نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانش آموخته کارشناسی ارشد دانشگاه اصفهان

2 عضو هیئت علمی/ دانشگاه اصفهان

3 هیات علمی

4 هیات علمی دانشگاه اصفهان

5 هیات علمی دانشگاه شهید بهشتی

چکیده

پروتئین‌های غیراختصاصی ناقل لیپید 2(nsLTP2) یکی از اعضای خانواده پرولامین‌ها هستند که به‌ دلیل ساختار ویژه خود توانایی انتقال ترکیبات لیپوفیل مختلفی را دارند. با وجود مزیت‌های نسبی پروتئین LTP2 در انتقال دارو، خاصیت آلرژنی این پروتئین‌ها نیز گزارش شده است. هدف مطالعه حاضر بررسی توالی و ساختار پروتئین nsLTP2 برنج ایرانی و نیز بهبود برخی از ویژگی های آن برای استفاده در سیستم‌های تحویل دارو، توسط ابزارهای بیوانفورماتیک است. مقایسه توالی‌ پروتئین های nsLTP2 انواع برنج، حداقل 51% شباهت بین گونه‌های مختلف را نشان می‌دهد. بر اساس ارزیابی های فیلوژنی مشخص شد که بیشترین شباهت بین توالی ژن این پروتئین با گونه ژاپنی (Accession NO. NP 0011048723.1) وجود دارد. موتیف‌ها و جایگاه‌های مختلف nsLTP2 برنج ایرانی با کمک آنالیز توالی به دست آمد. همچنین مطالعات بیوانفورماتیکی نشان دهنده 4 جایگاه‌ با خاصیت‌ شبه‌آنتی‌ژنی است که 3 عدد آن بعد از تغییرات پس‌ از ترجمه‌ باقی می‌ماند و حضور آنها می‌تواند خاصیت آلرژنی این پروتئین‌ها را توجیه کند. همچنین، بررسی توالی دو گونه ژاپنی و ایرانی موید این است که اسیدهای آمینه شرکت کننده در جایگاه فعال، به-طورکامل حفاظت شده است. به‌منظور مطالعه تاثیر حذف توالی‌های آلرژن بر تمایل به لیگاندهای هیدروفوب، از روش مدل‌سازی در راستای تعیین ساختار، استفاده گردید. نتایج تحقیق حاضر نشان داد که در صورت اعمال تغییراتی در توالی و حذف بخش‌های آلرژن nsLTP2، احتمالا می‌توان بازده پروتئین را در سیستم‌های تحویل دارو افزایش داد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Sequence Analyses, Antigenic Characteristic and Three-Dimensional Structure of Rice nonspecific Lipid Transfer Protein 2: a Bioinformatics Study

نویسندگان [English]

  • fatemeh zahra darvishi 1
  • Mehran Miroliaei 2

2 university of isfahan

چکیده [English]

Nonspecific lipid transfer protein 2 (nsLTP2) is among prolamin super family, capable of transferring various lipophilic molecules such as sterols. Despite advantages of the protein in drug delivery systems, there are some reports on its allergenic properties. Comparative sequence analysis displayed at least 51% homology in different species of rice-nsLTP2. The aim of the current study was to evaluate gene sequence and protein structure analysis of Iranian rice-nsLTP2, by means of bioinformatics tools, to improve its potential capability for drug delivery systems. Gene sequence homology assessment revealed resemblance mostly with Japonica species (Accession NO. NP-0011048723.1). The presence of various specific sites and motifs in the structure of nsLTP2 were determined by sequence analysis. Preliminary studies demonstrated four antigenic determinants in the primary sequence of the protein, which three of them retain after post translational modification. Moreover, sequence assessment revealed that those residues contributing in the protein cavity are conserved totally among Japonica and Iranian species. Modeling approaches were used to determine the influence of deletion of allergenic sites on protein affinity toward hydrophobic ligands. The obtained results revealed the efficacy of nsLTP2, as a drug carrier protein, could be improve by appropriate swap at specific residues and elision of allergenic sites.

کلیدواژه‌ها [English]

  • nsLTP2
  • Homology modeling
  • drug delivery
  • Antimicrobial activity

مطالعه توالی، خاصیت آنتی­ژنی و ساختار سه بعدی پروتئینهای غیراختصاصی ناقل لیپید2 در برنج ایرانی: مطالعه بیوانفورماتیکی

فاطمه زهرا درویشی1، مهران میراولیائی1*، رحمان امام­ زاده1، مجید متولی باشی2 و محبوبه نظری3

1 اصفهان، دانشگاه اصفهان، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، بخش سلولی و مولکولی 

2 اصفهان، دانشگاه اصفهان، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، بخش ژنتیک 

3 تهران، پژوهشکده فناوریهای نوین علوم پزشکی جهاد دانشگاهی ابن سینا، مرکز تحقیقات ریزفناوری زیستی

