نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجو دانشگاه مالک اشتر

2 استادیار دانشگاه صنعتی مالک اشتر

3 دانشیار دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی

چکیده

زمینه: فوتوپروتئین اکورین جدا شده از عروس دریایی اکوریا ویکتوریا ، فوتوپروتئین حساس به کلسیم است که از اپواکورین و گروه پروستاتیک کوالنترازین تشکیل شده و دراثر اتصال به کلسیم سبب نشر نور آبی می شود. این پروتئین مونومری شامل چهار موتیف EF hand است که سه موتیف آن می تواند به کلسیم متصل شود. از سوی دیگر افزایش کلسیم در مغز می تواند منجر به بیماری های عصبی نظیر آلزایمر، پارکینسون و سکته مغری گردد. اکورین با توجه به اینکه در گروه پروتئین های متصل شونده به کلسیم (CBPs) قرار دارد، همانند یک اسفنج می تواند کلسیم مازاد را در نرون های عصبی جذب نماید. هدف تحقیق حاضر ایجاد جهش های هدفمند در اکورین به منظور افزایش حساسیت آن به کلسیم است.
مواد وروش‌ها: در این تحقیق ، با استفاده از روش جهش زایی هدفمند، دو جهش نقطه ای در اسیدهای آمینه آسپاراژین 28 و لیزین 30 K30T)و (N28D در ناحیه EF hand  طراحی گردید و درون سیستم بیانی pET21 کلون و بیان شد. با توجه به طراحی دنباله هیستیدین، تخلیص پروتئین های جهش یافته به کمک ستون های نیکله انجام شد و در نهایت حساسیت جهش های مذکور به کلسیم با نمونه اولیه، مقایسه گردید.
نتیجه گیری: نتایج حساسیت پروتئین های تولیدی به کلسیم، نشان داد که جهش K30T در مقایسه با نمونه اولیه ، حساسیت و میل ترکیبی بالاتری به کلسیم از خود نشان می دهد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

The role of Asn 28 and Lys 30 of aequorin photoprotein in calcium sensitivity

نویسندگان [English]

  • Masoumeh Esmaeili Nezhad 1
  • Mehdi Zeinoddini 2
  • nader Maghsoodi 3

چکیده [English]

Introduction: The photoprotein aequorin, isolated from the jellyfish Aequoera victoria, is a calcium-sensitive bioluminescent protein formed with the apoprotein apoaequorin and the prosthetic group coelenterazine that emits light upon calcium binding. The protein is believed to be a monomer containing four helix-loop-helix motifs (EF hand) of which three domains can bind calcium. On the other hand, excess calcium in brain is associated with many neurodegenerative diseases and conditions including Alzheimer’s, Parkinson’s, and stroke. Aequorin as a natural calcium binding protein taking up excess calcium in brain cells much like a sponge. The aim of this study is production of mutant aequorin for calcium sensitivity increase.
Material and method: The mutated aequorin (N28D, K30T), in EF hand I, were prepared using site directed mutagenesis and subcloned in the pET21 expression vector. According to design of His-taq, purified mutants aequorin prepared using nickel affinity chromatography. Finally calcium sensitivity compared between wild-type and mutant aequorin.
Results: Calcium sensitivity of mutated aequorin indicated aeq-K30T is more sensitive than wild type and aeq-N28D.

کلیدواژه‌ها [English]

  • photoprotein aequorin
  • Mutation
  • Calcium
  • sensitivity

مطالعه اهمیت و نقش اسیدهای آمینه آسپارژین 28 و لیزین 30  فوتوپروتئین اکورین در جذب کلسیم

معصومه اسماعیل نژاد 1، مهدی زین الدینی1* و نادر مقصودی2 

1 تهران، دانشگاه صنعتی مالک اشتر، پژوهشکده علوم و فناوری زیستی

2 تهران، دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی، مرکز علوم اعصاب

