نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

دانشگاه تهران

چکیده

تا کنون تلاش های متعددی در جهت جداسازی آنزیم هایی که در شرایط سخت صنعتی پایداراند از میکروارگانیسم های کران دوست از جمله نمک دوست صورت گرفته است. آرکی نمک دوست افراطی سویه Ha25، آنزیم پولولاناز خارج سلولی نمک دوست و گرمادوست نسبی را در شرایط پرتنش در محیط کشت دارای 23% نمک تام تولید می کند. تعیین توالی ژن S rRNA16 و ویژگی های فنوتیپی نشان داد سویه Ha25 متعلق به جنس Halorubrum است. تولید آنزیم با میزان رشد هماهنگ بود و در میانه فاز سکون به بیشترین میزان خود رسید. ترشح این آنزیم در حضور نمک سدیم کلراید صورت گرفته و در حضور غلظت 3 تا 4 مولار نمک NaCl بیشینه تولید آنزیم مشاهده شد (U/ml 85). دما و pH بهینه برای تولید آنزیم به ترتیب 45 درجه سانتی گراد و0/7 تعیین شد. منابع مختلف کربن مانند مالتوز، نشاسته و پولولان به عنوان القا کننده و گلوکوز به عنوان مهار کننده تولید آنزیم شناسایی شدند. غلظت بهینه منیزیوم برای تولید آنزیم 0.1 مولار بوده و این در حالی است که هیچ رشدی و متعاقب آن، هیچ تولیدی در عدم حضور یون های منیزیوم مشاهده نشد. بیشینه فعالیت آنزیم در حضور غلظت 3 مولار نمک NaCl و در دمای 50 درجه سانتی گراد بوده و در دمای 45 و 35 درجه سانتی گراد به ترتیب کاهش 25% و 72% در فعالیت آنزیم مشاهده شد. pH بهینه برای فعالیت آنزیم 8 بوده و در pH 6 و 9، به ترتیب 49.5% و 32.4% از فعالیت آنزیم باقی ماند.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Production of an extracellular halophilic Pullulanase By Halorubrum sp. Strain Ha25 Isolated From Aran- Bidgol Lake

نویسندگان [English]

  • Mostafa Fazeli
  • Mohammad Ali Amoozegar
  • Mehran Habibi Rezaei
  • Maryam Siroosi

University of Tehran

چکیده [English]

The industrial application of enzymes which can withstand in harsh condition such as high salinity and temperature has greatly increased. An extracellular halophilic and moderately thermophilic pullulanase was produced under stress conditions by a newly isolated extreme haloarchaeal strain designated as Ha25 in culture medium with 23% of total salt. 16S rRNA gene sequence analysis with phenotypic characterization places strain Ha25 in the genus Halorubrum. The enzyme production corresponded with growth and reached a maximum level during the mid-stationary phase. The isolate was capable of producing pullulanase in the presence of sodium chloride and the maximum enzyme production was at 3-4 M NaCl (85 U/ml). Optimum pH and temperature for enzyme production were 7.0 and 45 °C, respectively. Various carbon sources including maltose, starch and pullulan was inducing enzyme production, while glucose repressed production of enzyme. No cell growth and enzyme production was observed in the lack of Magnesium ions and the optimum concentration was 0.1 M. The maximum pullulanase activity was obtained in the medium containing 3 M NaCl at 50 °C, with 25% and 72% activity reductions at temperature 45 and 35°C, respectively. The optimum pH for activity of enzyme was 8.0, with 49.5% and 32.4% residual activities at pH 6 and 9, respectively.

کلیدواژه‌ها [English]

  • pullulanase production
  • extreme halophilic archaea
  • Halorubrum
  • pullulan

تولید پولولاناز نمک دوست خارج سلولی توسط سویه Ha25  Halorubrumجدا شده از دریاچه پرشور آران و بیدگل 

مصطفی فاضلی1، محمدعلی آموزگار1*، مهران حبیبی رضایی2 و مریم سیروسی1

1 تهران، دانشگاه تهران، پردیس علوم، دانشکده زیست شناسی، بخش میکروبیولوژی

2 تهران، دانشگاه تهران، پردیس علوم، دانشکده زیست شناسی، گروه سلولی و مولکولی

تاریخ دریافت: 29/3/91               تاریخ پذیرش: 16/5/92 

چکیده

امروزه کاربرد زیست­فن­آوری آنزیمهایی که در شرایط سخت صنعتی مانند دما و شوری بالا پایدارند رو به افزایش است، از این رو تلاشهای متعددی در جهت جداسازی این آنزیمها از میکروارگانیسم­های کران دوست انجام گرفته که در این میان نمک­دوستها، مهم ترین تولید کننده این آنزیمها هستند. در این پژوهش یک آرکی نمک­دوست که به عنوان جنس Halorubrum شناسایی شد، آنزیم پولولاناز خارج سلولی نمک­دوست و گرمادوست نسبی را در محیط کشت دارای 23 درصد نمک تام تولید کرد. تولید آنزیم پولولاناز در این سویه با میزان رشد هماهنگ بود و در میانه فاز سکون به بیشترین میزان خود رسید. در حضور غلظت 0/3 تا 0/4 مولار نمک NaCl بیشینه تولید آنزیم مشاهده شد ( U ml-185). دما و  pHبهینه برای تولید آنزیم به ترتیب 45 درجه سانتی­گراد و0/7 تعیین شد. منابع مختلف کربن مانند مالتوز، نشاسته و پولولان به عنوان القاء کننده و گلوکز به عنوان مهار کننده تولید آنزیم شناسایی شدند. غلظت بهینه منیزیم برای تولید آنزیم 1/0 مولار تعیین و در نبود یونهای منیزیم، رشد سویه و تولید آنزیم مشاهده نشد. بیشینه فعالیت آنزیم در حضور غلظت 0/3 مولار نمک NaCl و در دمای 50 درجه سانتی­گراد اندازه­گیری و در دمای 45 و 35 درجه سانتی­گراد به ترتیب کاهش 25 درصد و 72 درصد در فعالیت آنزیم مشاهده شد. pH بهینه برای فعالیت آنزیم 8 تعیین و در pH 0/6 و 0/9، پس از مدت 30 دقیقه به ترتیب 5/49 درصد و 4/32 درصد از فعالیت آنزیم باقی ماند.

