نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته کرمان

2 عضو هیات علمی پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی کرمان

چکیده

مقدمه: سرطان معده یکی از عوامل مهم بیماری و مرگ‌ و میر در جهان است. گونه‌های گیاهی منحصر به فرد زیادی وجود دارد که برای یافتن ترکیبات ضد سرطانی باید مطالعه شوند.
هدف: در این تحقیق، خاصیت ضد سرطانی عصاره اتانولی و آبی گل محمدی بر رده سلولهای سرطانی معده انسان (AGS) بررسی شد.
روش بررسی: هشت غلظت متفاوت از عصاره‌ها به همراه داروی 5- فلورواوراسیل بر روی رده سلولی سرطان معده اعمال شد. سمّیت عصاره‌ها با آزمون MTT و اثر عصاره‌ها بر تکثیر سلولی با سنجش مصرف BrdU بررسی گردید. روش TUNEL برای اندازه‌گیری مرگ آپوپتوزی سلول به‌کار رفت.
نتایج: نتیجه نشان داد عصاره آبی و عصاره اتانولی گل محمدی بقای سلول‌های سرطانی را به‌طور معنی‌داری کاهش می‌دهند. شاخص IC50 برای این دو عصاره روی سلول AGS به ترتیب 887/3 و 517/2 میکرو‌گرم بر میلی‌لیتر به دست آمد.
نتایج روش میزان مصرف BrdU نشان داد هر دو عصاره آبی و اتانولی سبب کاهش معنی‌دار تکثیر سلول‌های سرطان معده (نسبت به سلول فیبروبلاست) می‌شوند. با افزایش غلظت هر دو عصاره میزان تکثیر نیز کاهش می‌یابد. همچنین اثر کشندگی و مهاری عصاره اتانولی بیشتر از عصاره آبی است.
میزان بروز مرگ آپوپتوزی ناشی از افزودن هر دو عصاره آبی و اتانولی روی سلول‌های سرطانی 90% برآورد گردید.
نتیجه گیری: عصاره آبی و اتانولی گل محمدی از طرق مختلف باعث کاهش بقا و تکثیر و القای مرگ در سلول سرطانی معده انسان می‌شود.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Effects of aqueous and ethanolic extract of Rosa damascena mill L. against human gastric Cancer cells

چکیده [English]

Introduction: Gastric cancer is one of the important morbidity factors in the world. There are many unique plant species that should be explored for anti-cancer components.
Goal: In this project, anti-cancer effects of aqueous and ethanolic extract of Persia rose (Rosa damascena mill L.) against human gastric cancer cell line (AGS) was studied.
Experimental procedure: Eight different concentrations of extracts as well as 5-fluorouracil was applied on the cells. The toxicity of the extracts, their inhibitory effects on proliferation and apoptotic effects were studied by MTT, BrdU and TUNEL assays respectively.
Result: The results showed that all concentrations of aqueous and ethanolic extracts reduced viability of the AGS cells significantly. The IC50 of these extracts on AGS cells was determined 2.517 and 3.887 µg/ml respectively.
BrdU assay also showed the inhibitory effect of extracts on proliferation of AGS cells (in comparison to fibroblast cells). The proliferation of AGS cells was decreased as the concentration of both of the extracts was increased. Also, the toxicity and anti-proliferative effect of ethanolic extract was more than aqueous extract. The rate of apoptosis was determined 90% for both aqueous and ethanolic extract.
Conclusion: Aqueous and ethanolic extract of Rosa damascena mill L. reduced viability and proliferation and induce apoptosis in human gastric cancer cells through different pathways.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Gastric cancer cell
  • Aqueous and ethanolic extract
  • Persia rose
  • Apoptosis
  • Toxicity

اثرات عصاره آبی و اتانولی گل محمدی (Rosa damascena mill L.) بر علیه سلولهای سرطانی معده انسان 

کتایون میمندی و محمدمهدی یعقوبی*

کرمان، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته کرمان، پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، گروه بیوتکنولوژی 

تاریخ دریافت: 8/6/93                 تاریخ پذیرش: 9/12/93 

چکیده

سرطان معده یکی از عوامل مهم بیماری و مرگ­ و میر در جهان است. گونه­های گیاهی منحصر به فرد زیادی وجود دارد که برای یافتن ترکیبات ضد سرطانی باید مطالعه شوند. هدف در این تحقیق، بررسی خاصیت ضد سرطانی عصاره اتانولی و آبی گل محمدی بر رده سلولهای سرطانی معده انسان (AGS) می باشد. لذا بررسی بر روی هشت غلظت متفاوت از عصاره­ها به همراه داروی 5- فلورواوراسیل بر روی رده سلولی سرطان معده انجام گرفت. سمّیت عصاره­ها با آزمون MTT و اثر عصاره­ها بر تکثیر سلولی با سنجش مصرف BrdU بررسی گردید و روش TUNEL برای اندازه­گیری مرگ آپوپتوزی سلول به­کار رفت. از نتایج برآمده عصاره آبی و عصاره اتانولی گل محمدی بقای سلولهای سرطانی به­طور معنی­داری کاهش می­یابد. شاخص IC50 برای این دو عصاره روی سلول AGS به ترتیب 887/3 و 517/2 میکرو­گرم بر میلی­لیتر به دست آمد. نتایج روش میزان مصرف BrdU نشان داد هر دو عصاره آبی و اتانولی سبب کاهش معنی­دار تکثیر سلولهای سرطان معده (نسبت به سلول فیبروبلاست) می­شوند. با افزایش غلظت هر دو عصاره میزان تکثیر نیز کاهش می­یابد. همچنین اثر کشندگی و مهاری عصاره اتانولی بیشتر از عصاره آبی است. میزان بروز مرگ آپوپتوزی ناشی از افزودن هر دو عصاره آبی و اتانولی روی سلولهای سرطانی 90 درصد برآورد گردید. در نتیجه عصاره آبی و اتانولی گل محمدی از طرق مختلف باعث کاهش بقاء و تکثیر و القای مرگ در سلول سرطانی معده انسان می­شود.

