نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجو-دانشگاه صنعتی شاهرود

2 دانشگاه شاهرود،دانشکده کشاورزی،گروه زراعت واصلاح نباتات

3 هیات علمی/پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری

4 هیات علمی/پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران

5 هیات علمی/مؤسسه تحقیقات گیاهپزشکی کشور

6 هیات علمی/دانشکده کشاورزی دانشگاه صنعتی شاهرود

چکیده

در این مطالعه، عصاره خام قارچ 1103- Trichoderma harzianum تهیه شد و اثر بازدارندگی آن بر طیفی از باکتری‌های گرم مثبت، گرم منفی و تعدادی از گونه‌های قارچ مورد آزمایش قرار گرفت. عصاره سبب کنترل باکتری‌های پاتوژن شامل Escherichia coli، Bacillus subtilis، Pseudomonas fluorescens، Salmonella typhi، Staphylococcus aureus و Xanthomonas citri (NIGEB-88 , NIGEB-9322) و همین‌طور قارچ‌های پاتوژن Macrophomina phaseolina و Rhizoctonia solani شد اما اثری بر پکتوباکتر Erwinia amylovora نداشت. اثر بیوکنترلی ترکیب ضد میکروبی موجود در عصاره در تیمار با تریپسین از بین رفت و در حضور SDS کاهش یافت که نشان از پروتئینی بودن طبیعت آن دارد. این پروتئین ضد میکروبی توانست به مدت نیم ساعت دمای 100 درجه سانتی‌گراد را تحمل کند و همچنین در طیفی از pHهای اسیدی و قلیایی (9-4) پایدار بماند. بدین ترتیب، دستاوردهای ما نشان از جداسازی یک پروتئین‌ ضد میکروبی قارچی مقاوم در برابر حرارت را دارد که می‌تواند در آینده به عنوان عامل بیوکنترل مورد استفاده قرار بگیرد.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Trichoderma harzianum secretome and its efficacy in biocontrol

نویسندگان [English]

  • Sarah Kazemzadeh 1
  • Saeed Aminzadeh 3
  • Seyed Mehdi Alavi 4
  • Abolfazl Sarpeleh 5
  • Mojtaba Mamarabadi 6

1 Student at Sharood University of Technology

چکیده [English]

Trichoderma harzianum crude extract was prepared and its controlling effect on a wide range of Gram positive and negative bacteria, and a few fungal species was evaluated via disk assay techniques. The extract was able to control pathogenic bacteria including Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, two Xanthomonas citri pathovars (NIGEB-88 and NIGEB-9322), and two fungal pathogens, namely Macrophomina phaseolina and Rhizoctonia solani. However, it failed to control a pectobacter, Erwinia amylovora. The biocontrol efficacy of crude extract was lost once treated with trypsin and reduced in the presence of SDS, indicating the protein nature of the effective materials in the fungal extract. The antimicrobial protein was resisted 100 °C for 30 min and was active in a wide range of pH (4-9). Our data is indicative of an efficient isolation of novel fungal thermostable antimicrobial proteins with the potential to be used as a biocontrol agent in the future.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Trichoderma
  • antibacterial protein
  • antagonist
  • pathogen

خواص ضد میکروبی عصاره خام قارچ- 1103  Trichoderma harzianum و نقش بیوکنترلی آن

سارا کاظم­زاده1و2، ناصر فرّخی3*، سعید امین­زاده2، سید مهدی علوی2، ابوالفضل سرپله4، مجتبی ممرآبادی1

1 شاهرود، دانشگاه صنعتی شاهرود، دانشکده کشاورزی

2 تهران، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری 

3 تهران، دانشگاه شهید بهشتی، دانشکده مهندسی انرژی و فناوری­های نو، گروه مهندسی بیوتکنولوژی 