تاریخ دریافت: 19/1/93                تاریخ پذیرش: 3/8/93 

چکیده

فوتوپروتئین اکورین جدا شده از عروس دریایی اکوریا ویکتوریا، فوتوپروتئین حساس به کلسیم است که از اپواکورین و گروه پروستاتیک کوالنترازین تشکیل شده و دراثر اتصال به کلسیم سبب نشر نور آبی می شود. این پروتئین مونومری شامل چهار موتیف EF hand است که سه موتیف آن می تواند به کلسیم متصل شود. از سوی دیگر افزایش کلسیم در مغز می تواند منجر به بیماریهای عصبی نظیر آلزایمر، پارکینسون و سکته مغری گردد. اکورین با توجه به اینکه در گروه پروتئینهای متصل شونده به کلسیم (CBPs) قرار دارد، همانند یک اسفنج می تواند کلسیم مازاد را در نرونهای عصبی جذب نماید. هدف تحقیق حاضر ایجاد جهشهای هدفمند در اکورین به منظور افزایش حساسیت آن به کلسیم است. در این تحقیق ، با استفاده از روش جهش زایی هدفمند، دو جهش نقطه ای در اسیدهای آمینه آسپاراژین 28 و لیزین 30  K30T)و  (N28D در ناحیه EF hand I  طراحی گردید و درون سیستم بیانی pET21 کلون و بیان شد. با توجه به طراحی دنباله هیستیدین، تخلیص پروتئینهای جهش یافته به کمک ستونهای نیکله انجام شد و در نهایت حساسیت جهشهای مذکور به کلسیم با نمونه اولیه، مقایسه گردید. نتایج حساسیت پروتئینهای تولیدی به کلسیم، نشان داد که جهش K30T در مقایسه با نمونه اولیه ، حساسیت و میل ترکیبی بالاتری به کلسیم از خود نشان می دهد.

واژه های کلیدی: فوتوپروتئین اکورین ، جهش ، کلسیم، حساسیت.

* نویسنده مسئول، تلفن: 02122974600 ، پست الکترونیکی:  zeinoddini52@mut.ac.ir 

مقدمه

 

در سال 1961 یک دانشمند ژاپنی مقیم آمریکا به نام اوسامو شیمومورا برای اولین بار یک پروتئین غیرمعمول بیولومینسانس را از نوعی ستاره دریایی به نام  اکوریا ویکتوریا شناسایی کرد که براساس نام ژنریک عروس دریایی مذکور آن را اکورین نامید (18). این پروتئین قدرت انتشار نور را در محلولهای آبی در اثر افزودن مقدار کمی کلسیم (Ca2+) داراست. کمپلکس اکورین شامل سه بخش مجزا است، یک آپوپروتئین حدود 23 کیلودالتونی به نام اپواکورین، مولکول اکسیژن و یک گروه پروستتیک به نام کوالنترازین (از خانواده لوسیفرین).  در حقیقت کمپلکس اکورین مشابه آنزیم است که وقتی 3 یون کلسیم به این کمپلکس باند می شود، کوالنترازین به کوالنترامید، اکسیده می شود و سبب آزاد شدن   اپواکورین ، CO2 ، و نوری با طول موج 469 نانومتر  (آبی رنگ) می شود. از نظر ساختاری اکورین پروتئینی با 189 اسید آمینه است که دارای سه جایگاه اتصال به کلسیم در هنگام فعالیت است. به دلیل حساسیت بالای اکورین به غلظت کلسیم، سازگاری زیستی آن با سلولهای زنده و دارا بودن درصد بسیار بالای سیگنال نسبت به نویز پس زمینه، از این فتوپروتئین به عنوان مارکر جهت شناسایی مقادیر پایین محصولات معدنی(کمتر از 01/0 مولکول) و به خصوص کلسیم استفاده می شود (3، 9 و 10). با توجه به اینکه تهیه اکورین طبیعی از عروس دریایی زمان بر بوده و بازده کمی نیز دارد در سال 1985 به طور همزمان دو گروه آزمایشگاهی به رهبری پراشر و اینوی، cDNA آپو اکورین را با استفاده از تکنیکهای مهندسی ژنتیک، کلون کردند  (11و 16). همچنین برمبنای کاربردهای زیاد اکورین، تا به امروز جهشهای مختلفی بر روی این پروتئین انجام شده است که سبب افزایش کارآیی و ایجاد خصوصیات بیشتر برای آن شده است (6، 7، 13 و 15). از سوی دیگر مطالعات محققین نقش و ارتباط پروتئینهای اتصالی به کلسیم (CaBPs) نظیر کالبایندین و اکورین را در حفاظت از سلولهای عصبی نشان می دهد. اغلب این مطالعات بیانگر این نکته مهم بوده است که در مغز حیوانات مسن نظیر انسان، کاهش چشمگیر CaBPs مشاهده می شود (2، 4 و 22). با در نظر گرفتن اینکه اکورین در گروه پروتئینهای متصل شونده به کلسیم قرار دارد، از این پروتئین مشابه اسفنج به منظور مهار کلسیم اضافی تولید شده در بیماریهایی آسیب رسان به نرونهای عصبی، استفاده می شود. به طوری که از اکورین به عنوان ماده محافظ سلولهای عصبی در قالب دارو و مکمل غذایی به نام پریواژن استفاده شده است (1 و 17). در تحقیق حاضر با ایده برداری از برخی CaBPs نظیر کالمودولین، دو جهش در موتیف EF Hand I K30T) و (N28D اعمال شد تا حساسیت پروتئین به کلسیم در مقایسه با نمونه اولیه مورد ارزیابی قرار گیرد.

