قارچها به عنوان یکی از عوامل فرسودگی زیستی بنای سنگی پاسارگاد 

نسیم مقبولی بلاسجین و پریسا محمدی^*

تهران، دانشگاه الزهرا^(س)، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی 

تاریخ دریافت: 10/10/92             تاریخ پذیرش: 8/9/93 

چکیده

پاسارگاد، پایتخت سلسله هخامنشیان در زمان کوروش کبیر است که زمان ساخت آن به قرن 6 قبل از میلاد مسیح برمی­گردد. از مهم ترین آثار باستانی پاسارگاد، مقبره کوروش کبیر است که عمده آن از سنگهای آهکی ساخته شده است. پاسارگاد، دومین بنای تاریخی بزرگ بعد از پرسپولیس می باشد. این بنا توسط UNESCO به عنوان میراث فرهنگی جهانی شناخته شده است. این مطالعه به شناسایی قارچهای عامل فرسودگی زیستی این بنا که برای اولین بار در ایران انجام گرفته است می پردازد. به طور کلی با استفاده از محیطهای کشت Potato Dextrose Agar و Sabouraud Dextrose Agar، 33 جدایه از سطوح سنگی پاسارگاد به دست آمد. جدایه ها کشت مجدد شدند. برای مشاهده میکروسکوپی ساختارهای زایشی و رویشی قارچ، از تکنیک اسلاید کالچر استفاده شد و قارچها بر اساس خصوصیات شکلی میکروسکوپی و ماکروسکوپی شناسایی شدند. در این بررسی قارچ­های رنگی و مخمر ها جدا شدند. قارچهای Alternaria sp., Cladosporium sp., Ulocladium sp., Fusarium sp., Humicula sp., Arthirinium sp. و مخمر ها از جمله قارچهای غالب جدا شده از سطوح مذکور بودند. میکروسکوپ الکترونی نگاره (SEM) برای مشاهده روند فرسودگی زیستی سنگ توسط قارچها استفاده شد و پدیده هایی مانند ایجاد حفره های زیستی، شکرزدگی و سنگ شویی به خوبی قابل رؤیت بود. این تغییرات در اثر رشد میسلیوم قارچها و نفوذ آنها به درون سنگ و ترشح متابولیسم­های قارچی رخ می دهند. جداسازی و شناسایی جدایه ها، اولین قدم در محافظت از سطوح آثار باستانی می­باشد.

واژه های کلیدی: پاسارگاد، قارچ، فرسودگی زیستی، میکروسکوپ الکترونی نگاره

* نویسنده مسئول،  تلفن: 02188058912، پست الکترونیکی: p.mohammadi@alzahra.ac.ir

مقدمه

فرسودگی زیستی، آسیب غیر قابل برگشتی است که توسط میکروارگانیسم ها بر آثار باستانی به وجود می آید. Hueck (1968-1965) فرسودگی زیستی را چنین تعریف کرد: "هر نوع تغییر نامطلوب در خواص مواد که به وسیله فعالیتهای حیاتی ارگانیسم های زنده رخ می دهد"(2 و 20).

سنگ ماده ای است که در ساخت بناهای تاریخی و مجسمه های کوچک به کار می­رود. فرسایش سنگ و صخره و تبدیل آن به خاک، اثرات متفاوتی بر زمین می گذارد. از نگاهی دیگر، اثر فرسودگی زیستی بر آثار تاریخی، می تواند بر فرهنگ و تاریخ هر سرزمینی اثرات نامطلوب قابل توجهی بگذارد (22).

میکروارگانیسمهای پویکیلوتروف یا خونسرد سبب فرسودگی زیستی می شوند و عمدتاً شامل باکتریها، سیانوباکتریها، مخمرها، بعضی گونه های جلبک و بسیاری از گونه­های قارچی و گلسنگها می باشند. این میکروارگانیسمها دارای سوخت و ساز در محدوده های متنوع زیستی می باشند. همچنین اجتماعات اندولیتیک این میکروارگانیسم ها سبب تشدید فرسودگی زیستی می شود. کرومباین در سال 1966 برای اولین بار این دسته از میکروارگانیسم ها را جداسازی کرد (13 و 14). مطالعات نشان داده است که قارچها از جمله جمعیتهای غالب روی سطوح باستانی می باشند و بنابراین دارای اثرات مخرب بیشتری می­باشند (8). این قارچها عمدتاً متعلق Ascomycota, Basidiomycota, Zygomycota  و Glomeromycota  می باشند. بسیاری از سنگها مانند مرمر، گرانیت، آهک و سایر سنگها تحت تأثیر آسیبهای قارچی دچار فرسایش می شوند (14 و 20).

