نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه لرستان

2 عضو هیأت علمی دانشگاه لرستان

3 دانشگاه زابل

چکیده

آویشن کرک¬آلود (Thymus pubescens) یکی از گیاهان دارویی خانواده نعناعیان است. با توجه به مشکلات اصلاحی گیاهان دارویی، استفاده از نشانگرها در بررسی تنوع ژنتیکی آنها ابزار قدرتمندی محسوب می¬شود. در این تحقیق جهت تعیین تنوع ژنتیکی آویشن¬های کرک¬آلود از 30 آغازگر نیمه¬تصادفی از دو گروه آغازگرهای اینترونی و اگزونی استفاده شد. پس از مشاهده محصولهای واکنش زنجیره¬ای پلیمراز بر روی ژل آگارز و امتیازدهی باندهای DNA، تجزیه و تحلیل با نرم¬افزار DARwin5 انجام شد. کل آغازگرها 96 درصد چندشکلی نشان داد. بیشترین میزان اطلاعات چندشکلی و شاخص نشانگر در آغازگرهای اینترونی و اگزونی را به ترتیب آغازگرهایIT18-1 و ET12-27 تشکیل دادند. در هر دو گروه آغازگرها بیشترین شباهت ژنتیکی را دو توده با منشأ جغرافیایی یکسان تشکیل دادند و گروه¬بندی تجزیه خوشه¬ای با گروه¬بندی تجزیه مولفه¬های اصلی همخوانی داشت. نتایج نشان داد که آغازگرهای اینترونی بهتر از آغازگرهای اگزونی توانسته توده-های آویشن کرک¬آلود را از هم تفکیک کنند.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Comparison of intron and exon markers in assessment of genetic diversity between Thymus pubescens

نویسنده [English]

  • farhad nazarian firoozabadi 1

چکیده [English]

Thymus pubescens is one of the medicinal plants of Lamiaceae, growing endemically in most regions (especially in north and west) of Iran. Molecular markers were used in genetic diversity studies of medicinal plants for breeding applications. In this study, 30 semi-random primers, including IT (intron targeting) and ET (exon targeting), were used for assessment of genetic diversity among Thymus pubescens accessions. DNA extracted from fresh leaves of Thyme and polymerase chain reaction products were separated on 1.5% agarose gel by electrophoresis. All of primers produced 559 bands which 96% of them were polymorphic. 302 and 257 polymorphic bands belong to IT and ET primers, respectively. The highest polymorphic information content (PIC) and marker index (MI) among IT and ET primers belonged to IT18-1 and ET12-27, respectively. Cluster analysis 0f IT and ET primers, using UPGMA method, Dice's similarity coefficient and DARwin5 software, divided accessions into three and four clusters, respectively. In both dendrogram, the highest genetic similarity showed between two accessions with similar geographical origin. Cluster analysis results were aligned with grouping of principal component analysis. Results of this study revealed that IT primers could discriminate Thymus pubescens accessions in compared with ET primers.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Thyme
  • Exon
  • Intron
  • Cluster analysis
  • Polymorphism

مقایسه نشانگرهای اینترونی و اگزونی در ارزیابی تنوع ژنتیکی آویشن کرک­آلود (Thymus pubescens)

فرزانه مجیری1، احمد اسماعیلی1*، فرهاد نظریان فیروزآبادی1 و رضا مومنی2

1 خرم آباد، دانشگاه لرستان، دانشکده کشاورزی، گروه زراعت و اصلاح نباتات 

2 زابل، دانشگاه زابل، دانشکده علوم، گروه آمار

تاریخ دریافت: 20/11/91           تاریخ پذیرش: 5/3/92

چکیده

آویشن کرک­آلود (Thymus pubescens) یکی از گیاهان دارویی خانواده نعناعیان است. با توجه به مشکلات اصلاحی گیاهان دارویی، استفاده از نشانگرها در بررسی تنوع ژنتیکی آنها ابزار قدرتمندی محسوب می­شود. در این تحقیق جهت تعیین تنوع ژنتیکی آویشنهای کرک­آلود از 30 آغازگر نیمه­تصادفی از دو گروه آغازگرهای اینترونی و اگزونی استفاده شد. پس از مشاهده محصولهای واکنش زنجیره­ای پلیمراز بر روی ژل آگارز و امتیازدهی باندهای DNA، تجزیه و تحلیل با نرم­افزار DARwin5 انجام شد. کل آغازگرها 96 درصد چندشکلی نشان داد. بیشترین میزان اطلاعات چندشکلی و شاخص نشانگر در آغازگرهای اینترونی و اگزونی را به ترتیب آغازگرهایIT18-1  و ET12-27 تشکیل دادند. در هر دو گروه آغازگرها بیشترین شباهت ژنتیکی را دو توده با منشأ جغرافیایی یکسان تشکیل دادند و گروه­بندی تجزیه خوشه­ای با گروه­بندی تجزیه مؤلفه­های اصلی همخوانی داشت. نتایج نشان داد که آغازگرهای اینترونی بهتر از آغازگرهای اگزونی توانسته توده­های آویشن کرک­آلود را از هم تفکیک کنند.