مواد و روشها

ایجاد جهشهای هدفمند: جهشهای هدفمند،  براساس روش Quick change site directed mutagenesis ، انجام شد. پرایمر های الیگونوکلئوتیدی به طور مکمل مخالف رشته های پلاسمید طراحی شده و در طی سیکلهای دمایی گسترش می یابد (جدول 1). براساس روش مذکور ، تکثیر پلاسمیدی با استفاده از آنزیم پلیمراز PWO صورت گرفته و پس از هضم رشته های اولیه با آنزیم محدودگر DpnI (10 U/µl) ، درون باکتریهای مستعد شده XL-1 Blue انتقال یافت. در ادامه استخراج پلاسمید از کلونهای حاصله به دست آمده و با استفاده از دو آنزیم محدودگر NdeI و EcoRI ، صحت کلونها تأیید و جهت بررسی جهشهای مربوطه به شرکت ژن فناوران ارسال گردید. لازم به توضیح است که پلاسمید pET-aequorin (کلون ژن رمز کننده اکورین درون جایگاههای برش NdeI و EcoRI پلاسمید pET21) از مطالعه قبلی به دست آمد (23).

 

جدول 1 - توالی و اندازه پرایمرهای مورد استفاده در این تحقیق.

اندازه (bp)

توالی

نام پرایمر

33

5/ - CTG GAT GTG AAC CAC GAT GGT AAA ATC TCT CTG – 3/

F-N-28-D

33

5/ - CAG AGA GAT TTT ACC ATC GTG GTT CAC ATC CAG – 3/

R-N-28-D

36

5/ - GTG AAC CAC AAC GGT ACC ATC TCT CTG GAC GAA ATG – 3/

F-K-30-T

36

5/ - CAT TTC GTC CAG AGA GAT GGT ACC GTT GTG GTT CAC – 3/

R-K-30-T


بیان و خالص سازی فوتوپروتئین اکورین جهش یافته: پس از تأیید مولکولی حضور توالی جهش یافته مورد نظر در اکورین اولیه، وکتور نوترکیب به سلولهای BL21(DE3) مستعد شده، ترانسفورم گردید. بعد از کشت تک کلنی حاصله، القای بیان با یک میلی مولار IPTG در دمای 30 درجه سانتی گراد انجام شد. با توجه به طراحی دنباله هیستدین در انتهای آمینو پروتئین، پس از القاء با استفاده از ستون Ni-NTA ، دو نوع پروتئین جهش یافته  aeq-N28D و aeq-K30T خالص سازی و با استفاده از SDS-PAGE خلوص آنها مورد آنالیز قرار گرفت. همچنین پروتئینها با استفاده از روش برادفورد تعیین غلظت شده و در غلظت mg/ml 1 به همراه mM 30 سوربیتول، در دمای 80- درجه سانتی گراد، ذخیره سازی شدند.

