اثر عصاره برگی آلوئه ورا بر رشد، تولید آفلاتوکسین B1 و الگوی پروتئینهای خارج سلولی آسپرژیلوس فلاووس در شرایط آزمایشگاهی 

آرش بابایی^1*، میلاد منافی² و حدیث طوافی¹

¹ ملایر، دانشگاه ملایر، گروه میکروبیولوژی

² ملایر، دانشگاه ملایر، گروه علوم دامی

تاریخ دریافت: 19/1/92               تاریخ پذیرش: 28/8/92

چکیده

 آسپرژیلوس فلاووس از جمله قارچهایی است که آلودگی وسیعی بر روی مواد غذایی ایجاد می کند. در این مطالعه، فعالیت ضد قارچی عصاره های مختلف گیاه آلوئه ورا بر رشد و میزان آفلاتوکسین تولیدی آسپرژیلوس فلاووس و همچنین تأثیر این عصاره ها بر الگوی پروتئینهای خارج سلولی این قارچ مورد بررسی قرار گرفت.  حلال مختلف استن، اتانول، آب، متانول، کلروفرم و اتیل اتر برای استخراج عصاره از برگهای گیاه آلوئه ورا استفاده گردید. فعالیت ضد قارچی عصاره ها به روش Agar Plate Diffusion Plate  انجام گرفت. هر کدام از عصاره ها در غلظتهای 0، 2، 20، 200 و 2000 میکرو لیتر بر 20 میلی لیتر محیط کشت، آزمایش شدند. بعد از بررسی، از عصاره استنی آلوئه ورا، به منظور ارزیابی و تأثیر عصاره بر میزان تولید آفلاتوکسین B1 و الگوی پروتئینهای خارج سلولی تولیدی توسط قارچ آسپرژیلوس فلاووس به ترتیب HPLC و SDS-PAGE انجام گرفت. بیشترین فعالیت ضد قارچی در عصاره استن در غلظت 2000 میکرو لیتر،  دیده شد. با توجه به نتایج HPLC میزان مهار تولید آفلاتوکسین در غلظت 2000 میکرو لیتر، 94/40 درصد و در غلظت 2 میکرو لیتر،14/18 درصد گزارش شد. نتایج SDS-PAGE نشان داد که با کاهش رشد قارچی، میزان تولید پروتئینها نیز کاهش یافته است. از این مطالعه می توان نتیجه گرفت که، عصاره استنی آلوئه ورا می تواند به عنوان عامل ضد قارچی مؤثر تری بر مهار رشد آسپرژیلوس فلاووس نسبت به حلالهای دیگر باشد.

واژه های کلیدی: آلوئه ورا، آسپرژیلوس فلاووس ، فعالیت ضد قارچی، آفلاتوکسین B1، HPLC، SDS-PAGE