واژه­های کلیدی: آویشن کرک­آلود، تنوع ژنتیکی، اگزون، اینترون، چندشکلی

* نویسنده مسئول، تلفن: 09126054611 ، پست الکترونیکی:  ahmad_ismaili@yahoo.com

مقدمه

 

آویشن (Thymus spp.) یکی از پرکاربردترین گیاهان دارویی و از خانواده نعناعیان (Lamiaceae) است که به عنوان یک گیاه معطر و دارویی در کشاورزی و اقتصاد مطرح می­باشد. این گیاه به صورت بومی در مناطق گسترده­ای از ایران به ویژه در مناطق غربی و شمالی رویش دارد. از نظر رده‌بندی جنس آویشن پیچیده بوده و طبقه‌بندی آن مشکل است که علت این موضوع را می­توان به فراوانی گونه‌ها و عدم ناسازگاری ژنتیکی بین گونه‌ها نسبت داد. سطوح پلوئیدی متفاوتی حتی در بین گونه­های مشابه آویشن دیده شده که نمایانگر پلی­پلوئیدی فراوان در این جنس است (18).

آویشن کرک­آلود با نام علمی Thymus pubescens Bioss. & kotschy ex Celak یکی از گونه­های این جنس است. زمان گلدهی آن بهار و تابستان، رویشگاه آن دامنه­های کوهستانی، شکاف سنگها در ارتفاعات منطقه خزری و ایرانی تورانی در ارتفاع 695 تا 3600 متر است (4). این گونه از نظر دامنه پراکنش در شمال عراق و نواحی مرکزی، غربی و شمال غربی ایران پراکنش دارد (24).

کارآیی یک برنامه اصلاحی انتخابی به وسعت تنوع ژنتیکی و قابلیت توارث یک صفت بستگی دارد (12). از آنجا که مبنای همه گزینشها وجود تنوع ژنتیکی است، بنابراین با افزایش تنوع ژنتیکی در یک جمعیت، حدود انتخاب چه طبیعی و چه مصنوعی وسیع تر می­شود. از دیگر دلایل اهمیت بررسی تنوع ژنتیکی، استفاده در مدیریت مجموعه­های ژنتیکی با هدف کاهش هزینه­ها، افزایش دقت و قابلیت استفاده در برنامه­های اصلاحی است. بنابراین یکی از پایه­های اساسی علم اصلاح نباتات به ویژه برای گیاهان دارویی، دسترسی و آگاهی از میزان تنوع در مراحل مختلف پروژه­های اصلاحی است (10).

امروزه مطالعات اندکی بر روی تنوع ژنتیکی گیاهان دارویی صورت گرفته است، به طوری که در حال حاضر بیشتر گونه­های گیاهان دارویی در معرض خطر انقراض قرار دارند. از مهم ترین کاربرد نشانگرها، بررسی تنوع ژنتیکی در گیاهان است. از بین انواع نشانگرها، نشانگرهای مولکولی به علت مستقل بودن از شرایط محیطی و دارا بودن چندشکلی بیشتر نسبت به نشانگرهای مورفولوژیکی و بیوشیمیایی مورد توجه زیادی قرار گرفته است. یک نوع از نشانگرهای مولکولی مبتنی بر واکنش زنجیره­ای پلیمراز یا PCR، نشانگری است که توالی آنها بر اساس نواحی کدکننده (اگزون) و یا غیرکدکننده (اینترون) ژنوم گیاه طراحی شده­اند که به این نشانگر، نشانگر نیمه­تصادفی ISJ (Intron exon Splice Junction) گفته می­شود. این نشانگر توسط وینینگ و لانگریج (30) ابداع گردید و سپس توسط رافالسکی و همکاران (22) گسترش بیشتری یافت. محققین بیان کردند که این آغازگرها بسته به اینکه نواحی کدکننده و یا غیرکدکننده ژنوم را تکثیر کنند به ترتیب آغازگرهای مکان هدف اگزون یا ET و مکان هدف اینترون یا IT نامیده می­شوند (23). توالی آغازگرهای نیمه­تصادفی ISJ شامل نوکلئوتیدهای حفاظت شده و نوکلئوتیدهای تصادفی است (15 و 22). عده­ای از محققین بیان نمودند که آغازگرهای ET دارای انتهای 5َ آغازگر اختصاصی است که با نواحی حفاظت شده­ای از مکان هدف اینترون اتصال می­یابند و نواحی اگزونی را تکثیر می­کنند ولی آغازگرهای IT انتهای 3َ آنها اختصاصی است که به نواحی حفاظت شده مرز بین اگزون-اینترون اتصال می­یابند و اینترونها را تکثیر می­کنند (20، 21 و 30) (شکل 1).

 

 

 

شکل 1- شمایی از مکان هدف آغازگرهای ISJ بر روی ژنوم (فلش جهت تکثیر در رشته الگو را نشان می­دهد) (26)

 

 

محققین (26) در مطالعه­ای بر روی بریوفیتها گزارش کردند که برای تعیین نوع آغازگرهای ISJ از دو نوع IT و ET  می بایست بیان نمود که بخشی و یا تمامی توالی آغازگر با کدام توالی شکل 1 مطابقت دارد و سپس بر اساس آنکه آن توالی مناطق اینترونی یا اگزونی را تکثیر می­کند مشخص خواهد شد که به ترتیب آغازگر از نوعIT  یا ET است. برای مثال آغازگر ISJ3 ('3TGCAGGTCA'5) مشابه توالی پایین در سمت راست شکل 1 می­باشد که فلش جهت تکثیر را به سمت تکثیر اگزونها نشان می­دهد پس این آغازگر از نوع ET است. اما آغازگر ISJ9 ('3AGGTGACCGACCTGCA'5) که بخش محافظت شده توالی (سمت چپ شکل 1) در اگزونها بوده ولی فلش جهت تکثیر را به سمت اینترونها نشان می­دهد؛ پس این آغازگر از نوع IT است.  

