزیم در برابر یونهای مختلف از طریق مجاورت آنزیم با محلولهای یونی به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق و اندازه­گیری میزان فعالیت باقی مانده در مقایسه با شاهد فاقد محلول یونی به دست آمد (9). یون K+ به میزان 4/0±47 درصد باعث افزایش پایداری شد. یونهایFe2+ و Na+بیش از 10 درصد پایداری آنزیم را افزایش دادند، در حالی که یون Zn2+ با کاهش 5/0±20 درصدی فعالیت، دارای بیشترین اثر بازدارندگی بود (جدول 2).

تأثیر ترکیبات مختلف بر فعالیت و پایداری پروتئاز: ترکیبات مختلف مانند بازدارنده­ها سبب تغییراتی در میزان فعالیت آنزیم پروتئاز می­شوند که گاهی اثر افزآینده و گاهی اثر کاهنده دارند. برای بررسی این اثر، آنزیم در طول مدت زمان واکنش با سوبسترا در معرض انواع مختلف ترکیبات قرار گرفته و میزان اثر این مواد در مقایسه با شاهدی که بدون محلول بازدارنده یا ترکیب دیگری است سنجیده شد. از میان انواع ترکیباتی که مورد آزمایش قرار گرفت تریتون X-100 به میزان 2/0±5 درصد سبب افزایش فعالیت آنزیم شد. H2O2 به میزان 3/0±6 درصد از فعالیت آنزیم را کاهش داد و دیگر ترکیبات مثل SDS و EDTA باعث کاهش بیش از 4/0±55 درصد از میزان فعالیت آنزیم گردیدند (شکل 8). میزان پایداری آنزیم پروتئاز در برابر انواع ترکیبات باید سنجیده شود زیرا گاهی این مواد سبب تغییر ساختار آنزیم می­گردند. بدین منظور ابتدا آنزیم به مدت 30 دقیقه در مجاورت ترکیبات مختلف در دمای اتاق قرار گرفته و سپس فعالیت باقیمانده در مقایسه با شاهد اندازه­گیری شد. نمونه شاهد این آزمایش فاقد ماده بازدارنده یا ترکیب دیگری بود. در رابطه با آنزیم مورد آزمایش تریتون X-100 به میزان جزیی 2/0±8 درصد پایداری را افزایش دادند. H2O2 به میزان 3/0±9 درصد از پایداری آنزیم کاسته و SDS باعث کاهش 5/0±25 درصد از پایداری آنزیم شد. EDTA تا 3/0±50 درصد سبب کاهش پایداری آنزیم شد (شکل 8).

تأثیر شوری بر فعالیت و پایداری پروتئاز: برای بررسی اثر شوری روی فعالیت آنزیم باکتریایی محلولهای نمکی با غلظتهای مختلف از 25-0 درصد در مجاورت آنزیم در حال واکنش قرار گرفته و تأثیر آن روی فعالیت آنزیم سنجیده شد. در غلظت 1 درصد نمک آنزیم 100 درصد فعالیت خود را دارا بود. در غلظتهای 3، 5 و 10 درصد ،کاهش فعالیت آنزیم از 2/0±14 درصد تا 2/0±48 درصد مشخص شد (شکل 9). میزان پایداری و مقاومت آنزیم در برابر نمک مهم است. برای سنجش میزان پایداری، آنزیم به مدت 30 دقیقه در معرض محلولهای نمکی با غلظتهای مختلف قرار گرفته و فعالیت باقی مانده آن در مقایسه با شاهد که فاقد محلول نمکی است سنجیده شد. از میان غلظتهای مختلف مورد آزمایش، غلظتهای 20 و 25 درصد نمک موجب کاهش 3/0±45 درصد پایداری آنزیم شدند و در غلظت 1 درصد نمک، آنزیم 1/0±90 درصد از فعالیت اولیه خود را حفظ کرد (شکل 10).