* نویسنده مسئول، تلفن: 09188512622 ، پست الکترونیکی: a.babaei@sheffield.ac.uk

مقدمه

از جمله استراتژیهای درمانی که از دیرباز مورد توجه انسان بوده است، استفاده از گیاهان دارویی می باشد. گیاهان دارویی منبع غنی از عوامل ضد میکروبی هستند که این عوامل، جزء متابولیتهای ثانویه گیاهان هستند (13 و 16). از جمله این گیاهان دارویی می توان به آلوئه ورا اشاره کرد. آلوئه ورا گیاهی سبز رنگ و دارای برگهای سخت می باشد که حاشیه و وسط برگها را ژلی شفاف با ویسکوزیته بالا پر کرده است. آلوئه ورا شامل ترکیبات متنوعی از جمله، ترکیبات فنولی، ساپونین ها و آنتروکوئینون ها می باشد. این ترکیبات، دارای فعالیتهای ضد باکتریایی، ویروسی و قارچی می باشند (22). قارچها از جمله میکروارگانیسم های دخیل در فساد مواد غذایی (به خصوص مواد غذایی انباری) هستند و باعث کاهش ارزش مواد غذایی می شوند. از جمله قارچهایی که به صورت غالب بر روی محصولات انباری رشد می کنند، گونه های آسپرژیلوس، فوزاریوم و پنی سلیوم ها هستند(26). آسپرژیلوس فلاووس و آسپرژیلوس پارازیتیکوس از جمله قارچهای رشته ای هستند که دارای توزیع جهانیند و بر روی انواع کثیری از مواد آلی فاسد شدنی یافت می شوند (23). این قارچها، متابولیت ثانویه سمی و کارسینوژنی به نام آفلاتوکسین تولید می کنند که برای سلامتی انسان و حیوان مضراست (8)، بنابراین، این نگرانی سبب شده است که محدودیتهای تنظیمی بر روی رشد این قارچها و به مراتب بر تولید آفلاتوکسین توسط آنها اتخاذ شود(7 و 17). مصرف مواد غذایی آلوده به آفلاتوکسین ها باعث بیماریهای حاد و یا مزمن مانند سرطان کبد و اگر در مقادیر بسیار مصرف شوند، منجر به مرگ می شوند (20). از جمله راههای مؤثر برای کنترل مشکلات ناشی از آفلاتوکسین ها، جلوگیری از رشد قارچها بر روی سوبسترا ها می باشد (15). در طی تحقیقات مختلف گزارش شده است که عصاره ها و پودرهای انواع مختلف گیاهان دارویی و روغنهای استخراج شده از آنها، دارای فعالیت ضد قارچی هستند و همچنین تعدادی از آنها حتی تشکیل و تولید آفلاتوکسین را نیز مهار می کنند (3، 11 و 24).  Casion و همکارانش در سال 2007 ، اثرات مهاری برجسته ای از عصاره های هیدرو الکلیک برگهای تازه آلوئه ورا بر رشد میسلیوم های هتروسپوریوم پرونتی، بوتریتیس گلادیولروم، فوزاریوم اکسیزپوریوم و پنی سیلیوم گلادیولی مشاهده کردند (4). گیاهان دارویی متنوعی مانند آرکا کاتکو، پیپر بتل، سنتلا آسیتیکا، کاسیا باکریانا، سیرتوروس رتیکولیت و موموردیکا کارانتیا به منظور کنترل رشد آسپرژیلوس فلاووس مورد بررسی قرار داده شدند و نتایج نشان داد که عصاره های خام آتانولیکی برخی از گیاهان دارویی رشد قارچی را مهار می کنند (25). Masood وRanjan نیز دریافتند که عصاره های آرگمون مکزیکی و سیپروس روتوندوس، تولید آفلاتوکسین را به واسطه مهار رشد قارچ آسپرژیلوس فلاووس مهار کرد و نتایج نشان دادند که مهار تولید و تشکیل آفلاتوکسین در نتیجه مهار رشد آسپرژیلوس فلاووس بوده است (14). روشهای آنالیز آفلاتوکسین ها بر پایه 3 روش  TLC، HPLCو ELISA می باشند (27 و 28). در میان این سه روش،  HPLC روشی است که از نظر دقت و تعیین کمی میزان سم تولیدی، از حساسیت بیشتری برخوردار است. HPLC روشی شیمیایی است که قادر است میزان ترکیبات شیمیایی درون مخلوطی از مواد شیمیایی را آنالیز و تعیین مقدار کند. این روش، دارای دقت بالا می باشد و در تشخیص روشی سریع است (12). الایزا نیز روشی است که اخیراً برای تعیین مقدار آفلاتوکسین در مواد غذایی از آن استفاده می شود. اما این روش به دلیل ارائه نتایج کاذب بایستی با روشهای دیگر نیز جهت تأیید نتیجه، همرا گردد (19).

در این مطالعه، گیاه آلوئه ورا با حلالهای آلی استن، اتانول، متانول، کلروفرم، اتیل اتر و آب، عصاره گیری شد و اثر هریک از استخراجها بر ممانعت از رشد شعاعی آسپرژیلوس فلاووس مورد بررسی قرار گرفت. همچنین تأثیر عصاره آلوئه ورا بر میزان تولید آفلاتوکسن B1 و الگوی پروتئبنی خارج سلولی قارچ آسپرژیلوس فلاووس به ترتیب به وسیله روشهای HPLC و SDS-PAGE  نیز بررسی شد.

مواد و روشها

آماده سازی اولیه مواد گیاهی: بعد از جمع آوری برگهای تازه گیاه آلوئه و شستشو آنها توسط آب مقطر، به منظور ضد عفونی کردن آنها از اتانول 70 درصد استفاده شد. سپس به قطعات کوچکی خرد شدند. قطعات ریز شده برگها در دمای 60-50 درجه سانتی گراد به مدت 3 روز قرار داده شدند تا به طور کامل خشک شوند. بعد از خشک شدن کامل، برگها توسط دستگاه خردکن الکتریکی پودر شدند.