در مطالعه­ای با استفاده از آغازگرهای نیمه­تصادفی، تنوع ژنتیکی 25 رقم تجاری و 14 رقم محلی لوبیا بررسی شد. از 50 آغازگر به کار رفته، شش آغازگر بر اساس تعداد قطعات تولیدی انتخاب شد. نتایج به دست آمده بیانگر کارآیی بالای این نوع آغازگرها در برآورد تنوع ژنتیکی ارقام لوبیا بوده است (20). وهابی و همکاران (28) به ارزیابی تنوع ژنتیکی 14 ژنوتیپ نخود علفی که از مکانهای مختلف ایران جمع­آوری شده بود با استفاده از نشانگرهای RAPD و ISJ پرداختند. نتایج مبنی بر عدم وجود همبستگی معنی­داری بین تنوع حاصل از نشانگرهای مورفولوژیکی با نشانگر RAPD بود. در حالی که تنوع ژنتیکی نخودهای علفی با استفاده از نشانگرهای ISJ و RAPDوابستگی معنی­دار بالایی را با طبقه­بندی مورفولوژیکی نشان دادند. در این مطالعه دندروگرام حاصل از نشانگر RAPD با دندروگرام نشانگر ISJ مطابقت چندانی نداشت. سمیعی (7) در مطالعه خود بر روی توده­های شبدر ایرانی با نشانگر نیمه­تصادفی ISJ گزارش کردند که گروه­بندی حاصل از آغازگرهای ET توانست ارقام بهاره و پاییزه را بهتر از آغازگرهای IT جدا کند که احتمالاً به دلیل تکثیر بخشی از DNA توسط این نوع آغازگرهاست که صفت بهاره­سازی را کنترل می­کند.

مطالعات اخیر نشان داد که مطالعات ژنتیکی و اصلاحی محدودی روی گونه آویشن کرک­آلود در داخل و خارج کشور انجام شده است، به طوری که تاکنون مطالعه­ای در مورد تنوع ژنتیکی آویشنT. pubescens  با نشانگرهای ISJ صورت نگرفته است. در این مطالعه برای اولین بار به بررسی روابط خویشاوندی توده­های آویشن  T. pubescens با استفاده از نشانگرهای ISJ از دو گروه نشانگرهای اینترونی و اگزونی پرداخته شده است.

مواد و روشها

مواد گیاهی مورد استفاده شامل 12 توده آویشن  T. pubescensاز چند استان مختلف ایران بود که از مزرعه تحقیقاتی مؤسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور واقع در کرج تهیه گردید (جدول 1).

جدول 1- منشأ جغرافیایی توده­های آویشن کرک­آلود (Thymus pubescens) 

توده­ها 

منشأ جغرافیایی 

توده­ها 

منشأ جغرافیایی 

1

گیلان

7

زنجان

2

زنجان

8

آذربایجان شرقی، مراغه

3

قزوین

9

آذربایجان شرقی، قره چمن

4

آذربایجان غربی

10

کردستان

5

نامشخص

11

زنجان

6

نامشخص

12

تهران

از آنجا که معمولاً استخراج DNA در گیاهان دارویی به علت وجود ترکیبات بازدارنده و متابولیتهای ثانویه با مشکلاتی روبروست، به همین منظور برای به دست آوردن DNA ژنومی با کیفیت مطلوب، چندین روش استخراج DNA از برگهای جوان و شاداب آویشن مورد آزمایش قرار گرفت و سرانجام روش خانوجا و همکاران (17) با اندکی تغییرات انتخاب شد (9). به منظور تعیین کمیت و کیفیت DNA ژنومی استخراج شده از دستگاه اسپکتروفتومتر و الکتروفورز بر روی ژل آگارز 8/0 درصد استفاده شد. از آنجا که توالی آغازگرهای ISJ از نظر تعداد نوکلئوتید متفاوت است (21، 22 و 29) واکنش PCR در دو مرحله مطابق با روش جزرتکویچ و همکاران (21) در دستگاه ترموسایکلر انجام شد. سرانجام محصولات PCR بر روی ژل آگارز 5/1 درصد بارگذاری شدند. پس از رنگ­آمیزی با اتیدیوم بروماید به مدت 15 دقیقه، زیر نور UV با دستگاه ژل نگار عکسبرداری صورت گرفت. برای تعیین روابط ژنتیکی نمونه­ها، باندهای تکثیر یافته از نشانگرهای ISJ به کد صفر (عدم وجود باند) و کد یک (وجود باند) تبدیل شدند. دندروگرام تجزیه خوشه­ای برای آغازگرهای IT و  ETبا استفاده از نرم­افزارDARwin5  ترسیم گردید. تعداد کل باندها، باندهای چندشکل و درصد چندشکلی برای هر آغازگر محاسبه گردید. همچنین دو شاخص میزان اطلاعات چندشکل یا PIC و شاخص نشانگر یا MI  برای هر آغازگر بر اساس فرمول تیماپاه و همکاران (27) محاسبه شد و از بین آنها بهترین آغازگرهای IT و ETاز نظر چندشکلی بیشتر و پتانسیل تولید بیشترین باند معرفی شدند. تجزیه مؤلفه­های اصلی آغازگرهای IT و ET  نیز با نرم­افزارNTSYS  انجام شد (25).