واژه های کلیدی: سلول سرطان معده، عصاره آبی و اتانولی، گل محمدی، آپوپتوز، سمّیت

* نویسنده مسئول، تلفن:03433776610 ،  پست الکترونیکی:  m.yaghoobi@kgut.ac.ir

مقدمه

 

در بسیاری از کشورهای دنیا سرطان دومین عامل عمده مرگ و میر بعد از بیماریهای قلبی عروقی است. سرطان معده چهارمین سرطان رایج در جهان و با نرخ بالای مرگ و میر هفت صد هزار نفر در سال، بعد از سرطان ریه دومین عامل اصلی مرگهای سرطانی است(25). مشکلات فعلی در استفاده از شیمی درمانی و پرتو درمانی و عوارض جانبی متعددی که در اثر استفاده از آنها برای بیمار ایجاد می­شود و همچنین مقاومت سلولهای سرطانی به درمانهای رایج، سبب شده است محققین رو به سوی داروهای جدید با اثر بیشتر و سمّیت کمتر بیاورند. طبیعت منبعی شگفت انگیز از ترکیبات مناسب دارویی جدید با تنوع شیمیایی بسیار زیاد است که در میلیونها گونه گیاهی، جانوری، جانداران دریایی و میکروارگانیسم­ها یافت می­شود(6 و 16). متابولیتهای ثانویه موجود در گیاهان از جمله این ترکیبات هستند که بسیاری از آنها هنوز ناشناخته هستند. ترکیبات گیاهی که خاصیت ضد سرطانی و ضد توموری دارند در گروههای شیمیایی آلدهیدها، آلکالوئیدها، فلاوونوئیدها، گلیگوزیدها، ترپنوئیدها و ترکیبات فنلی قرار می­گیرند(1، 11 و26). قابل توجه است که هم ­اکنون بیش از 60 درصد داروهای رایج ضد سرطانی از منابع طبیعی شامل گیاهان، جانداران دریایی و میکروارگانیسم­ها مشتق شده­اند(16).

گل محمدی با نام علمی Rosa damascena mill L.از خانواده رزاسه می­باشد. نام انگلیسی آن پرشیا رز (Persia Rose) است و عموماً به داماسک رز (Damask rose) معروف می­باشد. این گیاه هیبریدی از Rosa gallica L. و Rosa moschata Herrm. است(17 و 23). گل محمدی، گل ملی ایران، بومی خاورمیانه و یکی از فراوان­ترین گلها در ایران می­باشد و چون بسیار مقاوم به خشکی است، هم به صورت طبیعی و هم زراعی در بسیاری از نقاط ایران می­روید. مناطق تولید عمده آن در ایران، کاشان، فارس، آذربایجان و کرمان هستند(3). ترکیبات مختلفی از گلها، گلبرگها و میوه­های گل محمدی شامل ترپنها، گلیکوزیدها، فلاونوئیدها و آنتوسیانینها جدا شده­ است. این گیاه همچنین حاوی کربوکسیلیک اسید، میرسن، ویتامینC، کامپفرول و کوئرستین است(3 و 12). خواص دارویی خانواده رزاسه عمدتاً به فراوانی ترکیبات فنولی آنها نسبت داده می­شود. ترکیبات فنولی خواص دارویی زیادی مثل آنتی­اکسیدانت، از بین برنده رادیکالهای آزاد، ضد التهاب، ضد جهش و ضد افسردگی را دارند(3). آنتی­اکسیدانتهای گیاهی در پیشگیری از سرطان و کشندگی انتخابی سلولهای سرطانی از طرق مختلف مانند القای آپوپتوز، جلوگیری از رگ­زایی و رشد متاستاتیک سرطان نقش دارند (2، 5، 9، 11، 13، 26 و 27). در طب سنتی ایرانی برگهای رز به عنوان صفرابَر و ملیّن استفاده می­شوند. همچنین برای درمان درد قفسه سینه شکمی، تقویت قلب، درمان خونریزی قاعدگی و ناراحتیهای گوارشی توصیه می­شود. گل محمدی اثرات ضد باکتریایی قوی علیه انواع زیادی از باکتریها شامل آئروموناس، باسیلوس، انتروباکتر، انتروکوکوس، اشریشیا، کلبسیلا، مایکوباکتریوم، پروتئوس، سالمونلا، سودوموناس، استافیلوکوکوس و یرسینیا دارد(17). ترکیبات جدا شده از عصاره آبی و متانولی گل محمدی  شامل کامپفرول و کوئرستین اثر ضد ویروس نقص ایمنی اکتسابی انسان دارند(14). همچنین اخیراً گزارش شده که بخش غیر محلول اسانس گل محمدی باعث کاهش تکثیر سلول سرطانی روده بزرگ انسان می شود(19). با توجه به خواص زیاد دارویی گل محمدی که بخشی از آن در بالا ذکر گردید و وجود ترکیبات فنولی، ترپنها، گلیکوزیدها، فلاونوئیدها و آنتی اکسیدانتها در آن، مطالعه اثرات احتمالی ضد سرطانی این گیاه ضروری به نظر می­رسد. از طرف دیگر در زمینه خواص ضد سرطانی  عصاره گل محمدی با توجه به فراوانی آن در ایران، مطالعه منتشر شده­ای دیده نشد و لذا این گیاه برای مطالعه و بررسی انتخاب شد. در این تحقیق اثر عصاره­های آبی و اتانولی گل محمدی روی رشد و مرگ و میر سلول سرطان معده بررسی شد.