قارچها آنزیمهایی چون آمیلاز، کاتالاز و کازئیناز، اسیدهای آلی مانند اسید اگزالیک، اسید سیتریک، اسید استیک ، اسید گلوکونیک، اسید مالیک و اسید سوکسینیک و همچنین اسیدهای غیرآلی مانند اسید نیتریک، اسید سولفوریک، اسید سولفوروس و اسید نیتروس ترشح می کنند و سبب فرسایش سنگها می شوند. به علاوه، بدنبال رشد قارچی روی سنگ، میسلیومهای آن به داخل سنگ نفوذ می کنند. قارچهای تثبیت شده بر بسترهای سنگی از ترکیبات آلی ناشی از لاشه سایر موجودات و یا آلاینده های موجود در اتمسفر، جهت تامین منابع کربن استفاده می کنند. آنها به طور معمول اسیدهای آلی عامل خوردگی زیستی تولید می کنند و با اکسیداسیون فلزات Mn⁺²و Fe⁺² شبکه جدیدی از عناصر معدنی تولید می کنند که کانیهای زیستی نامیده شده­اند. لازم بذکر است که در گلسنگهای ساکن بر بسترهای سنگی، قارچها از مواد غذایی آلی تولید شده توسط جلبکها استفاده می کنند و اسید­های ترشحی قارچی موجب انحلال مواد معدنی بستر می شود. علاوه بر این، قارچها قادر به رشد بر روی ذرات گرد و غبار و لایه های سیمانی هستند و بدین طریق اسپورهایشان را در هوا و اطراف خود پراکنده می­کنند. این موجودات  قادر به تجزیه مواد غذایی، پارچه، چوب، پلاستیک، چرم، چسب و دیگر مواد می باشند. خاصیت تجزیه کنندگی قارچها، سبب بازگشت مواد به محیط می شود و این موجودات به عنوان پاک کننده های محیط زیست شناخته شده­اند (1، 12، 19 و 23) .

در دهه های اخیر، به دنبال افزایش آلودگی هوا و فعالیتهای صنعتی ترکیب آلاینده های موجود در اتمسفر کره زمین تغییر یافته و شرایط برای رشد چنین موجوداتی افزایش یافته است. یکی از موادی که در هوای مناطق شهری فراوان است، دی اکسید سولفور می باشد که تشکیل پوسته­هایی روی سنگ آهک می دهد. این پوسته، ماده­ای کریستالی، خاکستری مایل به سیاه و سخت می­باشد که روی سطوح سنگی تشکیل می شود که اگر چه توسط قارچ مستقیماً مورد استفاده قرار نمی گیرد بلکه با تأمین شرایط اسیدی محیط، عملاً به رشد قارچها به طور غیر مستقیم کمک می­کند. مطابق مطالعات انجام شده قارچها از طریق به دام انداختن هیدروکربنها، می­توانند سبب ایجاد پوسته های سیاه رنگ روی سطوح سنگی شوند (3، 4، 5، 10، 17 و 18).

در این مطالعه، بجداسازی و شناسایی قارچهای بنای تاریخی پاسارگاد به عنوان یکی از عوامل فرسودگیهای زیستی پرداخته شده است.

مواد و روشها

نمونه برداری به روش کلاسیک و با استفاده از سواب و اسکالپل استریل، از بنای پاسارگاد انجام شد (7). نمونه ها در محیط کشت Potato Dextrose Agar (PDA) قرار داده شد و بلافاصله به آزمایشگاه منتقل گردید.

