نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

گروه علوم سلولی و مولکولی، دانشکده زیست شناسی، پردیس علوم، دانشگاه تهران، تهران، ایران.

چکیده

دی‌متیل‌سولفوکسید (DMSO) یکی از حفاظت‌کننده‌های سرمایی است که در زمان انجماد و نگهداری طولانی مدت سلول‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد. در این مطالعه، ساز و کار حفاظتی این ماده در رابطه با مسیرهای بقای سلولی و اتوفاژی مد نظر قرار گرفته است. بررسی سطح بیان ژن‌های دخیل در اتوفاژی با استفاده از Real time RT-PCR نشان داد که در پایین‌ترین غلظت از DMSO ژن‌های دخیل در مسیر اتوفاژی (atg5، lc3، beclin1، dram و p53) افزایش بیان می‌یابند و به همین علت، با راه ‌افتادن اتوفاژی مرگ، سلول‌ها توان حیاتی پایین‌تری را در قیاس با سلول‌ها‌یی که در غلظت‌های بالاتر از ماده‌ی حفاظت‌کننده‌ی سرمایی منجمد شده‌اند دارا می‌باشند. افزایش توان حیاتی سلول‌ها در غلظت‌های بالاتر DMSO (بالاتر از 10%) به خاطر تبدیل اتوفاژی مرگ به اتوفاژی بقا روی می‌دهد که با افزایش سطح بیان ژن‌های مسیر AKT/mTOR مورد ﺗﺄیید قرار گرفته است. مطالعه‌ی همزمان اتوفاژی و مسیر AKT/mTOR می‌تواند به عنوان یکی از روشهای تفکیک اتوفاژی مرگ و بقا تلقی و استفاده گردد.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Quantitative Study of the Genes Involved in Survival and Autophagy Pathways in T-47D Cell Line with Emphasis on Upgrading Cold Resistance of the Cells in the Presence of DMSO

نویسندگان [English]

  • Mahrou Vahabi
  • Shahrokh Safarian
  • Seyed Jalal Zargar
  • Laya Aliasghari

Department of Cell & Molecular Biology, School of Biology, College of Science, University of Tehran, Tehran, Iran.

چکیده [English]

Dimethylsulfoxide (DMSO) is one of the cryoprotectants utilizing in freezing and long term maintenance of the cells. In this study, the mechanism of protection of this mater in relation with cell death and autophagy is envisaged. Study of the expression level of autophagic genes (atg5، lc3، beclin1، dram و p53), using real time RT-PCR, indicated that at the lowest concentration of DMSO the genes involved in autophagy are over-expressed, thus regarding to death autophagy induction, the cells have lower viability relative to those cells which are freezed at the higher concentrations of cryoprotectant. Increasing cell viability, at the greater concentrations of DMSO (over than 10%), occurs because of the converting of death autophagy to cytoprotective one which is supported by means of over-expression of the genes involved in the survival pathway. Simultaneous study of autophagy and AKT/mTOR pathway can be utilized as a separating method for death and survival autophagy.

کلیدواژه‌ها [English]

  • "Cryopreservation"
  • "Autophagy"
  • "Dimethylsulfoxide"
  • " Real time RT-PCR"

مطالعه کمی بیان ژنهای دخیل در مسیرهای بقای سلولی و اتوفاژی در رده سلولی T-47D با ﺗﺄکید بر اعمال مقاومت سرمایی در سلولها در حضور DMSO 

مهرو وهابی، شاهرخ صفریان*، سید جلال زرگر و لعیا علی‌اصغری

تهران، دانشگاه تهران، پردیس علوم، دانشکده زیست شناسی، گروه علوم سلولی و مولکولی

تاریخ دریافت: 18/9/91                              تاریخ پذیرش: 17/7/92 

چکیده 

دی‌متیل‌سولفوکسید (DMSO) یکی از حفاظت‌کننده‌های سرمایی است که در زمان انجماد و نگهداری طولانی مدت سلولها مورد استفاده قرار می‌گیرد. در این مطالعه، ساز و کار حفاظتی این ماده در رابطه با مسیرهای بقای سلولی و اتوفاژی مد نظر قرار گرفته است. بررسی سطح بیان ژنهای دخیل در اتوفاژی با استفاده از Real time RT-PCR نشان داد که در پایین‌ترین غلظت از DMSO ژنهای دخیل در مسیر اتوفاژی (atg5، lc3، beclin1، dram و p53) افزایش بیان می‌یابند و به همین علت، با راه ‌افتادن اتوفاژی مرگ، سلولها توان حیاتی پایین‌تری را در قیاس با سلولها‌یی که در غلظتهای بالاتر از ماده حفاظت‌کننده سرمایی منجمد شده‌اند دارا می‌باشند. افزایش توان حیاتی سلولها در غلظتهای بالاتر DMSO (بالاتر از 10 درصد) به خاطر تبدیل اتوفاژی مرگ به اتوفاژی بقاء روی می‌دهد که با افزایش سطح بیان ژنهای مسیر AKT/mTOR مورد ﺗﺄیید قرار گرفته است. مطالعه همزمان اتوفاژی و مسیر AKT/mTOR می‌تواند به عنوان یکی از روشهای تفکیک اتوفاژی مرگ و بقا تلقی و استفاده گردد.

واژه‌های کلیدی: حفاظت سرمایی، اتوفاژی، دی‌متیل‌سولفوکسید، Real time RT-PCR

* نویسنده مسئول، تلفن: 61113312-021 ، پست الکترونیکی:  safarian@khayam.ut.ac.ir 

مقدمه 

 

حفاظت سرمایی فرآیندی است که طی آن تلاش می‌شود تا سلولها و بافتها در درجه حرارتهای زیر صفر (معمولاً 196- درجه سانتی گراد که نقطه جوش نیتروﮊن مایع است) نگهداری ‌شوند. هدف اصلی در حفاظت سرمایی، به حداقل رساندن احتمال بروز آسیب به سامانه‌های زیستی در زمانی است که منجمد و سپس ذخیره می‌شوند (6، 10، 16، 18، 23 و 26). آب ترکیب اولیه هر سلول زنده می‌باشد و در دماهای زیر صفر درجه سانتی گراد تمایل به تشکیل بلور‌های یخ دارد. زمانی که تمام آب داخل سلول به یخ تبدیل شود سوخت‌وساز‌ سلولی متوقف می‌شود و به ‌همین علت، مهم ترین عامل در حفظ تمامیت ساختاری و عمل‌کردیِ سلولهای زنده کنترل تشکیل یخ در حین فرآیند انجماد می‌باشد (22). به طور کلی با انجام چند راهکار، اثرات زیان‌آور ناشی از آبگیری و تشکیل بلورهای یخ کاهش می‌یابد:

  • کنترل آهنگ سرمادهی: با کنترل آهنگ سرمادهی و سرمادهی بهینه در سرعتهای مناسب، آسیبهای ناشی از انجماد کاهش می‌یابد. معمولاً آهنگ سرمادهی مناسب حدود ۱ درجه سانتی گراد در دقیقه می‌باشد (10 و 26).
  • استفاده از حفاظت‌کننده‌های سرمایی: موادی که برای حفاظت بافتها و سلولها از آسیبهای ناشی از انجماد استفاده می‌شوند حفاظت‌کننده سرمایی نامیده می‌شوند (4). این مواد با افزایش غلظت تام حل‌شونده‌های درون سلولی از تشکیل بلورهای یخ در درجه‌ حرارتهای پایین جلوگیری می‌کنند. این مواد به دو دسته تقسیم می‌شوند. دسته اول شامل حفاظت‌کننده‌های سرمایی نفوذ‌کننده به درون سلول می‌باشد که به دلیل داشتن وزن مولکولی کم توانایی عبور از غشای سلولی و نفوذ به درون سلول را دارند (29). از جمله این مواد می‌توان گلیکول‌ها و دی‌متیل‌سولفوکسید را نام برد (5 و 34). در این مطالعه از دی‌متیل‌سولفوکسید (DMSO) به عنوان حفاظت‌کننده سرمایی استفاده شده است.

دسته دوم مشتمل بر حفاظت‌کننده‌های سرمایی غیر‌نفوذ‌کننده به درون سلول می‌باشد که به دلیل داشتن وزن مولکولی زیاد توانایی عبور از غشای سلولی و نفوذ به درون سلول را ندارند و از آن جمله می‌توان به پلی وینیل پیرولیدون (PVP)، هیدروکسی‌اتیل نشاسته (HES) و اکسید پلی‌اتیلن (PEO) اشاره نمود (5 و 17). حفاظت‌کننده‌های سرمایی زیستی دسته دیگری از حفاظت‌کننده‌های سرمایی هستند که با اتصال به یخ از رشد و گسترش آنها جلوگیری می‌کنند. این مواد همچنین قادرند با غشای سلولی در دماهای پایین میانکش داشته باشند تا آسیب ناشی از سرما را به حداقل برسانند. انواع مختلفی از پروتئینهای ضد انجماد وجود دارد که از آن جمله می توان AFP I، AFP II، AFP III را نام برد (7، 15 و 19).

  • نگه‌ داشتن دماهای ذخیره‌سازی در شرایط بهینه.
  • کنترل آهنگ گرم کردن (ذوب سلولها): احیا و بازیابی سلولها از حالت انجماد به دلیل احتمال بروز آسیبهای ناشی از تشکیل دوباره‌ بلور یخ فرآیند بسیار مهمی می‌باشد و به‌ همین دلیل هر چه سریع تر انجام شود امکان بقای سلول بیشتر می‌شود (6 و 8).

با وجود پیشرفتهای حاصله در زمینه حفاظت سرمایی، به دلیل بروز اثرات زیانبار سرما، هنوز هم امکان را‌ه‌اندازی فرآیندهای منجر به مرگ سلولی وجود دارد. مرگ سلولی به طرق مختلفی بروز می‌نماید ولی مطالعات انجام شده بیشتر بر روی نقش سرما در راه‌اندازی مرگ برنامه‌ریزی‌شده سلول یا آپوپتوز متمرکز شده‌ است در حالی که تاکنون گزارشی درمورد ارتباط سرما با فرآیندهای بقای سلولی و یا اتوفاژیِ مرگ موجود نمی‌باشد. در نتیجه، هدف از این مطالعه‌، بررسی اثرات حفاظتی DMSO به عنوان حفاظت‌کننده سرمایی با تأکید بر امکان جلوگیری از بروز اتوفاژی مرگ و یا راه‌اندازی فرآیندهای بقای سلولی در رده سرطانی اپی تلیالی مجاری سینه (T-47D) بوده است.

اتوفاژی به معنی خودخواری، یک فرآیند سلولی است که محتوای سیتوپلاسمی (پروتئینهای پیر و اندامکهای آسیب دیده) در داخل وزیکولهای دوغشایی محصور و بعد از ملحق شدن به لیزوزوم تجزیه می‏شوند و تولید انرژی می‏کنند (13، 21 و 33). اتوفاژی اغلب به عنوان سازوکاری برای حفظ بقای سلولی می‏باشد (21). امّا پیشرفت اتوفاژی می‌تواند منجر به مرگ سلولی شود. فرآیند اتوفاژی را می‏توان به چهار مرحله تقسیم کرد: القای اتوفاژی، تشکیل اتوفاگوزوم‌ها، تجزیه محتویات درون اتوفاگوزوم‌ها و نهایتاً رها شدن ماکرومولکولها از اتوفاگولیزوزوم‌ها که در تمام این مراحل پروتئینهای مختلفی ازجمله Atg، LAMP1، LAMP2، Rab7، UVRAG و BECN1 نقشهای مهمی را ایفاء می‌کنند. همچنین مسیرهای سلولی مختلفی در القای اتوفاژی دخیل می‌باشد که از جمله آنها می‌توان به مسیر‌های PI3K I/Akt/mTOR، Raf/MEK/ERK، PI3K III/BECN1، مسیر مرتبط با خانواده p53/p73 و مسیر DAPK اشاره نمود (9 و 30). قابل ذکر است که اتوفاژی همواره در یک سطح پایه‌ای در بافتهای نرمال برای حفظ هموستازی و عمل‌کرد معمول سلولها‌ روی می‌دهد اما در شرایط تنش نقش دوگانه‌ایی را از خود ظاهر می‌سازد. در واقع، اتوفاژی می‌تواند منجر به افزایش بقای سلولی و یا منجر به مرگ سلولی شود اما تاکنون هیچ‌گونه سازوکار مشخصی جهت تفکیک این دو نوع اتوفاژی از هم ارائه نشده است.

مسیر سیگنالی PI3K/Akt در مسیر آبشاری وابسته به گیرنده فاکتورهای رشدی فعّال می‏شود. Akt دارای سوبستراهای متعددی می‌باشد و از مسیر‌های مختلفی باعث مهار مرگ سلولی می‌شود و از این رو، این مسیر را به عنوان مسیر بقای سلولی نیز نامگذاری کرده‌اند. PI3K فسفواینوزیتاید‏های غشای پلاسمایی را در موقعیت 3-OH (D3) از حلقه اینوزیتول فسفریله می‏کند به نحوی که از سوبسترا‌های ‌فسفاتیدیل‌اینوزیتول-4-فسفات (PI-4-P) و ‌فسفاتیدیل‌اینوزیتول-4و5-بیس‌فسفات (PI-4,5-P2) پیام‌رسانهای ثانویه فسفاتیدیل‌اینوزیتول-3و4-بیس‌فسفات (PI-3,4-P2) و فسفاتیدیل‌اینوزیتول سه فسفات (PIP3) ساخته شود. PI3K سه کلاس با چندین سوبسترا دارد. کلاس I لیپیدهای اینوزیتول را در موقعیت 3 فسفریله می‌کند. کلاس II توسط گیرنده‌های تیروزین کیناز فعال می‌شود و کلاس III توسط گیرنده‌های جفت شده با G-protein ها فعال می‌گردد (12 و 31).