واژه های کلیدی: تولید پولولاناز، نمک دوست، آرکی نمک دوست افراطی، Halorubrum ، پولولان

* نویسنده مسئول، تلفن: 61113557-021، پست الکترونیکی:  amozegar@khayam.ut.ac.ir

مقدمه

 

گلیکوزیل هیدرولازها مانند آمیلازها، سلولازها، زایلانازها و غیره، به طور گسترده­ای در هر سه قلمرو حیات شناسایی شده­اند­. این آنزیمها نقش مهمی در متابولیسم کربوهیدراتها دارند­، اما تاکنون مطالعات اندکی روی آنزیمهای آرکیایی صورت گرفته است (6 و 17). آنزیمهای آمیلولیتیک میکروبی کاربردهای متعددی در صنایع دارویی، مواد شوینده، صنایع غذایی و به خصوص صنایع نشاسته به منظور هیدرولیز نشاسته پیدا کرده­اند (6 و 8).

پولولانازها (پولولان 6- گلوکانوهیدرولاز، EC 3.2.1.41) گروهی از آنزیمهای شاخه­شکن هستند که پیوندهای گلیکوزیدی (6-1)α را در پولولان، گلیکوژن، آمیلوپکتین و سایر کربوهیدراتهای مرتبط هیدرولیز کرده و مالتواولیگوساکاریدها، مالتوتریوز و مالتوز را به عنوان محصول نهایی تولید می­کنند (19 و 38). پولولانازها به طور گسترده­ای به همراه آمیلازهای ساکاریفیه کننده برای بهبود ساکاریفیکاسیون و به عنوان عاملی برای جلوگیری از بیات شدن نان استفاده می­شوند )7 و 38).

نمک­دوستها میکروارگانیسم­های کران­دوستی هستند که در محیطهای پرشور نظیر دریاچه­های شور و پرشور و غذاهای نمکی تخمیر شده زندگی می­کنند. هالوباکتریها و هالوآرکیها در پروکاریوتها از جمله این میکروارگانیسم­ها هستند.

به تازگی توجه به آنزیمهای میکروارگانیسم­های نمک­دوست نسبی و کاربردهای زیست­فن­آوریشان افزایش یافته است  (3، 23، 34 و 35). آنزیمهای نمک­دوست علاوه بر اینکه عملکرد آنزیمی مشابهی با همتایان غیرنمک­دوست خود نشان می دهند، ویژگیهایی از قبیل نیازمندی به غلظتهای بالای نمک برای فعالیت و پایداری نیز دارند. این آنزیمها اغلب تحمل کننده دما بوده و در آب فعال کم (آب فعال آبی است که برای هیدراته کردن ساختار پروتئینی به منظور حفظ ساختار صحیح در اختیار آن قرار دارد) نیز عملکرد دارند. بسیاری از فرآیندهای صنعتی در شرایط سختی انجام می­شوند که آنزیمهای معمولی در این شرایط فعال نیستند (9، 22 و 27). از این رو اکستریموزیم­ها که در غلظتهای نمک زیاد، دمای بالا و pH های مختلف فعالیت بهینه دارند، دارای اهمیت هستند. آنزیمهای هیدرولیزکننده تولید شده توسط هالوآرکیها به دلیل فعالیت در دمای بالا و آب فعال کم، می­توانند در صنعت به کار روند.

گلیکوزیل هیدرولازهای تولید شده توسط آرکیها نسبت به سایر قلمروها کمتر مطالعه شده­اند، با این ­وجود آمیلازها و زایلانازها در برخی آرکیهای نمک­دوست افراطی مانند Halobacterium sp.، Haloferax mediterranei، Haloarcula hispanica، Natronococcus sp. Ah-36 و Halorhabdus utahensis گزارش شده­اند (13، 18، 21، 32، 39).

 در این پژوهش برای اولین  بار،  تولید  آنزیم پولولاناز  از

آرکی نمک­دوست افراطی جنس Halorubrum سویه Ha25 گزارش شده است. در این بررسی همچنین، شرایط بهینه جهت تولید و فعالیت آنزیم نیز تعیین شده است.

مواد و روشها

سویه آرکی و شرایط کشت: آرکی نمک­دوست افراطی سویه Ha25 از دریاچه پرشور آران و بیدگل در ایران جدا شد. این سویه در شرایط هوازی در دمای 40 درجه سانتی­گراد در محیط کشت دارای (w/v) 1 درصد نشاسته محلول، 1 درصد پپتون گوشت، 2/0  درصد عصاره مخمر و با پایه نمکی (g l-1)  NaCl184­، MgCl2.6H2O 23­،  MgSO427­، KCl 4/5 و  CaCl24 (محلول CaCl2 جداگانه اتوکلاو شد و سپس به میزان 4 میلی لیتر بر لیتر به محیط کشت افزوده گردید) کشت داده شد. pH محیط نیز با استفاده از Tris – HCl در محدوده­ی 4/7- 2/7 تنظیم شد.