تاریخ دریافت: 14/11/92             تاریخ پذیرش: 8/9/93

چکیده

پروتئینهای غیراختصاصی ناقل لیپید 2(non specific Lipid Transfer Protein 2: nsLTP2)  یکی از اعضای خانواده پرولامینها هستند که به­ دلیل ساختار ویژه خود توانایی انتقال ترکیبات لیپوفیل مختلفی را دارند. با وجود مزیتهای نسبی پروتئین nsLTP2 در انتقال دارو، خاصیت آلرژنی این پروتئینها نیز گزارش شده است. هدف مطالعه حاضر بررسی توالی و ساختار پروتئین nsLTP2 برنج ایرانی و نیز بهبود برخی از ویژگیهای آن برای استفاده در سیستمهای تحویل دارو، توسط ابزارهای بیوانفورماتیک است. مقایسه توالی­ پروتئینهای nsLTP2  انواع برنج، حداقل 51 درصد شباهت بین گونه‌های مختلف را نشان می­دهد. بر اساس ارزیابیهای فیلوژنی مشخص شد که بیشترین شباهت بین توالی ژن این پروتئین با گونه ژاپنی (Accession NO. NP 0011048723.1  ) وجود دارد. موتیفها و جایگاههای مختلف nsLTP2 برنج ایرانی با کمک آنالیز توالی به دست آمدند. همچنین مطالعات بیوانفورماتیکی نشان دهنده 4 جایگاه‌ با خاصیت­ شبه­آنتی­ژنی است که 3 عدد آن بعد از تغییرات پس­ از ترجمه­ باقی می­ماند و حضور آنها احتمالاً می­تواند خاصیت آلرژنی این پروتئینها را توجیه کند. همچنین، بررسی توالی دو گونه ژاپنی و ایرانی مؤید این است که اسیدهای آمینه شرکت کننده در جایگاه فعال، به­طورکامل حفاظت شده است. به­منظور مطالعه تاثیر حذف توالیهای آلرژن بر تمایل به لیگاندهای هیدروفوب، از روش مدل­سازی در راستای تعیین ساختار، استفاده گردید. نتایج تحقیق حاضر نشان داد که در صورت اعمال تغییراتی در توالی و حذف بخشهای آلرژن nsLTP2، احتمالا می‌توان بازده پروتئین را در سیستمهای تحویل دارو افزایش داد.

واژه های کلیدی: nsLTP2، مدل­سازی براساس تشابه، دارورسانی، آلرژن

* نویسنده مسئول، تلفن:03137932475 پست الکترونیکی: MMiroliaei@yahoo.com

مقدمه

 

پروتئینهای انتقال دهنده لیپید در همه رده­های جانوران شامل باکتریها، مخمرها، گیاهان و جانوران وجود دارند. این پروتئینها جزء رایج­ترین و فراوان­ترین پروتئینهای محلول در گیاهان هستند (8 و 9) و به دلیل توانایی ویژه آنها در انتقال لیگاندهای مختلف مانند گلیکولیپیدها، اسیدهای چرب و استروئیدها بین غشاهای زیستی، با نام عمومی non-specific lipid transfer proteins (nsLTP) شناخته می­شوند (12 و 35). آنها را براساس وزن مولکولی، به دو دسته nsLTP1 و nsLTP2 تقسیم می­کنند (26). اسکلت پلی­پپتیدی پروتئینهای nsLTP متشکل از چهار مارپیچ راست­گرد است که توسط لوپهای انعطاف­پذیری به هم متصل­شده و توسط چهار پیوند دی­سولفیدی پایدار شده­است (25). خاصیت اتصال و انتقال مولکولهای مختلف لیپیدی توسط این پروتئینها، به واسطه وجود یک حفره هیدروفوب داخل مولکولی تسهیل می­شود (30). یکی از مهمترین کاربردهای این پروتئینها استفاده در سیستمهای انتقال دارو است. این ناقلها از یک سو با تمایل زیاد به داروها متصل و از اکسیداسیون و تخریب آنها جلوگیری می­کنند. ازسوی دیگر با نگهداری داروها در فضای بسته خود سبب کاهش اثر سمی آنها بر سلولهای غیرهدف می­شوند (9 و 33). همچنین، خواص آلرژنی پروتئینهایی مثل nsLTPها (13، 16 و 39) که غنی از آلفاهلیکس و اسیدآمینه­های قطبی مانند سیستئین و اسیدآمینه­های بارداری مانند لیزین و آرژینین می­باشند، به اثبات رسیده است (5، 6، 7، 15، 22، 23، 32 و 38). پروتئینهای nsLTP2 به­دلیل ساختار کوچکتر خود نسبت به nsLTP1ها، با کاهش خاصیت آنتی­ژنی و افزایش سرعت انتقال و آزادکردن لیگاندها و توانایی اتصال به لیگاندهای متعدد (42)، برای استفاده در سیستمهای تحویل دارویی مناسب­تر می­باشند (9). ویژگیهای nsLTP2ها مانند نحوه اتصال به لیگاند و بررسی اتصال انواع لیگاند کمتر از nsLTP1ها شناخته شده است. تاکنون پروتئین nsLTP2 از تعدادی از گونه ها (9، 28، 39 و 47) و از جمله گونه ایرانی برنج با نام علمی Oryza sativa به دست آمده است (26) و توالی کدکننده پروتئین آن کلون شده است. به­علاوه بررسیها نشان داده که nsLTP2 نوع ایرانی از انواع ژاپنی آن کوچک­تر است که می­تواند سبب افزایش سرعت انتقال و آزادکردن لیگاند توسط آن شود. به همین ­دلیل تمرکز مطالعه حاضر روی nsLTP2 برنج ایرانی است. در مطالعه­ای که در سال 2004 توسط Cheng انجام گرفت پتانسیل ذاتی زیستی این پروتئین به منظور استفاده در سیستم تحویل دارویی با ایجاد جهش نقطه­ای فلورسانس افزایش یافت (9). با کمک روشSite-direct mutagenesis  و نرم­افزارهای داکینگ نقش واحدهای آمینواسیدی  هیدروفوب در ساختار، پایداری اتصال به لیگاند و فعالیت انتقال به لیپیدnsLTP2  برنج نوع ژاپنی مشخص شده است (10). به دلیل هدفمندکردن تحقیقات آزمایشگاهی، در این مطالعه با کمک ابزارهای بیوانفورماتیکی، توالی ژنnsLTP2  برنج ایرانی، ساختار پروتئینی و نواحی دارای خاصیت آنتی­ژنی آن بررسی شده است. ­به علاوه با هدف کاهش خاصیت آنتی ژنیسیته‌ و همزمان افزایش کارآیی پروتئین فوق در اتصال به لیپید، ابتدا با روش تشابه، ساختار آن مدل سازی شد و در ادامه، تأثیر تغییرات اسیدآمینه­ای که منجر به کاهش خاصیت آنتی­ژنی و افزایش کارآمدی این پروتئین می­شوند، پیش­بینی شد. دستاوردهای پژوهش حاضر احتمالا می­تواند به­منظور دستورزی ژن این پروتئین و در راستای ارتقا کارآمدی آن، برای تولید ناقلهای دارورسان نوین با خاصیت زیست سازگاری بیشتر مفید باشد.