4 تهران، مؤسسه تحقیقات گیاهپزشکی کشور

تاریخ دریافت: 29/9/91               تاریخ پذیرش: 4/8/93 

چکیده 

در این مطالعه، عصاره خام قارچ 1103- Trichoderma harzianum تهیه شد و اثر بازدارندگی آن بر طیفی از باکتریهای گرم مثبت، گرم منفی و تعدادی از گونه­های قارچ مورد آزمایش قرار گرفت. عصاره سبب کنترل باکتریهای پاتوژن شامل Escherichia coli، Bacillus subtilis، Pseudomonas fluorescens، Salmonella typhi، Staphylococcus aureus و Xanthomonas citri (NIGEB-88 , NIGEB-9322) و قارچهای پاتوژن Macrophomina phaseolina و Rhizoctonia solani شد اما اثری بر پکتوباکتر Erwinia amylovora نداشت. اثر بیوکنترلی ترکیب ضد میکروبی موجود در عصاره در تیمار با تریپسین از بین رفت و در حضور SDS کاهش یافت که نشان از پروتئینی بودن طبیعت آن دارد. این پروتئین ضد میکروبی توانست به مدت نیم ساعت دمای 100 درجه سانتی­گراد را تحمل کند و همچنین در طیفی از pHهای اسیدی و قلیایی (9-4) پایدار بماند. بدین ترتیب، دستاوردهای این تحقیق نشان از جداسازی یک پروتئین ضد میکروبی قارچی مقاوم در برابر حرارت را دارد که می تواند در آینده به عنوان عامل بیوکنترل مورد استفاده قرار بگیرد.

واژه های کلیدی: قارچ تریکودرما، پروتئین آنتی­باکتریال، آنتاگونیست، پاتوژن

* نویسنده مسئول، تلفن:09124405840، پست الکترونیکی: nfarrokh@nigeb.ac.ir 

مقدمه

 

کنترل بیولوژیک آفات و بیماریهای گیاهی شاخص مهمی در تولید محصولات کشاورزی سالم می­باشد. با توجه به اهمیت بهداشت محیط زیست و سلامت انسان تحقیقات زیادی در جهت کاهش استفاده از سموم و افزایش مبارزه بیولوژیک انجام شده است، البته به علت محدودیتهای تحقیقاتی، اقتصادی و اجتماعی در جهان سوم و کشور ایران این روش توسعه زیادی نداشته است (1، 3 و 4). گزارشها در خصوص کنترل بیولوژیک بیماریها توسط قارچهای آنتاگونیست به اوایل قرن 20 میلادی باز می­گردد (8). هارتلی (1921) قارچ آنتاگونیست خاک­زادی را برای کنترل بوته میری در گیاهچه­های کاج معرفی کرد (21). سنفورد (1926) و میلارد و تایلور (1927) اسکب سیب­زمینی را که به وسیلهStreptomyces scabies  ایجاد می شد، با استفاده از Actinomyces praecox کنترل کردند (31 و 34). فلمینگ (1928) آنتی­بیوتیکی خاص به نام پنی­سیلین را کشف کرد (2 و 9). هنری (1931) بیماریهای ریشه غلات را به­وسیله میکروارگانیزم­های خاک کنترل کرد (20). واکسمن در سال 1943 استرپتومایسین را از Streptomyces به دست آورد. با گذشت زمان به علّت پیدایش مقاومت در باکتریها تأثیر آنتی بیوتیکها روز به روز کمتر شد. در نتیجه دانشمندان تلاش کردند تا آنتی­بیوتیکی جدید کشف کنند. در راستای تحقق این هدف از Corylophilumdierckx penicillium آنتی بیوتیکی جدا شد که علیه Staauveus  و Microcococcus leutaus خاصیّت ضد میکروبی داشت (33). ریشبت (1963) مقاله­ای را درمورد کنترل Fomes annosus به وسیله Peniophora gigantea منتشر کرد (33). البته بیشتر تولیدات تجاری در این زمان بر پایه سویه­های مختلف قارچ تریکودرما که برای کنترل بیماریها متداول­ترند به بازار عرضه شد. در سال 1967 آنتی­بیوتیک تتراسایکلین برای کنترل بیماریهای گیاهی ناشی از موجودات شبه باکتری (mollicutes)  به کار رفت (5). بردی و بندیکت (1972) فعالیّت متابولیتهای قارچهای خوراکی انتخابی را روی تعدادی از باکتریها امتحان کردند و گزارش دادند که بهترین پاسخ بازدارندگی آن علیه باکتریهای گرم مثبت و مخمرهاست (10). این کشف اطّلاعاتی را در مورد فعالیّتهای ضدمیکروبی تعدادی از قارچهای خوراکی فراهم کرد. یک پپتید آنتی­باکتریال به­نام پلکتاسین از قارچ ساپروفیتPseudoplectania nigrella  علیه باکتری Streptococcus pneumoniae جدا شد (29). فاگاد و همکارانش (2009) خاصیّت آنتی­باکتریالی را در گونه­های قارچ fulvus  Panusو Pleeurotus florida علیه Escherichia coli، Streptococcus pyogenes، Streptococcus sp.، Staphylococus aureus، Klebsiella pneumonia و Flavobacterium sp. کشف کردند (19). سویوژنگ و همکارانش (2010) به پروتئین آنتی­باکتریال جدیدی از قارچ Clitocybe sinopice به وزن مولکولی 44 کیلو دالتون دست یافتند (42). در همین سال پپتید آنتی­باکتریال دیگری از قارچ Aspergillus clavatus  به وزن مولکولی 6 کیلو دالتون به نام AcAMP که دارای اثرات ضد باکتریایی علیه چندین باکتری گرم مثبت و منفی بود جدا شد (19). در مطالعه حاضر فعالیت آنتی­باکتریالی پروتئینهای موجود در عصاره خام قارچ تریکودرماهرزیانوم مورد بررسی قرار گرفت. فعالیت این پروتئینها بر علیه برخی از پاتوژنهای مهم عملکرد ضد میکروبی آنها را مشخص نمود. براساس یافته­ها این چهارمین پروتئین ضد میکروبی قارچی است که دارای خاصیت ضد میکروبی علیه باکتریهاست (aps.unmc.edu-May 2011).