 

شکل 8- تأثیر ترکیبات مختلف بر روی فعالیت و پایداری آنزیم

 

 

شکل 9- تأثیر غلظتهای مختلف نمک روی فعالیت آنزیم

 

 

شکل 10- تأثیر غلظتهای مختلف نمک روی پایداری آنزیم

 

تأثیر شوینده­های تجاری بر فعالیت و پایداری پروتئاز: به منظور کاربرد آنزیم پروتئاز در انواع شوینده­ها و پودرهای تجاری باید میزان فعالیت آنها در حضور عوامل شوینده بررسی شود. بدین منظور آنزیم در طول مدت زمان واکنش در مجاورت انواع مختلف پودرهای لباسشویی تجاری با غلظت1 درصد قرار گرفت. پودر تاژ سبب افزایش 2/0±15 درصد میزان فعالیت آنزیم گشت و در حضور پودر شوما آنزیم کاهش 3/0±37 درصد فعالیت را از خود نشان داد (شکل 11). پودرهای تجاری به سبب عوامل سفیدکننده، اکسید­کننده ممکن است سبب تغییر در میزان پایداری آنزیم شوند. برای سنجش میزان پایداری، آنزیم به مدت 30 دقیقه در مجاورت انواع پودرهای تجاری با غلظت 1 درصد در دمای اتاق قرار گرفته و سپس میزان فعالیت باقی مانده در مقایسه با شاهد بدون محلول حاوی شوینده سنجیده شد. از میان انواع مختلف پودرهای مورد آزمایش پودر تاژ سبب افزایش 1/0±4 درصد میزان پایداری آنزیم شد و انواع دیگر پودر مانند برف و دریا سبب کاهش به ترتیب 2/0±2 درصد و 2/0±10 درصد پایداری شدند، در حالی که پودر شوما باعث کاهش 2/0±48 درصد پایداری آنزیم شد (شکل 12).

 

شکل 11- تأثیر شوینده های تجاری مختلف روی فعالیت آنزیم

 

شکل 12- تأثیر شوینده­های تجاری مختلف روی پایداری آنزیم

بحث

نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که دمای بهینه فعالیت این آنزیم 40 درجه سانتی گراد می­باشد که با نتایج آنامالای و همکاران در مورد پروتئاز تولیدی توسط باکتری Bacillus firmus CAS7 مطابقت دارد (7). آبیدی و همکاران در سال 2011 دمای 50 درجه را به عنوان دمای بهینه برای آنزیم باکتریBotrytis cinerea  که مقاوم به گرما است، ارائه دادند (3). آنزیم پروتئاز باکتریهای Bacillus koreensis BK-P21A  که یک باکتری گرمادوست است وPseudomonas aeruginosa MCMB-327  به ترتیب در دماهای 60 و 35 درجه سانتی گراد بیشترین فعالیت را داشتند (6 و 43). آنزیم پروتئاز باکتریL99 Chryseobacterium در دمای 40 درجه و Chryseobacterium sp. Kr6 در دمای 50 درجه بیشترین فعالیت را دارا بودند (27، 28، 29، 30، 31 و 32). در مورد باکتریهای از همین جنس چادهاری و همکاران در سال 2013 نشان دادند که آنزیم باکتریChryseobacterium gleum  تا دمای 50 درجه پایدار است (30). در مورد پروتئاز باکتری Chryseobacterium L99 دمای 60 درجه به عنوان حد پایداری توسط ال وی و همکاران در سال 2010 گزارش شد (27).

با توجه به pH بهینه برای فعالیت و پایداری پروتئاز مورد پژوهش می­توان گفت که این آنزیم یک پروتئاز خنثی دوست است. در مورد فعالیت بهینه پروتئاز باکتری Bacillus firmus CAS7، 9pH توسط آنالامای و همکاران در سال 2014 گزارش شد (7). زامبر و همکاران در سال 2011، pH بهینه برای فعالیت پروتئاز  Pseudomonas aeruginosa MCM B-327 را، 8 گزارش کردند (43). pH بهینه برای فعالیت پروتئازی باکتریهای Chryseobacterium taeanense TKU001 وChryseobacterium indologenes TKU014 به ترتیب 8-7 و 10-7 گزارش شد (41 و 42). برای پروتئاز باکتریایی Botrutis cinerea  و Pseudomonas aeruginosa محدوده پایداری 9-7 pH  گزارش شده است (3 و 43). چادهاری و همکاران در سال 2013 محدوده pH پایدار برای پروتئاز باکتری Chryseobacterium gleum را 10-6 ارائه دادند (30).