مواد و روشها

جمع­آوری و انطباق توالی پروتئینهای nsLTP2 برنج: توالیهای مورد استفاده در این مطالعه از بانک ژن (www.ncbi.nlm.nih.gov/genebank/‎) به دست آمد. به علاوه توالی نوکلئوتیدی nsLTP2 گونه هندی
(Accession No. A2XBN5.2)، از پایگاه داده SWISS-PROT به دست آمد. دستورزی، بررسی و ترجمه هر یک از توالیهای نوکلئوتیدی کدکننده پروتئین به ­وسیله پایگاه داده مولکولی Expassy (www.expasy.ch)، انجام شد (46). مطالعات ردیف سازی چندتایی (Multiple sequence alignments) با استفاده از BLAST موجود در پایگاه اطلاعاتی  NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov.blast) و CLUSTAL W موجود در پایگاه اطلاعاتی Expassy (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) انجام شد (24).

مطالعه فیلوژنیک‌، بررسی توالی پروتئینی و خاصیت آنتی‌ژنیستی ns-LTP2 برنج ایرانی: مطالعات فیلوژنی توالی پروتئین nsLTP2 گونه ایرانی و یازده پروتئین مشابه با استفاده از پایگاهGeneBee (www.genebee.msu.su) به اجرا درآمد (15، 17و20).

محاسبه  تئوری pI و وزن مولکولی پروتئین با استفاده از ابزارهای موجود در پایگاه داده Expassy (http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html) انجام شد. موتیفهای موجود بر روی ساختار nsLTP2 مورد بررسی قرار گرفتند (www.expasy.ch/ motif scan). خاصیت آنتی­ژنسیتی ns-LTP2 برنج ایرانی با کمک پایگاه داده دانشگاه مادرید با آدرس http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl بررسی شد. این پایگاه با استفاده از روشKolaskar and Tongaonkar  و بر اساس نتایج تجربی اپی­توپهای شناخته شده موجود عمل می‌کند (21، 27 و 45). به دلیل ارتباطی که بین nsLTP های گیاهی و آلرژیهای انسانی گزارش شده است (4 و 38)، برای مثال قابلیت اتصال nsLTPهای ذرت به IgE مشخص شده است که حتی پس از حرارت دیدن هم این ویژگی در پروتئین فوق حفظ می شود، میانکنش­ بین nsLTP2 برنج ایرانی با MHC-II نیز بررسی شد (2، 20، 23، 32 و 38).

مدل­سازی پروتئینnsLTP2  برنج ایرانی: مدل سه بعدی پروتئین nsLTP2 برنج ایرانی، ابتدا با استفاده از پایگاه M4T (http://manaslu.aecom.yu.edu/M4T/) و به روش مدل­سازی براساس تشابه(Homology modeling)  به دست آمد (18 و 40). بمنظور پیدا کردن مدل مناسب، در این مرحله توالی nsLTP2 برنج ایرانی با توالی ساختارهای شناخته شده BLAST شد و توالیهای Nonspecific Lipid Transfer Protein (شماره دستیابیl6h1)، Nonspecific lipid transfer protein 2G (شماره دستیابیtuk1)، lipid transfer protein (شماره دستیابیn891)، Nonspecific lipid transfer protein (شماره دستیابیuvc1) و Nonspecific lipid transfer protein 2G (شماره دستیابیrzl1) همسانی 97 تا 35 درصد با توالی nsLTP2 ایرانی نشاد دادند. در نتیجه توالیهای Nonspecific Lipid Transfer Protein (شماره دستیابیl6h1) با بیشترین همسانی برای مدل سازی به روش تشابه (Homology modeling) استفاده شد. در ادامه بهینه­سازی مدل با استفاده از سرور YASARA و با استفاده از میدان نیروی GROMOS 96 انجام شد (18 و 37) و Q-mean score (http://swissmodel.expasy.org/qmean) و Z-score آن محاسبه شد (1، 3، 13، 28 و 44).

Molecular Docking: مطالعات Docking با استفاده از نرم­افزار Molegro (Molegro Virtual Docker (MVD)) و براساس یک الگوریتم هیبرید با نام تکامل افتراقی هدایت شده انجام گرفت. به این منظور، لیگاند مورد استفاده LysPC14 از Pubchem به دست آمده است. کمپلکسهای لیگاند- پروتئینی بر اساس MolDock Score امتیازدهی شده­اند (43 و 50).