مواد و روشها

جمع آوری نمونه­ها: گلهای محمدی از شهرستان بردسیر(65/29 درجه شمالی و 75/56 درجه شرقی) استان کرمان جمع­آوری و توسط آقای دکتر سید محمدعلی وکیلی شهربابکی تأیید شد. گیاه فوق با شماره 1275 در هرباریوم دانشگاه شهید باهنر کرمان، کلکسیون آقای دکتر سید منصور میرتاج الدینی نگهداری می شود. گلها تا زمان انتقال به آزمایشگاه در یخ خشک نگهداری و پس از انتقال به آزمایشگاه تا زمان استفاده در فریزر 80- درجه سانتی گراد نگهداری شدند.

تهیه عصاره آبی: حدود 40 گرم از گلبرگهای گل محمدی در هاون چینی و با کمک نیتروژن مایع آسیاب شدند.80 میلی­لیتر آب مقطر به آن افزوده شد، سپس نمونه­ها به مدت 48 ساعت در شیکر با دمای 4 درجه سانتی گراد و دور از نور برای نفوذ حلال قرار داده شدند. پس از این مدت نمونه­ها به مدت ده دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد در دور 12000  بر ابر شتاب جاذبه زمین سانتریفیوژ شدند. محلول رویی حاصل در دستگاه فریزدرایر به صورت پودر خشک شد و برای استفاده در مراحل بعدی آزمایش دور از نور و در فریزر 20- درجه سانتی گراد نگهداری شد(4).

تهیه عصاره اتانولی: 200 گرم از گلها به روش ذکر شده در بالا آسیاب و 400 میلی­لیتر اتانول اضافه شد. سپس به مدت 48 ساعت در شیکر با دمای 4 درجه سانتی گراد و دور از نور برای نفوذ حلال قرار داده شدند. بعد از این مدت محلول رویی با کاغذ واتمن شماره 1 و پمپ خلأ فیلتر شد. محلول حاصل در دستگاه روتاری تغلیظ شده و باقیمانده حلال نیز با قرار دادن در معرض هوا تبخیر شد. عصاره حاصل برای استفاده در مراحل بعدی آزمایش در فریزر 20- درجه سانتی گراد و دور از نور نگهداری شد(4).

تهیه رده­های سلولی و کشت آنها: رده سلولی فیبروبلاست ماهیچه انسان (HSkMC) به عنوان سلول شاهد و رده سلولی آدنوکارسینومای سرطان معده انسان (AGS) از بانک سلولی انستیتو پاستور ایران تهیه گردید.

کلیه مراحل کشت سلول در شرایط استریل و در زیر هود لامینار در اتاق کشت سلول انجام شد. سلولها در فلاسکهای کشت سلولی 25 سانتیمتر­مربع و در محیط کشت حاوی 5 میلی­لیتر از محیط کشت RPMI1640، حاوی 10 درصد سرم جنین گاو (FBS)، μg/ml50 آنتی­بیوتیک استرپتومایسین، U/ml50 پنی سیلین و µg/ml2 آمفوتریسینB در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی گراد و  CO25 درصد کشت داده شدند. وضعیت سلولها هر روز زیر میکروسکوپ معکوس مشاهده شده و سلولهای در مرحله رشد لگاریتمی در محیط انجماد (شامل محیط کشت به اضافه 20 درصد سرم جنین گاو و 10 درصد DMSO) منجمد شده و در ازت مایع نگهداری شدند.

سنجش سمّیت عصاره گیاهی روی سلولها به روش رنگ آمیزیMTT : تعداد 5000 سلول AGS در چهار ردیف افقی از چاهکهای پلیت 96 خانه کف صاف باμl 50 محیط، کشت داده شد و به مدت 24 ساعت در انکوباتور با همان شرایط نگهداری شدند. ردیف بالا، پایین، چپ و راست به عنوان بلانک بدون سلول خالی نگه داشته شد. هفت غلظت متفاوت از عصاره آبی (3/0، 6/0، 2/1، 8/1، 4/2، 6/3، و 2/4) و هفت غلظت از عصاره اتانولی (2/0، 4/0، 8/0، 2/1، 6/1، 2، 4/2 و 8/2)  برحسب میکرو­گرم در میلی­لیتر در حجم نهایی حداکثر 5 میکرولیتر، غلظت صفر برای شاهد بدون عصاره و غلظت μg/ml6/2 داروی رایج 5-فلورواوراسیل (نزدیک به IC50 این دارو برای سلول سرطان معده) روی هریک از ستونهای پلیت 96 خانه به مدت 48 ساعت اثر داده شد(24). سپس با کیتCell Proliferation Kit (MTT, 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl)  طبق روش شرکت سازنده (Roche applied science ,Germany) آزمون MTT انجام شد. ابتدا 5 میکرولیتر از معرف MTT به هر چاهک اضافه شده و پس از 4 ساعت 50 میکرولیتر حلال اضافه شد. پلیتها در روز بعد با روش اسپکتروفتومتری و با دستگاه الایزاریدر مدلELX808 (شرکت BioTek) در طول موجهای nm490 و nm680 ( طول موج مبنا) خوانده شدند.