آماده سازی عصاره ها: 30 گرم از مواد گیاهی پودر شده را با 100 میلی لیتر از حلالهای مختلف ﴿استن، اتانول،آب، متانول، کلروفرم و اتیل اتر﴾ مخلوط کرده و به مدت  72 ساعت در دمای اتاق قرار داده شدند. سپس محتویات گیاهی مربوط به هر حلالی از کاغذ واتمن شماره 1 گذرانده شدند و مواد فیلتر شده توسط حمام بخار آب در دمای 70 -60 درجه سانتی گراد تبخیر شدند تا خشک گردند. عصاره های خشک شده، پودر شدند و در مقادیر کمی از حجمهای مساوی از حلالهای مربوطه و آب مقطر استریل (50 به 50) دوباره حل گردیدند و در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری شدند تا مورد مطالعه قرار گیرند (5 و 18).

استرین قارچی: در این مطالعه، قارچ ATCC 5004  Aspergillus flavus از بخش قارچ شناسی انستیتو پاستور ایران تهیه گردید. قارچها بر روی محیط کشت شیب دار (Potato Dextrose Agar) PDA کشت داده شده بودند. از قارچهای کشت داده شده در آزمایشگاه به عنوان ذخیره قارچی استفاده گردید و بر روی محیط PDA به مدت 7 روز در دمای 28 درجه سانتی گراد کشت داده شد و پلیتها بعد از 7روز در دمای 4 درجه سانتی گراد برای مطالعه بیشتر نگهداری شدند.

بررسی فعالیت ضد قارچی عصاره های استخراج شده به روش Agar Plate Diffusion: به منظور بررسی فعالیت ضد قارچی عصاره های استخراج شده توسط حلالهای مختلف از روش Agar Plate Diffusion استفاده گردید. بدین منظور غلظتهای 0، 2، 20، 200، 2000 میکرولیتر بر 20 میلی لیتر، از عصاره ها به محیط کشت PDA مذاب که حرارت آن در داخل پلیتها به 70 -60 درجه سانتی گراد رسیده بود، اضافه گردید و سپس مخلوط شدند. بعد از جامد شدن محیط کشتها، پلاکهایی از قارچهای کشت داده شده (در حدود ابعاد 4/0 میلی متر) را از سویه های استاندارد در مرکز هر پلیت مربوط به غلظتهای مختلف عصاره ها، به صورت نقطه ای قرار داده شد و کشتها به مدت 7 روز در دمای 28 درجه سانتی گراد گرمادهی شدند. برای هر یک از تیمار ها، 3 تکرار گذاشته شد. در پایان روز هفتم، میزان رشد شعاعی قارچها بر حسب سانتیمتر گزارش گردید و از نظر آماری، داده ها در هر تیمار مورد آنالیز قرار گرفت. میزان مهار رشد قارچی با توجه به فرمول مورد تحلیل قرار گرفت (10).

قطر کلنی کنترل/ قطر کلنی تیمار شده - قطر کلنی کنترل=  درصد مهار رشد میسیلیوم ×100

بررسی میزان تولیدآفلاتوکسین B1: با توجه به اینکه عصاره استنی ماکزیمم تأثیر را بر ممانعت از رشد قارچ نشان داده بود، از این عصاره به عنوان عصاره کاربردی برای بررسی میزان تولید آفلاتوکسین مورد استفاده قرار گرفت. به منظور ارزیابی و تعیین مقدار آفلاتوکسین B1، HPLC انجام گرفت. در ابتدا 1 میلی لیتر از سوسپانسیون قارچ آسپرژیلوس فلاووس در 50 میلی لیتر محیط کشت YESB (Yeast Extract Sucrose Broth) که در ارلنهای جدا تحت تأثیر غلظتهای 0، 2، 20، 200 و2000 میکرو لیتر بر 50 میلی لیتر از عصاره آلوئه ورا قرار داشتند، تلقیح شدند و در دمای 28 درجه سانتی گراد به مدت 7 روز گرمادهی گردیدند. از هر کدام از غلظتها، 3 تکرار تهیه شد. بعد از 7 روز میسیلیوم های رشد کرده بر سطح محیط کشت خارج شدند و با آب مقطر استریل شستشو داده شدند و به منظور شاخص رشد قارچی، بعد از خشک شدن، وزن شدند. محیط کشت بعد از گذراندن از پارچه کتانی، از کاغذ واتمن شماره 1 نیز عبور داده شد و برای آنالیز به وسیله HPLC به آزمایشگاه مرجع فرستاده شد و بعد از پاکسازی  نمونه ها به روش KHA- S001 مطابق با رفرنس موجود در استاندارد ملی 6872 مورد آنالیز قرار گرفتند.

