همسانه سازی و بررسی بیان ژن متالوتیونین smtA در باکتری اشریشیا کلی به منظور جذب فلزات سنگین

بهناز صفار^1،2* محسن مبینی دهکردی² و محسن پولادیان²

¹ شهرکرد، دانشگاه شهرکرد، پژوهشکده زیست فناوری

² شهرکرد، دانشگاه شهرکرد، دانشکده علوم، گروه ژنتیک

تاریخ دریافت: 24/2/93               تاریخ پذیرش: 14/11/93

چکیده

یکی از راههای جذب فلزات سنگین علاوه بر روشهای شیمیایی و فیزیکی، استفاده از فرآورده­های زیستی می باشد. یکی از این فرآورده ها، پروتئینهای جاذب فلزات سنگین مانند متالوتیونین می باشد. هدف از این مطالعه، همسانه­سازی ژن متالوتیونین smtA از سیانوباکتری سینکوکوس ایلانگاتوس سویه PCC7942 ، بیان و بررسی جذب فلز توسط آن می­باشد. بدین منظور ژن smtA در ناقل همسانه­سازیT/A ، همسانه­سازی و در باکتری  E.coli (DH5α) تراریخت شد. صحت تراریختی با Colony-PCR بررسی شد. سپس ژن مورد نظر به داخل ناقل بیانی pET15b زیرهمسانه سازی و در باکتری E.coli (BL21) تراریخت گردید. صحت تراریختی با بررسی الگوی هضم آنزیمی و تعیین توالی تأیید گردید. القای بیان ژن توسط IPTG انجام شد و بیان پروتئین توسط تریس-­تریسین SDS-PAGE و وسترن بلات بررسی شد. بررسی جذب یون کادمیم توسط پروتئین توسط دستگاه جذب اتمی صورت گرفت. نتایج توالی­یابی، صحت تراریختی را تائید کرد. بیان پروتئین تولید شده با روش های  SDS-PAGE و وسترن بلات تایید گردید. بررسی جذب فلز نشان داد که یک میلی گرم پروتئین SmtA می تواند به میزان 28 نانو مول یون کادمیم را جذب نماید.

واژه­های کلیدی: متالوتیونین، smtA، جذب فلزات سنگین

* نویسنده مسئول، تلفن: 03832324419 ، پست الکترونیکی:  saffar_b@sci.sku.ac.ir

مقدمه

در حال حاضر یکی از مهم­ترین مشکلات زیست ­محیطی، آلودگی ناشی از تجمع فلزات سنگین در محیط است که این آلودگی اثرات نامطلوبی بر سلامت انسان و اکوسیستم می­گذارد (22). از جمله فلزات سنگین، می توان کادمیم را نام برد که به وفور در محیط زندگی انسانها وجود دارد. این فلز از طرق مختلف وارد بدن شده و به علت خصوصیات فیزیکو شیمیایی، در متابولیسم بعضی از عناصر ضروری دخالت کرده و عوارض مختلفی از قبیل کم خونی، بیماری استخوانی، کبدی و کلیوی ایجاد می کند. برای برداشت این فلزات از محیط، از روشهای مختلف فیزیکی و شیمیایی استفاده شده است. امروزه از باکتریها، گیاهان و محصولات پروتئینی آنها نیز به این منظور استفاده می­شود (7). یکی از روشهای  حفاظتی موجودات در برابر آسیبهای ناشی از فلزات در سطح مولکولی و سلولی القای سنتز متالوتیونین­ها (MT) است (12).

متالوتیونین یک واژه عمومی برای یک ابرخانواده است که شامل پروتئینها و پپتیدهایی با وزن مولکولی پایین (7-6 کیلودالتون) می­باشند. نام­گذاری این دسته از پروتئینها به نام متالوتیونین به دلیل محتوای بالای تیولات سولفور و فلز در آنها است. متالوتیونین­ها نه­تنها در جانوران، بلکه در ریزسازواره­های یوکاریوتی و پروکاریوتی و حتی در گیاهان عالی دیده می شوند و بر اساس شباهتهای موجود در توالی و ارتباطات فیلوژنتیکی به چندین خانواده تقسیم می­شوند (14). این پروتئینها می توانند باعث خنثی شدن مقادیر اضافه فلزات سنگین در سلول شده و از میان­کنشهای غیراختصاصی ساختارهای سلول با فلزات سنگین جلوگیری کنند. همچنین به دلیل القاء شدن آنها توسط فلزات سنگین، می توان آنها را به عنوان بیومارکرهایی برای آلودگیهای غیر آلی در نظرگرفت (9).