نتایج

در این مطالعه پس از بررسی چندین آغازگر ISJ از نظر کمیت و کیفیت باندها، 30 آغازگر نیمه­تصادفی ISJ شامل 16 آغازگر IT و 14 آغازگر ET انتخاب شد. این آغازگرها 559 باند چندشکل تولید کردند که 96 درصد چندشکلی را از کل 585 باند DNA شامل می­شد (شکل 2).

 

 

شکل 2- محصول PCR آغازگر IT15-36  بر روی ژل 5/1 درصد آگارز.  M: بیانگر سایز مارکر kb1، C: کنترل منفی، شماره چاهکها بیانگر شماره توده­هاست.

کل آغازگرهای IT 302 باند چندشکل تولید کردند که 97 درصد از 311 باند تولید شده را شامل گردید. کل آغازگرهایET  257 باند چندشکل تولید نمودند که 94 درصد از کل 274 باند تولید شده را نشان داد. متوسط تعداد باند چندشکل به ازای هر آغازگر IT، 87/18 عدد و برای هر توده 17/25 عدد بود اما متوسط تعداد باند چندشکل به ازای هر آغازگر ET، 36/18 عدد و برای هر توده 42/21 عدد بود. نتایج به دست آمده با استفاده از آزمون t جفت نشده در سطح 05/0 نشان داد که تفاوت معنی­داری بین این دو گروه آغازگر  IT و ET از نظر متوسط درصد چندشکلی وجود ندارد. بیشترین میزان اطلاعات چندشکلی در آغازگرهای IT و ET به ترتیب مربوط به آغازگرهای IT18-1 و ET12-27 بود. همچنین این دو آغازگر بیشترین شاخص نشانگر را تشکیل دادند. شاخص نشانگر پتانسیل هر آغازگر جهت تولید باند بیشتر را نشان می­دهد، بنابراین بالا بودن مقدار شاخص نشانگر نشان داد که این دو آغازگر نسبت به سایر آغازگرهای به کار رفته، پتانسیل بالایی در تولید باند بیشتر دارند. از بین آغازگرهای IT، آغازگر IT18-1 با 23 باند چندشکل بیشترین درصد چندشکلی (100 درصد) و آغازگر ISJ9 کمترین درصد چندشکلی (88 درصد) را نشان داد. از 14 آغازگر ET، آغازگر ET12-30 با 25 باند چندشکل بیشترین درصد چندشکلی (100 درصد) و آغازگرهای ET12-28 و ET18-6 کمترین درصد چندشکلی (82 درصد) را نشان دادند (جدول 2).

در این مطالعه توده­های آویشن T. pubescens بر اساس روش میانگین فواصل یا UPGMA  و ضریب تشابه دایس در آغازگرهای اینترونی و اگزونی به ترتیب به سه و چهار گروه تقسیم شدند. در گروه اول دندروگرام آغازگرهای اینترونی توده­های آویشن T. pubescens از آذربایجان شرقی، کردستان، زنجان و دو توده با منشأ نامشخص قرار گرفتند. جمعیتهایی از زنجان، قزوین، آذربایجان غربی و گیلان در گروه دوم قرار گرفتند. توده آویشن کرک­آلود از تهران به تنهایی یک گروه جداگانه را تشکیل داد. در گروه اول دندروگرام آغازگرهای اگزونی توده­هایی از آویشن کرک­آلود از آذربایجان شرقی، کردستان و زنجان که همگی از مناطق سردسیری کشور بودند مشاهده گردید. در گروه دوم آن جمعیتهایی از تهران، گیلان، آذربایجان غربی و قزوین قرار گرفتند. دو توده از آویشن کرک­آلود زنجان هر کدام به تنهایی یک گروه جداگانه را تشکیل دادند.  

 

 

جدول 2- نوع آغازگر، توالی آنها، تعداد باندهای چندشکل، درصد چندشکلی و دیگر شاخصهای تفکیک آغازگرهایISJ  (حروف پررنگ توالیها بیانگر توالیهای حفاظت شده اگزونی و اینترونی است، شماره­های 1 تا 16 آغازگرهای IT و شماره­های 17 تا 30 آغازگرهای ET است)

شاخص نشانگر 

 

میزان اطلاعات چندشکلی 

 

درصد

چند شکلی 

 

باندهای چندشکل 

 

کل

 باندها 

 

توالی آغازگرها

('3-'5) 

نام

 آغازگر 

 

ردیف

 