بررسی میزان اثر عصاره گیاهی بر تکثیر سلول با استفاده ازBrdU : تعداد 5000 سلول فیبروبلاست و سرطان معده در چهار ردیف از چاهک پلیت 96 خانه کف صاف با حجم μl50 از محیط کشت، کشت داده شده و به مدت 24 ساعت در انکوباتور نگهداری شدند. سپس هفت غلظت از عصاره­های آبی و اتانولی در همان غلظتهایی که در روش MTT به­کار رفت، به سلولها افزوده شد و به مدت 48 ساعت در همان شرایط قرار گرفتند. غلظت صفر از عصاره برای شاهد بدون عصاره و غلظت μg/ml6/2 داروی رایج 5-فلورواوراسیل نیز به کار رفت. بعد از این مدت با استفاده از کیتCell Proliferation ELISA, BrdU kit  طبق دستور شرکت سازنده(Roche applied science, Germany) آزمون BrdU(5-bromo-2’-deoxyuridine) انجام شد. ابتدا 5 میکرولیتر از محلول BrdU به هر چاهک افزوده شده و سه ساعت بعد محیط فوق برداشته شده و 100 میکرولیتر محلول FixDenat به هر چاهک ریخته شد. 30 دقیقه بعد این محلول نیز برداشته شده و 50 میکرولیتر محلول آنتی بادی BrdU به هر چاهک ریخته شد. پس از 90 دقیقه آنتی بادی نیز برداشته شده و چاهکها سه بار با بافر نمکی فسفات شسته شد. آنگاه 50 میکرولیتر محلول سوبسترا به هر چاهک ریخته شد.20 دقیقه بعد پلیتها توسط دستگاه الایزاریدر مدلELX808 (شرکت BioTek) در طول موج nm370 و طول موج مبنایnm 490 خوانده شدند. از سلولهای فیبروبلاست به عنوان سلول طبیعی شاهد استفاده شد.

بررسی اثر عصاره در القای مرگ سلولی آپوپتوز به روش TUNEL : سلولهایAGS  روی لامل و در پلیتهای 6 خانه در انکوباتور با همان شرایط کشت داده شدند. پس از رسیدن به رشد حدود 60 درصد ، میزانµg/ml 6/1 از عصاره اتانولی وµg/ml 4/2 از عصاره آبی به سلولها اضافه شد و پلیتها به انکوباتور منتقل شدند. این غلظت از وسط محدوده غلظتی مورد استفاده در  آزمایشهای سنجش MTT و BrdU انتخاب شد. بعد از گذشت 24 ساعت با کیتIn situ cell death detection TMR Red  طبق دستور شرکت سازنده (Roche applied science, Germany) روش TUNEL انجام شد. در نمونه کنترل منفی آنزیم ترمینال ترانسفراز حذف شد و در نمونه کنترل مثبت از آنزیم DNase I برای ایجاد شکستگی در DNA سلول استفاده شد. برای محاسبه درصد آپوپتوز، از سلولها در طول موج 590 نانومتر با میکروسکوپ فلورسانس (Axioplan 2, Zeiss) عکس­برداری و سلولهای رنگ گرفته و رنگ نگرفته در 5 میدان تصادفی شمارش و درصد آپوپتوز محاسبه شد. به جهت مقایسه در همان میدان با میکروسکوپ نوری معمولی هم از سلولها عکس­برداری شد.

روشهای آماری: آزمایش برای روش MTT و  BrdUدر قالب طرح پایه کاملاً تصادفی با 4 تکرار انجام شد و نتایج به ترتیب به صورت درصد زنده ماندن (viability) و میزان جذب برآورد شد. در روش TUNEL میزان آپوپتوز بر اساس درصد از طریق شمارش سلولی برآورد شد. 50 درصد سمیت سلولی (IC50) با استفاده از نرم­افزارplus V1.0 (INER,V1.0)  ED50 محاسبه شد. تجزیه واریانس داده­های حاصل از این آزمون به صورت تجزیه واریانس (ANOVA) و مقایسه میانگین در طرح پایه کاملاً تصادفی (CRD) با استفاده از نرم­افزار SAS مورد بررسی قرار گرفتند. مقایسه میانگین تیمارها با استفاده از آزمون چند دامنه­ای دانکن در سطح احتمال 5 درصد انجام شد، مقایسه میانگین تیمارها با تیمار کنترل نیز با استفاده از آزمون دانت در سطح احتمال 5 درصد مورد بررسی قرار گرفت.

نتایج 

برای بررسی اثر کشندگی عصاره روی سلولهای سرطان معده، غلظتهای 3/0 تا 2/4 میکرو­گرم بر میلی­لیتر عصاره آبی و غلظتهای 2/0 تا 8/2 میکروگرم بر میلی­لیتر عصاره اتانولی بر سلولهای سرطان معده اثر داده شد و اثر آنها با روش MTT بررسی شد. نتیجه نشان داد تمام غلظتهای عصاره آبی و عصاره اتانولی گل محمدی بقای سلولهای سرطانی را به طور معنی­داری کاهش می­دهند (P<%5) (شکل-1). شاخص IC50 برای این دو عصاره روی سلول AGS به ترتیب 887/3 و 517/2 میکرو­گرم بر میلی­لیتر به دست آمد. نتایج حاکی از آن است که اثر کشندگی عصاره اتانولی بیشتر از عصاره آبی است. چرا که IC50 آن کمتر است و داده­های شکل-1 نشان می­دهد که عصاره اتانولی در غلظت کمتری (نسبت به عصاره آبی) حدود نیمی از سلولها را کشته است. همچنین نتایج نشان داد که اثر کشندگی غلظتهای بالای هر دو عصاره از داروی 5-فلورویوراسیل قدری بیشتر است. درصد زنده مانی سلولها در حضور دارو حدود 60 درصد و در حضور بالاترین غلظت از هر دو عصاره حدود 51 درصد است. (شکل-1).

 

شکل-1 درصد زنده ماندن سلولهای سرطان معده (AGS) تحت تیمار عصاره آبی (A) و اتانولی (B) گل محمدی در آزمایش سنجش MTT. سلولها به مدت 48 ساعت با غلظتهای مشخص شده از عصاره تیمار شده و سپس با روش MTT سنجش انجام شد. داده­ها به صورت میانگین چهار نمونه مختلف ارائه شده­اند.

مشاهده تغییرات مورفولوژیک سلولها پس از دو روز تیمار با غلظتهای مختلف عصاره نیز یافته­های آزمایش سنجش با MTT را تأیید نمود. با افزودن عصاره­ها به ویژه در غلظتهای بالا سلولهای تغییر شکل داده و جدا شده از سطح و همچنین برخی لاشه­های سلولی که دلالت بر سمّی بودن عصاره و وقوع مرگ سلول دارد به خوبی مشاهده می­شد. این در حالی است که در نمونه کنترل (عدم تیمار با عصاره) چنین تغییراتی مشاهده نمی­شد. همچنین اثرات داروی 5-فلورویوراسیل روی ظاهر سلولها کمتر از عصاره بود (شکل-2). به جهت رعایت اختصار، تنها تصویر اثر دو غلظت از هشت غلظت به کار رفته از عصاره­ها روی سلول نشان داده شده است.