سیانوباکتری سینکوکوس ایلانگاتوس سویه PCC7942 یک پروکاریوت تک سلولی فتوسنتزکننده است که در معرض بسیاری از تنشهای محیطی در طبیعت می باشد. این باکتری به فلزات سنگین محیط اطراف با القای پروتئینهایی مانند متالوتیونین پاسخ داده و در نهایت آسیبهای حاصل از آنها را تقلیل می دهد. smtA اولین متالوتیونین باکتریایی است که به دقت مورد مطالعه قرار گرفته است. پروتئین کد شده توسط این ژن توالی کوتاه تری نسبت به معادلهای خود در حیوانات و گیاهان دارد. این پروتئین دارای 56 اسید­آمینه، شامل 9 سیستئین می­باشد  و دارای یک خوشه حاوی چهار فلز می باشد که دو باقیمانده هیستیدینی در پیوند با فلز شرکت دارند (تصویر1) (3).

علاوه بر کاربردهای مختلف زیست محیطی به عنوان جاذب فلزات سنگین و حسگرهای زیستی این پروتئین کاربردهای پزشکی نیز دارد. هدف از این مطالعه، همسانه سازی و بیان ژن متالوتیونین smtA در باکتری  E. coliو بررسی جذب یون فلزی کادمیم توسط آن می باشد.

مواد و روشها 

مواد، سویه های باکتری و روشها: باکتریهای استفاده شده شامل سویه­های آزمایشگاهی همسانه ­سازی و بیانی باکتری  E.coliبه ترتیب با نامهای DH5α و BL21(DE3) از شرکت سیناژن تهیه گردید

تصویر 1- ساختار سه بعدی SmtA طبیعی مربوط به سیانوباکتری سینکوکوس ایلانگاتوس سویه PCC7942 . این پروتئین دارای یک خوشه، حاوی چهار فلز است. محل قرارگیری یونهای فلزی در این پروتئین در شکل با D, C, B, A نشان داده شده است. همان­طور که در تصویر دیده می­شود، در SmtA، دو باقیمانده هیستیدینی نیز در پیوند با فلز شرکت دارند (3).

از محیطهای کشت لوریا برتانی (LB) مایع و جامد جهت رشد باکتری E. coli استفاده گردید. آنتی­بیوتیک­ آمپی­سیلین به منظور غربالگری از شرکت سیگما خریداری شد. پلاسمید همسانه سازی با نام pTZ57R/Tکه جزء ناقلهایT/A-cloning  می­باشد، به صورت کیتInsT/Aclone PCR cloning kit  و پلاسمید بیانی  pET15b(+)از شرکت فرمنتاز خریداری شد. آنزیم Taqپلی­مراز از شرکت سیناژن، آنزیمهای محدودالاثر NdeI و HindIII و آنزیم DNA T4 لیگاز و RNase H از شرکت فرمنتاز تهیه شدند. روشهای مولکولی استفاده شده در این پژوهش بر اساس روشهای استاندارد می باشد (16).

تهیه و تکثیر ژن: ژن smtA یکی از ژنهای سیانوباکتری سینکوکوس ایلانگاتوس سویه PCC7942 می­باشد. در مطالعه قبلی، این ژن توسط اولیگونکلئوتیدهای همپوشان (شرکت ژن فن آوران) با روش PCR مورد سنتز قرار گرفته است (11). در این تحقیق از کدونهای ترجیحی E.coli جهت سنتز اولیگونکلئوتیدهای استفاده شده است (11). جهت تکثیر ژن، از واکنشPCR  در حجم 25 میکرولیتر استفاده شد. مقدار 5/2 میکرولیتر از بافر 10X ، 25/0 میکرو لیتر از آنزیمDNA polymerase Taq ،0.5 میکرولیتر (50mM) MgCl₂، 5/0 میکرولیتر(10mM) dNTP ، 5/0 میکرولیتر از آغازگرهای رفت و برگشت با غلظت 20 پیکو مول و 50 نانوگرم از محصول سنتز DNA در واکنش PCR استفاده شد. چرخه های واکنش PCR شامل یک مرحله واسرشتی 5 دقیقه ای ابتدایی در دمای 94 درجه سانتی گراد و 30 چرخه تکثیری شامل 30 ثانیه واسرشتی در دمای 94 درجه سانتی گراد، 30 ثانیه اتصال در دمای 57 درجه سانتی گراد و یک دقیقه گسترش در دمای 72 درجه سانتی گراد و در نهایت 5 دقیقه نگهداری در دمای 72 درجه سانتی گراد به منظور گسترش نهایی بود. محصول PCR بر روی ژل آگارز 1 درصد الکتروفورز گردید.