در این پژوهش، تلاش بر آن بوده است که با بررسی سطح بیان ژنهای مرتبط با مسیرهای بقای سلولی و اتوفاژی اولاً ارتباط بین ساز و کار حفاظتی DMSO با فرآیند اتوفاژی مشخص گردد و در ثانی پاسخ مناسبی برای این سئوال اساسی یافت شود که آیا القای اتوفاژی بقاء می‌تواند عاملی در بروز اثرات حفاظتی DMSO در شرایط انجماد سلولی باشد.

مواد و روشها

مواد: محیط کشت1640  Roswell Park Memorial Institute (RPMI)، سرم جنین گاوی ، محلول پنسیلین-استرپتومایسین و محلول تریپسین-EDTA از شرکت Gibco (انگلستان) خریداری گردید. محلول 3-[4-دی‌متیل‌تیازول2-ئیل]-2-5-دی‌فنیل‌تترازولیوم‌برومید (MTT) از شرکت سیگما (انگلستان) و دی‌متیل‌سولفوکسید (DMSO) از شرکت MERCK (آلمان) خریداری شد. پرایمر رندوم هگزامر، آنزیم رونوشت بردار معکوس (MULV Reverse transcriptase RNase H)، بافر واکنش(x5) مهارکننده‌ RNase ( RiboLock RNase inhibitor) از شرکت Vivantis (آمریکا) و dNTP Mix به همراه کیت RNX-Plus Solution For Total RNA Isolation از شرکت فرمنتاز خریداری گردید. کیت QuantiFast™ SYBR Green PCR master mix از شرکت QIAGEN (آمریکا) خریداری شد. در این پژوهش از دستگاههای ثبت الایزا ساخت شرکت چین (Rayto)، طیف نور‌سنج Nanodrop ساخت شرکت Thermsientific (آمریکا)، دستگاهRotorgene Corbett 6000 ساخت شرکت QIAGEN (آمریکا) استفاده شد.

روشها:

کشت سلولی و انجماد سلولی: رده سلولی ‌T-47D، که از رده‌های سلولی سرطان سینه انسان می‌باشد از بانک سلولی ایران (NCBI) با کد C203 تهیه گردید. سلولها در محیط کشت 1640 RPMI غنی شده با سرم گاو (10 درصد حجمی/حجمی) و محلول پنی سیلین/استرپتومایسین (1 درصد حجمی/حجمی) تحت شرایط کنترل‌ شده دما (37 درجه سانتی گراد) و اتمسفر مرطوب حاوی CO2 (5 درصد حجمی/حجمی) کشت داده شد. این سلولها به صورت تک لایه در فلاسک رشد می‌کنند. محیط کشت هفته‌ای سه بار تعویض و برای برداشت کردن سلولها نیز از محلول سترون تریپسین- EDTA استفاده شد. از آنجایی که هدف از انجام این مطالعه بررسی فعال شدن مسیر‌های اتوفاژی و مسیر بقای سلولی در اثر فرآیند انجماد در حضور DMSO بوده است (شکل 1) لذا سلولهای T-47D درحضور غلظتهای مختلف DMSO متشکل از غلظتهای 5، 10، 15 و 20 درصد حجمی/حجمی منجمد شدند. برای انجماد، ابتدا محیط سلولها 24 ساعت قبل از انجماد تعویض و سپس با استفاده از تریپسین سلولها از فلاسک جدا و با افزودن محیط کشت سرد حاوی 50 درصد سرم جنین گاوی سوسپانسیون یکنواخت سلولی تهیه و سلولهای زنده‌ موجود در آن شمارش شد. مقدار مناسبی از سوسپانسیون سلولی که دارای 106×2 سلول بود به هر یک از ویالهای ویژه انجماد سلولی، منتقل و بعد از افزودن DMSO با غلظتهای مختلف 5، 10، 15 و 20 درصد ، حجم نهایی مورد نظر با افزودن محیط کشت سرد حاوی50 درصد سرم فراهم گردید. کرایوویالها در داخل یخ قرار گرفت و به فریزر 70- درجه سانتی گراد به منظور نگهداری در این دما به مدت 3 تا 4 ساعت منتقل شد. بعد از گذشت این زمان، انتقال کرایوویالها به مخزن ازت مایع با دمای 196- درجه سانتی گراد انجام گرفت.

 

شکل 1 -  ساختار شیمیایی دی‌متیل‌سولفوکسید (DMSO).

سنجش MTT : آزمون MTT، آزمونی کمّی و رنگی است که بر پایه کاهیده شدنِ نمک زرد رنگ محلول در آبِ 3-[4-دی‌متیل‌تیازول2-ئیل]-2-5-دی‌فنیل‌تترازولیوم‌برومید (MTT) و تشکیل کریستالهای آبی رنگ تیره و نامحلول فورمازان در آب استوار شده است. کاهیده شدنِ MTT، به وسیله آنزیم میتوکندریایی سوکسینات دهیدروژناز و در سلولهای زنده رخ می‌دهد (2، 14 و 32). بلورهای فورمازان در حلالهای آلی همچون ایزوپروپانول قابل حل می‌باشد که با سنجش میزان جذب نوری آن با دستگاه اسپکتروفتومتر می‌توان تعداد سلولهای زنده را که فعالیت سوخت و سازی دارند تعیین نمود. روش کار به این صورت است که ابتدا یک سری از سلولهای فریز شده در غلظتهای مختلف 5، 10، 15 و 20 درصد با اضافه کردن قطره قطره محیط کشت حاوی 20 درصد سرم به کرایوویالها تا حجم ml 2 ذوب شدند و بعد از ذوب شدن کامل، محتویات هر کرایوویال به یک فالکون منتقل و مدت 5 دقیقه در1500 دور در دقیقه (rpm) سانتریفیوژ شد. پس از تخلیه‌ محیط رویی، سلولها در حجم مناسبی از محیط حاوی20 درصد سرم به صورت تعلیق درآورده شد. سپس محتویات فالکونها (معادل 105×5 سلول به همراه ml 1 محیط کشت) به هر خانه از پلیت 6 خانه (SPL) منتقل شد. بعد از این مراحل آزمون MTT جهت سنجش غیر‌مستقیم میزان تکثیر و بقای سلولها و یافتن مدت زمانی که در آن سلولها کمترین میزان توان حیاتی را بعد از انجام فرآیند انجماد داشته باشند در زمانهای 24، 48 و 72 ساعت پس از ذوب انجام شد. اساس روش MTT بر پایه توانایی آنزیم دهیدروژناز میتوکندریایی به منظور کاهیدن و تبدیل حلقه‌های نمک زرد رنگِ 3- [4,5- dimethylthiazol- 2yl]- 2,5- diphenyl tetrazolium bromide به بلورهای بنفش رنگِ فورمازان که نامحلول در آب است استوار شده است. در اینجا برای هر کدام از زمانهای ذکر شده یک پلیت 6 خانه استفاده شد. 5 میلی گرم از پودر MTT در 10 میلی لیتر بافر PBS 1X حل و پس از فیلتر کردن مقداری از آن معادل با 10 درصد از حجم محیط کشت (تقریباً  μl200) به هر خانه از پلیتهای 6 خانه اضافه شد. پلیتها به مدت 3 تا 4 ساعت (مدت زمان لازم برای فرآیند تبدیل MTT به فورمازان توسط سلولهای زنده) در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد انکوبه شد. پس از خارج کردن پلیت از انکوباتور، محیط سلولها تخلیه و سپس برای حل شدن فورمازان تولید شده به هر خانه از پلیت مقدار  μl2000 DMSO افزوده ‌شد تا پس از پیپتاژ محلولی یکنواخت حاصل گردد. سپس معادل μl 200 از محلول یکنواخت به هر خانه از پلیت 96 خانه منتقل و جذب نوری آن در طول موج 570 نانومتر، با استفاده از دستگاه Elisa Reader اندازه‌گیری شد. سپس درصد توان حیاتی سلولها محاسبه و با استفاده از نرم‌افزار SPSS16 آنالیز‌های آماری لازم انجام شد. ‌پس از انجام آزمون MTT، زمان 24 ساعت به عنوان زمان مناسب آزمایش انتخاب شد تا در کشت مجدد سلولهای منجمد شده و پس از فرآیند ذوب ملاک کار قرار گیرد.

