نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 استاد دانشگاه شهرکرد

2 دانشگاه شهرکرد

چکیده

آنزیم پپسین خوک A (EC 3.4.23.1) متعلق به خانواده آسپارتیک‌ پروتئاز‌ها است، و به صورت زیموژن که پپسینوژن نام دارد ترشح می شود، فعال‌شدن پپسینوژن در مقادیر pH بین 1 و 4 اتفاق می افتد. پپسین شامل یک صورتبندی دو لوبی با دو رزیدو آسپارتیک کاتالیتیکی(32Asp و215Asp) که در دو طرف جایگاه‌فعال می باشد و ساختار آن غالباً صفحه بتا و رندوم کویل با مارپیچ آلفا محدود می‌باشد. پپسین پیوند‌های پپتیدی بین آمینو‌اسید‌های هیدروفوبیک و ترجیحاً آروماتیک از قبیل تریپتوفان، فنیل‌آلانین و تیروزین را هیدرولیز می‌کند. با توجه به اهمیت آنزیم پپسین به عنوان یک آنزیم صنعتی در صنایع غذایی و کاربردهای نانوذرات در صنعت ما اثر نانوذرات اکسید مس و اکسید روی را بر روی پایداری ساختاری پپسین بررسی کردیم. این مطالعه با استفاده از بافر گلایسین-اسیدکلریدریک (0.1 مولار) با 2=pH و در دامنه دمایی 303 تا 363 درجه کلوین انجام شد. پایداری پپسین در حضور نانوذرات اکسید روی و اکسید آهن تغییر نکرد. قدرت برهم کنش الکتروستاتیک و هیدروژنی بین آنزیم پپسین و نانوذرات اکسیدروی و اکسیدآهن در دگرگون شدن پپسین کم بوده است.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Structural study on pepsin stability in the presence of ZnO and Fe3O4 nanoparticles

نویسندگان [English]

  • behzad shareghi 1
  • kolsoom shahdadnejad 2
  • homa mohamadi 2

1 university of shahrekord

2 university of jiroft

چکیده [English]

Porcine pepsin A (EC 3.4.23.1), belongs to the aspartic protease family, and is secreted as a zymogen called pepsinogen. Pepsinogen activation occurs at pH values between 1 and 4. Pepsin consists of a bilobal conformation with two catalytic aspartic residues (Asp32 and Asp215) on either side of the active site, The structure of porcine pepsin is predominantly β-strand and random coil with limited α-helix. Porcine Pepsin is most efficient cleaving peptide bonds between hydrophobic and preferably aromatic amino acids such as phenylalanine, tryptophan, and tyrosine. Because the importance of pepsin enzyme as an industrial enzyme in the food industry and nano particles functions in industry, we investigated Structural stability of pepsin in presence and absence of ZnO and Fe3O4 nanoparticles. This study were performed using glycin-Hcl(0.1M) buffer at pH=2 and temperature range (303 to 363) K. porcine Pepsin stability Was not changed in the presence of Zno and Fe3O4 nanoparticles. Strength of the electrostatic and hydrogen interactions between pepsin enzyme and ZnO , Fe3O4 nanoparticles Were a low level in denaturation of pepsin.

کلیدواژه‌ها [English]

  • pepsin
  • Structural stability
  • ZnO and Fe3O4 nanoparticles
  • denaturation