شناسایی سویه: ویژگیهای ریخت­شناسی و فیزیولوژیک سویه Ha25 روی محیط  MGM جامد و مایع محتوی 23  درصد نمک تام (w/v) بررسی شد. رنگ آمیزی گرم این سویه بر اساس روش Dussault (10) و بررسی حرکت آن نیز با روش لام مرطوب انجام شد (12). فعالیت کاتالازی و اکسیدازی­، تولید اندول­، هیدرولیز ژلاتین­، احیای نیترات و مصرف سیترات مطابق Bergey's Manual of Systematic Bacteriology مورد بررسی قرار گرفتند (4 و 15). تولید اسید از کربوهیدراتها، رشد در شرایط بی­هوازی و حساسیت به آنتی­بیوتیکهای مختلف با روشهای ارائه شده توسط Oren و همکاران مطالعه شدند (30). هیدرولیز تویین 80 طبق روش González بررسی شد (16).

DNA ژنومی این سویه با روش Wan Lam استخراج شد (11). ژن S rRNA16 این سویه با پرایمرهای عمومی F21

 (5′-TTCCGGTTGATCCYGCCGGA-3′)  و R1492 (5'- GGTTACCTTGTTACGACTT-3') با واکنش زنجیره­ای پلیمراز و طبق برنامه زیرتکثیر شد:

دمای دناتوراسیون اولیه 94 درجه سانتی­گراد و مدت زمان آن 5 دقیقه بود. سپس 30 چرخه شامل یک دقیقه دمای 94 درجه سانتی­گراد، یک دقیقه دمای 54 درجه سانتی­گراد، یک دقیقه دمای 72 درجه سانتی­گراد انجام شدند. در انتها­، برای تکمیل واکنش ساخت ­DNA دما برای 7 دقیقه در 72 درجه سانتی­گراد نگه داشته شد. درستی انجام واکنش زنجیر­ه­ای پلیمراز با الکتروفورز بخشی از محصول و رنگ آمیزی آن با اتیدیوم برماید تأیید شد. این محصول از هر دو سو تعیین توالی شد و سپس شباهت توالی S rRNA16 این سویه با سایرتوالیهای ثبت شده در پایگاه اطلاعاتی EzTaxon-e server  (http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/; Kim et al., 2012) تعیین شد (20).

تولید پولولاناز و آماده­سازی محلول آنزیمی خام: تولید آنزیم با تلقیح فلاسکهای 100 میلی لیتری حاوی 20 میلی لیتر محیط کشت با کشت سه روزه سویه، انجام گرفت. کشتها در دمای 40 درجه سانتی­گراد در انکوباتور شیکردار گرماگذاری شدند. فلاسکها پس از مدت زمان 96 ساعت برداشته شده و زیست­توده با سانتریفیوژ محتویات فلاسک در x g 9000 به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی­گراد حذف شد. مایع­رویی جهت ارزیابی فعالیت آنزیمی مورد بررسی قرار گرفت.

سنجش فعالیت پولولاناز: 50 میکرولیتر از محلول آنزیمی با 450 میکرولیتر بافر فسفات 50 میلی مولار (5/7pH ) حاوی 5/0 درصد پولولان و 5/2 مولار NaCl در دمای 50 درجه سانتی­گراد به مدت 30 دقیقه گرماگذاری و سپس مقدار قندهای احیاکننده آزاد شده با روش دی نیتروسالیسیلیک اسید (DNS) اندازه­گیری شد (26). بر حسب تعریف یک واحد آنزیم پولولاناز مقدار آنزیمی است که موجب آزاد شدن یک میکرو مول قند احیایی مالتوتریوز در یک دقیقه در یک میلی لیتر محلول آنزیمی شود.

اثر دما، pH و غلظت نمک روی رشد و تولید آنزیم: جهت بهبود تولید آنزیم پولولاناز، اثر عوامل مختلف روی رشد سویه Ha25 و تولید آنزیم  بررسی شد. برای دست­یابی به دمای بهینه جهت رشد و تولید آنزیم، از محیط پیش کشت به میزان 1 درصد به محیطهای پایه آماده شده با (w/v) 23 درصد نمک و pH معادل 4/7- 2/7 تلقیح شد و در انکوباتور شیکردار با دور rpm 150 در دماهای 25، 30، 35، 40، 45، 50 و 55 درجه سانتی­گراد گرماگذاری شد. برای تنظیم pH های مختلف به منظور تعیین pH  بهینه، از بافرهای استاندارد استات سدیم (0/5 pH)، (0/6 pH)­MES ، (0/7 pH) ­HEPES، (0/9-0/8 (pH   Trisو (0/10pH ) Glycine-NaOH استفاده شد. غلظتهای 5/5 – 5/1 مولار از NaCl و 5/0- 0/0 مولار از  MgCl2 و نمکهای کلرید پتاسیم، استات سدیم و نیترات سدیم با غلظتهای 0/1 تا 0/4 مولار جهت تعیین میزان بهینه این نمکها بررسی شدند.