48/7

34/0

100

22

22

ACGTCCAGAC

IT 10-1

1 

92/5

37/0

94

16

17

ACGTCCAGGT

IT 10-2

2 

65/6

35/0

95

19

20

ACGTCCAGCA

IT 10-3

3 

76/5

36/0

94

16

17

ACGTCCACCA

IT 10-4

4 

8/6

34/0

100

20

20

ACGTCCAGAG

IT 10-5

5 

74/8

38/0

96

23

24

ACGTCCATCC

IT 10-6

6 

65/6

35/0

90

19

21

GAAGCCGCAGGTAAG

IT 15-31

7 

4/5

27/0

100

20

20

GACTCGCCAGGTAAG

IT 15-32

8 

35/7

35/0

100

21

21

GCGGCATCAGGTAAG

IT 15-34

9 

76/5

36/0

94

16

17

CGAAGCCCAGGTAAG

IT 15-35

10 

19/8

39/0

100

21

21

ACCTACCTGGGGCTC

IT 15-36

11 

43/9

41/0

100

23

23

CCGGCAGGTCAGGTAAGT

IT 18-1

12 

86/2

26/0

100

11

11

GCAGAGGGCCAGGTAAGT

IT 18-2

13 

4/7

37/0

100

20

20

CAGACCTGC

(IT) ISJ1

14 

6/7

38/0

100

20

20

CAGGGTCCCACCTGCA

 (IT) ISJ5

15 

65/4

31/0

88

15

17

AGGTGACCGACCTGCA

(IT)  ISJ9

16 

4/6

32/0

95

20

21

AGCAGGTGACTG

ET 12-25

17 

11/5

36/0

5/87

14

16

AGCAGGTGGACT

ET 12-26

18 

90/9

43/0

100

23

23

AGCAGGTCCTAG

ET 12-27

19 

88/5

42/0

82

14

17

AGCAGGTCCAAG

ET 12-28

20 

02/7

39/0

95

18

19

AGCAGGTCGTGA

ET 12-29

21 

75/8

35/0

100

25

25

AGCAGGTGGTAC

ET 12-30

22 

3/3

30/0

100

11

11

ACTTACCTGGGCCAG

ET 15-31

23

8/6

34/0

91

20

22

ACTTACCTGGGCCACG

ET 15-32

24 

64/8

36/0

96

24

25

ACTTACCTGGCCGTG

ET 15-33

25

56/7

34/0

100

21

21

ACTTACCTGGCCGAG

ET 15-34

26

29/6

37/0

100

17

17

ACTTACCTGCCGCAG

ET 15-35

27

32/4

27/0

84

16

19

ACTTACCTGGGGCTC

ET 15-36

28

64/3

26/0

82

14

17

ACTTACCTGCCTACGCGG

ET 18-6

29

6/7

38/0

95

20

21

TGCAGGTCA

(ET)  ISJ3

30

60/6

35/0

96

6/18

5/19

 

میانگین

 

 

نتایج گروه بندی دندروگرام آغازگرهای اگزونی نشان داد که نمونه­های آویشن استان زنجان در کل دندروگرام به طور پراکنده قرار گرفته­اند. نمونه استان تهران با شرایط اقلیمی متفاوت با توده­های آویشن مناطق سردسیری کشور در یک گروه قرار گرفته است. در حالی که در دندروگرام آغازگرهای اینترونی توده آویشن تهران یک گروه جداگانه را تشکیل داد. می­توان نتیجه گرفت که نتایج حاصل از دندروگرام تجزیه خوشه­ای آغازگرهای اینترونی با منشأ جغرافیایی توده­ها مطابقت داشت اما چنین مطابقتی در دندروگرام آغازگرهای اگزونی با منشأ جغرافیایی مشاهده نشد (شکل 3).

 

 

(الف)

 

(ب)

شکل 3- دندروگرام تجزیه خوشه­ای آویشن کرک­آلود (Thymus pubescens) با آغازگرهای IT (الف) و ET (ب)  بر مبنای روش UPGMA با نرم­افزار  DARwin5

 

در هر دو دندروگرام بیشترین شباهت ژنتیکی بین دو توده 8 و 9 با کمترین bootstrap از مراغه و قره­چمن استان آذربایجان شرقی دیده شد. اعداد روی دندروگرام مقادیر bootstrap را نشان می­دهد که هر چه این مقدار بیشتر باشد بیانگر آن است که نمونه­های آن گروه با درصد اعتماد بالایی در این گروه­بندی قرار دارند. مقادیر پایین bootstrap نشان دهنده بیشترین شباهت توده­ها به یکدیگر است. اگرچه از نظر متوسط چندشکلی تفاوتی چندانی بین دو نوع آغازگر اینترونی و اگزونی دیده نشد ولی در مجموع نتایج نشان داد که آغازگرهای اینترونی نسبت به آغازگرهای اگزونی بهتر توانسته­اند توده­های آویشن کرک­آلود را بر اساس منشأ جغرافیایی تفکیک کنند.

آزمون تجزیه مؤلفه­های اصلی برای تعیین نحوه پراکندگی نشانگرهای اینترونی و اگزونی در سطح ژنوم صورت گرفت. نتایج حاصل از آن نشان داد که در نشانگرهای اینترونی، سه مؤلفه اول 70/41 درصد و در نشانگرهای اگزونی، سه مؤلفه اول 10/40 درصد از واریانس کل بین توده­های آویشن T. pubescens را توجیه نموده است. به عبارتی دیگر هر دو نوع آغازگرها توزیع مناسبی در سطح ژنوم گیاه داشته­اند اما آغازگرهای اینترونی بهتر توانستند ژنوم آویشن کرک­آلود را پوشش دهند و در ارزیابی تنوع ژنتیکی توده­های آویشن کرک­آلود بهتر عمل کرده­اند (شکل 4).