نتایج

در مطالعه بیوانفورماتیک حاضر، پروتئین nsLTP2 برنج ایرانی در سطح توالی و ساختار بررسی و موتیفهای آنتی‌ژن آن مشخص شده است. دستاوردهای مطالعه حاضر قابلیت استفاده در دستورزیهای پروتئینی آینده را بر روی nsLTP2 دارد.

مطالعه توالی و خاصیت آنتی‌ژنیسیتی nsLTP2 برنج ایرانی: nsLTP2 شامل 96 اسید آمینه است، که سیگنال پپتید 26 اسیدآمینه­ای انتهای آمینی آن می‌تواند از پپتید جدا شده و پروتئین بالغ در مسیر ترشحی به خارج از سلول، هدایت شود (20 و 39). pI و وزن مولکولی این پروتئین با کمک ابزارهای پایگاه Expasy به ترتیب 33/9 وkDa 65/7 محاسبه شد. موتیفهای موجود در ساختار nsLTP2 نیز مورد بررسی قرار گرفت (جدول1). به طور جالب توجه nsLTP2 دارای شباهت با مهارکننده پروتئازی  Tryp_alpha_amyl است. اخیراً مطالعات نشان داده­اند که اغلب پروتئینهای آلرژن موجود در برنج دارای موتیفهای مشابه این نوع از مهارکنند­ها هستند و با وجود شباهت ساختاری در اعضای این خانواده از پروتئینهای آلرژن، همه آنها الزاماً فعالیت مهارکنندگی بر روی سرین پروتئاز تریپسین ندارند و درنتیجه تاکنون نقش این پروتئینها در گیاهان مشخص نشده ­است (48). براین اساس، احتمال دارد این پروتئین نقشهای دیگری را هم در سیستمهای زیستی ایفاء کند که تاکنون شناخته نشده است.

 

 

جدول1- موتیفها و مکان­ قرارگیری گروههای مختلف nsLTP2 برنج ایرانی .

Amino acid position                                     Motif information

1-31                                                                          Prokaryotic membrane

                                                                                 Lipoprotein lipid attachment 

                                                                                 Site profile

21-26                                                                        N-myristoylation sites

28-33

41-46

56-58                                                                        Phosphorylation site

31-96                                                                        Tryp_alpha_amyl Proteases                        

                                                                                 Inhibitor

                                                                                 Seed storage

 

 


 

شکل 1- درخت فیلوژنی Rice-nsLTP2. فیلوگرام حاضر توسط Clustal-W alignment توالیهای پروتئینی شناخته شده این ژن و با استفاده از نرم افزار TreeTop program (www.genebee.msu.su/genebee.html) به دست آمده است. طول شاخه­ها در محور X نشان­دهنده فاصله بین توالیهای مورد استفاده­اند که توسط BLOSUM62 substitution matrix محاسبه شده است.

جدول2- ماتریکس فاصله، فاصله هر گونه با خودش صفر می­باشد.

 

 

مطالعه و بررسی توالی ژنی و پروتئینی nsLTP2 برنج ایرانی نشان­دهنده‌ شباهت زیاد توالی آن به نوع خاصی از گونه ژاپنی(Accession NO. NP 001048723.1)  (98 درصد) و نوع هندی (97 درصد) است و کمترین شباهت آن با‌ nsLTP2 ژاپنی دیگر (Accession No. NP_001056242.1) به میزان 51 درصد است. نتایج حاصل با مطالعات فیلوژنیکی همخوانی دارد، به طوری که nsLTP2 برنج ایرانی با گونه ژاپنی (Accession NO. NP_0010562421 ) یک گروه هموفیلیک تشکیل می­دهد، در حالی­که با نمونه هندی در دو گروه هتروفیلیک قرار دارند (شکل1 و جدول2). به­علاوه این نتایج نشان­دهنده کاربرد توالیها و ژنهای جدید در تعیین روابط بین گونه‌ای در گیاهان می باشد.

بررسی­های بیوانفورماتیکی پروتئین nsLTP2 گونه Oryza sativa ایرانی موید وجود 4 توالی آنتی­ژنی در ساختار آن است که بزرگترین آن در قسمت سیگنال پپتید قرار دارد. طول، محل شروع و خاتمه توالی­های آنتی­ژنی پروتئین ns-LTP2 برنج ایرانی در جدول 3 قابل مشاهده است.

 

جدول 3- بررسی خاصیت آنتی ژنیسیتی توالی nsLTP2 ایرانی.   (http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl)

 

 

بررسیهای ایمونوژنیسیتی دقیق­تر با سرور دوم ذکرشده در بخش روشها، به­صورت اختصاصی آمینواسیدهای اصلی درگیر در میانکنش بین سلولهای T و پپتید موردنظر را نشان می­دهد ( جدول4).  

 

جدول 4- نواحی آنتی­ژنی موجود در nsLTP2که با MHC-II برهمکنش می­دهند.

End Position 

Sequence 

Start Position 

n

15

VLVLAVAMVA

6

1

28

VVGVAGASC

20

2

62

LRAQQGCFC

54

3


مدل­سازی پروتئینnsLTP2  برنج ایرانی و آنالیز ساختار پروتئینی: پیش بینی ساختار سه بعدی توسط سرور M4T انجام و از ساختار کریستالوگرافی nsLTP2 برنج هندی به عنوان ساختار الگو استفاده شد. سپس با استفاده از سرور YASARA و با اضافه کردن مولکول آب به محیط مدل، انرژی کل ساختار از kJ/mol 2/6111- به
 kJ/mol6/25607- کاهش یافت (شکل2). میزان 5/1-Z-score:  و 748/0 Q-mean:  برای مدل نهایی به­دست آمد. بررسی کیفیت مدل نهایی با  تعیین میزان Qmean بیشتر از 7/0 به دست آمد، که نشان دهنده کیفیت مناسب مدل پیش­بینی شده می­باشند. نمودار راماچاندران پروتئینهای نوع هندی و ایرانی به ترتیب در شکل3 آورده شده است (http://nihserver.mbi.ucla.edu/SAVES).