اثر منابع مختلف کربن و نیتروژن بر رشد و تولید پولولاناز: به منظور بررسی اثر منابع کربن، کربوهیدراتهای مختلفی شامل گلوکز، فروکتوز، مالتوز، لاکتوز، دکسترین، پولولان به میزان 1 درصد w/v)) به عنوان تنها منبع کربن، در محیط پایه جایگزین نشاسته شدند. جهت تعیین غلظت بهینه نشاسته محلول برای تولید پولولاناز، نشاسته محلول با غلظتهای (w/v) 0/5 - 0/0  درصد به عنوان منبع کربن به محیط کشت اضافه شد. برای بررسی اثر منابع  مختلف نیتروژن آزمایشگاهی در تولید پولولاناز در محیط پایه، از منابع آلی و معدنی شامل عصاره مخمر، عصاره گوشت، پپتون، ترکیبی از عصاره گوشت و پپتون، عصاره مخمر و پپتون، کلرید آمونیوم (NH4Cl)، سولفات آمونیوم ((NH4)2 SO4) ، نیترات آمونیوم و نیترات سدیم به میزان (w/v) 1 درصد استفاده شدند.

خالص­سازی نسبی آنزیم: کلیه مراحل خالص­سازی در دمای 4 درجه سانتی گراد صورت گرفتند. رسوب­دهی پروتئینها با روش­ رسوب­دهی توسط اتانول مطلق سرد انجام شد. برای این منظور ابتدا کشتهای میکربی 4 روزه­، در فالکونهای 15 میلی­لیتری در دمای4 درجه سانتی­گراد به مدت 20 دقیقه با دور x g ­9000، سانتریفیوژ شده و به این ترتیب سلولها و دیگر مواد جامد محیط حذف شدند. یک حجم اتانول مطلق سرد ­شده در دمای 20- درجه سانتی­گراد به صورت قطره قطره به مایع رویی حاصل از سانتریفیوژ محیط کشت اضافه گردید. رسوب حاصل با استفاده از سانتریفیوژ با دور x g 9000  به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی­گراد جمع آوری شد. این رسوب در کمترین مقدار بافر فسفات 50 میلی مولار با pH برابر با 5/7 حل­شد. سپس این مایع مورد دیالیز قرار گرفت. برای تخلیص بیشتر آنزیم، کروماتوگرافی فیلتراسیون ژلی با محیط سفادکس G-100 انجام شد. با استفاده از این روش کروماتوگرافی، پروتئینها بر حسب اندازه از ستون خارج می­شوند. با شستشوی ستون با بافر پروتئینهای بزرگتر زودتر و پروتئینهای کوچکتر با تأخیر از ستون خارج می­شوند. ستون کروماتوگرافی (cm 40 × 5/1) با استفاده از بافر سدیم فسفات 20 میلی مولار (5/7 pH) حاوی  NaCl2مولار به حالت تعادل در آمد. جداسازی تفکیکی پروتئینها با استفاده از دو حجم از همان بافر با سرعت جریان 2/0 میلی لیتر بر دقیقه انجام شد. حجم بخشهای جمع آوری شده از ستون، یک میلی­لیتر بود. بعد از اتمام شستشوی ستون، فعالیت آنزیمی تمام بخشهای خارج شده از ستون مورد بررسی قرار گرفتند. بخشهای فعال جمع­آوری شده و به عنوان آنزیم خالص شده برای بررسیهای بیشتر استفاده شدند. در همه مراحل تخلیص، اندازه­گیری میزان پروتئین با روش برادفورد انجام گرفت (5).

بررسی بیوشیمیایی فعالیت پولولاناز تخلیص شده نسبی: برای تعیین دمای بهینه فعالیت پولولانازی، واکنش آنزیمی در گستره دمایی 55-25 درجه سانتی گراد به مدت یک ساعت انجام شد و سنجش فعالیت پولولیتیک مطابق شرایط استاندارد انجام گرفت. برای تعیین pH بهینه فعالیت پولولیتیک بخشهای فعال، از محلول سنجش پولولان 5/0 درصد در بافرهایی با pH مناسب با غلظت 20 میلی مولار(0/5، استات سدیم؛ 0/6،MES ؛ 0/7،HEPES ؛ 0/8 تا 0/9، Tris؛ 0/10، Glycine-NaOH) استفاده­ شد. فعالیت آنزیم تخلیص شده نسبی در حضور غلظتهای 2/5 – 0/0 مولار  NaClاندازه­گیری شد، همچنین اثر غلظتهای مختلف NaCl (3-1 مولار) در گستره دمایی 55-25 درجه سانتی­گراد روی فعالیت آنزیم بررسی شد.

بررسی محصولات حاصل از عملکرد آنزیم: جهت تعیین محصولات حاصل از عملکرد آنزیمی بر روی پولولان، نشاسته و مالتوتریوز، از روش کروماتوگرافی لایه نازک (TLC) استفاده شد. به این منظور، در تانک TLC، از سیستم حلال  –nبوتانول- اسید استیک – آب (1 : 1 : 3 ، v/v/v) و به منظور ردیابی محصولات حاصل از عملکرد آنزیم نیز از  معرف دی فنیل آمین – آنیلین – اسید ارتو فسفریک استفاده شد (31).

نتایج

مطابق با آزمونهای بیوشیمیایی و اطلاعات حاصل از تعیین ترادف ژن S rRNA16، سویه Ha25  در جنس Halorubrum قرار گرفت. درخت فیلوژنی این سویه با روش Neighbour-joining رسم شد (شکل1). این درخت موقعیت فیلوژنی سویه Ha25 را نشان داده و مطابق با آن نزدیکترین گونه به این سویه،Halorubrum chaoviator  با شماره دسترسی Gene bank، AM048786 است (24).