 

 

(الف)

 

(ب)

شکل 4- نمودار دو بعدی تجزیه مؤلفه­های اصلی توده­های آویشن کرک­آلود (Thymus pubescens) با آغازگرهای IT (الف) و آغازگرهای ET (ب)


بحث

تعداد باند تکثیر شده و میزان چندشکلی بالا (96 درصد چندشکلی) در توده­های آویشن مورد مطالعه بیانگر کارآیی بالای آغازگرهای ISJ در ارزیابی تنوع ژنتیکی آنها بوده است. اما از نظر متوسط درصد چندشکلی اختلاف معنی­داری بین آغازگرهای اینترونی و اگزونی دیده نشد. هاشمی پترودی و همکاران (16) در مطالعه­ای برای انگشت­نگاری 8 هیبرید برنج و والدین آنها از 21 آغازگر نیمه­تصادفی ISJ از دو گروه آغازگرهای IT و ET استفاده کردند که متوسط تعداد باند به ازای هر آغازگر و هر ژنوتیپ به ترتیب 41/15 و 56/11 بود و بیشترین چندشکلی را آغازگرهای IT، 10 و 15 نوکلئوتیدی داشتند. رمضانی و همکاران (6) در مطالعه تنوع ژنتیکی گلرنگ با نشانگرهای ISJ بیان کردند که تفاوت معنی­داری از نظر درصد چندشکلی بین دو گروه آغازگرهایIT  و ET مشاهده نشد. در بعضی مطالعات دیده شده که آغازگرهای ET نتایج رضایت بخشی را نسبت به آغازگرهای IT داشته­اند. فراهانی و ارزانی (14) در مطالعه تنوع ژنتیکی 20 ژنوتیپ گندم دوروم همراه با سه هیبرید 1F و لاینهای پدری آنها با نشانگرهای نیمه­تصادفی ISJ گزارش کردند که آغازگرهای ET نسبت به آغازگرهای  ITقطعات باندی بیشتر و با وضوح بالاتری تولید کردند.

انصاری (3) در مطالعه تنوع ژنتیکی 40 ژنوتیپ تریتیکاله و یک رقم گندم دوروم با آغازگر نیمه­تصادفی ISJ بیان کردند که متوسط تعداد باند به ازای هر آغازگر 7/12 عدد باند و تعداد باندهای تکثیر شده به ازای هر آغازگر از 10 تا 16 عدد باند متغیر بود. همچنین آغازگرهای ET نسبت به آغازگرهای IT قطعات باندی بیشتر با وضوح بالاتر و درصد چندشکلی بیشتری تولید کردند. اسماعیلی و همکاران (2) به بررسی تنوع ژنتیکی 25 ژنوتیپ گندم دیم (شامل 23 رقم و لاین گندم نان و 2 رقم گندم دوروم) با استفاده از نشانگرهای ISJ پرداختند. آنها در این مطالعه از 32 آغازگر نیمه­تصادفی استفاده نمودند که از بین آنها 17 آغازگر بین ارقام گندم چندشکلی نشان داد. فابریکی اورنگ و همکاران (8 ) در مطالعه تنوع ژنتیکی توده­های بومی خربزه ایرانی (Cucumis melo L.) با 11 آغازگر ISSR بیان کردند که متوسط تعداد باند به ازای هر آغازگر 5/10 عدد بود. آغازگرهای به کار رفته شاخص نشانگر (MI) بالاتری نسبت به سایر آغازگرها داشتند. دندروگرام تجزیه خوشه­ای نیز تنوع بالایی را در بین ژنوتیپها آشکار کرد.

مطالعات نشان داده است که تاکنون مطالعات مورفولوژیکی بر روی گونهT. pubescens  انجام نشده است. در مورد مطالعات مولکولی نیز فقط در برخی موارد تنوع ژنتیکی این گونه همراه با چند گونه دیگر آویشن مورد ارزیابی قرار گرفته است. برای نمونه، علمداری و همکاران (11) تنوع ژنتیکی گونه­های Thymus daenensis، Thymus migricus،T. pubescens  وThymus fedtschenkoi را با نشانگر RAPD مورد مطالعه قرار دادند که نتایج حاصل از آن نشان داد که نشانگرRAPD  برای تعیین لوکوسهای چندشکل و تخمین فواصل ژنتیکی آویشن مناسب است. همچنین مهرپور و همکاران (19) با بررسی سطوح پلوئیدی سه جمعیت آویشن T. pubescens بیان کردند که نمونه­های منطقه تسوج آذربایجان شرقی دارای سطح پلوئیدی دیپلوئید و مناطق نیکنام­ده و شمشک در استان تهران سطح پلوئیدی تتراپلوئید دارند. آنها عدد پایه کروموزومی را 5=x گزارش کردند. در مطالعه­ای ابدالی و همکاران (1) به ارزیابی تنوع چهار رقم زیتون شمال کشور با صفات مورفولوژیک و نشانگر RAPD پرداختند. از بین 20 آغازگر به کار رفته 4 آغازگر چندشکلی بالایی را آشکار کرد و نتایج این تحقیق نشان داد که ارقام زیتون با تفاوت 33 تا 45 درصد به عنوان ارقام مجزا تفکیک شده­اند.

تجزیه مؤلفه­های اصلی یکی از روشهای چندمتغیره است که کاربرد زیادی در تنوع ژنتیکی دارد. این روش در واقع ابزار دیگری برای نمایش پراکنش توده­هاست که به عنوان روشی مکمل برای تجزیه خوشه­ای به کار می­رود. در این مطالعه نتایج آن بیانگر توزیع مناسب آغازگرهای نیمه­تصادفی در سطح ژنوم گیاه آویشن کرک­آلود بوده است. همچنین نتایج آن با نتایج دندروگرام تجزیه خوشه­ای هماهنگی کامل داشت.