 

شکل-2 تغییرات ریخت­شناسی سلولهای سرطان معده تحت تأثیر غلظتهای مختلف عصاره آبی (A و B وC) و عصاره اتانولی (E وF وG) گل محمدی به مدت 48 ساعت (بزرگنمایی X 320( :(A)شاهد، (B)غلظتml /µg­6/0، (C) غلظتml /µg3 عصاره آبی گل محمدی، (D)­5-فلورواوراسیلml /µg­6/2،(E)  شاهد،  (F)غلظتml /µg8/0،(G) غلظتµg/ml  8/2عصاره ­اتانولی گل محمدی،(H) 5-فلورواوراسیلml /µg­6/2.

در بخش بعد، برای بررسی میزان تکثیر سلولها در حضور غلظتهای مختلف عصاره، میزان سنتز DNA که نشان دهنده میزان تکثیر سلول است به روش محاسبه میزان مصرف BrdU اندازه گیری شد. در این بخش نیز سلولهای در حال رشد AGS و HSkMC به مدت 48 ساعت در معرض همان غلظتهایی از عصاره که در بخش قبل به­کار رفت قرار گرفتند و میزان مصرف BrdU محاسبه شد. نتایج نشان داد هر دو عصاره آبی و اتانولی سبب کاهش معنی­دار تکثیر سلولهای سرطان معده در مقایسه با گروه کنترل می­شوند (P<%5). با افزایش غلظت هر دو عصاره میزان تکثیر نیز کاهش می­یابد. اما میزان کاهش در غلظتهای بالاتر عصاره اتانولی بیشتر از عصاره آبی است (شکل-3).

همچنین میزان تکثیر سلولهای فیبروبلاست در حالت عادی (عدم تیمار با عصاره) کمتر از سلول سرطانی است. اثر هر دو عصاره روی تکثیر سلول فیبروبلاست نیز کمتر از سلول سرطانی است و با افزایش غلظت عصاره آبی کاهش تکثیر فیبروبلاست معنی­دار نمی­باشد. اما افزایش غلظت عصاره اتانولی اثر مهارکنندگی بیشتری روی تکثیر سلولهای سرطانی دارد. علاوه بر این نتایج نشان می­دهد که اثر هر دو عصاره از داروی 5-فلورویوراسیل بیشتر بوده و اثر این دارو معادل کمترین غلظتهای عصاره آبی(حدود 6/0 میکروگرم بر میلی لیتر) یا اتانولی (حدود 3/0 میکروگرم بر میلی لیتر) است (شکل-3).

 

شکل-3 منحنی اثر غلظتهای مختلف عصاره آبی (بالا) و عصاره اتانولی (پایین) گل محمدی روی تکثیر سلولهای سرطان معده(AGS) و سلول فیبروبلاست(HSkMC) پس از 48 ساعت. داده­ها حاصل چهار تکرار بوده و به صورت میزان جذب  BrdU در سلولهای سرطانی معده و سلول شاهد فیبروبلاست ارائه شده­اند.

در انتها، برای بررسی نحوه کشندگی عصاره و نوع مرگ و میر از روشTUNEL که به طور اختصاصی سلولهای در حال آپوپتوز را شناسایی می­کند استفاده شد. سلولهای سرطان معده به مدت 24 ساعت در معرض غلظتهای ذکر شده از عصاره­های آبی و اتانولی گل محمدی قرار گرفته و رنگ­آمیزی شدند (شکل -4). سیگنال فلورسانس قرمز که نشان دهنده قطعه قطعه شدن DNA ناشی از وقوع آپوپتوز است در نمونه تیمار شده با عصاره کاملاً مشهود است. این درحالی است که در نمونه کنترل که با عصاره تیمار نشده بود هیچ سیگنال فلورسانسی مشاهده نشد (به جهت سیاه بودن کامل، تصویر نمونه کنترل نشان داده نشده است).

میزان بروز آپوپتوز با هر دو عصاره آبی (µg/ml 4/2) و اتانولی (µg/ml 6/1) گل محمدی در سلولهای سرطان معده 90 درصد برآورد شد.

بحث

گیاهان دارویی و خوراکی به عنوان منبع ناشناخته­ای از ترکیبات و متابولیتهای ثانویه هستند که پتانسیل شناسایی ترکیبات مختلف در آنها همیشه وجود دارد. مطالعه چندانی روی اثرات ضد سرطانی ترکیبات گل محمدی انجام نشده است. هدف از انجام این طرح بررسی اثر دو عصاره آبی و اتانولی گل محمدی روی رشد و تکثیر و یا القای مرگ در سلولهای سرطان معده بود. تستهای مختلف سنجش سمّیت به روش MTT، سنجش میزان تکثیر به روش BrdU و سنجش مرگ آپوپتوزی به روش TUNEL هر سه نشان دهنده این بود که هم عصاره آبی و هم عصاره اتانولی این گیاه ایجاد سمّیت برای سلول نموده، مانع تکثیر آن می شود و مرگ آپوپتوزی را هم به راه می­اندازد (شکلهای 1 تا 4). نتایج حاکی از آن بود که سمّیت و اثر ضد تکثیری هر دو عصاره در برخی غلظتها از اثر داروی رایج ضد سرطان (5- فلورویوراسیل) در غلظت ثابت μg/ml6/2 هم بیشتر بود (شکل1 و 2). البته چون عصاره حاوی چندین و شاید دهها ماده مختلف است اثر تَجَمّعی آنها می­تواند نسبت به اثر یک داروی منفرد بیشتر باشد. همچنین غلظت به­کار رفته از دارو و عصاره در میزان اثر آنها تأثیرگذار است. در این طرح تنها یک غلظت از داروی 5-فلورویوراسیل به عنوان شاهد به کار رفته است و در این تحقیق هدف آن نبود که رگرسیون غلظتهای مختلف دارو و غلظتهای مختلف عصاره با هم مقایسه شود. چه بسا عصاره در غلظتهای کمتر یا بیشتر از آنچه  در  این  تحقیق

استفاده شد اثرات متفاوت و غیر منتظره­ای داشته باشد.