این سویه گرم منفی، چند شکلی، متحرک و هوازی بوده و اسپور تشکیل نمی­دهد. کلنیهای آن بر روی محیط جامد حاوی 23 درصد نمک تام (w/v) به رنگ قرمز و محدب با کناره­های صاف بود.

 

 

 

 

 

 Strain Ha25

 Halorubrum chaoviator Halo-GT(AM048786)

 Halorubrum ezzemoulense 5.1T(DQ118426)

 Halorubrum distributum JCM 9100T(D63572)

 Halorubrum coriense Ch2T(L00922)

 Halorubrum sodomense (D13379)

 Halorubrum trapanicum NRC 34021T(X82168)

 Halorubrum ejinorense EJ-32T(AM491830)

Halorubrum terrestre VKM B-1739T(AB090169)

 Halorubrum arcis AJ201T(DQ355793)

Halorubrum kocurii BG-1T(AM900832)

 Halorubrum vacuolatum(D87972)

  Halogranum gelatinilyticum TNN44T(GQ282624)

Halogranum rubrum RO2-11T (EU887283)

 Halogranum gelatinilyticum TNN44T(GQ282623)

 Haloplanus natans (DQ417339)

64

100

100

98

99

99

99

65

89

 

 

96

0.01

 

 

 

 

 

 


شکل 1- درخت فیلوژنی Halorubrum sp. strain Ha25

 

رشد این آرکی در غلظتهای 5/1 تا 2/5  مولار از NaCl و در محدوده pH بین 0/6 تا 0/9 و دمای 25 تا 50 درجه سانتی­گراد مشاهده شد. غلظت نمک، pH و دمای بهینه برای رشد به ترتیب 0/3 مولار، 0/7 pH  و40 درجه سانتی­گراد تعیین شد. همچنین مشخص شد که حضور یونهای منیزیم برای رشد ضروری است. این سویه اکسیداز و کاتالاز مثبت بوده، نیترات را به نیتریت احیاء کرده و قادر به مصرف کربوهیدراتهای گلوکز، گالاکتوز، لاکتوز، مانوز، سوکروز، مالتوز، ریبوز و نشاسته بود، ولی توان مصرف مانیتول را نداشت. این سویه قادر به هیدرولیز ژلاتین، کازئین و تویین 80 نبوده، اندول و H2S را تولید نکرده و به پنیسیلینG، کلرامفنیکل، اریترومایسین، تتراسایکلین و آمپی­سیلین مقاوم بود.

 

 

 

شکل 2- کینتیک رشد و تولید آنزیم پولولاناز Halorubrum sp. strain Ha25 در محیط پایه. نتایج نشان داده شده میانگین 3 بار تکرار هستند.

جدول 1- ویژگیهای افتراقی سویه -Ha251 با Halorubrum chaoviator Halo-GT -2، Halorubrum ezzemoulense 5.1T -3  و Halorubrum distributum JCM 9100T -4

ویژگی

1

2

3

4

شکل ظاهری

چند شکلی

چند شکلی میله­ای

چند شکلی

چند شکلی میله­ای

نیازمندی به Mg2+

100-200mM

50mM

+

+

محدوده دمایی رشد (°C)

50-25

50-28

50-22

50-26

احیای نیترات

+

-

+

+

هیدرولیز تویین 80

-

-

-

-

هیدرولیز نشاسته

+

+

-

-

مصرف:

 

+

 

+

 

+

 

-

گلوکز

سوکروز

+

-

+

-

لاکتوز

+

+

+

-

گالاکتوز

+

+

-

-

دمای بهینه (°C)

40

37

40-37

45-37

تولید H2S

-

نا مشخص

نا مشخص

+

محدودهNaCl  برای رشد (M)

 2/5-5/1

5-2

3/4-5/2

 2/5-7/1

G+C content (mol%)

نا مشخص

5/65

9/61

6/63

Data were taken from Kharroub (2006), Mancinelli (2009), Castillo (2007), Cui (2007)

 

ویژگیهای تمایز دهنده سویه Ha25 از دیگر گونه­های نزدیک جنس Halorubrum در جدول 1 آمده است.

اثر دما، pH و غلظتهای مختلف نمک روی رشد و تولید پولولاناز: تولید آنزیم با میزان رشد همراه بوده و در میانه فاز سکون به بیشینه خود ­رسید. پیوستگی بین رشد و تولید آنزیم در شکل 2 نشان داده شده است. همان طور که در شکل دیده می­شود، تولید آنزیم با رشد سویه شروع شده و زمانی که رشد به بیشترین میزان خود می­رسد، تولید آنزیم نیز در بیشترین مقدار خود است. با وارد شدن سلولها به فاز مرگ، تولید آنزیم نیز کاهش پیدا می­کند. رشد و تولید آنزیم در گستره دمایی 50- 25 درجه سانتی­گراد صورت گرفته و بیشترین تولید )  U ml-124/0±  56( در دمای 40 درجه سانتی­گراد دیده شد (شکل.3. الف). رشد سلولی و ترشح پولولاناز در گستره pH بین 0/6 تا 0/9 بوده و بیشترین فعالیت پولولیتیک معادل  U ml-1 4/4 ± 2/55 در pH 0/7 مشاهده گردید (شکل.3.ب). بیشترین میزان تولید آنزیم در غلظت 5/3 مولار از NaCl معادل U ml-1 4/4 ± 2/83 تعیین شد (شکل.3.پ). رشد و تولید آنزیم در نبود یونهای منیزیم مشاهده نشد و بیشترین میزان تولید پولولاناز ( U ml-132/0 ±4/53) در غلظت 1/0 مولار از MgCl2 تعیین شد (شکل.3.ت). این سویه قادر به تولید پولولاناز در حضور نمک NaCl بود. با جایگزینی نمک NaCl با نمکهای سدیم نیترات و سدیم استات رشد سویه بدون تولید آنزیم صورت گرفت. با جایگزینی نمک NaCl با KCl رشد و تولید آنزیم مشاهده نشد (داده­ها نشان داده نشده­اند).