 

 

شکل 2- نمودار ستونی مربوط به چگونگی بروز تغییرات در توان حیاتی سلولهای T-47D. این نمودار در حضور سرما و در غلظتهای مختلف از DMSO در زمانهای  24، 48 و 72 ساعت پس از ذوب نشان داده شده است. کاهش شدت تیرگی رنگ ستونها از چپ به راست، افزایش مدت زمان پس از ذوب سلولها را نشان می‌دهد. نماد * معنادار بودن آماری را در سطح (05/0p<) نشان می‌دهد. مقایسه بین توان حیاتی سلولها در درصدهای حجمی بالاتر از 10%  DMSO با درصدهای پایین‌تر از 10% انجام شده است.اختلاف آماری معنادار فقط برای زمان 24 ساعت پس از ذوب که در این پژوهش مورد توجه قرار گرفته نشان داده شده است.


استخراج RNA و سنتز cDNA : RNA  هر مجموعه سلولیِ کشت داده شده، 24 ساعت پس از ذوب استخراج گردید. در واقع می‌بایست زمانی برای مطالعه‌ ژنها انتخاب می‌گردید که اولاً سلولها پس از یخ‌گشایی به تعداد مناسب در محیط کشت وجود داشته باشند تا مقادیر مناسبی از RNA را برای مطالعات Real time RT-PCR در اختیار بگذارند و در ثانی اختلاف بین بیان ژنها در حالت تنش سرمایی و شرایط فاقد تنش (سلولهای منجمد نشده) از میان نرفته باشد. همان گونه که در آزمون MTT مشاهده می‌شود (شکل 2) در غلظتهای بالای DMSO و زمان 72 ساعت پس از ذوب، درصد زیستایی سلولی بسیار به شاهد منجمد نشده نزدیک شده است که حکایت از تطابق سلولها با شرایط جدید و فراموش کردن شرایط تنش سرمایی دارد. در چنین حالتی سطح بیان ژنها به سطح بیان در سلولهای شاهد که فاقد تنش سرمایی بوده‌اند نزدیک می‌شود و اختلاف معنادار بین آنها از میان می‌رود. لذا برای ثبت تغییرات ژنی به ویژه در غلظتهای بالای DMSO می‌بایست تا حد امکان زمان انکوباسیون پس از ذوب را کاهش داد. از سوی دیگر، مطالعات انجام شده در این تحقیق نشان داد که در زمانهای کمتر از 24 ساعت (مانند زمان 12 ساعت پس از ذوب) سلولها به اندازه کافی افزایش تعداد نداشته‌اند و به همین علت شرایط مناسبی را برای استخراج مقادیر کافی از RNA فراهم نمی‌سازند. بنابر‌این، با توجه به توضیحات ارائه شده، زمان انکوباسیون 24 ساعت پس از ذوب به عنوان بهترین زمان جهت انجام مطالعات ژنی انتخاب گردید.

برای استخراج ابتدا μl 500 از محلول RNX-Plus سرد به داخل ویال ml 2 حاوی سلولهای برداشت شده از فلاسکهای مورد نظر اضافه شد. پس از ورتکس کردن به مدت 5 تا 10 ثانیه، محلول حاصله به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق قرار داده شد و سپس μl 200 کلروفرم به آن افزوده گردید. مخلوط نهایی به مدت 15 ثانیه بدون استفاده از ورتکس لرزانده شد و به مدت 5 دقیقه بر روی یخ یا در دمای 4 درجه سانتی گراد قرار گرفت و در دمای 4 درجه سانتی گراد و دور rpm 12000 به مدت 15 تا 20 دقیقه سانتریفیوژ گردید. سپس فاز آبی جدا و μl 200 از آن به داخل ویال  ml5/1 جدید منتقل و به حجم مساوی بر روی آن ایزوپزوپانول اضافه گردید. در این حالت، مواد به آرامی با هم مخلوط شدند و به مدت 15 دقیقه بر روی یخ قرار گرفتند. مخلوط حاصل، در دور rpm 12000 و در دمای 4 درجه سانتی گراد به مدت 15 تا 20 دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس محلول رویی دور ریخته و به رسوب به دست آمده  ml1 اتانل 75 درصد اضافه گردید تا رسوب به دست آمده کنده شود. فرآیند رسوب‌گیری مجدداً با انجام سانتریفیوژ به مدت 5 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد و rpm 10000 انجام گرفت. در این مرحله محلول رویی دور ریخته شد و رسوب به دست آمده به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق قرار گرفت تا خشک شود. رسوب RNA در μl 30 آب میلی کیو (ساخت شرکت بن‌یاخته با شماره خرید 1002 Bon) حل شد. برای بهتر حل شدن RNA در آب، ویال به مدت 5 دقیقه در دمای 65 درجه سانتی گراد قرار داده شد. پس از ارزیابی کمّی و بررسی خلوص RNAی استخراج شده که توسط دستگاه نانودراپ انجام گرفت، ارزیابی کیفی RNA که در واقع راندن آن بر روی ژل آگارز می‌باشد نیز صورت پذیرفت.