همسانه­سازی ژن smtA در ناقل T/A : محصول  PCRطبق روش کیت  InsT/Aclone PCR cloning kitدر ناقل pTZ57R/Tقرار گرفت. تراریختی ناقل نوترکیب حاصل با روش شوک حرارتی بدرون باکتری E.coli(DH5α) مستعد شده انجام شد و باکتریها بر روی محیط جامد LB حاوی Xgal-IPTG و آمپی­سیلین (به غلظت μg/ml 50) کشت داده شدند. برای تولید باکتریهای مستعد شده از روش کلرید کلسیم استفاده شد (16). بعد از گذشت 12 ساعت کلنیهای سفید و آبی مشاهده شدند. برای تأیید تراریختی، کلنیهای سفید موجود بر روی پلیت، Colony-PCR شدند. برای این منظور کلنیهای سفید بر روی محیطهای انتخابی کشت مجدد گردید. سپس مقداری از باکتری در 10 میکرولیتر آب مقطر استریل مخلوط و در ظرف آب جوش به مدت 5 دقیقه قرار گرفت. بعد از 2 دقیقه سانتریفیوژ در دور 5000 دوردردقیقه (rpm) از 2 میکرولیتر از مایع رویی به عنوان منبع پلاسمید نوترکیب برای PCR استفاده گردید.

زیرهمسانه­سازی ژن smtA در ناقل  pET15b(+) : ناقل T/A حاوی ژن مورد نظر و ناقل pET15b(+) با آنزیمهای محدودالاثرNdeI و HindIII مورد هضم قرار گرفتند. برای جداسازی قطعات مورد نظر محلولهای واکنش برش بر روی ژل آگارز 1 درصد با دمای ذوب پایین الکتروفورز شد. سپس توسط کیت استخراج DNA از ژل آگارز مورد جداسازی قرار گرفتند. باند مربوط به ژن و pET15b(+) برش یافته از ژل جدا شدند. واکنش الحاق ژن متالوتیونین با ناقل بیانی pET15b در حجم 20 میکرولیتر در دمای 16 درجه سانتی­گراد به مدت یک شب انجام شد و محصول الحاق به باکتریهای مستعد شده  DH5α و سپس  BL21(DE3)به روش شوک حرارتی انتقال یافت(13). سویه میزبان نوترکیب بر روی محیط LB حاوی عامل انتخابی آمپی­سیلین به مدت یک شب کشت گردید. به منظور غربالگری کلنیهای نوترکیب از میان کلنیهای کشت شده 5 کلونی انتخاب شد و مورد کلنی- PCR و هضم آنزیمی با آنزیمهای NdeI و HindIII قرار گرفتند. در ادامه کلنیهای مثبت (کلنیهای دارای باندی برابر نمونه PCR کنترل مثبت) جهت توالی یابی با استفاده از دو پرایمر موجود انتخاب شدند.

القای بیان و بررسی تولید پروتئین: به منظور بررسی بیان ژن، یک تک همسانه از باکتری تراریخت، در محیط  LB مایع دارای آنتی بیوتیک آمپی­سیلین با غلظت μg/ml 50 کشت شبانه داده شد و سپس 5 میلی­لیتر از آن به 50 میلی­لیتر از همان محیط تلقیح و پس از رسیدن OD به حد مطلوب (6/0-4/0) القاء توسط IPTG با غلظت یک میلی­مولار انجام شد. نمونه برداری قبل از القاء و در زمانهای مختلف پس از القاء (2ساعت، 4ساعت و 16ساعت) صورت گرفت. بدین نحو که هر بار 5 میلی لیتر از محیط جدا و مورد سانتریفیوژ قرار گرفت. نمونه‎ها درrpm 5000 به مدت 30 دقیقه سانتریفیوژ گردیدند و رسوب سلولی بعد از حل شدن در بافر  TEو تاثیر امواج ماوراء صوت (قدرت 80 درصد و پالس 5/0) در دورrpm 13000 در دمای 4 درجه سلسیوس به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شد. محلول رویی جهت بررسی بیان، بر روی ژل پلی اکریل امید با نام تریس-تریسین SDS-PAGE که منحصراً برای پروتئینها و پپتید­های کوچک کاربرد دارد، برده شد. روش آماده کردن این ژل نیز مانند ژل پلی­آکریل­آمید سدیم دو­دسیل ­سولفات  می باشد، با این تفاوت که این ژل دارای 3 قسمت می­باشد. ژل بالایی با غلظت 5، میانی 10 و پایینی 16 درصد اکریل امید می­باشد (17).