 

 

 

شکل 2- سمت چپ تصویر مدل اولیه پروتئین با میزان انرژیkJ/mol  2/6111- و در سمت راست مدل نهایی با مولکول­های آب در اطراف آن و میزان انرژیkJ/mol  6/25607-.

 

 

شکل3- نمودار راما چاندران nsLTP2 برنج نوع ایرانی و نوع هندی  .(NIH MBI Laboratory for Structural Genomics and Proteomics)

 

 

این پروتئین دارای 3 مارپیچ آلفای غالب و یک مارپیچ کوچک است که انتهای C پروتئین شامل 40 واحد اسیدآمینه است. الگوی پیوندهای دی سولفیدی در نوع ژاپنی به صورت Cys 3_Cys 35/Cys 11_ Cys 25/Cys37_ Cys61/ Cys28_ Cys68 است (27) و به نظر می­رسد توالی نوع هندی و ایرانی نیز از همین الگو پیروی کند (شکل 4 قسمت الف). با مطالعه توالی و ساختار پروتئینی rice-nsLTP2 نوع ایرانی با نوع ژاپنی مشخص گردید که آمینواسیدهای درگیر در تشکیل حفره هیدروفوب این پروتئینها مشابه یکدیگر هستند (شکل 4 قسمت ب).


 

 

ب 

الف

 

 

 

 

 

 

 


شکل4- ساختار فضایی، رزیدو­های شرکت کننده در حفره هیدروفوب و الگوی باندهای دی سولفیدی درnsLTP2  نوع ایرانی (Chimera 1.7rc and M4T Server) ، الف) رزیدو­های شرکت کننده در تشکیل باندهای دی سولفیدی، ب) رزیدو­های شرکت کننده در تشکیل حفره هیدروفوب.

 

 


جهش­زایی پروتئین nsLTP2 برنج ایرانی و Molecular Docking : جستجو به منظور یافتن حفره آب گریز در ساختار سه بعدی nsLTP2 بر مبنای هیدروفوبیسیته سطحی با نرم­افزار MVD نشان داد، یک حفره آب گریز با حجم 53/22 آنگستروم مکعب با منفذ ورودی در مرکز این پروتئین وجود دارد که این حفره  توسط ساختارهای آلفاهلیکسی پروتئین احاطه شده و ناحیه اتصال و استقرار مولکولهای هیدروفوب است. مطالعات جهش­زایی که روی nsLTP2 برنج ژاپنی انجام شده است، اثر اسیدهای آمینه حفاظت شده آروماتیکی مانند: Y45, F39, F36 وY48 ، آمینواسیدهای هیدروفوبی مانند Il15, L8 و V49 روی ساختار پروتئین، پایداری، اتصال به لیگاند و فعالیت انتقال لیپید را نشان داده­است (10).

به منظور کاهش خاصیت آنتی­ژنی پروتئین nsLTP2، تعدادی از این اسیدآمینه­های باردار یا قطبی موجود، در بین توالی آلرژن پروتئین جهش داده شد. انجام مطالعات بیوانفورماتیکی نشان داد (14) که تغییر در تعدادی از توالیهای آلرژن و با جایگزینی آمینواسیدهای L28 و F39 و نیز تغییر در هر دو موقعیت به آلانین، باعث بهبود در خاصیت آنتی ژنی nsLTP2 می‌شود. تغییر این اسیدآمینه عموماً در محل تشکیلTurn های پروتئین انجام گرفت، تا کمترین تأثیر بر روی ساختار پروتئین ایجاد شود.

توالیهای تغییر یافته بار دیگر با استفاده از مدل‌سازی به روش تشابه(Homology modeling) ، مدل‌سازی شده و در مطالعات داکینگ در حضور لیپید LysPC14 مورد استفاده قرار گرفتند. نتایج برهم کنشهای انواع جهش­یافته از لحاظ توانایی اتصال به مولکولهای هیدروفوب در جدول 5 آورده شده است. به طور جالب توجه، جایگزینی آمینواسیدهای L28 و F39 به آلانین و یا تغییر در هر دو موقعیت، نه تنها باعث بهبود در خاصیت آنتی ژنی nsLTP2 می‌شود، بلکه خاصیت اتصال به لیپید را در پروتئین حاضر بهبود می دهد. بر این اساس پیشنهاد می­شود دستورزی در این مکانها باعث افزایش هیدروفوبیسیته جایگاه اتصال و بهبود خاصیت انتقال دارو در پروتئین nsLTP2 شود.

 

جدول5- نتایج حاصل از جهش­زایی پروتئین nsLTP2.