ارزیابی عملکرد فوتوپروتئین اکورین جهش یافته: 5 میکروگرم از نمونه پروتئین بدون جهش یا جهش یافته به 15 میکرولیتر از بافر 1 (50 mM Tris, 10 mM DTT, 5 mM EDTA, pH 8) اضافه شد. سپس 5 میکرومولار از کوالنترازین به آن افزوده شده و به مدت حداقل یک ساعت در دمای 4 درجه سانتی گراد، انکوبه گردید. در نهایت نیز پس از 10 الی 20 بار رقیق سازی مخلوط مذکور با بافر 2 (50 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 8)، با اضافه کردن 100 میکرولیتر از بافر 3 (50 mM Tris, 15 mM CaCl2, 5 mM EDTA, pH 8) بلافاصله نشر نوری (relative luminescence, RLU) به کمک دستگاه لومینومتر (Berthold Detection Systems, GmbH)، خوانش شد. جهت انجام تیتراسیون کلسیم، کلرید کلسیم با استفاده از EDTA جهت حذف یونهای زائد خالص سازی و در طی چند مرحله با استفاده از کوره در دمای بالا (350 درجه سانتی گراد)، آب گیری شد. در ادامه دو میکرولیتر از مخلوط 50 میکرولیتری اشاره شده در بالا به 100 میکرولیتر محلولهای رقیق شده از غلظتهای 9-10-2-10 کلرید کلسیم انتقال داده شد و شدت نور حاصل از مقادیر مختلف غلظت کلسیم به وسیله دستگاه لومینومتر خوانش گردید و میانگین مقادیر متفاوت از شدت نور پروتئینها، حاصل از چند مرحله خوانش اندازه گیری و سپس نمودار حاصل ترسیم و حساسیت به کلسیم در جهشهای مختلف با پروتئین اکورین فاقد جهش مقایسه گردید. لازم به توضیح است که آزمایشات با سه بار تکرار مورد آنالیز قرار گرفت.

نتایج

ساخت سازه ژنی فوتوپروتئین اکورین جهش یافته: پس از انجام جهشهای هدفمند ، محصول PCR بر روی ژل آگاروز آنالیز شد که تکثیر پلاسمید با اندازه حدود kb 6 بیانگر صحت تکثیر است (شکل 1- الف). همچنین پس از هضم آنزیمی DpnI و انتقال پلاسمید به درون باکتری E.coli ، از کلونهای به دست آمده مجدد استخراج پلاسمید صورت گرفته و با دو آنزیم NdeI و EcoRI هضم شد که آزاد شدن قطعه حدود 625 بازی بیانگر حضور اکورینهای جهش یافته درون پلاسمید (pET-aequorin) است (شکل 1-ب). پلاسمیدهای تأیید شده جهت تعیین ترادف، به شرکت مربوطه ارسال گردید که نتایج تعیین ترادف نیز بیانگر صحت جهشهای اعمال شده بود (شکل 2).

تولید پروتئینهای جهش یافته: در ادامه پلاسمیدهای pET-aequorin بدون جهش و جهش یافته، درون باکتری بیانی ، انتقال یافته و پس از القاء با استفاده از ستونهای Ni-NTA خالص شدند. مطابق شکل 3، خلوص مطلوب از پروتئینهای جهش یافته به دست آمده است.

خصوصیات پروتئینهای جهش یافته: فعالیت اکورین اولیه و جهش یافته براساس روش سنجش ارائه شده در بخش مواد و روشها و با استفاده از دستگاه لومینومتر صورت گرفت. نتایج حاصل از این آزمایش نشان داد که aeq-K30T فعالیت بالاتر و aeq-N28D عملکرد پایین تری نسبت به اکورین بدون جهش (aeq.) از خود نشان می دهد (شکل 4).

تیتراسیون کلسیم پروتئین نوترکیب اولیه و جهش یافته: جهت تعیین میزان حساسیت به کلسیم نمودار منفی لگاریتم غلظت کلسیم در برابر لگاریتم شدت نور ترسیم گردید و نسبت به نمونه اکورین فاقد جهش مقایسه شد. نتایج حاصله نشان داد که جهش K30T  به مقادیر کمتر کلسیم واکنش می دهد. به عبارت دیگر این جهش دارای حساسیت بالاتری به کلسیم در مقایسه با جهش N28D و اکورین اولیه است (شکل 5) .

 

 

شکل 1- الف- نتایج ژل الکتروفورز مربوط به محصول PCR دو جهش انجام شده بر اساس شرایط و برنامه جهش نقطه ای Quick Change . 1) N28D ، 2) K30T ، 3) مارکر 1 kb. ب- نتایج حاصل از هضم آنزیمی پلاسمید های  pET-aequorin جهش یافته، با دو آنزیم NdeI و EcoRI. 1) K30T ، 2) N28D،  3) مارکر 100bp. 

  

شکل 2- نتیجه مربوط به تعیین ترادف جهشهای N28D  و K30T.