تعیین غلظت پروتئین نوترکیب به کمک روش برادفورد انجام شد. بدین صورت که بعد از تهیه آلبومین سرم گاوی (BSA) از شرکت سینا ژن بر اساس میزان جذب (OD) نمودار استاندارد در طول موج 595 نانومتر رسم گردید و در مرحله‎ی بعد با استفاده از آن غلظت پروتئین نوترکیب تخمین زده شد (8). به منظور انجام وسترن بلات ابتدا مقدار مساوی از پروتئین قبل از القاء و بعد از القاء روی ژل SDS-PAGE برده شد. پروتئینها از ژل پلی اکریل امید توسط بافر انتقال ( تریس 25 میلی مولار/ گلیسین 192 میلی مولار همراه با متانول 20 درصد) به مدت یک شبانه روز با شدت 80 میلی امپر به غشای PVDF منتقل شدند. مرحله مسدود سازی با قرار دادن کاغذ در  Skim Milk 5 درصد به مدت دو ساعت صورت گرفت. سپس آنتی بادی mouse anti-(His)6 peroxidase (شرکت سیتو متین ژن) با رقت 1 به 2000 اضافه گردید. پس از شست و شوی کاغذ PVDF با بافر شست و شو (Tris  02/. مولار، NaCl نیم مولار و HCL  6نرمال) 3 مرتبه و هر بار به مدت 5 دقیقه، سوبسترای TMB اضافه گردید. با ظاهر شدن باند آبی تیره پروتئین مورد نظر شناسایی گردید.

جذب فلز: جهت بررسی توانایی پروتئین مورد نظر در اتصال به یونهای کادمیم از دستگاه جذب اتمی (GBC M932 plus) با روش تغییر یافته صفار و همکاران استفاده گردید ( 15). به محلول پروتئین با غلظت مشخص کلرید کادمیم با غلظت نهایی 2/0 میلی مولار اضافه شد (15). نمونه ها به مدت دو ساعت در انکوباتور شیکردار در دمای 37 درجه سانتی گراد قرار داده شدند. سپس به آن استن با غلظت نهایی 80 درصد (v/v) اضافه شده و به آرامی تکان داده شد تا به خوبی مخلوط گردد. بعد از نگهداری بر روی یخ به مدت یک ساعت، محلول مورد نظر در دمای 4 درجه به مدت 30 دقیقه با دور  rpm15000 سانتریفیوژ گردید تا پروتئینهای مذکور رسوب گردند. محلول رویی برداشته شده و توسط دستگاه جذب اتمی میزان یونهای متصل نشده اندازه گیری گردید.

نتایج

تهیه و تکثیر ژن : پس از تکثیر ژن smtA با استفاده از پرایمر های رفت و برگشت محصول PCR بر روی ژل اگارز 1 درصد  الکتروفورز گردید همان طور که در تصویر2 مشاهده می شود مطابق انتظار فقط یک باند حدود 200 جفت بازی روی ژل مشاهده می شود.

تصویر2-  تکثیر ژن به کمک PCR و تأیید آن توسط الکتروفورز برروی ژل آگارز. ستون اول M))نشانگر 100 جفت بازی SM0321  فرمنتاز. ستون دوم محصول PCR که نشان دهنده باند 200 جفت بازی ژن سنتز شده است.

همسانه سازی ژن smtA در ناقل pTZ57R/T: محصول  PCRدر ناقل pTZ57R/Tقرار گرفت و محصول الحاق به باکتری E.coli(DH5α) مستعد شده منتقل گردید و کلنیهای سفید و آبی مشاهده شدند. برای تأیید تراریختی، کلنیهای سفید موجود بر روی پلیت کشت داده شده و مورد Colony PCR قرار گرفتند. نتایج حاصل بر روی ژل اگارز 1 درصد مورد ارزیابی قرار گرفت. تصویر 3 محصول 200 جفت بازی را نشان می دهد.