مطالعه پایداری ساختاری آنزیم پپسین در حضور نانوذرات اکسیدروی و اکسیدآهن

بهزاد شارقی*، کلثوم شهدادنژاد و هما محمدی

شهرکرد، دانشگاه شهرکرد، دانشکده علوم پایه، گروه بیوشیمی

تاریخ دریافت: 21/8/93                تاریخ پذیرش: 24/12/93 

چکیده

آنزیم پپسین خوک  A (EC 3.4.23.1) متعلق به خانواده آسپارتیک‌ پروتئاز‌ها است، و به صورت زیموژن که پپسینوژن نام دارد ترشح می شود، فعال‌شدن پپسینوژن در مقادیر pH بین 1 و 4 اتفاق می افتد. پپسین شامل یک صورتبندی دو لوبی با دو رزیدو آسپارتیک کاتالیتیکی(32Asp و215Asp) که در دو طرف جایگاه ‌فعال می باشد و ساختار آن غالباً صفحه بتا و رندوم کویل با مارپیچ آلفا محدود می‌باشد. پپسین پیوند‌های پپتیدی بین آمینو‌اسید‌های هیدروفوبیک و ترجیحاً آروماتیک از قبیل تریپتوفان، فنیل‌آلانین و تیروزین را هیدرولیز می‌کند. با توجه به اهمیت آنزیم پپسین به عنوان یک آنزیم صنعتی در صنایع غذایی و کاربردهای نانوذرات در صنعت اثر نانوذرات اکسید مس و اکسید روی را بر روی پایداری ساختاری پپسین بررسی گردید. این مطالعه با استفاده از بافر گلایسین-اسیدکلریدریک (1/0 مولار) با 2=pH و در دامنه دمایی 303 تا 363 درجه کلوین انجام شد. پایداری پپسین در حضور نانوذرات اکسید روی و اکسید آهن تغییر نکرد. قدرت برهمکنش الکتروستاتیک و هیدروژنی بین آنزیم پپسین و نانوذرات اکسیدروی و اکسیدآهن در دگرگون شدن پپسین کم بوده است.

واژه های کلیدی:پپسین، پایداری ساختاری، نانوذرات اکسیدروی و اکسیدآهن، دگرگون شدن

* نویسنده مسئول، تلفن: 09131093764، پست الکترونیکی: b_shareghi@yahoo.com

مقدمه 

 

فناوری نانو یکی از مدرن­ترین فناوریهای روز دنیاست که دارای خصوصیات منحصر­به­فرد و در تمام زمینه­های علم و فناوری کاربرد دارد(10). فناوری نانو در پزشکی از جمله دارورسانی، مواد کاشتنی در بدن، جراحی، وسایل تشخیصی، درمان سرطانها کاربردهای زیادی دارد (15و16). اخیراً از نانو­ذرات مغناطیسی مانند نانوذره اکسید­روی استفاده­های زیادی می شود برای مثال در تصویر­برداری رزونانس مغناطیسی MRI (MagneticResonanceImaging)، افزایش دما (hyperthermia) برای درمان تومور، رساندن دارو و .... کاربرد زیادی دارند. همچنین مشخص شده است که بعضی از نانو­ذرات مغناطیسی مانند نانو­ذره اکسید­آهن، از تشکیل تجمعات آمیلوئیدی(مثلاً آمیلوئید بتای لیزوزیم) جلوگیری می کنند و یا تجمعات تشکیل­شده آمیلوئیدی را از بین می برند و از این طریق در درمان بیماری آلزایمر مؤثر می باشند (4). آنزیم پپسین خوک A(3.4.23.1E )، متعلق به خانواده آسپارتیک ­پروتئاز­ها است. پپسین به صورت زیموژن که پپسینوژن نام دارد ترشح می شود (13). همانند دیگر زیموژنهای آسپارتیک معده، فعال­شدن پپسینوژن در مقادیر pH بین 1 و 4 اتفاق می افتد (8). پپسین شامل یک صورتبندی دو لوبی با دو رزیدو آسپارتیک کاتالیتیکی(32Asp و215Asp) که در دو طرف جایگاه­فعال می­باشد و ساختار آن غالباً صفحه بتا و رندوم کویل با مارپیچ آلفا محدود می‌باشد (14).  پپسین پیوند­های پپتیدی بین آمینو­اسید­های هیدروفوبیک و ترجیحاً آروماتیک از قبیل تریپتوفان، فنیل­آلانین وتیروزین را هیدرولیز می کند (5 و 6). 