بررسی الگوی پروتئینهای خارج سلولی آسپرژیلوس فلاووس : جهت بررسی الگوی پروتئینهای خارج سلولی آسپرژیلوس فلاووس ، از سویه استاندارد کشت داده شده بر روی محیط PDA استفاده گردید. اسپور ها از سطح پتری دیش قارچ توسط مخلوطی از آب و تریتون X به وسیله لوپ به طور کامل شستشو داده شد و از سوسپانسیون به دست آمده، 1 میلی لیتر (10⁵ اسپور ml^-1) در محیط کشت  PDB تلقیح شدند و در شرایط استریل غلظتهای مختلف 0، 2، 20، 200، 2000 میکرولیتر بر 50 میلی لیتر از عصاره استنی به محیط کشتها اضافه گردید و به مدت 10-7 روز در دمای 28 درجه سانتی گراد در انکوباتور شیکر دار قرار داده شدند. این نمونه ها نیز در 3 تکرار تست شدند. بعد از پایان 10-7 روز در شرایط استریل، قطعات بزرگ میسیلیوم قارچ، ابتدا توسط پارچه کتانی جدا و سپس مابقی محیط کشت قارچی به مدت 10 دقیقه در سرعت 4000 دور در دقیقه سانتریفیوژ گردیدند مایع رویی جمع آوری شدند و برای آنالیز توسط SDS- PAGE در دمای 20- درجه سانتی گراد نگهداری شدند.

الکتروفورز با ژل SDS: به منظور آنالیز پروتئینهای به دست آمده، نمونه ها به وسیله SDS- PAGE مورد بررسی قرار گرفتند. در این بررسی از ژل جدا کننده 12 درصد و ژل فشرده کننده 4 درصد طبق روش Laemmli (Laemmli, 1970) استفاده گردید. 20 میلی لیتر از نمونه و 10 میکرولیتر از بافر 2x SDS gel loading  در لوله تیوب ریخته و مخلوط گردید و سپس به مدت 7 دقیقه در دمای 100 درجه سانتی گراد قرار داده شدند و 30 میکرولیتر از نمونه ها در ژل ریخته شد. در میان نمونه ها، نشانگر استاندارد نیز الکتروفورز گردید، که دارای قطعات پروتئینی در اندازه های 20 تا 120 کیلو دالتون بود. رنگ آمیزی ژل نیز توسط محلول آبی کوماسی G-250 انجام گرفت.

آنالیز آماری: نتایج به دست آمده با استفاده از نسخه نوزدهم نرم افزار SPSS وآزمون مربع کای آنالیز گردید و سطح معنی دار 5 درصد  P<0.05) )  و درجه اطمینان 95 درصد  انتخاب گردید

نتایج

فعالیت ضد قارچی عصاره های مختلف آلوئه ورا بر رشد آسپرژیلوس فلاووس: دراین مطالعه فعالیت ضد قارچی عصاره های مختلف آلوئه ورا، بر رشد شعاعی قارچهای آسپرژیلوس فلاووس  در غلظتهای 0، 2، 20، 200، 2000 میکرولیتر بر 20میلی لیتر به روش Agar Plate Diffusion  مورد بررسی قرار گرفت. با توجه به تحلیل آماری، اختلاف آماری بین نتایج به دست آمده
 p value < 0.05 به طور معنی داری کاهش رشد در قارچهای مذکور را نشان می دهد. طبق نتایج به دست آمده در این مطالعه، فعالیت ضد قارچی آلوئه ورا در غلظت 2000 میکرولیتر از عصاره استنی، اثر مهاری 100 درصد را بر رشد آسپرژیلوس فلاووس داشته است و کمترین اثر مهاری در غلظت 2 میکرولیتر از عصاره متانولی به میزان 25/6 درصد گزارش شد. (جدول 1)