 

شکل 3- نمونه خالص پروتئین فاقد جهش و جهش یافته. 1)اکورین جهش یافته aeq-N28D، 2) اکورین بدون جهش (aeq.)، 3)مارکر وزن مولکولی (از پایین به بالا: 4/14، 8/18، 25، 35، 45، 66، 116 کیلودالتون)، 4) اکورین جهش یافته aeq-K30T .

 

شکل 4- آنالیز عملکرد اکورین اولیه (aeq.) و جهش یافته. (آزمایشات با سه بار تکرار می باشد.)

  

شکل 5- نمودار مقایسه حساسیت به کلسیم در اکورینهای جهش یافته و بدون جهش (aeq.).


بحث

پروتئینهای متصل شونده به کلسیم (CBPs) نقش مهمی در کاهش غلظت کلسیم داخل سلولی نرونها دارند. تحقیقات نشان داده که تنظیم سطح کلسیم در ایسکمی از طریق CBPs تسهیل می شود. همچنین مشخص شده است که در طی کهولت، کاهش در CBPs نرونی مانند کالبایندین صورت می گیرد. CBPs به طور طبیعی در سراسر بدن یافت می شود و مسئول حفظ سلامت سلولها در برابر کهولت است. در انسان سالم یک میزان فراوان از این نوع پروتئین، وجود دارد به طوری که قدرت تنظیم کلسیم را فراهم می کند،  ولی در افراد مسن به جایگزینی این پروتئینهای کاهش یافته نیاز است (5). از سال 2004 یک شرکت تحقیقاتی اقدام به ارائه دارو و مکمل غذایی به نام پریواژن نمود که ماده اولیه آن از اکورین تشکیل شده است و سبب جلوگیری از پیشرفت آلزایمر می گردد (1و 17). اکورین دسته ای از CBPs است که قادر به جذب کلسیم اضافی درون سلولهای عصبی است. از نظر ساختاری این پروتئین دارای چهار موتیف EF-hand است که از طریق سه موتیف می تواند کلسیم را جذب نماید. بر اساس مطالعات صورت گرفته، درقسمت  EF-hand های CBPs ، 12 اسیدآمینه وجود دارد که اسیدآمینه های 1، 3، 5، 7، 9 و 12 می تواند با کلسیم واکنش دهد (شکل 6) (8 و14).

مطالعات نشان داده است که تغییر در این موقعیتها باعث از دست رفتن زنجیره جانبی اسیدآمینه های اسیدی و یا تغییر در میل اتصال به کلسیم می گردد. به طوری که اعمال جهش  D133E در موقعیت +Z ، در EF-hand کالمودولین سبب کاهش میل تمایلی آن به کلسیم شده است (21). همچنین جهشهای زیادی تاکنون بر روی EF-hand های اکورین انجام شده است. جهشهای D119A در موقعیت +y ، D117G در موقعیت +x و D153G در موقعیت +x ، سبب کاهش حساسیت به کلسیم شده است. در حالی که جهشهای N26D سبب افزایش حساسیت به کلسیم شده است ( 12، 19 و 20).

 

شکل 6- تصویری از موتیف EF hand و موقعیتهای متصل شونده به کلسیم.

بر اساس مطالعات جهش زایی انجام گرفته در موقعیتهای مذکور و برمبنای مقایسه اسیدهای آمینه موجود در EF-hand کالمودولین و اکورین ، دو جهش K30T و N28D ، در ناحیه EF hand I اکورین طراحی گردید. در این حالت آسپارژین 28 در موقعیت +z به اسید آمینه اسیدی آسپاراتیک و اسیدآمینه بازی لیزین 30 در موقعیت -y به ترئونین تبدیل می شود تا با افزایش شرایط اسیدی لوپ مذکور، میل تمایلی آن به کلسیم بررسی گردد. نتایج حاصله نشان داد که جهش K30T سبب افزایش فعالیت و همچنین افزایش حساسیت پروتئین اکورین به کلسیم در مقایسه با پروتئین جهش نیافته و جهش N28D شده است که می توان با تولید آن در راستای طراحی بهینه دارو و مکمل غذایی پریواژن جهت جلوگیری از پیشرفت بیماری آلزایمر، اقدام نمود.         

1. ALSUnangled Group, ALSUntangled no.18: apoaequorin (Prevagen), 2013.Amyotroph Lateral Scier Frontotemporal Degener  ; 14(1): 78-9.