مواد دگرگون­کننده پروتئین، سبب از هم گسیختن ساختمان دوم، سوم و چهارم می­شوند بنابراین مواد دگرگون­کننده سبب تخریب تمامی ترتیبهای ساختمان پروتئین به جز ساختمان اولیه شده و فعالیت بیولوژیک آن را از بین می­برند(11). هدف اصلی از مطالعات دگرگون­سازی پروتئینها به دست آوردن اطلاعات اضافی در مورد ساختمان، خواص و عملکرد پروتئینها است. مطالعات غیر طبیعی کردن پروتئینها در محلولهای آبی انجام می­شود و بنابراین در درک رفتار پروتئینها تحت شرایط فیزییولوژیک مفید خواهد بود. فرایند دگرگون­سازی پروتئینها برای مطالعه نیروهای تعیین­کننده ساختمان سوم حائز اهمیت است. استفاده دیگر از مطالعات دگرگون­سازی مطالعه نیرو­های مؤثر و نقش انواع میان­کنش­ها در جایگاه­فعال آنزیم است(7).

با توجه به اهمیت آنزیم پپسین به عنوان یک آنزیم صنعتی در صنایع غذایی از جمله تهیه پنیر، نوشابه و در چاشنیهای غذایی، و همچنین کاربردهای نانوذرات در صنعت، در این تحقیق پایداری دمایی پپسین در حضور نانوذرات اکسید روی و اکسیدآهن مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روشها 

در این مطالعه از  آنزیم پپسین خوک (محصول شرکت سیگما) ، بافر گلایسین-اسیدکلریدریک با 2=pH در غلظت 1/0 مولار و نانوذرات  اکسید­روی(اندازه14-10نانومتر) و اکسید­آهن(اندازه10نانومتر ) (محصولات شرکت سیگما) و از دستگاه اسپکتروفتومتر UV-Vis مدل فارماسیا-4000، جهت اندازه گیری استفاده شده است. 

بررسی پایداری حرارتی آنزیم پپسین در حضور غلظتهای مختلف نانوذره اکسید­روی در دامنه حرارتی 303 تا 363 درجه کلوین: از بافر گلایسین-اسیدکلریدریک با 2pH=  درغلظت 1/0 مولار و غلظتهای مختلف نانوذره اکسید روی( 0 تا 3/6 میکرو­گرم بر میلی­لیتر) استفاده شد. منحنیهای دگرگون سازی در حضور نانوذره اکسید روی در طول موج 280 نانومتر با استفاده از محلولهای پپسین با غلظت 138/0 میلی گرم بر میلی لیتر به دست آمده است.

بررسی پایداری حرارتی آنزیم پپسین در حضور غلظتهای مختلف نانوذره اکسیدآهن در دامنه حرارتی 303 تا 363 درجه کلوین: از بافر گلایسین-اسیدکلریدریک با 2pH=  درغلظت 1/0 مولار و غلظتهای مختلف نانوذره اکسید آهن( 0 تا 7/0میکرو­گرم بر میلی­لیتر) استفاده شد. منحنیهای دگرگون سازی در حضور نانوذره اکسید آهن در طول موج 280 نانومتر با استفاده از محلولهای پپسین با غلظت 138/0 میلی گرم بر میلی لیتر به دست آمده است.

نتایج و بحث

پایداری حرارتی آنزیم پپسین با اندازه­گیری تغییرات انرژی آزاد گیبس و Tmمحاسبه می گردد. برای این هدف با تغییر آنزیم از حالت طبیعی به حالت دگرگون­شده، کسر دگرگون­سازی بصورت زیر محاسبه می­شود:

(1)                     FU=(AN-A)/(AN-AU)

در این رابطه، AN، جذب در حالت طبیعی، A، جذب مشاهده شده و AU، جذب در حالت دگرگون­شده می باشند  Keqیا ثابت تعادل از رابطه زیر بدست می آید:

(2)        Keq=FU/(1-FU)=(AN-A)/(A-AU)

تغییرات انرژی آزاد گیبس نیز از این رابطه محاسبه می­شود:

(3)                   ΔG°=-RTlnKeq=-RTln[FU/(1-FU)]=-RTln[(AN-A)/(A-AU)]

در این رابطه، R، ثابت گاز­ها می باشد و برابر با 314/8 است و T، دما بر حسب کلوین می باشد.

Tmیا دمای ذوب یک آنزیم، دمایی است که در آن  ΔG°برابر با صفر است.