cDNA مربوط به هر نمونه که در غلظت مشخصی از DMSO قرار گرفته بود، با استفاده از RNA استخراج شده ساخته شد. برای سنتز cDNA، ابتدا دریک ویال  ml2/0، معادل  μg2 از RNA استخراج شده همراه با μl 1 از پرایمر رندوم هگزامر مخلوط و سپس حجم آن با آب میلی‌کیو  (DNase & RNase free) به μl 13 رسانده شد. مخلوط حاصل به مدت 5 دقیقه در دمای 65 درجه سانتی گراد انکوبه گردید تا پرایمرها راحت‏تر به داخلRNA  نفوذ کنند. در این مرحله بلافاصله نمونه‌ها بر روی یخ قرار گرفتند تا اتصال پرایمر به RNA صورت بگیرد. بافر واکنش(X5)، مهارکننده‌ RNase، dNTP Mix و آنزیم رونوشت بردار معکوس به همراه آب میلی کیو به ترتیب با مقادیر μl 4،μl  5/0، μl 1 و μl 1 و μl 5/0 به محلول واکنش افزوده شد تا حجم نهایی به μl 20 برسد. قرار دادن مخلوط نهایی در دمای 25 درجه سانتی گراد به مدت 10 دقیقه و سپس انکوبه کردن آن در دمای 42 درجه سانتی گراد به مدت 60 دقیقه شرایط ساخت cDNA را فراهم نمود. حرارت دادن نمونه با دمای 70 درجه سانتی گراد به مدت 10 دقیقه اختتام واکنش را در پی داشت. محصول واکنش در فریزر 20- درجه سانتی گراد نگهداری شد.

آزمایش Real time RT-PCR : رنگهای سایبر در گروه رنگهای اتصال‌یابنده بهDNA  و RNA قرار دارند. این رنگها نسبت به اتیدیوم ‌برماید اثر جهش‌زایی کمتر و در عوض، حساسیت بیشتری دارند. سه نوع رنگ SYBR در پژوهشهای مولکولی استفاده می‏شود که در اینجا از سایبرگرین 1 استفاده شده است. پس از طراحی پرایمرهای مربوط به ژنهای مورد نظر که توسط نرم‌افزار الیگوآنالایزر نسخه 1/3 نجام گرفت پرایمرها توسط شرکت سیناکلون ساخته و در آزمون Real time RT-PCR در حجم نهایی µl 10 استفاده گردید. در هر میکروویالِ ستونی با حجم  ml1/0 مقدار µl 5 از محلول مَستر موجود در کیت به همراه µl 1 از cDNA و µl 1 از مجموع پرایمرهای پیشرو و پسرو مخلوط و با آب به حجم نهایی µl 10 رسانده شد. سپس میکروویالها در دستگاه Rotogene Corbett 6000 قرار داده شدند و برنامه real time به شرح زیر برای دستگاه تعریف شد: 10 دقیقه توقف در دمای 95 درجه سانتی گراد، 40 چرخه‌ تزایدی مشتمل بر10 ثانیه در 95 درجه سانتی گراد، 25 ثانیه در دمای ذوب هر پرایمر و 30 ثانیه در دمای 72 درجه سانتی گراد (28).

نرم‌افزار‌های رایانه‌ای و تجزیه و تحلیلهای آماری: آنالیز‌های آماری آزمون MTT با استفاده از نرم‌افزار SPSS16 و Excel 2007 انجام شد. همچنین برای انجام محاسبات و آنالیز‌های آماری  آزمون time RT-PCR Real،

از نرم افزار rotor-gene 6 نسخه 6.1 استفاده شد.

نتایج و بحث

به منظور بررسی اثر DMSO بر افزایش بقاء و کاهش مرگ و میر سلولی، زمان 24 ساعت بعد از ذوب که در آن سلولها کمترین میزان توان حیاتی را در قیاس با زمانهای بالاتر و در حضور غلظتهای مختلف DMSO داشته‌اند، جهت انجام آزمونهای Real time RT-PCR انتخاب شد تا بتوان به طریقی میزان راه‌افتادن فرآیندهای مرگ سلولی را در غلظتهای مختلف DMSO مورد بررسی قرار داد.

 

 

 

 

شکل 3 -  نمودار ستونی مربوط به چگونگی بروز تغییرات در بیان ژنهای atg5 (الف)، lc3 (ب) و dram (ج) بر حسب افزایش غلظت DMSO. نماد * و ** معنادار بودن آماری را به ترتیب در سطح آماری (05/0p<) و (001/0p<) در زمان مقایسه‌ هر ستون‌ با ستون شاهد  نشان می‌دهد.  شاهد در اینجا نمونه‌ بدون تیمار سرمایی  با ارتفاع ستون معادل 1 است که برای ساده‌تر شدن، در شکل نشان داده نشده است.

 

در شکل 2 در یک روند وابسته به غلظت و زمان‌، اختلاف معنادار آماری در سطح 05/0 بین درصدهای حجمی بالاتر از 10 درصد DMSO با درصدهای حجمی پایین‌تر مشاهده می‌گردد که با گذاردنِ علامت * در بالای نمودار ستونی مربوط به مهم ترین زمان یعنی 24 ساعت پس از ذوب نشان داده شده‌ است.

بدیهی است اولین حدس در مورد دلیل کاهش توان حیاتی سلولها در زمان 24 ساعت پس از ذوب می‌تواند کاهش توان زیستیِ سلولها به ‌واسطه‌ بروز مرگ سلولی ناشی از سرما باشد. به دنبال یافتنِ فرآیند سلولی و مسیرهای مولکولی منطبق با این ایده، اتوفاژی به عنوان یک فرآیند سلولی دوکاره که می‌تواند موجب مرگ و یا بقای سلولها گردد، یکی از بهترین مسیر‌های انتخابی برای بررسی فرضیه‏ مورد نظر محسوب می‌شد. لذا به منظور بررسی امکان راه‌افتادن مسیر اتوفاژی در سلولها، سطح بیان ژنهای مرتبط با این فرآیند مورد بررسی قرار گرفت.