شکل.3. (الف):

 

شکل .3 .(ب):

 

شکل .3.(پ) :

 

شکل .3. (ت) :

 

شکل.3. اثر دما، pH و غلظتهای مختلف نمک روی رشد وتولید پولولاناز توسط Halorubrum sp. strain Ha25.     الف) اثر دما روی رشد و تولید آنزیم       ب) اثر pH روی رشد و تولید آنزیم      پ) اثر غلظتهای مختلف NaCl روی رشد و تولید آنزیم    ت) اثر غلظتهای مختلف MgCl2 روی رشد و تولید آنزیم

اثر منابع کربن و نیتروژن روی رشد و تولید پولولاناز: بیشینه رشد وتولید آنزیم به ترتیب در حضور نشاسته و مالتوز به عنوان تنها منابع کربن مشاهده شد. تولید آنزیم در محیطهای کشت حاوی منو، دی و پلی ساکاریدهای بررسی شده دیده شد. تولید پولولاناز در محیط حاوی مالتوز، القاء شد ( U ml-15/80)، در حالی که گلوکز به طور کامل تولید آنزیم را در محیط کشت مهار کرد. در حضور دکسترین، نشاسته و پولولان به ترتیب U ml-1 3/26، 5/24 و 2/22 تولید آنزیم مشاهده شد که در این میان نشاسته زی­توده بیشتری تولید کرد. بیشترین تولید آنزیم (U ml-1 9/59) در غلظت w/ v)) 5 درصد نشاسته به دست آمد. با افزایش غلظت نشاسته، تولید زی­توده کاهش پیدا کرد. تولید آنزیم بر روی ترکیب پپتون گوشت به همراه عصاره گوشت به عنوان منبع نیتروژن، به میزان     U ml-1 8/1  ±5/118 مشاهده شد، با این وجود استفاده از پپتون گوشت به تنهاییU ml-1)  3/0  ± 9/115 (اختلاف زیادی را با آن نشان نمی­دهد. میزان رشد روی منابع معدنی نیتروژن­، بسیار کمتر از منابع آلی آن بود. جدول 2 میزان رشد و تولید آنزیم پولولاناز را در روی منابع کربن و نیتروژن متفاوت نشان می­دهد.

 

 

جدول 2- اثر منابع مختلف کربن و نیتروژن روی رشد و تولید آنزیم پولولاناز

منبع غذایی (w/v)

میزان رشد ( (OD 600 nm

میزان فعالیت (U ml-1)

تولید پولولاناز

 

(U OD-1 600 nm)

گلوکز

2/3

0 ± 0

0

فروکتوز

5/3

0 ± 0

0

سوکروز

53/2

3/0 ± 6/6

6/2

لاکتوز

23/2

1/0 ± 5/7

4/3

مالتوز

9/2

4/0± 5/80

5/27

دکسترین

4/2

4/1 ± 3/26

11

پولولان

1/2

 1 ± 2/22 

6/10

نشاسته 5/0%

1

4/0± 8/17

8/17

نشاسته 1%

2/3

8/0± 5/24

7/7

نشاسته 2%

1

7/0 ± 35

35

نشاسته 3%

1

6/0 ± 5/41

5/41

نشاسته 4%

1

2/1 ± 42/42

2/42

نشاسته 5%

8/0

9/2± 5/59

67

عصاره مخمر

3/0

 2/0 ± 8/35

7/137

عصاره گوشت

1

 2/0 ± 3/91

3/91

پپتون

1

3/0 ±  116

116

عصاره گوشت و پپتون

1

8/1 ± 4/118

4/118

عصاره مخمر و پپتون

1/1

1/1± 4/94

  8/82

کلرید آمونیوم

0

0

0

سولفات آمونیوم

0

0

0

نیترات آمونیوم

0

0

0

نیترات سدیم

0

0

.

درصد های مشخصی از منابع مختلف کربن و نیتروژن ذکر شده در جدول، جایگزین این منابع در محیط کشت پایه شده اند. داده­ها به صورت میانگین سه بار تکرار آزمایش ± انحراف معیار نشان داده شده­اند. درصد تمام منابع غذایی جز مواردی که در جدول ذکر شده است، به میزان (w/v) 1% بوده است.

 


تخلیص نسبی آنزیم پولولاناز: پولولاناز خارج سلولی از محیطهای فاز سکون آرکی با رسوب­دهی اتانولی و کروماتوگرافی فیلتراسیون ژلی به طور نسبی خالص­سازی شد. نتایج تخلیص پولولاناز در جدول 3 خلاصه شده است. یک پیک فعالیت پولولیتیک از ستون سفادکس G-100 شسته شد. تخلیص نسبی آنزیم نیز با استفاده از SDS-PAGE ثابت شد (نتایج نشان داده نشده­اند).