نمودارهای 1 و 2 تغییرات کسر دگرگون­سازی علیه دما در غلظتهای مختلف نانو­ذرات اکسید­روی و اکسیدآهن در 2pH= را نشان می­دهند. همان­طور که در این نمودارها دیده می­شود، با افزایش غلظت نانو­ذرات اکسید­روی و اکسیدآهن، منحنیهای دگرگون­سازی برای آنزیم پپسین تقریباً تغییر پیدا نکرده است یعنی هرچه غلظت نانو­ذرات اکسید­روی و اکسیدآهن افزایش می یابد، آنزیم پپسین تقریباً در همان دما دگرگون می شود.

در نمودارهای 3 و 4 تغییرات ΔG° علیه دما در غلظتهای مختلف نانو­ذرات اکسید­روی و اکسیدآهن در 2pH= مشاهده می­شود. در این نمودارها دیده می­شود که با افزایش غلظت نانو­ذرات اکسید­روی و اکسیدآهن، Tm آنزیم تقریباً تغییر نکرده است و درنتیجه پایداری حرارتی آن تقریباً ثابت مانده است.

 

 

 

نمودار 1- تغییرات)FUکسر دگرگون­سازی)آنزیم پپسین علیه دما در غلظتهای مختلف نانو­ذره اکسید­روی در 2pH= و دامنه حرارتی303 تا 363 درجه کلوین

 

نمودار 2- تغییرات) FUکسر دگرگون­سازی)آنزیم پپسین علیه دما در غلظتهای مختلف نانو­ذره اکسید­آهن در 2pH= و دامنه حرارتی303 تا 363 درجه کلوین

 

 

نمودار 3- تغییرات ΔG°آنزیم پپسین علیه دما در غلظتهای مختلف نانو­ذره اکسید­روی در 2pH= و دامنه حرارتی303 تا 363 درجه کلوین

 

نمودار4- تغییرات ΔG° آنزیم پپسین علیه دما در غلظتهای مختلف نانو­ذره اکسید­آهن در 2pH= و دامنه حرارتی303 تا 363 درجه کلوین

 

 

در طی چند سال اخیر، مشخص شده­است که نانو­مواد کاربرد­های زیادی در صنایع دارند. برای مثال، این نانو­مواد در کرمهای ضد آفتاب به منظور جذب نور UV استفاده می شوند و یا در خمیر دندان و رنگها برای تثبیت رنگ سفید به مدت طولانی، به­کار می روند، تعدادی از آنها نیز در صنعت الکترونیک مورد استفاده قرار می گیرند. علاوه بر این نانو­مواد کاربرد­های زیادی در پزشکی، لوازم آرایشی، وسایل ورزشی، سلولهای سوختی و دیگر صنایع دارند. با این وجود نانو­ذرات به خاطر اندازه کوچکشان از طریق استنشاق، هضم، نفوذ پوستی یا تزریق وارد بدن می شوند و باعث ایجاد آسیب فیزیکی یا القای پاسخ التهابی زیان باری در بدن خواهند شد. در چندین مطالعه نشان داده شده­است که نانو­ذرات می توانند از سد خونی-مغزی عبور کنند و وارد سیستم عصبی مرکزی(CNS) شوند. همچنین استرس اکسیداتیو ایجاد شده از طریق نانو­ذرات باعث از بین رفتن لیپید­ها، کربوهیدرات­ها، پروتئینها و DNA خواهد شد که در این بین، پروکسیداسیون لیپید، بیشترین آسیب را به بدن وارد می کند چون سبب می شود که در غشای سلول تغییراتی ایجاد شود(19و20). از نانوذرات اکسیدروی در زمینه های متعددی از جمله در پوشش رسانای اکسیدی با قابلیت هدایت بالا برای سلولهای خورشیدی، حسگر های گازی، آشکار ساز های نوری ماوراء بنفش،جاذب شیمیایی، کاتالیستهایی برای هیدروژن دار کردن درفاز مایع، کاتالیستهایی برای تخریب نوری به جای نانو ذره های تیتانیوم، ساخت نیمه هادیها، فیلترکننده های اشعه ماوراء بنفش و در زمینه های علوم پزشکی و دارویی به عنوان یکی از پرکاربردترین نانوذرات برای مقابله با عفونتهای بیمارستانی ناشی از باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی استفاده می شود (1).