 

 

شکل 4 - بررسی آپوپتوز در سلول­های سرطان معده به روش TUNEL. سلول­ها به مدت 24 ساعت تحت تأثیر غلظت µg/ml4/2 عصاره آبی (بالا) و µg/ml6/1 عصاره اتانولی (پایین) قرار گرفته و سپس با کیتIn situ cell death detection  رنگ­آمیزی شدند. تصویر سمت چپ توسط میکروسکوپ نوری عکس­برداری شده و تصویر سمت راست همان میدان زیر میکروسکوپ فلورسانس است.

 

بررسی میزان تکثیر دو سلول فیبروبلاست و سرطان معده در حضور عصاره­ها نشان داد که میزان مصرفBrdU که نشان دهنده میزان سنتز DNA و تکثیر سلول است، در سلول سرطانی بیشتر از سلول طبیعی فیبروبلاست است. این نتیجه کاملاً قابل انتظار بود چرا که ویژگی سلولهای سرطانی تکثیر بی­رویه و خارج از کنترل آنها می­باشد. یافته جالب و کاربردی دیگر آن بود که تحت تأثیر هر دو عصاره آبی و اتانولی تکثیر سلول سرطانی بیشتر از سلول فیبروبلاست مهار می­شود (شکل-3). به عبارت دیگر عصاره روی سلول سرطانی اثری مهاری بیشتری دارد تا سلول طبیعی. این یافته به جهت کاربردی اهمیت دارد، چرا که اثر اختصاصی داروها روی سلولهای سرطانی یک مزیّت برای آنها محسوب می­شود. شاید ترکیباتی که در عصاره گیاه گل محمدی حضور دارند به طور اختصاصی مهارکننده آنزیمها و پروتئینهایی هستند که در سلول سرطانی فعالیت غیرعادی دارند و تکثیر بی رویه آن را موجب می­شوند.  ضمیری اخلاقی و همکاران در سال 2011 عصاره اتانولی گل محمدی را روی سلول سرطانی Hela اثر داده و میزان زنده مانی سلول را پس از 24، 48 و 72 ساعت به روش MTT سنجیدند(29). اختلاف در زنده مانی سلول پس از 72 ساعت به طور مشهودی معنی دار بود. البته آنها سلول طبیعی مانند فیبروبلاست را در کنار سلول سرطانی بررسی نکردند. همچنین فقط به تست MTT بسنده نمودند. در حالی که در این تحقیق روشهای BrdU و TUNEL نیز به کار رفت.

یافته دیگر این مطالعه آن بود که در همه تستهای به­کار رفته اثر عصاره اتانولی نسبت به عصاره آبی بیشتر بود. البته در کنار همه آزمایشها اثر حلال به تنهایی (اتانول) نیز بررسی شد که به جهت رعایت اختصار داده­های آن حذف شده است. بنابراین سمّیت و اثر مهاری و کشندگی عصاره اتانولی به خاطر ترکیبات موجود در آن است نه خود حلال. از آنجا که ترکیبات و متابولیتهای ثانویه زیادی در گیاهان و از جمله گل محمدی وجود دارد، میزان حل شدن این ترکیبات در دو حلال آب و اتانول متفاوت است(26). لذا نوع ترکیباتی که در حلال اتانول حل می­شوند اثر سمّی و مهاری بیشتری روی سلول سرطانی دارند تا موادی که در عصاره آبی حضور دارند. شناسایی اجزای موجود در عصاره و اسانس گل محمدی و بررسی اثر ترکیبات منفرد و خالص می­تواند به شناسایی ترکیبات خاصی که اثرات فوق­الذکر را دارند منجر شود. این ترکیبات ممکن است چرخه سلولی را مهار کرده و یا چک­پوینت­های آنرا فعال کنند، جلوی همانندسازی DNA را بگیرند و خاصیت ضد اکسیدانتی داشته باشند و یا مسیر داخلی یا خارجی آپوپتوز را به راه اندازند.