مواد و روشها

تهیه گونه­های قارچی و باکتریایی: تمامی گونه­های قارچی که در این مطالعه غربالگری شدند، از مؤسسه گیاهپزشکی کشور تهیه شدند. این گونه­ها  شامل Trichoderma atraviridae، T. virens، T. harzianum-p(T22)، T. virens-1101، T. harzianum-1482، T. harzianum -1103، Rhizoctonia solani و Macrophomina  phaseolina بودند که هر یک در محیط PDA (شامل پپتون و گلوکز) کشت شده (3) و به مدت یک هفته در دمای 30 درجه سانتی­گراد قرار گرفتند. تمامی گونه­های باکتریایی نیز از پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری تهیه شد. این گونه­ها شامل Escherichia coli، Bacillus subtilis،Pseudomonas fluorescens،Salmonella typhi،Staphylococcus aureus، Erwinia amylovora و دو سویه از باکتری زانتوموناس Xanthomonas citri (NIGEB-88) نماینده تیپ *A و (NIGEB-9322) نماینده تیپ  Aبودند که در محیط YP (3 گرم عصاره مخمر و 5 گرم پپتون) کشت داده شدند.

تهیه عصاره خام از قارچ تریکودرما: بدین منظور، از حاشیه کشت هفت روزه هر یک از سویه­های قارچ تریکودرما، دو قطعه از محیط کشت قارچ حاوی ژلوز محیط کشت، به ابعاد تقریبی cm)1× cm1) جدا و در فلاسک ارلن مایر شامل 100 میلی­لیتر محیط PDB (شامل 4 گرم پپتون و 20 گرم گلوکز) ریخته شد و به مدّت 20 روز در شیکر انکوباتور با دور rpm 180 و دمای 30 درجه سانتی گراد نگهداری شد. سپس محیط کشت حاوی میسلیوم­های قارچی، با عبور از صافی فیلتر و مایع عبوری از صافی با حجم برابری از اتیل استات عصاره­گیری شد. سپس عصاره­ به مدت نیم ساعت در  ×g11627 سانتریفیوژ و در نهایت با استفاده از تبخیر چرخشی، غلیظ و در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری شد (30، 32 و 35).