جداسازی و شناسایی قارچها: محیطهای کشت: محیطهایی که در این مطالعه استفاده شد شامل Potato Dextrose Agar (PDA) و Sabouraud Dextrose Agar (SDA) برای کپکها و Corn Meal Agar (CMA)، Yeast Malt Agar (YMA) و Urea Agar برای شناسایی مخمرها می باشند. این محیطها بر اساس دستورالعمل کارخانه سازنده، آماده و مورد مصرف قرار گرفت.

قارچها بر روی PDA و SDA کشت و در دمای 25 تا 28 درجه سانتی­گراد قرار داده شدند تا کلنیهای خالص به دست آید.

برای مشاهده ساختار های رویشی و زایشی قارچها از روش اسلاید کالچر استفاده گردید. برای این منظور از محیط کشت PDA استفاده شد و در دمای 28 درجه سانتی­گراد گرما گذاری گردید و اسلاید ها از طریق رنگ آمیزی لاکتو فنل بلو توسط میکروسکوپ نوری بررسی شدند. سطح رویی و پشتی کلنیها از طریق استریومیکروسکوپ بررسی گردید (1).

علاوه بر روشهایی که در بالا اشاره شد، برای شناسایی اختصاصی مخمر ها از تستهای بیوشیمیایی استفاده گردید. این تستها شامل تست هیدرولیز اوره، تست دی بی بی (DBB)، تست تخمیر قندهاست که مطابق کتاب روشهای تئوری و آزمایشهای تخمیری انجام شد (19) و از محیط کورن میل آگار برای بررسی تولید میسلیوم و نوع اسپور های به وجود آمده استفاده شد.

تست هیدرولیز اوره: مخمرها بر روی محیط اوره آگار کشت داده شد و به مدت 4 روز در 28 درجه سانتی­گراد گرما گذاری شد. این تست قادر به جداسازی مخمرهایی است که هیدرولیز اوره را انجام می دهند.

محیط اوره شامل پپتون  g/l1، NaCl g/l 5، پتاسیم دی هیدروژن فسفات  g/l 2، فنل رد g/l  01/0 و آگار  g/l15 می­باشد (21).

تست DBB: با تولید رنگ قرمز بر روی محیط کشت مربوطه بازیدیومیست­ها از آسکومیست­ها جدا می شود. برای این منظور از کشت ده روزه مخمر بر محیط کشت YMA استفاده گردید. سپس مخمر به مدت 4 ساعت در 55 درجه سانتی­گراد گرما گذاری و پس از آن معرف رنگی DBB روی کشتها ریخته شد. کشتهایی که تغییر رنگ داده و قرمز شوند متعلق به گروه بازیدیومیست می باشند (21).

محیط YMA شامل: عصاره مخمر  g/l3، عصاره مالت  g/l3، پپتون  g/l 5، گلوکز  g/l10 و آگار g/l 20 می­باشد.

تست تخمیر قند: اغلب مخمر ها قادر به تخمیر قند دکستروز در شرایط بی هوازی می باشند و گاز دی­اکسیدکربن تولید می­کنند. بیشتر مخمر ها مقدار کمی اتانول و دی اکسیدکربن تولید می کنند. مخمر هایی که قادر به تخمیر نمی باشند مقادیر بسیار کمی اتانول و دی اکسید کربن تولید می­کنند که تولید گاز با استفاده از لوله دورهام قابل تشخیص نمی باشد.       
در این مطالعه، بررسی تخمیر برای 7 قند گلوکز، گالاکتوز، سوکروز، مالتوز، لاکتوز، رافینوز و تره هالوز انجام شد.
سوسپانسیون مخمری با غلظت 10⁷ سلول تهیه و در محیطهای قندی تلقیح گردید. محیطها به مدت یک ماه در 28 درجه سانتی­گراد گرما گذاری شد و به طور هفتگی تغییرات آن بررسی شد (21).