مطالعات قبلی نشان می­دهد گیاه گل محمدی حاوی کربوکسیلیک اسید، ترپن، میرسن، ویتامینC و ترکیبات فنولی است(3 و 27). ترکیبات آنتی­اکسیدانتی مثل فنولیک­اسیدها، پلی­فنولها و فلاونوئیدها، رادیکالهای آزادی مثل پراکسید، هیدروپراکسید، یا لیپید­پروکسیل را جمع­آوری می­کنند و مانع از بروز فرآیندهای اکسیداتیو که منجر به آسیب به ژنوم و بروز جهش می­شوند، می­گردند­. فلاونوئیدها به طور عمده­ای فرآیندهای ایمنی و سلولی مرتبط با گسترش و پیشرفت سرطان را تحت ­تأثیر قرار می­دهند. این ترکیبات انواع وقایع بیولوژیکی مرتبط با گسترش و پیشرفت سرطان مثل تکثیر سلولی، آپوپتوز، تمایز سلولی و ایجاد رگهای جدید را مانع می­شوند (5 و 11). کوئرستین و کامپفرول موجود در گل محمدی دو تا از ترکیبات مهم فنلی هستند. اثرات آنتی­اکسیدانت، اتصال به گیرنده اریل هیدروکربن (AhR) و واکنش با سیستمهای پیام رسان درون سلولی و تغییر مسیرهای پیام رسان جانبی به عنوان مکانیسمهای واسطه اثرات ضد سرطانی ترکیبات پلی فنول همانند کوئرستین و کامپفرول پیشنهاد شده­اند(5). تعدادی از آنتی اکسیدانتهای پلی فنولیک با سیستم تولید کننده نیتریک اکسید سینتاز) NOS) واکنش می­دهند. نیتریک اکسید (NO) می­تواند آپوپتوز را در بعضی سلولها شروع کند، در حالی که در برخی از سلولها مانع آپوپتوز می­شود. این پیچیدگی در اثر، نتیجه میزان تولید NO و واکنش متقابل آن با مولکولهایی مثل یونهای فلزی، تیول، تیروزین و انواع اکسیژن واکنش­گر است. NO با القای تمایز و کاهش گسترش متاستاتیک رده­های مختلف سلولهای سرطانی، مانع تکثیر سلولی می­شود(22). فلاونوئیدهای پلی­هیدروکسیله شده و کوئرستین رشد رده­های سلولی بدخیم سرطان معده انسانی در شرایط آزمایشگاه را مهار کرده، میزان ساخت DNA را به 14 درصد گروه کنترل کاهش دادند و مانع عبور سلول از مرحله G1 چرخه سلول به مرحله S شده­اند(28). در بین مراحل چرخه سلولی، مرحله G1 محل اصلی کنترل تکثیر سلول جانوری است و تفاوت مهم بین سلولهای طبیعی و تومورهای بدخیم بستگی به این مرحله دارد. لذا هر ترکیبی که بتواند عبور از مرحله G1 به S را مانع شود می تواند کاندیدای بالقوه ای در کنترل رشد تومورهای سرطانی باشد. همچنین کوئرستین از فعالیت آنزیمهای توپوایزومراز یک و دو جلوگیری می­کند در حالی که کامپفرول فقط مانع فعالیت آنزیم توپوایزومراز دو می­شود(15).

گزارشهای دیگری نشان می­دهد که کوئرستین فعالیت ضد سرطانی خود را با القای آپوپتوز که ناشی از توقف چرخه سلولی است، بروز می­دهد(7، 20 و 21). به نظر می­رسد که سلولهای بدخیم برای کنار زدن توقف چرخه سلولی وابسته به کوئرستین ناتوان هستند. همچنین کوئرستین مهار کننده گیرنده عامل رشد اپیدرمی (EGFR) و همچنین کیناز چسبندگی کانونی (FAK) است(10 و 20). هر دوی این پروتئینها برای رشد و تکثیر سلولهای سرطانی به ویژه سرطانهای اپی­تلیال (کارسینوما) لازم بوده و فعالیت غیرعادی دارند. در حالی که کوئرستین که بیان ژنهای دخیل در سمیت­زدایی را القاء می­کند، می­تواند بیان سایر فاکتورهای رونویسی را کم کند. در این مورد خانواده فاکتورهای رونویسی NF-kB و فاکتور رونویسی AP-1 کاملأ در شرایط آزمایشگاه بررسی شده­اند. NF-kB بیان بسیاری از ژنها که نقش اساسی در تنظیم پاسخهای ایمنی و التهابی و محافظت سلولها از آپوپتوز دارند را القاء می­کند. گزارشهای متعدد نشان می­دهد که NF-kB توسط مواد مشتق شده گیاهی از جمله کوئرستین تنظیم می­شود که می­تواند به طور بالقوه بیماریهای ناشی از فعال­سازی کنترل نشده NF-kB را بهبود ببخشد(18).

یکی دیگر از ترکیبات گل محمدی جرانیول است. گزارشهای قبلی نشان داده است که ایزوپرنوئیدهایی مثل بتا-ایونون و جرانیول اثرات ضد تکثیر و بازدارندگی از چرخه سلولی و فعالیت CDK2 در سلولهای سرطان پستان انسانی  MCF-7 دارند (8 و 27).

در مجموع می­توان گفت عصاره گل محمدی باعث کاهش بقای سلول، مهار تکثیر آن و القای مرگ در سلول سرطان معده می­شود و هر کدام از این اثرات می­تواند توسط مواد متفاوت و همچنین از مسیرهای مختلفی اجرا شود. شناسایی ترکیبات موجود در عصاره و اسانس گل محمدی بومی مناطق مختلف ایران و بررسی اثرات هر کدام از آنها می­تواند به فهم بیشتر نحوه بروز اثرات فوق کمک کند.

در پایان با توجه به بومی بودن گل محمدی، سازگاری این گیاه به شرایط اقلیمی مناطق مختلف ایران، پرورش آسان و کم هزینه این گیاه، وجود انواع متعدد فلاونوئیدهای گیاهی در آن، مطالعات بیشتر روی خواص ضد سرطانی ترکیبات این گیاه پیشنهاد می­شود.

تشکر و قدردانی

این طرح با حمایت مالی پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی طی قرارداد شماره 2708/1 انجام شده است. نویسندگان از آقای دکتر سید منصور میرتاج­الدینی عضو هیات علمی بخش زیست­شناسی دانشگاه شهید باهنر کرمان و آقای سید محمدعلی وکیلی شهربابکی به خاطر همکاری در شناسایی و بررسی گیاه ثبت شده در هرباریوم تشکر می کنند.