سنجش فعّالیت آنتی­میکروبیال عصاره قارچی: عصاره قارچ تریکودرما برای سنجش فعاّلیت ضدمیکروبی در مقابل دو سویه از باکتری citri ssp. citri Xanthomonas  با استفاده از روش دیسک مورد بررسی قرار گرفت. بدین منظور مقدار 15 میکرولیتر از عصاره قارچی روی سطح دیسک قرار گرفت و دیسکها روی سطح پلیت آغشته به 100 میکرولیتر سوسپانسیون باکتری (1cfu.ml-1023 × 4)، قرار داده شد. سپس در دمای 30 درجه سانتی گراد به مدت 24 ساعت انکوبه شد. فعَالیت آنتی­باکتریالی به صورت اندازه­گیری قطر ناحیه بازدارنده بر حسب میلی­متر مورد ارزیابی قرار گرفت (17، 30 و 35).

طیف بازدارندگی ترکیب ضدمیکروبی بر علیه باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی دیگر از جمله باکتری Bacillus subtilis، Erwinia amylovora، Pseudomonas fluorescens، Staphylococcus aureus، Salmonella typhi و Escherichia coli  و همین­طور سویه  NIGEB-9322 باکتریcitri  Xanthomonas  نیز بررسی شد. همچنین برای بررسی اثر ضد قارچی عصاره قارچ تریکودرما فعالیت آن بر روی دو قارچ Macrophomina phaseolina و Rhizoctonia solani مورد ارزیابی قرار گرفت.

تأثیر پروتئازها بر فعالیت عصاره قارچی: جهت تعیین ماهیت مولکولی ترکیب ضدمیکروبی قارچ تریکودرما، حساسیت عوامل بازدارنده عصاره قارچی بر رشد باکتری زانتوموناس، سویه 88 NIGEB- در حضور آنزیم پپسین، تریپسین و پروتئینازk  مورد بررسی قرار گرفت. برای این کار عصاره قارچ با سه آنزیم تریپسین، پپسین و پروتئینازk   با غلظت 1 میلی­گرم در میلی­لیتر به نسبت 1:1 مجاور گردید و پس از گذشت یک ساعت فعالیت عصاره به روش دیسک اندازه­گیری شد (13 و 36).

تأثیر pH، حرارت و دترژنتها بر فعالیت عصاره قارچی: جهت بررسی اثرpH  با استفاده از بافر سدیم فسفات، سری pHهای 9-4 تهیه شد و عصاره قارچی با هر یک از pHهای ساخته شده با نسبت 1:1 به مدت 30 دقیقه مجاور شد. جهت اندازه­گیری مقاومت به گرما عصاره در حرارت 100- 50 درجه سانتی­گراد به مدت نیم ساعت قرار گرفت. همچنین برای بررسی اثر دترژنتها، عصاره قارچی با EDTA و SDS یک درصد مجاور گردید و فعالیت آنتاگونیستی در تمامی موارد با استفاده از روش دیسک بررسی شد (6، 12 و 13).

تعیین حداقل غلظت بازدارنده (MIC): تعیین حداقل غلظت بازدارنده عصاره قارچ 1103- Trichoderma harzianum با استفاده از روش Broth microdilution صورت گرفت. این آزمایش در میکروپلیت الایزا انجام شد. برای این کار غلظتهای 4 تا 2048 میکروگرم در میلی­لیتر از عصاره حاوی ترکیب آنتی­میکروبیال تهیه شد. بدین ترتیب برای ساختن غلظتهای ذکر شده، ابتدا 048/2 میلی­گرم از عصاره لیوفیلیزه شده، در 1 میلی­لیتر محیط کشت حل شد تا محلول استوک با غلظت  μg/ml2048 به دست آید. برای رسیدن به غلظتهای کمتر به نسبت 1 به 2 رقت سازی صورت گرفت. کدورت باکتری زانتوموناس (سویه 88 NIGEB-) نیز به کمک دستگاه اسپکتروفتومتر در1  cfu.ml-105× 5 تنظیم شد. در زیر هود حجم 100 میکرولیتر از هر کدام از غلظتهای آنتی­میکروبیال ساخته شده به چاهکهای میکروپلیت اضافه شد. از نمونه باکتری نیز به میزان 1 میکرولیتر به دامنه غلظتهای ترکیب ضد میکروبی اضافه گردید. در نهایت میکروپلیت در دمای 30 درجه سانتی­گراد به مدت 24 ساعت قرار گرفت. پس از گذشت 24 ساعت میزان کدورت هر یک از چاهکهای میکروپلیت به صورت چشمی ارزیابی شد (15).