تست کورن میل آگار: مخمر ها در محیطهای کشت مخصوص مانند کورن میل آگار قادر به رشد رشته­ای می باشند. برای این منظور از روش دالمن استفاده شد. در این آزمایش، مخمر ها به صورت دو نقطه در کنار و یک خط در وسط، در محیط مذکور کشت داده شدند. دو لامل استریل روی یک نقطه و در وسط خط قرار داده شد و محیطها به مدت یک هفته در 28 درجه سانتی­گراد گرما گذاری گردید. جهت مشاهده نحوه تولید میسلیومها، محیطها هر روز بررسی شد. مخمرهایی که میسلیوم تولید می کنند، قادر به تولید پرز بر روی لامل می باشند. بعد از یک هفته، اسلاید ها با کمک رنگ آمیزی لاکتوفنل بلو توسط میکروسکوپ نوری مشاهده شدند. گاهی اوقات آسکوکارپ ها، کلامیدوسپور ها و آرتروسپورها به خوبی قابل رویت می باشند (21).

میکروسکوپ الکترونی نگاره (SEM): جهت مطالعات میکروسکوپ الکترونی نگاره از چند نمونه سنگ محوطه اطراف بنا که از لحاظ ساختمانی مشابه سنگ بنا بود استفاده شد. قبل از مشاهده با میکروسکوپ الکترونی، لازم است که سنگها آبگیری شوند. مراحل آبگیری از سنگ شامل فیکساسیون نمونه در محلول گلوتارآلدهید (w/v) 2 درصد به مدت 60 دقیقه، غوطه ور سازی نمونه در بافر فسفات 175/0 مولار با pH 5/7 به مدت 3 تا 5 دقیقه و مرحله آخر، آبگیری نمونه در اتانول 30،50،70،80،90 درصد (w/v) و در نهایت اتانول مطلق می باشد که زمان هر مرحله آبگیری 15 دقیقه می باشد.

نتایج و بحث

شناسایی قارچها: کپکها و مخمرها بطریق کشت و مشاهده  میکروسکوپی ساختار­های رویشی و زایشی، شناسایی گردید. تعداد 33 قارچ از سطوح بنای تاریخی پاسارگاد جدا شد. شناسایی مورفولوژیکی قارچها با استفاده از کتاب اطلس قارچ شناسی انجام شد (15). بر طبق کلید شناسایی، قارچهای غالب روی سنگهای آهکی پاسارگاد شاملAlternaria sp., Cladosporium sp., Ulocladium sp., Fusarium sp., Humicula sp., Arthirinium sp. و مخمرها می باشند که مطابق جدول 1 خصوصیات کلیدی میکروسکوپی و ماکروسکوپی فهرست و تصاویر اسلاید کالچر آنها ارائه شده است (شکل 1).

جدول 1- ویژگیهای میکرو-ماکروسکوپی.مورد استفاده در شناسایی جدایه­ها

مطابق کتاب روشهای تئوری و آزمایشهای تخمیری (19) و انجام آزمایشهای بیوشیمیایی، شناسایی مخمرها صورت گرفت. به طور کلی 18 مخمر از منطقه مورد نظر جدا شد.

میکروسکوپ الکترونی نگاره: حضور و رشد میسلیومهای قارچی، پدیده های کریستالیزاسیون، ایجاد حفره­های­ زیستی و شکرزدگی از طریق میکروسکوپ الکترونی نگاره بررسی شد (شکل 2). این پدیده ها در سطوح سنگهای آهکی به علت رشد قارچها و همچنین تولید و ترشح آنزیمها و اسیدهای آلی و غیرآلی رخ می دهد. آنزیمهای غالبی که توسط قارچها تولید می شوند شامل آمیلاز، کاتالاز و کازئیناز می باشند. اسید اگزالیک، اسید گلوکونیک و اسید لاکتیک، اسید های معمولی هستند که توسط قارچهای مستقر بر سطوح سنگی ترشح می شوند. موارد ذکر شده سبب فرسودگی زیستی سنگ و کلاته کردن فلزاتی مانند کلسیم، آلومینیوم، سیلیسیوم، آهن، منگنز و منیزیم موجود در مواد سنگی می شوند (7، 9، 10و 11).

نتیجه گیری

بناهای تاریخی در معرض تغییرات آب و هوایی مانند رطوبت، گرما، باران، نور خورشید، آلودگی هوا و همچنین انواع مواد شیمیایی مانند بیوساید ها، سورفاکتانت ها و ترکیبات آب دوست قرار دارند. موارد مذکور سبب مستعد شدن و گاه تحریک رشد عوامل زیستی در بناها می گردد.