2. Baimbridge, KG., Celio,  MR., Rogers,  JH. 1992. Calcium-binding proteins in nervous system. Trends in Neroscience . 15 : 303-8.

3. Brini, M, 2008.Calcium-sensitive photoproteins. Methods. 46: 160–66.

4. Cedervall, T., Berggard, T., Borek, V., et al. 2005. Redox sensitive cysreine residues in Calbindin D28K are structurally and functionally important. Biochem.  44: 684- 93.

5. Detert, JA., Adams, El., Lescher, JD., et al. 2013. Pretreatment with apoaequorin protects hippocampal CA1 neurons from oxygen-glucose deprivation. PLoS One. 8(11): e79002.

6. Dikici, E., Qu, X., Rowe, L., et al. 2009. Aequorin variants with improved bioluminescence properties. Protein Eng. Des. Sel. 22(4): 243-48.

7. Frank, LA.,   Borisova, VV., Markova, SV., et al. 2008. Violet and greenish photoprotein obelin mutants for reporter applications in dual-color assay, Anal.  Bioanal.  Chem. 391:2891–96.

8. Gifford, JL., Walsh, MP., Vogel, HJ. 2007. Structures and metal-ion binding properties of the Ca2+ binding helix-loop-helix EF-hand motifs. Biochem. J. 405: 199-221.

9. Head,  JF., Inouye, S., Teranishi, K., et al. 2000. The crystal structure of the photoprotein aequorin at 2.3 Å resolution. Nature. 405: 372–76.

10. Inouye, S. 2004. Blue fluorescent protein from the calcium-sensitive photoprotein aequorin is a heat resistant enzyme, catalyzing the oxidation of coelenterazine. FEBS. 577 : 105–10.

11. Inouye, S., Noguchi, M., Sakaki, Y., et al. 1985. Cloning and sequence analysis of cDNA for the luminescent protein aequorin. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA). 82 : 3154-58.

12. Kendall, JM., Sala-Newby, G., Ghalaut, V., et al. 1992. Engineering the Ca+2 activated photoprotein aequorin with reduced affinity for calcium. Biochem. Biophy. Res. Comm. 187(2): 1091-97.

13. Lambolez, B., Gibelin,  N., Bourout, G., et al. 2005. Mutated photoproteins and their uses , European patent, EP 1404711.

14. Lewit-Bentley, A., Rety, S. 2000. EF-hand calcium binding proteins. Cuur. Opin. Struct. Biol. 10(6): 637-43.

15. Prasher,  DC. 1992.  Modified apoaequorin having increased bioluminescence activity, U.S. patent, 5541309.

16. Prasher,  D., McCann,  RO., Cormier , MJ. 1985. Cloning and  expression of the cDNA coding for aequorin, a bioluminesance calsium-binding protein,  Biochem.  Biophys.  Res.  Commun. 126 : 1259–1268.

17. Quincy Bioscience, Prevagen quality of life study, Data on file, 2009. http://quincybioscience.com/ files/Aequorin-Protects-Adult-and-Aging-Hippocampal-CA1-Neurons-From-Ischemic-Cell-Death.pdf

18. Shimomura,  O., 1995. A short story of qequorin. Biol.  Bull. 189 : 1-5.

19. Tricoire,  L., Tsuzuki,  K., Courjean,  O., et al. 2006. Calcium dependence of aequorin biolumionesence dissected by random mutagenesis. PNAS. 103(25): 9500-5.

20. Tsuzuki,  K., Tricoire,  L., Courjean,  O., et al. 2005. Thermostable mutants of the photoprotein aequorin obtained by in vitro evolution. J.  Bio.  Chem. 280(40) :34324-31.

21. Wu, X., Reid, RE., 1997. Structure/calcium affinity relationships of site III of calmodulin: testing the acid pair hypothesis using calmodulin mutants. Biochem. 36(28): 8649-56.

22. Yenar, MA., Minami, M., Sun, GH., et al. 2001. Calbindin D28K overexpression protects striatal neurons from transient focal cerebral ischemia. Stroke. 32: 1028-35.

23. Zeinoddini, M., Khajeh, K. , Hosseinkhani, S., et al. 2013. Stabilisation of Recombinant Aequorin by Polyols: Activity, Thermostability and Limited Proteolysis. Appl.  Biochem.  Biotechnol . 170(2): 273-280.