نتایج و بحث

پروتئینها و پپتیدهای آنتی­باکتریال ارزش اقتصادی زیادی دارند به این علّت که این ترکیبات می­توانند گیاهان و جانوران را از آلودگیهای باکتریایی، قارچی، ویروسی و ... محافظت کنند. امروزه پروتئینهای مختلفی با فعالیتهای آنتی باکتریال و ضدقارچی گزارش شده­اند که بیشتر آنها از حیوانات (14، 23، 24، 26، 28، 34، 37 و 39)، گیاهان (20 و 38) و باکتریها (7، 22 و 25) استخراج شده­اند اما تعداد کمی از آنها از قارچها (20 و 27) جدا شده­اند که این موضوع اهمیّت بررسی روی قارچها را برجسته­تر می­نماید.

در این بررسی، اثر کنترل کنندگی قارچ1103 - Trichoderma harzianum بر باکتری زانتوموناس، سویه NIGEB-88 مشاهده شد که به صورت بروز هاله­های عدم رشد باکتری کشت داده شده در اطراف دیسکها بود.

جهت تعیین ماهیت عصاره ضدمیکروبی قارچ Trichoderma harzianum، اثر پروتئازهای گوناگون بر فعالیت ضدمیکروبی این عصاره مورد آزمایش قرار گرفت. بر اساس نتایج ارائه شده در جدول 1، اثر کنترل­کنندگی عصاره قارچی در حضور آنزیم تریپسین به طور کامل از بین رفت و در حضور آنزیمهای پپسین و پروتئیناز k فعالیت آنتی­باکتریالی کاهش یافت که می­توان آن را به پروتئینی بودن ترکیب بازدارنده نسبت داد (10، 11، 16 و 36). این پروتئین آنتی­میکروبیال تحت عنوان K91 نامگذاری شد.

K91 علاوه بر سویه NIGEB-88 باکتری زانتوموناس فعالیت بازدارندگی برعلیه باکتری E.coli، Bacillus subtilis، Pseudomonas fluorescense، Salmonella typhi، Staphylococcus aureus و Xanthomonas citri (NIGEB-9322) نشان داد اما فاقد اثر کنترل کنندگی بر باکتری  Erwinia amylovoraبود (جدول 2). عصاره مذکور واجد فعالیت ضد قارچی نیز بود (شکل 1).

حداقل غلظت بازدارنده برای پروتئین  K91265 میکروگرم بر میلی­لیتر تعیین شد. ترکیب K91 با EDTA تغییری را در عملکرد آن ایجاد نکرد. این عدم بازدارندگی حاکی از این است که کاتیونهای فلزی نقشی در فعالیت این پروتئین ضد میکروبی ندارند. این در حالی است که در مجاورت با  SDSعملکرد آن کاهش یافت که این مشاهده می­تواند تأکیدی بر ماهیت پلی پپتیدی K91 بنماید (41)، به این صورت که تقسیم زیر واحدهای بزرگ پلی پپتیدی توسط دترژنتها به زیر واحد کوچکتر می­تواند منجر به کاهش فعالیت ضد میکروبی و یا توقف آن شود.

خاصیت مهم K91 پایداری در دمای 100 درجه سانتی گراد به مدت نیم ساعت است که احتمالاً ناشی از ساختار سه بعدی ویژه آن و نقش نیروهای ضعیف الکتروستاتیک و هیدروژنی در شکل گیری این پروتئین است. گزارشات بسیاری پیرامون مقاومت پروتئینهای آنتی­میکروبیال در دماهای بالا وجود دارد (16 و 40).

حساسیت پروتئینهای آنتی­میکروبیال نسبت به  pH نیز بسیار متفاوت بوده و تعداد زیادی از آنها در محدوده وسیعی از pHها فعال می­باشند (16 و 40). K91 نیز همین خصوصیت را نشان داده و در تمامی pH های تهیه شده فعالیت خود را به خوبی حفظ کرد.