اثر عوامل مختلف روی فعالیت پولولاناز تخلیص شده نسبی: تأثیر عوامل مختلف روی فعالیت آنزیم در شکل 4 نشان داده شده است. آنزیم پولولاناز در pH های خنثی تا کمی قلیایی فعالیت بیشتری را نشان داد. فعالیت آنزیم در 0/8 pH به عنوان pH بهینه معادل 100 درصد در نظر گرفته شد. فعالیت پولولیتیک در pH های اسیدی 0/5 و 0/6 و pH قلیایی 0/9 به ترتیب به میزان 5/83 درصد و 5/50 درصد و 6/67 درصد کاهش یافت ( شکل .4. الف).

 

 

جدول 3- خلاصه تخلیص نسبی پولولاناز از مایع­رویی کشتهای Halorubrum sp. سویه Ha25.

 

مایع رویی محیط کشت

رسوب دهی اتانولی

محصول کروماتوگرافی

مقدار پروتئین تام (gµ)

2600

304

4/8

فعالیت آنزیمی (U)

4000

546

8/40

فعالیت ویژه (U mg-1)

1538

1820

2/4851

افزایش فعالیت

1

 18/1

51/3

 

اثر دما روی فعالیت پولولاناز Halorubrum sp. سویه Ha25 در شکل 4. ب نمایش داده شده است. بیشینه فعالیت پولولاناز در50 درجه سانتی­گراد بوده، و آنزیم خالص شده در دماهای 25، 35 و 45 درجه سانتی­گراد به ترتیب 15 درصد، 28 درصد و 75 درصد از فعالیت خود را حفظ کرد.

اثر غلظتهای مختلف NaCl روی فعالیت پولولاناز در شکل .4. پ نشان داده شده است. آنزیم در گستره غلظتهای 0/5-0/0 مولار NaCl فعال بوده و بیشینه فعالیت آن در غلظت 0/3 مولار NaCl مشاهده شد. در دو غلظت 0/0 و 0/5 مولار NaCl، فعالیت آنزیمی به ترتیب حدود 6 و 30 درصد فعالیت اولیه آنزیم بود.

در شکل 4. ت، اثر دماهای مختلف روی فعالیت پولولاناز در غلظتهای مختلف NaCl­، نشان داده شده است. با افزایش غلظت نمک، اثر دما بر فعالیت پولولاناز خالص شده نسبی مشهودتر است.

شکل .4.(الف):

 

شکل.4.(ب):

 

شکل.4.(پ):

 

شکل .4.(ت):

 

شکل  4- اثر عوامل مختلف روی فعالیت آنزیم پولولاناز       الف) اثر pH روی فعالیت پولولاناز در Halorubrum sp. سویه Ha25.     فعالیت آنزیمی توسط سنجش استاندارد با استفاده از بافرهای مختلف اندازه­گیری شد. فعالیت به صورت نسبی گزارش شده است و بیشینه فعالیت در 0/8  pH­، 100% در نظر گرفته شده است.     ب) اثر دما روی فعالیت پولولاناز خالص شده نسبی.  فعالیت به صورت نسبی گزارش شده است و بیشینه فعالیت در °C50 ، 100% در نظر گرفته شده است.       پ) اثر غلظتهای مختلف NaCl روی فعالیت آنزیم خالص شده نسبی. فعالیت برحسب سنجش استاندارد با غلظتهای NaCl از 0/0 تا 0/5 مولار اندازه­گیری شده است.        ت) اثر دماهای مختلف روی فعالیت پولولاناز خالص شده نسبی در غلظتهای مختلف NaCl. فعالیت بر حسب سنجش استاندارد تعیین شده است.

 

محصولات واکنش آنزیمی پولولاناز تخلیص شده نسبی: پولولاناز، پولولان و نشاسته محلول را به مالتوتریوز و مالتواولیگوساکاریدهای بزرگتر می­شکند (شکل 5). همچنان که در شکل دیده می­شود، آنزیم قادر به هیدرولیز مالتوتریوز نیست.

 

3

2

1

S

 

 

 

 

 

 

S

شکل 5- الگوی فعالیت پولولاناز روی سوبستراهای مختلف. محصولات واکنش آنزیمی روی پولولان (خط 1)، نشاسته محلول (خط 2)، و مالتوتریوز (خط 3) با استفاده از TLC مشخص شده­اند. خط S نشانگر یک مخلوط استاندارد مالتواولیگوساکاریدها با گستره­ای از گلوکز 1 Gتا مالتوهپتائوز 7G است.