تصویر 3 - تأیید کلنیهای حاوی ناقل smtA-pTZ57R/T  توسطPCR از کلنیهای سفید منتخب. ستون اول M)  (نشانگر 100 جفت بازی SM0321  فرمنتاز. ستونهای دوم و سوم نشان دهنده محصول PCR از کلنیهای نوترکیب که باند مورد انتظار در ناحیه 200 جفت بازتشکیل داده اند.

زیر همسانه سازی ژن smtA در ناقل بیانی pET15b : قطعات بریده شده ژن smtA و ناقل pET15b بریده شده از روی ژل آگارز تخلیص شد و با یکدیگر الحاق شدند. محصول الحاق به باکتریهای مستعد DH5α و سپس BL21(DE3) منتقل شد و بعد از کشت روی محیط حاوی آمپی سیلین ، حضور پلاسمید نوترکیب توسط روش هضم آنزیمی مورد تأیید قرار گرفت (تصویر 4). تأیید نهایی توسط تعیین توالی صورت گرفت (شرکت ژن فن آوران). نتیجه تعیین توالی نشان داد که توالی ژن مذکور فاقد نوارایی ناخواسته می باشد.

بیان ژن smtA و تأیید آن: ژن smtA توسط  IPTGالقاء شد و نمونه های پروتئینی تحت شرایط دناتوره به همراه نشانگر پروتئینی (SM1889) روی ژل پلی آکریل آمید تریس تریسین الکتروفورز شدند (تصویر 5). در مقایسه با نشانگر پروتئینی در ناحیه 10 کیلودالتونی باند پروتئینی نوترکیب مشاهده شد و با وسترن بلاتینگ تأیید گردید (تصویر 6). بیشترین بیان در زمان 4 ساعت پس از القاء مشاهده شد. در تصویر 5 وسترن بلاتینگ با استفاده از آنتی بادی علیه His-Tag پروتئین نوترکیب نشان داده شده است.

تصویر4- محصول برش پلاسمید pET15b  نوترکیب توسط آنزیمهای NdeI و HindIII:1:   pET15bبرش نخورده 2: pET15b برش خورده و خروج قطعه 200جفت بازی،  M : مارکر 1000 جفت بازیSM0312  فرمنتاز

تصویر5- Tris-Tricin SDS-PAGE حاصل از پروتئین نوترکیب بیان شده. M:  مارکر وزن مولکولی SM1889 (فرمنتاز). 1: باکتری BL21(DE3) فاقد پلاسمید2: باکتری ترانسفرم شده با ناقل نوترکیب قبل از القاء، 3و 4 به ترتیب 2و4 ساعت پس از القاأ با IPTG . فلشها باند پروتئین مورد نظر را نشان می دهد.

تصویر6- وسترن بلاتینگ. M: مارکر وزن مولکولی (abcam Ultra protein Ladder) 1: نمونه پروتئین 4 ساعت پس از القاء نشان داده شده است 2: باکتری ترانسفرم شده با ناقل نوترکیب قبل از القا (به عنوان کنترل منفی). فلش باند مورد نظر را نشان می دهد.

جذب یون کادمیوم توسط پروتئین نوترکیب: پس از تأیید بیان پروتئین نوترکیب، محلول کلرید کادمیم با غلظت نهایی 2/0 میلی مولار به پروتئین مورد نظر اضافه شد و پس از رسوب پروتئین، میزان کادمیم متصل نشده با روش جذب اتمی مورد ارزیابی قرار گرفت. بنابراین با توجه به غلظت اولیه یون کادمیم می توان  میزان یون کادمیم جذب شده را محاسبه نمود. اختلاف میزان جذب پروتئین کنترل و نمونه، بیانگر میزان جذب پروتئین نوترکیب بیان شده می باشد. جدول 1،  میزان جذب  یون کادمیم  به ازای هر میلی گرم پروتئین را نشان می دهد.

جدول 1 : بررسی میزان جذب  یون کادمیم  به ازای میلی گرم پروتئین

پروتئین نمونه: پروتئین حاصل از باکتری تراریخته حاوی ژن متالوتیونین 4 ساعت بعد از القاء، پروتئین کنترل :پروتئین حاصل از باکتری حاوی پلاسمید قبل از القاء. نتایج به دست آمده حاصل 3 تکرار مستقل می باشد که نشان دهنده تکرار پذیری آزمایش می باشد.