 

جدول 1- تأثیر عوامل بازدارنده فیزیکی و شیمیایی بر عامل بازدارنده تولید شده توسط قارچ Trichoderma harzianum

عامل

تیمار

اثر آنتاگونیستی

 

 

پروتئاز

 

 

پپسین

تریپسین

پروتئیناز k

 

-

-

-

 

دترژنت­

شلات کننده

 

 SDS1%

 EDTA1%

 

-

+

 

 

حرارت

(درجه سانتی گراد) 

 

50

70

90

100

 

+

+

+

+

 

 

 

pH

 

 

4

5

6

7

8

9

 

+

+

+

+

+

+

         +  همچنان اثر آنتاگونیستی خود را حفظ کرده است.         -  اثر آنتاگونیستی به­طور کامل از بین رفته و یا کم شده است.

جدول 2- طیف بازدارندگی K91 بر علیه باکتری­های گرم مثبت، گرم منفی و قارچ­ها

ردیف

باکتری

فعالیت بازدارندگی

1

Bacillus subtilis 

+

2

Erwinia amylovora 

_

3

Pseudomonas fluorescens 

+

4

Escherichia coli 

+

5

                Staphylococcus aureus 

+

6

                        i Salmonella typh 

+

7

Xanthomonas citri 88 

+

8

Xanthomonas citri 9322 

+

9

Rhizoctonia solani

+

10

Macrophomina  phaseolina 

+

                         + دارای اثر آنتاگونیستی

                         - فاقد اثر آنتاگونیستی

 

در این مطالعه، نتایج بررسیها در شرایط آزمایشگاهی ثابت کرد که می­توان از پروتئینهای ضد میکروبی موجود در عصاره خام قارچ­ T. harzianum 1103 به عنوان عاملی برای بیوکنترل باکتریها و قارچهای پاتوژن استفاده نمود.

براساس یافته­ها این چهارمین پروتئین ضد میکروبی قارچی است که دارای خاصیت ضد میکروبی علیه باکتریهاست. از آنجا که این پپتیدها و پروتئینهای ضد میکروبی طیف اثر گسترده­ای دارند و بر علیه آنها مقاومت ایجاد نمی­شود، لذا سرمایه گذاری بر روی آنها ارزشمند خواهد بود.

 

 

 

 

 

 


                                                     الف                                                                  ب

شکل1 - الف: اثر ضد باکتریایی  K91بر سویه88  NIGEB- باکتری citri Xanthomonas ، ب: اثر ضد قارچی K91بر قارچ Macrophomina  phaseolina

تشکر و قدردانی

هزینه اجرای این پژوهش از طریق طرح اولویت محور شانکر مرکبات با شماره (406 م)، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری تأمین شده است که بدین وسیله تشکر و قدردانی می­گردد.

  1. احمدزاده، م.، 1381، بررسی اثر ریزوباکتری­های آنتاگونیست از جنس­های Pseudomonas و Bacillus علیه بیماری­های پوسیدگی بذر و مرگ گیاهچه لوبیا و مطالعه مکانیزم­های آنتاگونیستی آن­ها. رساله دکتری دانشکده کشاورزی دانشگاه تهران، ص 146.
  2.  بابایی، ن.، ملک­زاده، ف.، امامی، م. و بابایی، م.، 1378، بررسی خواصّ ضد میکروبی استرپتومیسس­ها و قارچ های جدا شده از خاک­های جنگل ­آمل و مناطق بیابانی کهریزک و حسن آباد خالصه. پژوهش و سازندگی در زراعت وباغبانی. ص 120-124.
  3. حریقی، م.، مطلبی، م.، زمانی، م.، 1385، خالص سازی آنزیم کیتیناز 42 ازTrichoderma atroviride PTCC5220. مجله زیست شناسی ایران. ص 214-203.
  4. سید اصلی، ن.، زمانی، م.، مطلبی، م.، حریقی، م.، 1383، مطالعه تولید آنزیم کیتیناز در قارچ تریکودرما. مجله زیست شناسی ایران. ص 233-227.
  5. صارمی، ح.، 1380، اثرات منفی سموم مصرفی برای کنترل آفات و بیماری­های گیاهی در بهداشت محیط­زیست و کاهش مصرف آن با افزایش روش­های کنترل بیولوژیک، چهارمین همایش کشوری بهداشت محیط. ص 1069-107.
  6.  مژگانی، ن.، اسماعیل خانیان، س.، عاملی، م. ، یوسفی، ا.، 1385، شناسایی و تشخیص باکتریوسین تولید شده توسط Lactobacillus acidophilus (RN78) جدا شده از پنیر محلی. پژوهش و سازندگی در امور دام و آبزیان. ص 42-36.
    1.  Agrios, G. (2005) Plant pathology, D. Dreibelbis, 922.
    2.  Baker, K.F. (1987) Evolving concepts of biological control of plant pathogens. Annual Review of phytopathology. 25: 67-85.
    3. Barja, J.L., Lemos, M.L., Toranzo, A. (1989) Purification and characterization of an antibacterial substance produced by a marine Alteromonas species. Antimicrob Agents Chemother 33: 1674–1679.