نتایج به طور معنی داری نشان می دهد که عصاره استخراج شده از استن در غلظت 2000 میکرولیتر، 100 درصد رشد آسپرژیلوس فلاووس را مهار نمود و در کمترین غلظت استفاده شده از این عصاره (2 میکرو لیتر) مهار رشد 72/51 درصد گزارش شد. عصاره های استخراج شده آلوئه ورا توسط حلالهای اتانول، اتیل اتر، آب، کلروفرم و متانول نشان داد که بالاترین غلطت که 2000(میکرولیتر) می باشد به ترتیب72/76 ، 53/61 ، 3/58 ، 48 و 5/37 درصد ممانعت رشد را باعث گردید ودر این عصاره های استخراجی توسط حلالهای دکر شده  کمترین غلطت (2میکرولیتر) به ترتیب 34/35 ، 84/33 ، 33/28 ، 20 و 25/6 درصد ممانعت رشد را سبب شد. در صورتی که بیشترین و معنی دارترین مهار رشدی در غلظتهای مختلف عصاره استنی عصاره های دیگر دیده شد (طبق جدول 1).

جدول 1- تأثیر عصاره های آلوئه ورا بر رشد آسپرژیلوس فلاووس در دمای 28 درجه سانتی گراد به مدت 7 روز

اثر عصاره استنی آلوئه ورا بر تولید آفلاتوکسین B1 به وسیله A. flavus  : همان طور که در جدول 2 نشان داده شده است، عصاره آلوئه ورا بر کاهش تولید آفلاتوکسین B1 توسط قارچ آسپرژیلوس فلاووس تأثیر داشته است. با توجه به نتایج HPLC، در نمونه کنترل (بدون تأثیر عصاره) میزان آفلاتوکسین تولیدی، 2/77  نانوگرم / گرم یافت شد و میزان مهار تولید آفلاتوکسین در غلظت 2000 میکرو لیتر بر 50 میلی لیتر ، 94/40 درصد و در کمترین غلظت از عصاره (2 میکرو لیتر بر 50 میلی لیتر) 14/18 درصد گزارش شد و در غلظتهای 20 و 200 میکرو لیتر بر 50 میلی لیتر از عصاره، میزان آفلاتوکسین تولید شده به ترتیب 8/59 و 6/52 نانوگرم / گرم گزارش شد. وزن خشک میسیلیوم های ایجاد شده توسط قارچ (به عنوان معیار میزان رشد قارچ) در محیط YES در غلظتهای 0، 2، 20، 200، 2000 میکرولیتر بر 50 میلی لیتر به ترتیب: 58/3، 02/3، 86/2، 43/2 و 93/1 گرم بود.

جدول 2- ارزیابی عصاره استنی آلوئه ورا بر بیوماس میسیلیومی ﴿g﴾ و میزان تولید آفلاتوکسین از آسپرژیلوس فلاووس در محیط YES

اثر عصاره استنی آلوئه ورا بر الگوی پروتئینهای خارج سلولی قارچ آسپرژیلوس فلاووس: با توجه به انحلال برخی از ترکیبات فعال گیاه آلوئه ورا در حلالهای مختلف، اثرات قابل توجه ای بر تولید و سنتز برخی از متابولیتها و ترکیبات سلولی می تواند داشته باشد. برخی از ترکیبات عصاره آلوئه ورا مانند آنزیمهای مختلف از جمله آلیاز، آلکالین فسفاتاز ها، آمیلاز ها، کربوکسی پپتیداز ها، کاتالاز، سلولاز، لیپاز، پراکسیداز می تواند بر تولید پروتئینهای حاصله از قارچ، در طی مسیر بیوسنتز آنها تأثیر گذار باشد. الگو تولید پروتئینهای خارج سلولی قارچ در غلظتهای مختلف 0، 2، 20، 200 و 2000 میکرولیتر بر 50 میلی لیتر در محیط کشتPDB  تلقیح شده با آسپرژیلوس فلاووس به وسیله روش SDS-PAGE مورد آنالیز قرار گرفت. بعد از گرمادهی به مدت 7 روز در دمای 28 درجه سانتی گراد و جداسازی میسیلیوم ها و آماده سازی نمونه ها، SDS-PAGE انجام گرفت ﴿شکل 1﴾. در این آنالیز، 24 باند پروتئینی دیده شد که وزن مولکولی آنها بین 10 تا 140 کیلو دالتون بود. این نتایج نشان دادند که در نتیجه کاهش رشد میسیلیوم قارچی، میزان تولید پروتئینها نیز کاهش یافته است.

شکل 1- الگوی پروتئینهای خارج سلولی قارچ در غلظتهای مختلف استون  0، 2، 20، 200 و 2000 میکرولیتر بر 50 میلی لیتر در محیط کشت PDB تلقیح شده با آسپرژیلوس فلاووس به وسیله روش SDS-PAGE