نانوذرات از جمله اکسید کادمیوم در طراحی حسگرهای زیستی نیز کاربرد دارند، نقش مؤثر نانوذرات در حسگرهای زیستی افزایش سرعت انتقال الکترون بین گونه احیاء واکسایش می باشد (2).

در مطالعه ای که اثر نانو­ذره 2SiO را بر روی آنزیم لیزوزیم بررسی کردند نشان دادند با افزایش غلظت نانو­ذره 2SiO میزان آلفا هلیکس لیزوزیم نسبت به آنزیم طبیعی کمتر می گردد. علاوه بر این با افزایش سایز نانو­ذره 2SiO نیز میزان آلفاهلیکس لیزوزیم کاهش می یابد (18). نانو­ذره 2SiO دارای بار منفی است و از طریق بر همکنش الکترواستاتیک با لیزوزیم واکنش می­دهد و سبب باز شدن تاخوردگی آنزیم می­شود و ساختار دوم لیزوزیم از بین می­رود میزان آلفا هلیکس کم شده ولی پیچه های تصادفی زیادمی­شوند، همچنین محتوای صفحه بتا کمی افزایش می یابد (21). در مطالعه­ای که اثر نانو­ذرات اکسید­روی بر روی پروتئین میوگلوبین بررسی شده، نشان داده شده است که جزء آلفاهلیکس میوگلوبین کاهش می یابد اگرچه حتی در حضور بیشترین غلظت نانو­ذرات اکسید­روی ساختار مارپیچی میوگلوبین حفظ می شود(9). آزمایشات مختلف نشان داده­اند که وقتی لیزوزیم برروی سطح نانو­ذره مغناطیسی اکسید­آهن جذب می شود، محتوای صفحه بتای آن از 42/25 درصد به 49/27 درصد افزایش می یابد و محتوای آلفا-هلیکس آن نیز از 9/15 درصد به 29/24 درصد افزایش پیدا می­کند. برعکس، محتوای رندوم­کویل و T-ترن کاهش می­یابد (17).

در مطالعه ای که اثر نانوذره  TiO2را بر روی لیزوزیم بررسی کردند نشان داده شده است که اثر TiO2 روی ساختار دوم لیزوزیم اثر می گذارد به این صورت است که میزان آلفا هلیکس آنزیم را به شدت کاهش می دهد ولی بتا شیت را افزایش می دهد و پیچ- بتا را همراه با رندوم کویلها کاهش می دهد. با نزدیک شدن لیزوزیم به سطح  TiO2 هیدروژن باند هایی از نوعN-H…..O , O-H…..O  تشکیل می شوند. دلیل این تغییرات گسترده بر روی ساختمان دوم لیزوزیم این است که تعداد زیادی از گروههای زنجیره های قطبی به TiO2 باند هستند لیزوزیم دچار پیچ خوردگی و تغییر ساختار زنجیره ها می شود که از این رو هیدورژن باند های آلفا هلیکسهای داخلی از بین می روند (22).

در مطالعه ای که اثر نانوذره 2TiO را بر روی پپسین بررسی کردند نشان دادند که نانو 2TiO، sheet-β وturn-β را کاهش می­دهد و همچنین لوپ hairpin-β را  که از جایگاه فعال محافظت می­کند، تخریب می نماید. نانو 2TiO یک اثر اتصالی قوی دارد و می­تواند OH- در سطح ذرات در شرایط آبی تولید کند. اثر اتصالی و تجمع OH- ممکن است سبب تغییر در قطبیت پپسین و ساختار جایگاه­فعال شود، به این صورت منجر به کاهش فعالیت پپسین شود. برهمکنش بین نانو 2TiO و پپسین بیشتر الکتروستاتیک، همراه با اتصالات هیدروفوبیک می­باشد. برهمکنش نانو2TiO با پپسین از نوع غیر­کووالان است. اتصال غیر­کووالان، شامل نیرو­های الکتروستاتیک، اتصالات هیدروفوبیک و پیوند هیدروژنی، اغلب ضعیف و غیر­اختصاصی است اما ترکیبی از پیوند­های غیر­کووالان ممکن است سبب تغییر صورتبندی و عملکرد پروتئین شود(23).