نتایج این مطالعه اولین گزارش از تنوع ژنتیکی گونه T. pubescens با آغازگرهای اینترونی و اگزونی بود. این تحقیق توانایی بالای نشانگرهای نیمه­تصادفی ISJ به خصوص نشانگرهای اینترونی را در تعیین تنوع ژنتیکی و بررسی روابط خویشاوندی توده­های آویشن کرک­آلود نشان داد. انتهای '3 آغازگر مهم ترین قسمت جهت اتصال آغازگر در واکنش PCR می­باشد (13) و به همین دلیل عده­ای از محققین بیان کردند که آغازگرهای اینترونی با انتهای '3 اختصاصی در تکثیر قطعات DNA از دقت و کارآیی بیشتری برخوردارند (15 و 22). همچنین نتایج آغازگرهای IT تا حد زیادی مطابقت تنوع جغرافیایی با تنوع مولکولی را نشان داد که ممکن است بیانگر قرابت ژنتیکی و خویشاوندیهای احتمالی موجود بین برخی از توده­های مورد مطالعه باشد. قرار گرفتن برخی توده­های رویشگاههای یک استان در گروههای مجزا (مانند توده­های استان زنجان) و همچنین گروه­بندی توده­های برخی از استانها در کنار هم ممکن است ناشی از جابه جایی ژرم پلاسم و یا سایر عوامل تکاملی ناشناخته باشد. حاجی کرم و همکاران (5) در بررسی تنوع ژنتیکی 86 نمونه Aegilops tauschii نواحی شمال ایران با نشانگر SSR گزارش کردند که دندروگرام تجزیه خوشه­ای با استفاده از ضریب تشابه دایس و روش UPGMA قادر به گروه بندی نمونه­ها بر اساس مناطق جغرافیایی نبود که علت آن را مربوط به تنوع ژنتیکی زیاد بین نمونه­ها دانستند و بیان کردند که با استفاده از نشانگر SSR می­توان شناسنامه مولکولی نمونه­ها را تهیه نمود. پراکنش نمونه­ها در تجزیه مختصات اصلی نیز 12 درصد تغییرات را توجیه نمود که 5/6 درصد آن مربوط به بعد اول و 5/5 درصد آن توسط بعد دوم توجیه گردید.

از نتایج به دست آمده می­توان برای سایر مطالعات ژنتیکی و اصلاحی توده­های آویشن استفاده نمود. پیشنهاد می­شود هر گاه به دلایلی نیاز به انتخاب یک گروه از آغازگرهای ISJ با دقت و کارآیی بالا باشد، جهت کاهش حجم کار و مقدار هزینه­های تحقیق آغازگرهای اینترونی (IT) به علت گروه بندی بهتر توده­های آویشن کرک­آلود مناسب تر به نظر می­رسد.

تشکر و قدردانی

از مسئولین محترم مؤسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور به خصوص جناب آقای دکتر حسن مداح عارفی به خاطر در اختیار گذاشتن نمونه­های آویشن تشکر و قدردانی به عمل می آید. از مسئولین مرکز تحقیقات داروهای گیاهی رازی دانشگاه علوم پزشکی لرستان که تأمین مالی این طرح را برعهده داشتند نیز قدردانی می­گردد.

1- ابدالی، ن.، حسینی مزینانی، م.، عطایی، س.، حسینی، س.م. و نقوی، م.ر. 1390. بررسی میزان تنوع در چهار رقم زیتون ایرانی با مطالعه صفات مورفولوژیک و نشانگرهای مولکولی RAPD. مجله زیست شناسی ایران. 24(6): 879-868.

2- اسماعیلی، ا.، سمیعی، ک.، نظریان فیروزآبادی، ف.، دریکوند، ر. و پورطهماسب، ح. 1388. بررسی تنوع ژنتیکی ژنوتیپ­های گندم دیم با استفاده از نشانگر نیمه­تصادفی. سومین همایش یافته­های پژوهشی کشاورزی و منابع طبیعی (غرب کشور). ص 387.

3- انصاری، س. 1384. بررسی تنوع ژنتیکی تریتیکاله با استفاده از صفات زراعی و نشانگرهای نیمه­تصادفی. پایان­نامه کارشناسی ارشد اصلاح نباتات. دانشکده کشاورزی. دانشگاه صنعتی اصفهان.

4- جمزاد، ز. 1388. آویشن و مرزه­های ایران. انتشارات موسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور، تهران. 171 صفحه.

5- حاجی کرم، م.، نقوی، م.ر.، طالعی، ع.ر. و آقایی، م.ج. 1390. بررسی تنوع ژنتیکی نمونه­های Aegilops tauschii نواحی شمالی ایران با استفاده از نشانگرهای SSR. مجله زیست شناسی ایران. 24(2): 399-390.

6- رمضانی، م.، اسماعیلی، ا.، نظریان فیروزآبادی، ف. و بخش­خانیکی، غ.ر. 1388. مطالعه تنوع ژنتیکی ژنوتیپ­های گلرنگ با استفاده از نشانگر مولکولی ISJ. پایان­نامه کارشناسی ارشد، دانشکده کشاورزی، دانشگاه پیام نور تهران.

7- سمیعی، ک. 1383. بررسی تنوع ژنتیکی در توده­های بومی شبدر ایرانی با استفاده از نشانگرهای مولکولی و مورفولوژیک. پایان­نامه کارشناسی ارشد اصلاح نباتات. دانشکده کشاورزی. دانشگاه صنعتی اصفهان.

8- فابریکی اورنگ، ص.، شمس بخش، م.، جلالی جواران، م. و احمدی، ج. 1388. بررسی تنوع ژنتیکی توده­های بومی خربزه ایرانی (Cucumis melo L.) با استفاده از نشانگرهای مولکولی بین ریزماهواره­ای (ISSR). مجله زیست شناسی ایران. 22(2).