یونها روی ساختار و متعاقبا فعالیت آنزیمها اثر دارند. یون K+ فعالیت این آنزیم را افزایش می­دهد. بررسیهای انجام شده توسط چادهاری و همکاران در سال 2013 روی Chryseobacterium gleum نشان داد که یونهای Fe2+ و Fe3+ بیشترین اثر افزاینده و یون­Cu2+ دارای بیشترین اثر بازدارنده روی پروتئاز هستند (30). در مورد پروتئاز باکتریPseudomonas stutzeri  گزارشات چارتورودی و همکاران در سال 2014 حاکی از این است که یون Mg2+ تا 39 درصد باعث تحریک و یون Cu2+ تا 89 درصد سبب بازدارندگی می­شود (11). همچنین فعالیت پروتئاز تولید شده توسط Chryseobacterium L99 با یونهای K+ و Zn2+ افزایش یافته و با یون Ag+ از فعالیت آن به میزان زیادی کاسته می­شود (27). یون K+ باعث افزایش پایداری این آنزیم نیز شد. تحقیقات صورت گرفته توسط سیناه و کاره در سال 2013 روی Bacillus EMB9 نشان داد که یونهای Ca2+, Na+ و K+ باعث افزیش پایداری آنزیم می­شوند (35). بنا به گزارشات ویجایاراگاوان و همکاران در سال 2013 یون Ca2+ در Bacillus cereus باعث افزایش پایداری می­شود که به علت نقش آن در ساختار مولکولی آنزیم است (40). وانگ و همکاران در سال 2008 گزارش کردند که یونهای Cu2+ و Fe2+  سبب مهار کامل پروتئاز باکتری Chryseobacterium taeanense TKU001 می­شود (42). طبق تحقیقات رایفل و همکاران در سال 2007 یون Ca2+ به میزان زیادی باعث افزایش پایداری پروتئاز Chryseobacterium sp.Kr6 شد (32).

EDTA یک عامل کلاته کننده فلزات است و به عنوان مهارکننده متالوآنزیمها مطرح می­شود. در این پژوهش EDTA نیمی از فعالیت آنزیم را کاهش داده است که احتمالاً شاهدی بر متالوآنزیم بودن پروتئاز مورد مطالعه است. از میان تحقیقات انجام شده توسط آبیدی و همکاران در سال 2011 این نتایج حاصل آمده که EDTA سبب کاهش 5 درصد فعالیت آنزیم پروتئاز باکتری Botrytis cinerea می­شود (3). همچنین زامبر و همکاران در سال 2011 گزارش دادند که SDS و EDTA روی پروتئاز باکتریPseudomonas aeruginosa به ترتیب 45 درصد و 25 درصد اثر بازدارندگی دارند (43). طبق مطالعات چادهاری و همکاران در سال 2013 مشخص گردید که EDTA بیشترین اثر مهاری را روی فعالیت پروتئازی باکتری Chryseobacterium gleum دارد و در حضور β-مرکاپتواتانول فعالیت آنزیم افزایش می­یابد (30). در مورد پروتئاز باکتری­Chryseobacterium L99 EDTA در غلظت بالای mM 10 سبب کاهش فعالیت آنزیمی شدند (27). H2O2 باعث افزایش پایداری آنزیم شد، در حالی که EDTA مقاومت پروتئاز را کاهش داد. در سال 2013 آنبو و همکاران نشان دادند که SDS, H2O2 و تریتون X-100 روی پایداری پروتئازBacillus koreensis BK-P21A  اثر منفی دارد (6). هدار و همکاران در سال 2010 گزارش کردند که H2O2 تا 23 درصد باعث کاهش پایداری آنزیم حاصل از باکتری Bacillus mojavensis می­شود (15). طبق تحقیقات صورت گرفته توسط چادهاری و همکاران در سال 2013، SDS سبب کاهش 50 درصد فعالیت باقیمانده پروتئاز باکتری Chryseobacterium gleum شده است (30). در سال 2007 رایفل و همکاران در مورد پروتئاز Chryseobacterium sp.Kr6 گزارش کردند که EDTA بیش از 80 درصد تأثیر منفی بر روی پایداری آنزیم دارد (32).