در شکل 3، محور عمودی نشان‌دهنده‌ میزان بیان ژنها محاسبه شده با روش -ΔΔCT2 و محور افقی نمایانگر غلظت DMSO می‌باشد. Atg5 و LC3 از پروتئینهای ضروری در تشکیل و بلوغ اتوفاگوزو‏م‌ها می‏باشند (9، 24 ،25 و 27). همان‏طور که در شکل 3- الف و 3- ب دیده می‌شود افزایش بیان ژن lc3 و atg5 در غلظتهای 5 تا 20 درصد (صرف نظر از غلظت 10 درصد که افزایش معناداری را در قیاس با شاهد منجمد نشده نشان نمی‌دهد) نشان‏دهنده‏ افزایش تمایل سلولها در تشکیل اتوفاگوزوم‌ها و در نتیجه القای اتوفاژی بعد از ذوب سلولهای تیمار شده با سرما می‌باشد. از سوی دیگر، DRAM پروتئینی با 6 ناحیه درون غشایی است که در غشای لیزوزوم واقع شده است. DRAM هدف مستقیم p53 است و احتمالاً با عملکرد بر روی لیزوزوم‌ها و یا با ارسال علائم فیدبک منفی بر روی پروتئینهای مهار‌کننده اتوفاژی، الحاق لیزوزوم‌ها به اتوفاگوزوم‌ها را راه‌اندازی می‏‌نماید و از این طریق می‏تواند تجمع اتوفاگوزوم‌ها را باعث شود (8، 11 و 20). افزایش بیان dram همانند atg5 و lc3 در تمامیِ نمونه‌های تیماری مؤید راه افتادن مسیر اتوفاژی در شرایط تنش سرمایی می‌باشد (شکل 3- ج). از آنجایی که اتوفاژی فرآیندی با سرشت دوگانه‌ است که از سویی به سلولها کمک می‌کند تا در شرایط تنشِ اعمال شده ضعیف، زنده بمانند (اتوفاژی بقا) و از سوی دیگر با افزایش شدت تنش، سبب نابودی و مرگ سلولها می‌گردد (اتوفاژی مرگ)، در اینجا تفکیک سرشت دوگانه این فرآیند، از طریق مطالعه‌ بر روی مسیر Akt صورت گرفت. بدین منظور، بررسی کمّی RNAهای نسخه‌برداری شده از ژنهای akt1، akt2 و pten به عنوان ژنهای مهم در مسیر بقای سلولی مد نظر قرار گرفت تا افتراقی بین اتوفاژی بقاء و مرگ امکان‌پذیر گردد (شکلهای 4 و 5). همانگونه که در شکل 4- ب مشاهده می‌شود با افزایش غلظت DMSO و در نتیجه‌ کاهش اثرات تنش سرمایی به روی سلولها، میزان بیان akt2 در قیاس با شاهد تغییر معناداری را ندارد که عدم پاسخ دهی این ژن را در برابر DMSO و تنش سرمایی نشان می‌دهد. اما بالا رفتن غلظت DMSO (بالاتر رفتن آن از سطح 10 درصد) باعث می‌شود تا بیانِ به شدت کاهش یافته akt1 (که در غلظتهای کم DMSO حادث شده است) به سمت مقادیر مشابه با شاهد افزایش مقدار یابد. این موضوع نمایانگر بروز اثرات حفاظتی DMSO در غلظتهای بالا (غلظتهای 15 و 20 درصد) و افزایش تمایل سلولها به بقاء همانند سلولهای شاهد می‌باشد. در واقع، روند افزایشی مشاهده شده برای akt1 که به دنبال افزایش غلظت DMSO روی داده است در کنار افزایش بیان ژنهای اتوفاژی (شکل 3- الف)، موجب کاهش اثرات تنش سرمایی به روی سلولها از طریق وقوع اتوفاژی بقاء در غلظتهای بالاتر از 15 درصد از DMSO شده است. در نمودار نقطه‌ای ارائه شده در شکل 4- ج روند تغییرات نامحسوس akt2 در برابر تغییرات صعودی akt1 و نیز مجموع تغییرات ثبت شده برای هر دو ژن (akt1+akt2) آورده شده است به شکلی که برآیند کلی تغییرات akt به صورت تام در زمان افزایش غلظت DMSO به تصویر کشیده شده است. همان گونه که مشاهده می‌شود برآیند تغییرات بیان در دو ژن akt1 وakt2 روندی صعودی را به ازای افزایش غلظت DMSO (بالاتر از 10 درصد) نشان می‌دهد که مؤید راه‌افتادن مسیر بقای سلولی است. راه‌اندازی مسیر بقای سلولی در کنار اتوفاژی نمایانگر وقوع همزمان اتوفاژی و بقاء در غلظتهای بالای DMSO و تنش سرمایی کمتر می‌باشد که این موضوع نشان‌دهنده وقوع اتوفاژی بقاء در سلولها می‌باشد. همانگونه که ملاحظه می‌گردد بررسی همزمانِ مسیر بقای سلولی و اتوفاژی می‌تواند راهکار مناسبی را در مورد تفکیک دو نوع اتوفاژی در اختیار قرار دهد.

 

 

 

 

الف 

 

 

شکل 4 -  نمودارهای ستونی و نقطه‌‌ای مربوط به چگونگی بروز تغییرات بیان ژنهایakt1  (الف)،akt2 (ب) بر حسب افزایش غلظت DMSO. نماد ** معنادار بودن آماری در سطح (001/0p<) را در زمان مقایسه هر ستون‌ با ستون شاهد نشان می‌دهد. شاهد در اینجا نمونه‌ بدون تیمار سرمایی با ارتفاع ستون معادل 1 است که برای ساده‌تر شدن، در شکل نشان داده نشده است.

 

الف

 

ب

 

     20                           15                        10                         5  

شکل 5 -  نمودار نقطه‌ای میزان فعالیت akt در مقایسه با pten  (الف) و نمودار ستونی مربوط به چگونگی تغییرات بیان ژن pten  بر حسب افزایش غلظت DMSO (ب). نماد * معنادار بودن آماری در سطح (05/0p<) را در زمان مقایسه‌ هر ستون‌ با ستون شاهد  نشان می‌دهد. شاهد در اینجا نمونه‌ بدون تیمار سرمایی  با ارتفاع ستون معادل 1 است که برای ساده‌تر شدن، در شکل نشان داده نشده است.

 

شکل 5- الف میزان بیان akt1 و akt2 را در قیاس با pten را نشان می‌دهد. PTEN فسفاتازی است که با افزایش فعالیت خود مانع از وقوع مسیر بقای سلولی می‌شود. افزایش بیان pten در تمامی غلظتهای DMSO نشان می‌دهد که مسیر بقای سلولی می‌بایست به نحوی سرکوب شده باشد و این به ظاهر، خلاف آن چیزی است که در ارتباط با افزایش بیان akt به‌ ویژه در غلظتهای بالای DMSO گفته شد (شکل 5- ب). اما باید دقت نمود این امکان نیز وجود دارد که افزایش میزان RNAهایakt  در سلول بتواند به نحوی پاسخگوی افزایش بیان pten باشد و به شکلی مسیر بقای سلولی را روشن نگه دارند تا میزان مرگ و میر سلولی همان گونه که در شکل 2 نشان داده شد، روندی کاهشی داشته باشد. در شکل 5- الف نسبت بیان akt1+akt2 به pten در برابر افزایش غلظت DMSO آورده شده است. همان گونه که ملاحظه می‌شود میزان بیان akt تام در مقایسه با pten در غلظتهای بالاتر DMSO روندی صعودی را دارد که نشان‌دهنده‌ افزایش توان akt در راه‌اندازی مسیر بقای سلولی و جبران اثرات pten می‌باشد.