9- مجیری، ف.، ضابطی، س.م.، اسماعیلی، ا.، نظریان فیروزآبادی، ف.، مداح عارفی، ح. و احمدی، ه. 1389. روش استخراج DNA ژنومی از برگ گیاه دارویی آویشن (Thymus spp.). چهارمین همایش منطقه­ای یافته­های پژوهشی کشاورزی (غرب ایران)، سنندج- دانشگاه کردستان، 23-22 اردیبهشت: صفحه 100.

10- نقوی، م.، قره­یاضی، ب. و حسینی سالکده، ق.، 1386. نشانگرهای مولکولی. انتشارات دانشگاه تهران. 334 صفحه.

 

11- Alamdary, S.B.L., Safarnejad, A. and Rezaee, M. 2011. Evaluation of Genetic Variation between Thymus Accessions Using Molecular Markers. Journal of Basic and Applied Scientific Research. 1(12): 2552-2556.

12- Amini, F., Saeidi, G. and Arzani, A. 2008. study of genetic diversity in safflower genotypes using agro-morphological traits and RAPD markers. Euphytica. 163: 21-30.

13- Erlich, H.A. 1989. PCR technology: Principle and application for DNA amplification. Mostockton press. USA. 1989.

14- Frahani, E. and Arzani, A. 2004. The use of semi-random marker for evaluation of genetic diversity among cultivars and F1 hybrids of durum wheat. Proc. of 4th International Iran & Russia Conference. Russia. 81-86.

15- Gawel, M., Wisniewska, I. and Rafalski, A. 2000. Semi-specific PCR for the evaluation of diversity among cultivare of wheat and triticale. Cellular and Molecular Biology Letters. 7: 577-582.

16- Hashemi-petroudi, S.H.R., Mirmohammadi maibody, S.A.M., Nematzadeh, G.A. and Arzani, A. 2010. Semi-random PCR markers for DNA fingerprinting of rice hybrids and theirs corresponding parents. African Journal of Biotechnology. 9 (7): 979-985.

17- Khanuja, S.P.S., Shasany, A.K., Darokar, M.P. and Kumar, S. 1999. Rapid Isolation of DNA Dry and Fresh Samples of Plants Producing Large Amounts of Secondary Metabolites and Essential Oils. Plant Molecular Biology Reporter. 17: 1-7.

18- Lopez-Pujol, J., Bosch, M., Simon, J. and Blanche, C. 2004. Allozyme Diversity in the Tetraploid Endemic Thymus loscosii (Lamiaceae). Annals of Botany. 93: 323-332.

19- Mehrpur, Sh., Mirzaie-Nodoushan, H., Majd, A. and Sefidkon, F. 2002. Karyotypic studies of two Thymus species. Cytologia. 67(4): 343-346.

20- Nowosielski, J., Podyma, W. and Nowosielska, D. 2002. Molecular research on the genetic diversity of polish varieties and landraces of Phaseolus coccineus L. and Phaseolus vulgaris L. using the RAPD and AFLP methods. Cellular and Molecular Biology Letters. 7: 753-762.

21- Przetakiewicz, J., Nadolska-Orczyk, A. and Orczyk, W. 2002. The use of RAPD and semi-random markers to verify somatic hybrids between diploid lines of Solanum tuberosum L. Cellular and Molecular Biology Letters. 7: 671-676.

22- Rafalski, A., Gidzinska, M. and Wisniewska, I. 1997. PCR-based systems for evaluation of relationships among maize inbreds In: Saftaris AS (eds.) Genetic and biotechnology breeding maize and sorghum. Royal Society Chemistry Cambridge. UK. pp: 106-111.

23- Rafalski, A., Madej, L., Wisniewska, I. and Gawel, M. 2002. The genetic diversity of components of rye hybrids. Cellular and Molecular Biology Letters. 7: 471-475.

24- Rechinger, K.H. 1982. Flora Iranica. Academische Druck-u. Verlagsanstalt. 152: 543-544.

25- Rohlf, F.J. 1998. NTSYS-pc, Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System. Varsion 2.02. Department of Ecology and Evolution. State University of New York.

26- Sawicki, J. and Szczecinska, M. 2007. Semi-specific intron-exon splice junction markers in bryophyte studies. Biodiversity Research Conservation. 5-8: 25-30.

27- Thimmappaiah, W., Santhosh, G., Shobha, D. and Melwyn, G.S. 2008. Assessment of genetic diversity in cashew germplasm using RAPD and ISSR markers. Scientia Horticulturae. 118: 1-7.

28- Vahabi, A.A., Solooki, M., Arzani, A., Ghorbani, A., Lotfi, A., Imamjomeh, A.A.  and  Bahrami, Sh. 2008. Comparative Analysis of Genetic Diversity among Grass pea Landraces as Detected Random, Semi Random and Morphological Markers. Asian Journal of Plant Sciences. ISSN 1682-3974.

29- Weining, S. and Henry, v. 1995. Molecular analysis of DNA polymorphism of barley (Hordeum spontaneum L.) germplasm using the polymerase chain reaction. Genetic Research Crop Evolution. 42: 273-281.

30- Weining, S. and Langridge, P. 1991. Identification and mapping of polymorphisms in cereals based on the polymerase chain reaction. Theoretical and Applied Genetic. 82: 209-216.