آنزیم پروتئاز مورد مطالعه در این پژوهش در غلظتهای نمک بالاتر از 1 درصد از میزان فعالیت و پایداریش کاسته شد. در مورد پروتئاز تولید شده توسط Bacillus sp. جاین و همکاران در سال 2012 نشان دادند که غلظت بهینه نمک 1 درصد بوده اما در غلظتهای 9 درصد و 24 درصد، آنزیم به میزان 93 درصد و 50 درصد فعالیت دارد (20). طبق تحقیقات جوشی و همکاران در سال 2007 پروتئاز تولیدی cereus MTCC6840 B. در غلظت 5 درصد نمک دارای بیشترین فعالیت بوده و در غلظتهای بیش از 10 درصد فعالیت آن تا 40 درصد کاهش می یابد (23). آنزیم حاصل از B. clausii I-52 در غلظتهای 10-0 درصد دارای فعالیت بهینه می­باشد (22). بدویی دلفارد و کرمی در سال 2013 گزارش کردند که پروتئاز باکتری Bacillus sp.JER02 در غلظت mM 8 نمک دارای فعالیت بهینه است (9). آنامالای و همکاران در سال 2014 در مورد آنزیم باکتریایی Bacillus firmus CAS7 نشان دادند که این آنزیم تا غلظت 30 درصد نمک دارای مقاومت است (7). آنزیم باکتری B. cereus SIU1 در غلظت 2-0 درصد دارای 100 درصد پایداری است و در غلظت 10 درصد میزان پایداری آن 98 درصد کاهش می­یابد (36). جاین و همکاران در سال 2012 گزارش کردند که پروتئاز تولید شده توسط Bacillus sp. در غلظت 15 درصد دارای بیشترین پایداری است (20). در یک تحقیق 22 سویه نمک دوست نسبی و 33 سویه تحمل کننده نمک مولد پروتئاز از تالاب پرشور اینچه برون توسط زرپرور و همکاران جداسازی و شناسایی شده است (2). باباولیان و همکاران نیز 20 سویه تولید کننده پروتئاز نمک دوست از دریاچه نمک آران و بیدگل جداسازسی و شناسایی نموده اند (1).

پروتئاز حاصل از سویه BYK27 در حضور برخی پودرهای تجاری فعالیت و پایداری اش افزایش پیدا می کند. هدار و همکاران در سال 2010 ثابت کردند که آنزیم پروتئاز باکتری Bacillus mojavensis A21 در حضور پودرهای Axion و Ariel، 100 درصد فعالیت دارد و در حضور پودرهای Dixan، Nadhif و New Det 85 ، 89 و 82 درصد از فعالیت آنزیم باقی می­ماند. این در حالی است که پودرهای Axion و Ariel موجب کاهش جزیی 4 و 3 درصد پایداری آنزیم پروتئاز این باکتری شده و پودر Nadhif کاهش 25 درصد پایداری آنزیم را به همراه داشته است (15). آدینارایانا و همکاران در سال 2003  گزارش دادند که آنزیم حاصل از باکتری subtilis PE-11 B. در حضور شوینده­های تجاری در غلظت 7/0 درصد به میزان 96-87 درصد پایداری دارد (5)­. طبق گزارشات سینا و همکاران در سال 2011  پروتئاز تولیدی B. cereus SIU1 در مجاورت پودرهای شوینده Rin، Surf و Ariel در غلظت 1/0 درصد بیش از 90 درصد پایداری دارد (36).

نتیجه­گیری کلی

در این مطالعه سویه باکتریایی مولد آنزیم پروتئاز شناسایی شد که بر اساس ویژگیهای بیوشیمیایی و مولکولی مشخص شد که به جنس Chryseobacterium تعلق دارد. دما وpH  بهینه برای فعالیت آنزیم پروتئاز حاصله 40 درجه و 8 pH بود. محدوده مقاومت حرارتی و pH این آنزیم به ترتیب 40 درجه و 9-8 pH   به دست آمد. یون فلزی K+ باعث افزایش میزان فعالیت و پایداری آنزیم پروتئاز گردید. از میان ترکیبات مورد آزمایش تریتون X-100 سبب افزایش میزان مقاومت و پایداری آنزیم شد. غلظتهای بیش از 1 درصد از محلول نمک NaCl سبب کاهش پایداری و فعالیت پروتئاز شد. در حضور شوینده تاژ فعالیت و مقاومت این آنزیم افزایش یافت. این ویژگیها قابلیت استفاده از این آنزیم را در بیوتکنولوژی نشان می­دهد. سایر آزمایشات برای بررسی قابلیتهای بیوتکنولوژی این آنزیم از جمله میزان تجزیه لکه­های خونی روی پارچه و لباس در حال انجام است.