H Bond (kcal/mol)

MolDock Score (kcal/mol)

حجم حفره

پروتئین

-5.75

-80.28

22.53

نوع وحشی

-11.15

-85.88

19.46

(L28A) نوع جهش­یافته

-10.01

-100.1

29.67

(F39A) نوع جهش­یافته

-2.14

-110.04

22.53

جهش­یافته نوع (L28A and F39A)

 

 

بحث

nsLTPs ، پروتئینهای قلیایی کوچک با قابلیت اتصال و انتقال انواع لیپیدها هستند، و با توجه به جایگاه هیدروفوب سطحی در آنها، موضوع کاربرد این پروتئینها در انتقال داروها مطرح شده است (31 و 35). در مطالعه حاضر توالی و ساختار nsLTP2 برنج ایرانی مورد بررسی قرار گرفت. توالی nsLTP2 های گونه‌های مختلف به شدت حفاظت شده است که احتمالاً نشان دهنده اهمیت توالی در عملکردهای سلولی پروتئین می باشد. به­علاوه با توجه به رابطه فیلوژنی nsLTP2 برنج ایرانی با گونه هندی، به نظر می­رسد این دو گونه دارای منشاء یکسان باشند (جدول 2). با این حال تفاوتهای موجود بین این دو گونه می‎تواند، سبب تغیرات اندک در توالی اسیدآمینه­ها و ساختار فضایی جایگاه اتصال شود. احتمال دارد چنین تفاوتهای بر روی خاصیت اتصال به لیپید و تمایل پروتئین به اتصال دارو اثرگذار باشد.

پروتئینهای غنی از آلفا هلیکس معمولاً به­عنوان آلرژن برای سیستم ایمنی بدن شناخته می­شوند. پروتئینهای غنی از اسیدآمینه­های قطبی باردار، دارای خاصیت آنتی­ژنی هستند و حداقل 8 اسیدآمینه از این نوع باید درکنارهم قرار بگیرند تا برای سیستم ایمنی بدن محرک باشند. مطالعات ایمونولوژیکی، خواص آلرژنی پروتئینهایی مثل nsLTPها که غنی از آلفاهلیکس و اسیدآمینه­های قطبی مانند سیستئین و اسیدآمینه­های بارداری مانند لیزین و آرژنین هستند، را مشخص کرده­اند (11، 21، 46 و 49).  بررسی ساختار اول نشان دهنده وجود چهار توالی آنتی ژن بر روی توالی nsLTP2 ایرانی می باشد. با این وجود، دو توالی آنتی‌ژن در پروتئین nsLTP2 در ناحیه پپتید نشانه قرار دارند (جدول 3)، در نتیجه پیش­بینی می شود با حذف این بخش خاصیت آنتی­ژنی آن کاهش ­یابد.

مطالعه توالیهای تغییر یافته نشان می‌دهند که هیچیک از تغییرات ایجاد شده در موتیفهای پس از ترجمه nsLTP2 ایرانی قرار ندارند. در نتیجه به نظر نمی‌رسد تغییر در توالی به طور مستقیم فرآیندهای همزمان با ترجمه و یا پس از ترجمه را با تغییرات شدید همراه کند. با این حال مطالعه حاضر نشان می‌دهد که جهش F39A در این پروتئین (جدول5)، با برهم زدن توالی آنتی­ژنی پروتئین سبب کاهش خاصیت آنتی­ژنی آن می­شود. به علاوه افزایش سطح حفره هیدروفوب، افزایش خاصیت انتقال مولکولهای هیدروفوب را به همراه دارد. بررسیهای مشابه بر روی پروتئین nsLTP2 نوع ژاپنی نشان داده­ است که تغییر F39A اثری بر ساختار پروتئین ندارد (10). به دلیل شباهت زیاد nsLTP2 برنج نوع ژاپنی با نوع ایرانی، استنباط می­شود جایگزینی F39 با آلانین تغییر شدیدی در ساختار nsLTP2 ایرانی ایجاد نکند. به علاوه به نظر می رسد تغییر L28 در محل انعطاف‌پذیر ساختار پروتئین، کمترین تاثیر برروی ساختار سه بعدی nsLTP2 ایرانی داشته باشد. باوجود پیشبینی انجام شده، احتمال دارد تعداد زیادی از پپتیدهای کوچک که دارای توالی­های هیدروفوب در ساختار خود هستند، تمایل بیشتری برای توده­ای شدن و تشکیل فیبریلهای آمیلوئیدی داشته باشند (19).  مکان حفره هیدروفوب پروتئین nsLTP2 در درون ساختار است. همچنین ایجاد جهش F39A تغییری در ساختار پروتئین نوع ژاپنی ایجاد نکرده است، به همین دلایل احتمال می رود که جهش­ فوق اثر ناچیزی برروی تاخوردگی پروتئین داشته باشند. همچنین برای حذف این اثر می­توان از ناقلهایی با دنباله­های پروتئینی محلول و بهینه­سازی شرایط بیان استفاده کرد (29، 34 و 36). مطالعات داکینگ نشان داد که تغییر در هر یک از موقعیت‌ها و یا تغییر همزمان آنها، نه تنها خاصیت آنتی‌ژنی پروتئین را کاهش می­دهد، بلکه قابلیت اتصال به لیپید و احتمالا داروهای هیدروفوب را نیز بهبود می‌دهد (41).

در نهایت باوجود پیش بینیهای بیوانفورماتیکی در جهت بهبود احتمالی عملکرد nsLTP2 ایرانی، اثر نهایی تغییرات ایجاد شده در توالی پروتئینی بر روی ساختار و فعالیت nsLTP2 ایرانی غیر قطعی می‌باشد. این موضوع به خصوص به علت کوچک بودن توالی و نیز حفاظت شدگی شدید آن به صورت چالش باقی مانده است و مطالعات آینده می‌تواند در پاسخ به آن مفید باشد. درمجموع  نتایج مطالعه حاضر می‌تواند در دستورزیهای پروتئینی هدفمند بر روی nsLTP2، به­منظور افزایش کارآیی پروتئین حاضر در اتصال لیگاند و به­ویژه در سیستمهای تحویل دارو مورد استفاده قرار بگیرد.  