  1. Amin A, Gali-Muhtasib H, Ocker M, Schneider-Stock R (2009) Overview of major classes of plant-derived anticancer drugs. International journal of biomedical science : IJBS 5:1-11.
  2. Borek C (2004) Dietary antioxidants and human cancer. Integrative cancer therapies 3:333-341.
  3. Boskabady MH, Shafei MN, Saberi Z, Amini S (2011) Pharmacological effects of rosa damascena. Iranian journal of basic medical sciences 14:295-307.
  4. Cseke LJ, Kirakosyan A, Kaufman PB, Warber SW, Duke JA, Brielmann HL (2006) Natural Products from Plants. 2nd ed. Taylor & Francis. pp 269-273.
  5. Ciolino HP, Daschner PJ, Yeh GC (1999) Dietary flavonols quercetin and kaempferol are ligands of the aryl hydrocarbon receptor that affect CYP1A1 transcription differentially. The Biochemical journal 340 ( Pt 3):715-722.
  6. Cragg GM, Newman DJ (2013) Natural products: a continuing source of novel drug leads. Biochimica et biophysica acta 1830:3670-3695.
  7. Dajas F (2012) Life or death: neuroprotective and anticancer effects of quercetin. Journal of ethnopharmacology 143:383-396.
  8. Duncan RE, Lau D, El-Sohemy A, Archer MC (2004) Geraniol and beta-ionone inhibit proliferation, cell cycle progression, and cyclin-dependent kinase 2 activity in MCF-7 breast cancer cells independent of effects on HMG-CoA reductase activity. Biochemical pharmacology 68:1739-1747.
  9. Evans P, Halliwell B (2001) Micronutrients: oxidant/antioxidant status. The British journal of nutrition 85 Suppl 2:S67-74.
  10. Huang CY, Chan CY, Chou IT, Lien CH, Hung HC, Lee MF (2013) Quercetin induces growth arrest through activation of FOXO1 transcription factor in EGFR-overexpressing oral cancer cells. The Journal of nutritional biochemistry 24:1596-1603.
  11. Kandaswami C, Lee LT, Lee PP, Hwang JJ, Ke FC, Huang YT, Lee MT (2005) The antitumor activities of flavonoids. In vivo 19:895-909.
  12. Kodouri Mr, Tabaei Aghdaei Sr (2007) Evaluation Of Flower Yield And Yield Components In Nine Rosa Damascena Mill. Accessions Of Kerman Province. Iranian Journal Of Medicinal And Aromatic Plants 23:100-110.
  13. Ma H, Das T, Pereira S, Yang Z, Zhao M, Mukerji P, Hoffman RM (2009) Efficacy of dietary antioxidants combined with a chemotherapeutic agent on human colon cancer progression in a fluorescent orthotopic mouse model. Anticancer research 29:2421-2426.
  14. Mahmood N, Piacente S, Pizza C, Burke A, Khan AI, Hay AJ (1996) The anti-HIV activity and mechanisms of action of pure compounds isolated from Rosa damascena. Biochemical and biophysical research communications 229:73-79.
  15. Moskaug JO, Carlsen H, Myhrstad M, Blomhoff R (2004) Molecular imaging of the biological effects of quercetin and quercetin-rich foods. Mechanisms of ageing and development 125:315-324.
  16. Newman DJ, Cragg GM (2012) Natural products as sources of new drugs over the 30 years from 1981 to 2010. Journal of natural products 75:311-335.
  17. özkan G, Sagdiç O, Baydar NG, Baydar H (2004) Note: Antioxidant and Antibacterial Activities of Rosa Damascena Flower Extracts. Food Science and Technology International 10:277-281.
  18. Potapovich AI, Lulli D, Fidanza P, Kostyuk VA, De Luca C, Pastore S, Korkina LG (2011) Plant polyphenols differentially modulate inflammatory responses of human keratinocytes by interfering with activation of transcription factors NFkappaB and AhR and EGFR-ERK pathway. Toxicology and applied pharmacology 255:138-149.
  19. Rezaie-Tavirani M, Fayazfar S, Heydari-Keshel S, Rezaee MB, Zamanian-Azodi M, Rezaei-Tavirani M, Khodarahmi R (2013) Effect of essential oil of Rosa Damascena on human colon cancer cell line SW742. Gastroenterology and hepatology from bed to bench 6:25-31.
  20. Richter M, Ebermann R, Marian B (1999) Quercetin-induced apoptosis in colorectal tumor cells: possible role of EGF receptor signaling. Nutrition and cancer 34:88-99.
  21. Romano B, Pagano E, Montanaro V, Fortunato AL, Milic N, Borrelli F (2013) Novel insights into the pharmacology of flavonoids. Phytotherapy research : PTR 27:1588-1596.
  22. Schmitt CA, Dirsch VM (2009) Modulation of endothelial nitric oxide by plant-derived products. Nitric oxide : biology and chemistry / official journal of the Nitric Oxide Society 21:77-91.
  23. Setzer WN (2009) Essential oils and anxiolytic aromatherapy. Natural product communications 4:1305-1316.
  24. Shchepotin IB et al. Antitumour activity of 5-fluorouracil, verapamil and hyperthermia against human gastric adenocarcinoma cell (AGS) in vitro. Surgical Oncology 1994, 3: 287-294.
  25. Siegel R, Naishadham D, Jemal A (2013) Cancer statistics, 2013. CA Cancer J Clin 63:11-30.
  26. Srivastava V, Negi AS, Kumar JK, Gupta MM, Khanuja SP (2005) Plant-based anticancer molecules: a chemical and biological profile of some important leads. Bioorganic & medicinal chemistry 13:5892-5908.
  27. Ulusoy S, Bosgelmez-Tinaz G, Secilmis-Canbay H (2009) Tocopherol, carotene, phenolic contents and antibacterial properties of rose essential oil, hydrosol and absolute. Current microbiology 59:554-558.
  28. Yoshida M, Sakai T, Hosokawa N, Marui N, Matsumoto K, Fujioka A, Nishino H, Aoike A (1990) The effect of quercetin on cell cycle progression and growth of human gastric cancer cells. FEBS letters 260:10-13.
  29. Zamiri Akhlaghi A, Rakhshandeh H, Tayarani-Najaran Z, Mousavi S-H (2011) Study of cytotoxic properties of Rosa damascena extract in human cervix carcinoma cell line. Avicenna Journal of Phytomedicine. 1(2):74-77.