از سوی دیگر، کاهش شدید بیان ژن‌ akt1 در راستای افزایش بیان ژن pten در غلظتهای 5 و 10 درصد، نشان‌ دهنده از کار افتادن مسیر Akt/mTOR است که این می‌تواند مؤید طبیعت اتوفاژی راه‌افتاده در این شرایط باشد که از نوع اتوفاژی مرگ است (شکلهای 3 و 4). به عبارت دیگر ضعف عامل حفاظت‌کننده سرمایی در غلظت 5 درصد نشان می‌دهد که سازوکار‌های حفاظت‌ سرمایی به منظور افزایش توان زیستی سلولها اعمال نشده و به همین علت تعداد سلولها در مقایسه با شاهد کاهش مشخصی را به واسطه‌ی راه افتادن مسیر اتوفاژی مرگ داشته است.

 

 

شکل 6 -  نمودار ستونی چگونگی بروز تغییرات بیان ژن  beclin1 بر حسب افزایش غلظت DMSO. نماد * و ** معنادار بودن آماری را به ترتیب در سطح آماری (05/0p<) و (001/0p<) در زمان مقایسه‌ هر ستون‌ با ستون شاهد  نشان می‌دهد. شاهد در اینجا نمونه بدون تیمار سرمایی  با ارتفاع ستون معادل 1 است که برای ساده‌تر شدن، در شکل نشان داده نشده است.


beclin1 اورتولوگ پستانداران از ژن atg6 مخمر است که محصول پروتئینیِ آن تشکیل اتوفاگوزوم‌ها را تنظیم می‏کند. کاهش معنادار بیان ژن  beclin1که به میزان چشمگیری در نمونه‌های تیمار شده با غلظتهای 15 و 20 درصد نسبت به نمونه‌های 5 و 10 درصد روی داده است، احتمالاً نشان از دخالت کلیدیِ این ژن در راه‌اندازی اتوفاژی بقاء دارد (شکل 6). روند مشابهی نیز در مورد p53 وجود دارد که به نحو دیگری ارتباط پایین بودن سطح بیان آن را با اتوفاژی بقاء نشان می‌دهد (شکل 7- الف). جالب است که در نقطه مقابل، بالا بودن میزان بیان ژنهای p53 و beclin1 ارتباط این دو ژن را با راه‌اندازی اتوفاژی مرگ به ویژه در نمونه‌ 5 درصد نشان می‌دهد. به نظر می‌آید میزان بیان p53 و beclin1 تعیین کننده سرنوشت سلول از لحاظ انتخاب مسیر خود در اتوفاژی مرگ و یا بقاء می‌باشد. بالا بودن سطح بیان dram در تمامی نمونه‌ها مشاهده شده (شکل 7- ب) و لذا این ژن تنها در راه‌اندازی اتوفاژی، خواه اتوفاژی مرگ و خواه اتوفاژی بقاء، نقش خود را ظاهر می‌سازد. این در حالی است که پایین بودن بیان p53 و beclin1 در غلظتهای بالاتر از 10 درصد DMSO باعث انتخاب مسیر اتوفاژی بقاء و بالا بودن سطح بیان این دو ژن سبب گزینش مسیر اتوفاژی مرگ شده است (شکلهای 6 و 7).

 

 

الف 

 

شکل 7 -  نمودار ستونی مربوط به چگونگی بروز تغییرات بیان ژن های p53 (الف) و dram (ب) بر حسب افزایش غلظت DMSO. نماد * معنادار بودن آماری در سطح (05/0p<) را در زمان مقایسه‌ هر ستون‌ با ستون شاهد  نشان می‌دهد. شاهد در اینجا نمونه بدون تیمار سرمایی  با ارتفاع ستون معادل 1 است که برای ساده‌تر شدن، در شکل نشان داده نشده است. 

 

پروتئین p53 به دو فرم سیتوپلاسمی و هسته‌ای وجود دارد که خواستگاه اصلی آن به عنوان پروتئین کنترل بیان ژن در هسته می‌باشد. بنابراین شاید بتوان ارتباط سطح بیان آن را در تفکیک اتوفاژی مرگ و بقاء به میزان بیان اشکال هسته‌ای و یا سیتوپلاسمیِ آن نسبت داد به شکلی که در مقادیر پایین از p53 (ایجاد شده در غلظتهای بالا از DMSO)، این پروتئین تمایل حضور بیشتری در هسته دارد تا ژنهای مؤثر در بقاء و اتوفاژی را همزمان روشن نماید اما در مقادیر بالا، علاوه بر حضور در هسته، حضور سیتوپلاسمی نیز محتمل خواهد بود که با اثر‌گذاری به روی اندامکهایی چون میتوکندری توان راه‌اندازی فرآیندهای منجر به مرگ سلولی مانند آپوپتوز را دارد و مرگ را همنشین اتوفاژی می‌سازد. آپوپتوز اصلی ترین شکل مرگ سلولی در سلولها می‌باشد (1). نحوه اثر گذاری اشکال سیتوپلاسمی p53 به روی میتوکندری و راه‌اندازی آپوپتوز قبلاً نیز گزارش شده است (3).

بنابراین به طور خلاصه، بر اساس نتایج حاصل از آزمون MTT و تحلیلهای آماری مرتبط با آن، می‌توان گفت که افزایش معناداری در توان حیاتی نمونه‌های تیمار شده با سرما در غلظتهای مختلف DMSO (در زمان قیاس غلظتهای پایین‌تر از 10 درصد با غلظتهای بالاتر از 10 درصد) مشاهده می‌شود که این افزایش روند مشخصی را در یک رفتار وابسته به زمان و غلظت از حفاظت‌کننده سرمایی نشان می‌دهد. ماده حفاظت‌کننده سرمایی دی‌متیل‌سولفوکسید در غلظت 5 درصد توانایی حفاظت سلولها را در برابر تنش اعمال شده توسط فرآیند انجماد را نداشته و به ‌همین جهت سلولها توان حیاتی پایین‌تری را نسبت به سلولها‌یی که در غلظتهای بالاتر ماده‌ حفاظت‌کننده سرمایی دی‌متیل‌سولفوکسید منجمد شده‌اند از خود نشان می‌دهند که علت آن راه‌اندازی مسیر اتوفاژی مرگ می‌باشد. با افزایش غلظت DMSO (از 5 به 20 درصد) و نیز افزایش مدت زمان پس از ذوب (از 24 تا 72 ساعت) توان حیاتی سلولها افزایش می‏یابد؛ به طوری ‌که اثر حفاظت سرمایی DMSO می‌تواند در غلظتهای حجمی 15 و 20 درصد ، بعد از گذشت سه روز از ذوب، توان حیاتی سلولها را به میزان 80 درصد (نزدیک به توان حیاتی سلولها در نمونه شاهد) افزایش دهد. به عبارت دیگر، با افزایش غلظت DMSO تنش سرمایی اعمال شده به روی سلولها به واسطه بروز اثرات حفاظت‌کننده DMSO کاهش می‌یابد و به همین علت توان زیستی سلولها افزایش می‌یابد. این افزایش، با تغییر نوع اتوفاژی از مرگ به بقاء حاصل می‌گردد که باعث نگهداری بیشتر سلولها در برابر اثرات مخرب سرما می‌گردد. بدیهی است که استفاده از روشهای آزمایشگاهی دیگر مانند لکه‌گذاری وسترن می‌توانست اطلاعات دقیق‌تری را در اختیار قرار دهد اما با توجه به منطق محکم و شفافی که در نحوه رفتار ژنهای دخیل در اتوفاژی در سلولهای تیمار شده با سرما وجود داشت و نیز انطباق بسیار مناسبی که بین یافته‌های این تحقیق با گزارشهای قبلی مشاهده می‌شد لذا حصول نتیجه نهایی چندان وابستگی اساسی نسبت به انجام بررسیهای بیشتر در سطح پروتئین‌سازی را نشان نمی‌داد.