  1. Abbas AK, Lichtman AHH, Pillai S. Cellular and Molecular Immunology: with Student Consult Online Access. Elsevier Health Sciences. 2011.
  2. Abascal F, Zardoya R, Posada D. ProtTest: selection of best-fit models of protein evolution. Bioinformatics. 2005; 21(9):2104-5.
  3. Benkert P, Kanzli M, Schwede T. QMEAN server for protein model quality estimation. Nucleic acids research. 2009; gkp322.
  4. Bernardi ML, Giangrieco I, Camardella L, Ferrara R, Palazzo P, Panico MR, et al. Allergenic lipid transfer proteins from plant-derived foods do not immunologically and clinically behave homogeneously: the kiwifruit LTP as a model. PloS one. 2011; 6(11):e27856.
  5. Blein J-P, Coutos-Thavenot P, Marion D, Ponchet M. From elicitins to lipid-transfer proteins: a new insight in cell signalling involved in plant defence mechanisms. Trends in plant science. 2002; 7(7):293-6.
  6. Breiteneder H, Mills EN. Plant food allergens: structural and functional aspects of allergenicity. Biotechnology advances. 2005; 23(6):395-9.
  7. Buhot N, Douliez JP, Jacquemard A, Marion D, Tran V, Maume BF, et al. A lipid transfer protein binds to a receptor involved in the control of plant defence responses. FEBS letters. 2001; 509(1):27-30.
  8. Carvalho AdO, Gomes VM. Role of plant lipid transfer proteins in plant cell physiology: a concise review. Peptides. 2007; 28(5):1144-53.
  9. Cheng C-S, Chen M-N, Liu Y-J, Huang L-Y, Lin K-F, Lyu P-C. Evaluation of plant non-specific lipid-transfer proteins for potential application in drug delivery. Enzyme and microbial technology. 2004; 35(6):532-9.
  10. Cheng C,  Cheng MN , Lai YT,  Chen T, Lin K,  Liu YJ , et al. Mutagenesis study of rice nonspecific lipid transfer protein 2 reveals residues that contribute to structure and ligand binding. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. 2008; 70(3):695-706.
  11. Clare Mills E.N, ‎Peter R. Shewry. Plant Food Allergen. 2008. Wily. P: 60-66.
  12. Douliez J-P, Michon T, Marion D. Steady-state tyrosine fluorescence to study the lipid-binding properties of a wheat non-specific lipid-transfer protein (nsLTP1). Biochimica Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 2000; 20-65:(1)1467.
  13. Eastwood MP, Hardin C, Luthey-Schulten Z, Wolynes PG. Evaluating protein structure-prediction schemes using energy landscape theory. IBM Journal of Research and Development. 2001; 45(3.4):475-97.
  14. Edreva A. Pathogenesis-related proteins: research progress in the last 15 years. Gen Appl Plant Physiol. 2005; 31(1-2):105-24.
  15. Edstam MM, Viitanen L, Salminen TA, Edqvist J. Evolutionary history of the non-specific lipid transfer proteins. Molecular plant. 2011; 4(6):947-64.
  16. Egger M, Hauser M, Mari A, Ferreira F, Gadermaier G. The role of lipid transfer proteins in allergic diseases. Current allergy and asthma reports.2010; 10(5):326-35.
  17. Emamzadeh AR, Hosseinkhani S, Sadeghizadeh M, Nikkhah M, Chaichi MJ, Mortazavi M. cDNA cloning, expression and homology modeling of a luciferase from the firefly Lampyroidea maculata. Journal of biochemistry and molecular biology. 2006; 39(5):578.
  18. Fernandez-Fuentes N, Madrid-Aliste CJ, Rai BK, Fajardo JE, Fiser As. M4T: a comparative protein structure modeling server. Nucleic acids research. 2007; 35:W363-W8.
  19. Fink AL. Protein aggregation: folding aggregates, inclusion bodies and amyloid. Folding and design. 1998; 3(1):R9-R23.
  20. Goff SA, Ricke D, Lan T-H, Presting G, Wang R, Dunn M, et al. A draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L. ssp. japonica). Science. 2002; 296(5565):92-100.
  21. Hartz C, Lauer I, del Mar San Miguel Moncin M, Cistero-Bahima A, Foetisch K, Lidholm J, et al. Comparison of IgE-binding capacity, cross-reactivity and biological potency of allergenic non-specific lipid transfer proteins from peach, cherry and hazelnut. International archives of allergy and immunology. 2010; 153(4):335-46.
  22. Hoffmann-Sommergruber K. Pathogenesis-related (PR)-proteins identified as allergens. Biochemical Society Transactions. 2002; 30(6):930-4.
  23. Isaac Kirubakaran S, Begum SM, Ulaganathan K, Sakthivel N. Characterization of a new antifungal lipid transfer protein from wheat. Plant physiology and Biochemistry. 2008; 46(10):918-27.
  24. Johnson M, Zaretskaya I, Raytselis Y, Merezhuk Y, McGinnis S, Madden TL. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic acids research. 2008; 36(suppl 2):W5-W9.
  25. Kader J-C. Lipid-transfer proteins in plants. Annual review of plant biology. 1996; 47(1):627-54.
  26. Karimian M, Miroliaie M, Ghaedi K, Ehsanpour A, Zahraie Z. Construction of a Vector Containing Coding Sequence of Lipid Transfer Proten-2 (LTP2) Gene from Rice. Journal of Molecular Genetics. 2011; 3(1):1-4.
  27. Kolaskar AS, Tongaonkar PC. A semi-empirical method for prediction of antigenic determinants on protein antigens. FEBS letters. 1990; 276(1):172-4.