 

10.  Benedict, R.G., Braddy, L.R. (1972) Antimicrobial activities of Mushroom metabolites. J. Pharm. Sci. 61: 1820 – 1822.

11. Campbell, R. (1989) Biological control of microbial plant pathogens, 218.

12. Cheikhyoussef, A., Pogori, N., Zhang, H. (2007) Study of the inhibition effects of Bidobacterium supernatants towards growth of Bacillus cereus and Escherichia coli. Int J Dairy Sc. 2:116–125.

13. Cheikhyoussef, A., Pogor,i N., Chen, W., Zhang, H. (2008) Antimicrobial proteinaceous compounds obtained from Bidobacteria: from production to their application. Int J Food Microbiol. 125: 215–222.

14. Cook, R.J., Baker, K.F. (1983) The nature and practice of biological control of plant pathogens.St Paul, Minnesota American Phytopathological Society.

15.  Devuyst, L. and Vandamme, E.J. (1994) Bacteriocins of LAB, microbiology, Genetics and applications. Blackie Academic and Professional. London.

16. Destoumieux, D., Bulet, P., Loew, D., Dorsselaer, A.V., Rodriguez, J., Bachère, E. (1997) Penaeidins, a new family of antimicrobial peptides isolated from the shrimp Penaeus vannamei (Decapoda). J Biol Chem 272: 398–406.

17. Elov, J.N. (1998) A sensitive and quick microplate method to determine the minimal Inhibitory concentration of plant extracts for bacteria. Planta Med 64: 711–713.

18. Fagad, O.E., Oylade, A.A. (2009) A comparative of the antibacterial activites of some wood-decay fungi to synthetic antibiotic discs. EJEAFCHE 8: 184-188.

19. Hajji, M., Jellouli, K., Hmidet, N., Balti, R., Kamoun, A.S., Naseri, M. (2010) A highly thermostable antimicrobial peptide from Aspergillus clavatus ES1: biochemical and molecular characterization, J Ind Microbial Biotechnol 37: 805-813.

20. Henry, A.w. (1943) The natural microflora of soil in relation to the foot rot problem of wheat, Canadian of Research 4: 69-77.

21. Hartly, C. (1921) Damping off in forest nurseries. USDA Bulletin 943: 1-99.

22. Huynh, Q.K., Bergmeyer, J.R., Zobel, J.F. (1992) Isolation and characterization of a 22 kDa protein with antifungal properties from maize seeds. Biochem Biophys Res Commun 182: 1–5.

23. Hu, Z., Ye, M.Q., Xia, L.Q., Tu, W.J., Li, L., Zou, G.L. (2006) Purification and characterization of an antibacterial protein from the cultured mycelia of Cordyceps sinensis. Wuhan University Journal of Natural Sciences 3: 709–714.

24. James, S.G., Holmstrom, C., Kjelleberg, S. (1996) Purification and characterization of a novel antibacterial protein from the marine bacterium D2. Appl Environ Microbiol 62: 2783–2788.

25. Krishnakumari, V., Nagaraj, R. (1997) Antimicrobial and hemolytic activities of crabrolin, a 13-residue peptide from the venom of the European hornet, Vespa crabro, and its analogs. J Pept Res 50: 88–93.