تشکر و قدردانی:

نویسندگان مقاله از معاونت پژوهشی دانشگاه شهید باهنر کرمان تشکر و قدردانی می کنند.

1- باباولیان، ح.،  آموزگار، م.ع.،  پوربابایی، ا.ع.، 1388. شناسایی و تعیین خصوصیات باکتریهای نمک دوست تولید کننده آنزیمهای هیدرولتیک جدا شده از دریاچه نمک آران و بیدگل، مجله پژوهش­های سلولی و مولکولی (زیست شناسی ایران) جلد 22، شماره 1، 24-46.

2- زرپرور، پ.، آموزگار، م.ع.، فلاحیان، م.ع.، 1393. بررسی تنوع زیستی باکتریهای نمک دوست نسبی و تحمل کننده نمک قابل کشت درتالاب پرشور اینچه برون، مجله پژوهش­های سلولی و مولکولی (زیست شناسی ایران). جلد 27، شماره 1، 56-44.

 

3- Abidi, F., Chobert, J., Haertle, Th., and Marzouki, M., 2011. “Purification and biochemical characterization of stable alkaline protease Prot-2 from Botrytis cinerea”. Process Biochemistry, 46, 2301-2310.

4- Abraham, J., Gea, T., and Sanchez, A., 2014. “Substitution of chemical dehairing by proteases from solid-state fermentation of hair waste”. Journal of Cleaner Production, 74, 191-198.

5- Adinarayana, K., Ellaiah, P., and Prasad. DS., 2003. “Purification and partial characterization of thermostable serine alkaline protease from a newly isolated Bacillus subtilis PE-11”. AAPS PharmSciTech, 4, 440-448.

6- Anbu, P., 2013. “Characterization of solvent stable extracellular protease from Bacillus koreensis (BK-P21A)”. International journal of Biological Macromolecules, 56, 162-168.

7- Annamalai, N., Veeramuthu Rajeswari, M., Kumar Sahu, S., and Balasubramanian, Th., 2014. “Purification and characterization of solvent stable, alkaline protease from Bacillus firmus CAS 7 by microbial conversion of marine wastes and molecular mechanism underlying solvent stability”. Process Biochemistry, 49, 1012-1019.

 8- Asker, M., Mahmoud, M., Shebwy, Kh., and Abd el Aziz, M., 2013. “Purification and characterization of two thermostable protease fractions from Bacillus megaterium”. Journal of Genetic Engineering and Biotechnology, 11, 103-109.

9- Badoei-Dalfard, A., and Karami, Z., 2013. “Screening and isolation of an organic solvent tolerant-protease from Bacillus sp. JER02: Activity optimization by response surface methodology”. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 89, 15-23.

10- Badoei Dalfard, A., Khajeh, Kh., Soudi, M.R., Naderi-Manesh, H., Ranjbar, B., and Hassan Sajedi, R., 2006. “Isolation and biochemical characterization of Laccase and Tyrosinase activities in a novel melanogenic soil bacterium”. Enzyme and Microbial Technology, 39, 1409-1416.

11- Chaturvedi, V., Bhange, Kh., Bhatt, R., and Verma, P., 2014. “Production of keratinases using chiken feather as substrate by a novel multifunctional stain of Pseudomonas stutzeri and its dehairing application”. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 3, 167-174.

12- George, N., Singh Chauhan, P., Kumar, V., Puri, N., and Gupta, N., 2014. “Approach to ecofriendly leather: characterization and application of an alkaline protease for chemical free dehairing of skins and hides at pilot scale”. Journal of Cleaner Production, 79, 249-257.

13- Ghafoor, A., and Hasnain, Sh., 2010. “Purification and Characterization of an Extracellular Protease from Bacillus subtilis EAG-2 Strain Isolated from Ornamental Plant Nursery”. Polish Journal of Microbiology, 59, 107-112.