  28. Krieger E, Joo K, Lee J, Lee J, Raman S, Thompson J, et al. Improving physical realism, stereochemistry, and side chain accuracy in homology modeling: four approaches that performed well in CASP8. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. 2009; 77(S9):114-22.
  29. Kristensen AK, Brunstedt J, Nielsen KK, Roepstorff  P, Mikkelsen JD. Characterization of a new antifungal non-specific lipid transfer protein (nsLTP) from sugar beet leaves. Plant Science. 2000; 155(1):31-40.
  30. Lee JY, Min K, Cha H, Shin DH, Hwang KY, Suh SW. Rice non-specific lipid transfer protein: the  crystal structure in the unliganded state reveals a small hydrophobic cavity. Journal of molecular biology. 1998; 276(2):437-48.
  31. Liu Y-J, Samuel D, Lin C-H, Lyu P-C. Purification and characterization of a novel 7-kDa non-specific lipid transfer protein-2 from rice (Oryza sativa). Biochemical and biophysical research communications. 2002; 294(3):535-40.
  32. Pastorello EA, Farioli L, Pravettoni V, Ortolani C, Ispano M, Monza M, et al. The major allergen of peach (Prunus persica) is a lipid transfer protein. Journal of allergy and clinical immunology. 1999; 103(3):56-20.
  33. Pato C, Le Borgne M, Le Baut G, Le Pape P, Marion D, Douliez J-P. Potential application of plant lipid transfer proteins for drug delivery. Biochemical pharmacology. 2001; 62(5):555-60.
  34. Peng L, Xu Z, Fang X, Wang F, Cen P. High-level expression of soluble human defensin-2 in Escherichia coli. Process Biochemistry. 2004; 39(12):2199-205.
  35. Porth I, Koch M, Berenyi M, Burg A, Burg K. Identification of adaptation-specific differences in mRNA expression of sessile and pedunculate oak based on osmotic-stress-induced genes. Tree physiology. 2005; 25(10):1317-29.
  36. Qing G, Ma L-C, Khorchid A, Swapna GVT, Mal TK, Takayama MM, et al. Cold-shock induced high-yield protein production in Escherichia coli. Nature biotechnology. 2004; 22(7):877-82.
  37. Rodriguez, R., et al. 1998. Homology modeling, model and software evaluation: three related resources. Bioinformatics. 14(6): p. 523-528.
  38. Salcedo G, Sanchez-Monge R, Barber D, Diaz-Perales A. Plant non-specific lipid transfer proteins: an interface between plant defence and human allergy. Biochimica Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids. 2007; 1771(6):781-91.
  39. Samuel D, Liu Y-J, Cheng C-S, Lyu P-C. Solution Structure of Plant nonspecific LipidTransfer Protein-2 from Rice (Oryza sativa). Journal of Biological Chemistry. 2002; 277: 35267-35273.
  40. Sarowar S, Kim YJ, Kim KD, Hwang BK, Ok SH, Shin JS. Overexpression of lipid transfer protein (LTP) genes enhances resistance to plant pathogens and LTP functions in long-distance systemic signaling in tobacco. Plant cell reports. 2009; 28(3):419-27.
  41. Schwede T, Kopp Jr, Guex N, Peitsch MC. SWISS-MODEL: an automated protein homology-modeling server. Nucleic acids research. 2003; 31(13):3381-5.
  42. Tassin-Moindrot Sv, Caille A, Douliez J, Marion D, Vovelle Fo. The wide binding properties of a wheat nonspecific lipid transfer protein. European Journal of Biochemistry. 2000; 267(4):1117-24.
  43. Thomsen R, Christensen MH. MolDock: a new technique for high-accuracy molecular docking. Journal of medicinal chemistry. 2006; 49(11):3315-21.
  44. Tousheh M, Miroliaei M, Asghar Rastegari A, Ghaedi K, Esmaeili A, Matkowski A. Computational evaluation on the binding affinity of non-specific lipid-transfer protein-2 with fatty acids. Computers in biology and medicine. 2013; 43(11):1732-8.
  45. Van Loon LC, Van Strien EA. The families of pathogenesis-related proteins, their activities, and comparative analysis of PR-1 type proteins. Physiological and molecular plant pathology. 1999; 55(2):85-97.
  46. Varjonen E, Vainio E, Kalimo K, Juntunen-Backman K. Clinical importance of non-specific lipid transfer proteins as food allergens. Biochemical Society Transactions. 2002; 30(part 6).
  47. Wang SY, Wu JH, Ng TB, Ye XY, Rao PF. A non-specific lipid transfer protein with antifungal and antibacterial activities from the mung bean. Peptides. 2004; 25(8):1235-42.
  48. Wang J, Yang L, Zhao X, Li J, Zhang D. Characterization and Phylogenetic Analysis of Allergenic Tryp_alpha_amyl Protein Family in Plants. Journal of agricultural and food chemistry. 2014; 62(1):270-8.
  49. Wijesinha-Bettoni R, Alexeev Y, Johnson P, Marsh J, Sancho AI, U. Abdullah S, et al. The structural characteristics of nonspecific lipid transfer proteins explain their resistance to gastroduodenal proteolysis. 2010; Biochemistry. 49(10):2130-9.
  50. Zhao X, Xia L, Ding X, Yu Z, Loe Y, Tao W. Homology modeling of Cyt2Ca1 of Bacillus thuringiensis and its molecular docking with inositol monophosphate. Chinese Journal of Chemistry. 2009; 27(10):2085-9.