Tm، یک شاخص پایداری گرمایی پروتئین است، Tm بالاتر نشان دهنده پایداری بیش تر پروتئین است. دگرگون سازی پروتئین یک متد کلیدی در ترمودینامیک و آنالیز جایگاه اتصال  است که می تواند درک و فهم را از ارتباط ساختار و عملکرد پروتئین افزایش دهد (3). Tm یا دمای ذوب یک آنزیم، دمایی است که در آن ΔG° برابر با صفر است. که نحوه محاسبه آن در ابتدای مبحث نتایج بیان شده است. در نمودارهای تغییرات کسر دگرگون سازی علیه دما چنانچه نمودار به سمت دمای بیشتر شیفت کند یعنی میزان پایداری آنزیم بیشتر شده است در واقع آنزیم در دمای بیشتری دگرگون می شود، چنانچه چنانچه نمودار به سمت دمای کمتر شیفت کند یعنی میزان پایداری آنزیم کمتر شده است در واقع آنزیم در دمای کمتری دگرگون می شود. 

همان طور که در نمودارهای کسردگرگون سازی و تغییرات انرژی آزاد گیبس نشان داده شد با افزایش غلظت نانو­ذره اکسید­روی و اکسیدآهن منحنیهای دگرگون­سازی برای آنزیم پپسین تقریباً تغییر پیدا نکرده است یعنی هرچه غلظت نانو­ذره اکسید­روی و اکسیدآهن افزایش می­یابد، آنزیم پپسین تقریباً در همان دما دگرگون می­شود. با توجه به اینکه  pH ایزوالکتریک آنزیم پپسین تقریباً 1 می باشد (5). آنزیم پپسین در  pHهای بالاتر ازنقطه ایزوالکتریک دارای بار منفی ودرpH های پایین تر از آن دارای بار مثبت است.  پس در نتیجه آنزیم پپسین در 2pH= دارای بار منفی می باشد. از طرفی نانو­ذرات اکسید­روی و اکسیدآهن به ترتیب دارای نقطه ایزوالکتریک 9 و1/5 هستند(12). پس این نانوذرات در 2pH= دارای بار مثبت هستند و پپسین هم که دارای بار منفی است، بنابراین نانو­ذرات اکسید­روی و اکسیدآهن از طریق برهمکنش الکتروستاتیک و همچنین  از طریق پیوند هیدروژنی در صورتی که زاویه و فاصله بین آنها به اندازه­ای باشد که برای تشکیل پیوند هیدروژنی مجاز باشد، به پپسین متصل می شوند، با توجه به نتایج به دست آمده از آزمایش می توان گفت که میزان برهمکنشهای هیدروژنی و الکتروستاتیک بین نانو­ذرات اکسیدروی با پپسین به اندازه­ای نبوده که سبب تغییر ساختار سه­بعدی آنزیم و دناتوراسیون آن شود.

1.آشنگرف، مراحم.(1393)  معرفی سویه جدید مخمری Candida sp. strain MY2 با توان بالقوة سنتز سریع و برون سلولی نانوکریستالهای اکسید روی.  مجله زیست شناسی، 27:2، ص.166-155.

2 .رضایی زارچی، سعید.، نگهداری، مسعود. 1393 طراحی حسگر زیستی اندازه گیری گلوکز با استفاده از الکترود اصلاح شده با نانو ذرات کسید کادمیوم و آنزیم گلوکز اکسیداز، 27:3، ص366-354.

 

3.Behbehani G. R., Saboury A. A. and Taleshi E. 2008. A direct calorimetric determination of denaturation enthalpy for lysozyme in sodium dodecyl sulfate. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 61(2): 224-228.

4.Bellova, A., E.Bystrenova, et al. 2010. Effect of Fe3O4 magnetic nanoparticles on lysozyme amyloid aggregation. Nanotechnology21: 065103.