 14- Grzonka, Z., Janlowska, E., Kasprzykowsk, F., Kasprzykowsk, R., Lankiewicz, L., Wiczk, W., Wieczerzek, E., Ciarkowki, J., Drabik, P., Janowski, R., Kozak, M., Jaskolski, M., and Grubb, A., 2001. “Structural studies of cysteine proteases and their inhibitors”. Acta Biochimia Polonica, 48, 2000-2020.

15- Haddar, A., Sellami-Kamoun, A., Fakhfakh-Zouari, N., Hmidet, N., and Nasri, M., 2010. “Characterization of detergent stable and feather degrading serine proteases from Bacillus mojavensis A21”. Biochemical Engineering Journal, 51, 53-63.

16- Hajji, M., Kanoun, S., Nasri, M., and Gharsallah, N., 2007. “Purification and characterization of an alkaline serine-protease produced by a new isolated Aspergillus clavatus ES1”. Process Biochemistry, 42, 791-797.

17- Hamada, Sh., Suzuki, K., Aoki, N., and Suzuki, Y., 2013. “Improvements in the qualities of gluten-free bread after using a protease obtained from Aspergillus oryzae”. Journal of Cereal Science, 57, 91-97.

18- Hantsis-Zacharov, E., and Halpern, M., 2007. “Chryseobacterium haifense sp. nov., a psychrotolerant bacterium isolated from raw milk”. International Journal of systematic and Evolutionary Microbiology, 57, 2344-2348.

19- Hee Lee, S., Wook Chung, Ch., Joon Yu, Y., and Ha Rhee, Y., 2009. “Effect of alkaline protease-producing Exiguobacterium sp. YS1 inoculation on the solubilization and bacterial community of waste activated sludge”. Bioresource Technology, 100, 4596-4603.

20- Jain, D., Pancha, I., K.Mishra, S., Shrivastav, A., and Mishra, S., 2012. “Purification and characterization of haloalkaline thermoactive, solvent stable and SDS-induced protease from Bacillus sp.: A potential additive for laundry detergent”. Bioresource Technology, 115, 228-236.

21- Jellouli, K., Ghorbel-Bellaaj, O., Ben Ayed, H., Manni, L., Agrebi, R., and Nasri, M., 2011. “Alkaline protease from Bacillus licheniformis MP1: Purification, characterization and potential application as a detergent additive and for shrimp waste deproteinization”. Process Biochemistry, 46, 1248-1256.

22- Joo, H.S., and Chang, CS., 2005. “Oxidant and SDS-stable alkaline protease from a halo-tolerant Bacillus clausii I-52: enhanced production and simple purification”. Journal of Applied Microbiology, 98, 491–497.

23- Joshi, GK., Kumar, S., and Sharma, V., 2007. “Production of moderately halotolerant, SDS stable alkaline protease from Bacillus cereus MTCC 6840 isolated from lake Nainital, Uttaranchal state, India”. Brazilian Journal of Microbiology, 38, 773–779.

24- Joshi, S., and Satyanarayana, T.,  2013. “Characteristics and applications of a recombinant alkaline serine protease from a novel bacterium Bacillus lehensis”. Bioresource Technology, 131, 76-85.

25- Ke, Q., Chen, A., Minoda, M., and Yoshida, H., 2013. “Safety evaluation of a thermolysin enzyme produced from Geobacillus stearothermophilus”, Food and Chemical Toxicology, 59, 541-548.

26- Lin, Y. T., Jeng, Y. Y., Lin, M. L., Yu, K. W., Wang, F. D., and Liu, Ch. Y., 2010. “Clinical and microbiological characteristics of Chryseobacterium indologenes bacteria”, Journal of Microbiology, Immunology and Infection, 43, 496-505.

27- Lv, L-X., S, M-H., Li, Y-D., Min, J., Feng, W-H., Guan, W-J., and Li, Y-Q., 2010. “Production, characterization and application of a keratinase from Chryseobacterium l99 sp.nov”. Process Biochemistry, 45, 1236-1244.