1- علومی مانا، شریعتی الهه سادات، بوذری سعید (1388)مطالعه فعالیت آپوپتوزیس پروتئین هیبرید ( A1-GMCSF ) بر روی رده های مختلف سلولی دارای گیرندهGMCSF. مجله زیست‌شناسی ایران، 22(1): 85.

2- مومنی حمید رضا، سلیمانی مهرنجانی ملک، آبنوسی محمد حسین، نسیمی پروا (1389) ارزیابی قابلیت حیات قطعات نخاع موش بالغ به وسیله سنجش  MTT. مجله زیست‌شناسی ایران، 23 (2):267.

 

3- Amaral JD, Xavier JM, Steer CJ, Rodrigues CM. 2010. The role of p53 in apoptosis. Discov Med. 9(45):145-152.

4- Armand M, Karow JR. 1969. Cryoprotectants- a new class of drugs. J Pharm. Pharmac. 21: 209-223.

5- Barry JF. 2004. Cryoprotectants: The essential antifreezes to protect life in the frozen state. Cryo-letters. 25: 375-388.

6- Brockbank KGM, Carpenter JF, Dawson PE. 1992. Effects of storage temperature on viable bioprosthetic heart valves. Cryobiology. 29: 537-542.

7- Chapsky L, Rubinsky B. 1997. Kinetics of antifreeze protein-induced ice growth inhibition. FEBS Lett. 412: 241-244.

8- Chen N, Debnath J. 2010. Autophagy and tumorigenesis. FEBS Lett. 584: 1427-1435.

9- Codogno P, Meijer AJ. 2005. Autophagy and signaling: their role in cell survival and cell death. Cell Death Differ. 12 :1509-1518.

10- Coger R, Toner M. 1995. Preservation techniques for biomaterials. The Biomedical Engineering Handbook; Chapter 105: 1567-1578.

11- Crighton D, Wilkinson S, Ryan K. 2007. DRAM links autophagy to p53 and programmed cell death. Autophagy. 3: 72-74.

12- Datta SR, Brunet A, Greenberg ME. 1999. Cellular survival: a play in three Akts. Genes Dev, 13: 2905-2927.

13- De duve C, Wattiaux R. 1966. Functions of lysosomes, Annu. Rev. Physiol. 28: 435-492.

14- Denizot F, Lang R. 1986. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye proceduregiving improved sensitivity and reliability. J. Immunol. Methods. 89: 271-277.

15- Devries AL, Wohlschlag DE. 1969. Freezing resistance in some Antarctic fishes. Science. 163: 1074-1075.

16- Drobnis EZ, Crowe LM, Berger T, Anchordoruy TJ, Overstreet JW, Crowe JH. 1993. Cold shock damage is due to lipid phase transitions in cell membranes: a demonstration using sperm as a model. J Exp Zool. 265: 432-437.

17- Fahy GM. 1986. The relevance of cryoprotectant “toxicity” to cryobiology. Cryobiology. 23: 1-23.

18- Farrant J, 1977. Water transport and cell survival in cryobiological procedures. Phil Trans R Soc Lond. 278: 191-205.

19- Jia Z, Davies PL. 2002. Antifreeze proteins: an unusualreceptor–ligand interaction. TRENDS in Biochemical Sciences. 27(2): 101-106.

20- Lim LY, Vidnovic N, Ellisen LW, Leong CO. 2009. Mutant p53 mediates survival of breast cancer cells. Br J Cancer. 3: 1606-1612.

21- Liu B, Cheng Y, Liu Q, Bao JK, Yang JM. 2010. Autophagic pathways as new targets for cancer drug development. Acta Pharmacologica Sinica. 31: 1154-1164.

22- Mazur P, Leibo SP, Chu EH. 1972. A two factor hypothesis of freezing injury. Experimental Cell Research. 71: 345-355.

23- Mazur P. 1984. Freezing and Low Temperature Storage of Freezing of Living Cells: Mechanisms and implications. Amer. J. Physiol. 247: 125-142.

24- Mehrpour M, Esclatine A, Beau I, Codogno P. 2010. Overview of macroautophagy regulation in mammalian cells. Cell Res. 20: 748-762.

25- Mizushima N, Yoshimori T, Levine B. 2010. Methods in Mammalian Autophagy Research. Cell. 140: 311-326.

26- Pegg DE. 2007. Principles of cryopreservation. Methods in Molecular Biology. 368: 39-57.

27- Roy S, Debnath J. 2010. Autophagy and tumorigenesis. Semin Immunopathol. 32: 383-396.

28- Sambrook J, Russell DW. 2001.Molecular cloning (A Laboratory Manual). 3th ed. p:5.

29- Shepard ML, Goldstone CS, Cocks FH. 1976. The H2O-NaCl-glycerol phase diagram and its application in cryobiology. Cryobiology. 13  :9-23.

30- Turcotte S, Chan DA, Sutphin PD, Hay MP, Denny WA, Giaccia AJ. 2008. A molecule targeting VHL-deficient renal cell carcinoma that induces autophagy. Cancer Cell. 14 :90-102.

31- Vivanco I, Sawyers CL. 2002. The phosphatidylinositol 3-Kinase AKT pathway in human cancer. Nat. Rev. Cancer. 2: 489-501.

32- Wu B, Zhu JS, Zhang Y, Shen WM, Zhang Q. 2008. Predictive value of MTT assay as an in vitro chemosensitivity testing for gastric cancer: One institution's experience. World J Gastroenterol. 14: 3064-3068.

33- Yang Z, Klionsky DJ. 2010. Eaten alive: a history of macroautophagy. Nat. Cell Biol. 12: 814-822.

34- Zeron Y, Sklan D, Arav A. 2002. Effect of polyunsaturated fatty acid supplementation on biophysical parameters and chilling sensitivity of ewe oocytes. Mol Reprod Dev. 61: 271-278.