26. Kato, T., Matsuda, T., Yoneyama, Y., Kato, H. and Nakamura, R., (1993) Isolation of Enterococcus faecium with antibacterial activity and characterization of its bacteriocin. Biosci Biotech Biochem, 57:551-556.

27. Longeon, A., Peduzzi, J., Barthélemy, M., Corre, S., Nicolas J.L., Guyot M. (2004) Purification and partial identification of novel antimicrobial protein from marine bacterium Pesudoalteromonas species strain X153. Mar Biotechnol 6: 633–641.

28. Lemaître, C., Orange, N., Saglio, P., Saint, N., Gagnon, J., Molle, G. (1996) Characterization and ion channel activities of novel antibacterial proteins from the skin mucosa of carp (Cyprinus carpio). Eur J Biochem. 240: 143–149.

29. Mygind, P.H., Fischer, R.L., Schnorr, K.M., Hansen, M.T., Sonksen, C.P., Ludvigsen, S., Raventos, D., Buskov, S., Christensen, B., Maria, L.D., Taboureau,O., Yaver, D., Gorgensen, S.G.E., Sorensen M.V., Christensen, B.E., Kjaerlff, S., Moller, N.F., Lehrer, R.L., Zasloff, M., Kristensen, H.H. (2005) Plectasin is  a peptide antibiotic with therapeutic potential from a saprophytic fungus.nature 437: 975-980.

30. Mayr-Hartings, A. hedges, A.J, and Berkeley, R.C.W. (1972) Methods for studying bacteriocins. Methods Microbiol. 7: 315-422.

31. Millard, W.A. and Taylor, C.B. (1927) Antagonism of microorganism as the controlling factor in the inhibition of Scab by green manuring. Annals of Applied Biology 14: 202-16.

32. Radji, M., sumiati, A., rachmayani, R. and Elya, B. (2011) Isolation of fungal endophytes from Garcinia mangoostana and their antibacterial activity. African J Biotechnol 1: 103-107.

33.  Rishbeth, J. (1963) Stump protection against Fomes annosus.III Inoculation with Peniophora gigantea. Annals of Applied Biology. 52: 63-77.

34. Sanford, G.B. (1926) Some factors affecting the pathogenicity of Actinomyces scabies. Phytopathology 16: 525-47. 

35.  Silva, M.G., Dose, A. (2004) The best penicillin for resistant bacteria. J Antibiotics 48: 562-569.

36.  Steiner, H., Hultmark, D., Engström, A., Bennich, H., Boman, H.G. (1981) Sequence and specificity of two antibacterial proteins involved in insect immunity. Nature 292: 246–248.

37. Tong, W.Y., Darah, I. and Latiffeh, Z. (2011) Antimicrobial activities of endophytic fungul isolation from medicinal herb Orthosiphon stamineus benth. J Medicinal Plant Research. 5: 831-836.

38.  Tahara, T., Kanatani, K., Yoshida, K., Hirosumi, M., Sakamoto, M. and Oshimura, M. (1991) Purification and some properties of acidocin 8912, a novel bacteriocin produced by L. acidophilus TK 8912. Biosci Biotech Biochem. 56:1212-1215.

39. Torres-Larios, A., Gurrola, G.B., Zamudio, F.Z., Possani, L.D. (2000) Hadrurin, a new antimicrobial peptide from the venom of the scorpion Hadrurus aztecus. Eur J Biochem 267: 5023–5031.

40. Talas, T. (2004) Screening antimicrobial activities of basic protein fractions from dry and germinated wheat seeds. Biologia Plantarum 48: 583–588.

41. Tagg, J.R., Dajani, A.S. and Wannamaker, L.W. (1976) Bacteriocins of Gram-positive bacteria. Bacteriol Rev 40:722-756.

42. Zheng, S., Liu,Q., Zhang, G., Wang, H., Ng, T.B. (2010) Purification and characterization of an antibacterial protein from dried fruiting bodies of antibacterial protein from dried fruiting bodies the wild mushroom Clitocube sinopica. ABPs 57: 43-48.