28- Maeda, T., Yoshimura, T., Garcia-Contreras, R., and I. Ogawa, H., 2011. “Purification and characterization of a serine protease secreted by Brevibacillus sp.KH3 for reducing waste activated sludge biofilm formation”. Bioresource Technology, 102, 10650-10656.

29- Nabarlatz, D., Vondrysova, J., Jenicek, P., Stuber, F., Font, J., Fortuny, A., Fabregat, A., and Bengoa, Ch., 2012. “Hydrolytic enzymes in activated sludge: Extraction of protease and lipase by stirring and ultrasonication”. Ultrasonics Sonochemistry, 17, 923-931.

30- N.Chaudhari, P., N.Chaudhari, B., and B. Chincholkar, S., 2013. “Iron containing keratinolytic metallo-protease produced by Chryseobacterium gleum”. Process Biochemistry, 48, 144-151.

31- Pawar, R., Zambare, V., Barve, S., and Paratkar, G., 2009. “Application of Protease Isolated from Bacillus sp. 158 in Enzymatic Cleaning of Contact Lenses”. Biotechnology, 8, 276-280.

32- Riffel, A., Brandelli, A., M.Bellato, C., H.M.F.Souza, G., N.Eberlin, M., and C.A.Tavares, F., 2007. “Purification and characterization of a keratinolytic metalloprotease from Chryseabacterium sp.Kr6”. Journal of Biotechnology, 128, 693-703.

33- Seker, S., Beyenal, H., Ayhan, F., and Tanyolac, A., 1998. “Production of microbial rennin from Mucor miehei in a continuously fed fermenter”. Enzyme and Microbial Technology, 23, 469-474.

34- Shrinivas, D., and Naik, G.R., 2011. “Characterization of alkaline thermostable keratinolytic protease from thermoalkalophilic Bacillus halodurans JB 99 exhibiting dehairing activity”. International Biodeterioration and Biodegradation, 65, 29-35.

35- Sinah, R., and Khare, S.K,. 2013. “Characterization of detergent compatible protease of a halophilic Bacillus sp. EMB9: Different role of metal ion in stability and activity”. Bioresource Technology, 145, 357-361.

36- Sinagh, S., Sinagh, S., Tripathi, V., and Grag, S., 2012. “Purification, Characterization and secondary structure elucidation of a detergent stable, halotolerant, thermoalkaline protease from Bacillus cereus SIU1”. Process Biochemistry, 47, 1479-1487.

37- Soares de Castro, R. J., and Harumi Sato, H., 2013. “Synergistic effects of agroindustrial wastes on simuitaneous production of protease and α-amylase under solid state fermentation using a simplex centroid mixture design”. Industrial Crops and Products, 49, 813-821.

38- Suganthi, A., Mageswari, S., Karthikeyan, M., Anbalagan, M., Sivakumar, A., and Gothandam, K.M., 2013. “Screening and optimization of protease production from a halotolerant Bacillus licheniformis isolated from saltren sediments”. Journal of Genetic Engineering and Biotechnology, 11, pp. 47-52.

39- Sundararajan, Sh., Narasimhan Kannan, Ch., and Chittibabu, Sh., 2011. “Alkaline protease from Bacillus sereus VITSN04: Potential application as a dehairing agent”. Journal of Bioscience and Bioengineering, 111, 128-133.

40- Vijayaraghavan, P., Lazarus, S., and Prakash Vincent, S.G., 2014. “De-hairing protease production by an isolated Bacillus cereus strain AT under solid-state fermentation using cow dung: Biosynthesis and properties”. Saudi Journal of Biological Sciences, 21, 27-34.

41- Wang, S., Hsu, W., Liang, T., Yen, Y., and Wang, Ch., 2008. “Purification and characterization of three novel keratinolytic metalloprpteases produced by Chryseobacterium indologenes TKU014 in a shrimp shell powder medium”. Bioresource Technology, 99, 5679-5686.

42- Wang, S., Yang, Ch., Liang, T., and Yen, Y., 2008. “Optimization of conditions for protease production by Chryseobacterium taeanense TKU001”. Bioresource Technology, 99, 3700-3707.

43- Zambare, V., Nilegaonkar, S., and Kanekar, P., 2011. “A novel extracellular protease from Pseudomonas aeruginosa MCM B-327: enzyme production and its partial characterization”. New Biotechnology, 28,173-181.