5.Chakraborty, T., Chakraborty, I., Moulik, S.P.& Ghosh, S. 2007. Physicochemical studies on pepsin-CTAB interaction: Energetics and structural changes. the Journal of Physical Chemistry B, 111(10): 2736-2746.

6.Dunn, B.M. 2001. Overview of Pepsin‐like Aspartic Peptidases. Current Protocols in Protein Science, 21-3.

7. Fink, A. L., Calciano, L. J., Goto, Y., Kurotsu, T. & Palleros, D. R. 1994. Classification of acid denaturation of proteins: intermediates and unfolded states. Biochemistry, 33(41): 12504-12511.

8.Horimoto, Y., Dee, D.R.& Yada, R.Y. 2009. Multifunctional aspartic peptidase prosegments. New biotechnology, 25(5): 318-324.

9.Mandal, G., Bhattacharya, S.& Ganguly, T. 2011. Mode of bindings of zinc oxide nanoparticles to myoglobin and horseradish peroxidase: A spectroscopic investigations. Journal of Applied Physics, 110)2(: 024701-024701.

10.Mnyusiwalla, A., A.S. Daar, et al. 2003. Mind the gap': science and ethics in nanotechnology. Nanotechnology14: R9.

11.Murray, K., Rodwell, V., Bender, D., Botham, K. M., Weil, P. A. & Kennelly, P. J. 2009. Harper's Illustrated Biochemistry. 28, New York: McGraw-Hill.

12.Norouzi, P., Ganjali, H., Larijani, B., Ganjali, M.R., Faridbod, F.& Zamani, H.A. 2011. A glucose biosensor based on nanographene and ZnO nanoparticles using FFT continuous cyclic voltammetry. International Journal of Electrochemical Science, 6: 5189-5199.

13.Okoniewska, M., Tanaka, T.& Yada, R.Y. 1999. The role of the flap residue, threonine 77, in the activation and catalytic activity of pepsin A. Protein Engineering, 12(1):55-61.

14.Sielecki, A.R., Fedorov, A.A., Boodhoo, A., Andreeva, N.S.& James, M.N.G. 1990. Molecular and crystal structures of monoclinic porcine pepsin refined at 1.8 A resolution. Journal of Molecular Biology, 214(1):143-170.

15.Silva, G.A. 2004.Introduction to nanotechnology and its applications to medicine. Surgical Neurology, 61(3): 216-220

16Singh, M., S. Singh, et al. 2008.Nanotechnology in medicine and antibacterial effect of silver nanoparticles.Digest J. Nanomater.Biostructures, 3(3): 115-122

17.Sun, J., R.Xu, et al. 2011. Conformational changes and bioactivity of lysozyme on binding to and desorption from magnetite nanoparticles. Journal of ChromatographyB879(13): 3053-3058.

18.Vertegel, A. A., Siegel, R. W. & Dordick, J. S. 2004. Silica nanoparticle size influences the structure and enzymatic activity of adsorbed lysozyme. Langmuir,20(16):6800-6807.

19.Wang, Y., B.Wang, et al. 2011. Microglial activation, recruitment and phagocytosis as linked phenomena  in ferric oxide nanoparticle exposure. Toxicology Letters205(1): 26-37.

20.Xu, Z., X.W. Liu, et al. 2009. Interaction of nano-TiO2 with lysozyme: insights into the enzyme toxicity of nanosized particles. Environmental Science and Pollution Research17(3): 798-80.

21.Wu X. and Narsimhan G. 2008. Effect of surface concentration on secondary and tertiary conformational changes of lysozyme adsorbed on silica nanoparticles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins & Proteomics, 1784(11): 1694-1701.

22.Yongli C., Xiufang Z., Yandao G., Nanming Z., Tingying Z. and Xinqi S. 1999. Conformational Changes of Fibrinogen Adsorption onto Hydroxyapatite and Titanium Oxide Nanoparticles. Journal of colloid and interface science, 214(1): 38-45.

23.Zhu, R.-R., Wang, W.-R., Sun, X.-Y., Liu, H. & Wang, S.-L 2010. Enzyme activity inhibition and secondary structure disruption of nano-TiO2 on pepsin. Toxicology in Vitro, 24(6): 1639-1647.