بحث

میکروارگانیسم­های نمک دوست افراطی، نمک دوست نسبی و تحمل­کننده نمک اهمیت زیادی در زیست­فن­آوری دارند و کاربردهای آنها روز بروز در حال افزایش است. با توجه به اهمیت آنزیمهای هیدرولازی تولید شده توسط نمک­دوست­ها، تلاشهای متعددی در جهت جداسازی و شناسایی این آنزیمها صورت گرفته است (1 و 2). در این پژوهش، مشخص شد که تولید پولولاناز توسط سویه Ha25 در طول فاز لگاریتمی شروع شده و در فاز سکون، در چهارمین روز کشت، به بیشینه خود می­رسد. سویه Ha25 قادر به تولید پولولاناز در محیط کشتهایی با منابع کربن متنوع است. آنچنان که در نتایج نشان داده شد، مالتوز بهترین و گلوکز نامناسب­ترین منابع کربن برای تولید آنزیم هستند. ترشح آنزیم سویه Ha25 در حضور مالتوز القاء شده و این نمایانگر طبیعت القاءیی آنزیم است، در حالی که تولید آنزیم در هنگام رشد در محیط حاوی گلوکز و فروکتوز به عنوان تنها منبع کربن به شدت کاهش می­یابد. مهار تولید آنزیم توسط گلوکز و سایر قندهای ساده در تولید پولولاناز و آمیلاز درhalobius OR1 Micrococcus، Thermoanaerbacter thermohydrosulfuricus وBacillus cereus var. mycoide  نیز گزارش شده است، با اینکه این میکروارگانیسم­ها رشد بسیار خوبی روی این منابع کربنی دارند (25، 28 و 29). از طرفی القاءی بیان پولولاناز توسط مالتوز در مورد پولولاناز باکتری Rhodothermus marinus نیز گزارش شده است. همچنان که در این پژوهش مشاهده شد، مالتوز در hydrothermalis Thermus، T.profundus،thermosulfurogenes  Clostridium و C. thermocellum نیز القاءگر تولید آمیلاز و پولولاناز است. منابع کربنی مانند دکسترین، نشاسته و پولولان نیز تولید این آنزیم را القاء می­کنند که مشابه این نتایج در مورد تولید پولولاناز   cereus FDTA13  B.نیز به دست آمده است (14، 25، 28، 36 و 37).

در میان منابع نیتروژن بررسی شده، ترکیب پپتون گوشت و عصاره گوشت ترشح پولولاناز را افزایش می­دهند. این منابع به عنوان بهترین منبع نیتروژن برای ترشح پولولاناز در B. cereus var mycoide گزارش شده است و همچنین کاهش رشد و تولید در حضور منابع نیتروژن معدنی در سویه Ha25 مشابه B.cereus FDTA13 و Chromohalobacter sp. TVSP 101 است. میزان نمک NaCl در محیط کشت به طور محسوسی ترشح پولولاناز را تحت تأثیر قرار می­دهد. این سویه بیشینه تولید آنزیم را در محیط حاوی 5/3 مولار  NaClنشان داد، در حالی که توانایی تولید پولولاناز در حضور سایر نمکها را نشان نداد (22، 33 و 36).

فعالیت بیشینه آنزیم در غلظت 3 مولار  NaClدر دمای 50 درجه سانتی­گراد و 0/8  pH مشاهده شد. پولولاناز در pH­ های بالا فعالیت بیشتری را نشان داد ولی فعالیت پولولیتیک در0/9 pH به شدت کاهش یافته طوری که تنها 32 درصد فعالیت اولیه آن باقی ماند (شکل 2). در دماهای بالاتر و پایین­تر (25 و 55 درجه سانتی گراد)، به ترتیب 85 درصد و 33 درصد کاهش فعالیت آنزیم ردیابی شد. رفتار آمیلازهای Natronococcus sp، Hfx. Mediterranei و پولولاناز Thermoanaerbacter thermohydrosulfuricus نیز در برابر عامل دما مشابه است (21، 25 و 32).

فعالیت آنزمی پولولاناز با افزایش دما و غلظت NaCl افزایش می­یابد، این رفتار در آمیلازهای Micrococcus sp. و Halobacterium sp. نیز مشاهده شده است. پولولاناز خالص شده از Halorubrum sp. سویه Ha25، پولولان و نشاسته محلول را به مالتوتریوز به عنوان محصول اصلی هیدرولیز می­کند. بنابراین این آنزیم یک آمیلوپولولاناز است که توانایی شکستن پیوندهای (4-1( α و (6- 1( α را داراست. تاکنون تعداد اندکی از گلیکوزیل هیدرولازهایی که از نشاسته مالتوتریوز تولید می­کنند، شناخته شده­اند که آنزیمهای Natronococcus sp. Ah-36،  Streptomyces griseus NA-468، subtilis  B.و
 M. imperial از این قبیل هستند (13، 20 و 29).

نتایج مطالعه حاضر نشان می­دهد که سویه Ha25 منبع بالقوه­ای برای تولید پولولاناز نمک دوست افراطی و گرمادوست است، بنابراین آنزیم تولید شده در شرایط سخت چند عاملی مانند دمای بالا، شوری بالا و آب فعال کم می­تواند از دیدگاه زیست­فن­آوری و تجاری ارزش داشته باشد.

  1. باباولیان  ح، آموزگار م ح، پوربابایی ا ع (1388) شناسایی و تعیین خصوصیات باکتری­های نمک­دوست تولید کننده­ی آنزیم­های هیدرولیتیک جداشده از دریاچه نمک آران و بیدگل. مجله زیست شناسی ایران، جلد 22، شماره 1، 45- 24
  2. زنجیربند م، کسری کرمانشاهی ر، گلبانگ ن (1388) جداسازی باکتریهای نمک دوست نسبی تولید کننده آنزیمهای هیدرولازخارج سلولی و تحمل کننده نمک و بررسی اثر غلظت نمک سدیم کلراید بر تولید آنزیم. مجله زیست شناسی ایران، جلد 22، شماره 3، 497-490
    1. Amoozegar M.A., Malekzadeh F., Malik K. (2003) Production of amylase by newly isolated moderate halophile, Halobacillus sp. strain MA-2. Journal of Microbiological Methods, 52: 353-359.
    2. Boone D.R., Castenhoiz R.W., Garrity G.M., )2001( Bergey’s manual of systematic bacteriology: The Archaea and the deeply branching and phototrophic bacteria, 294–334.
    3. Bradford M.M., )1976( A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry, 72(1-2): 248-254.

 

6. Carol D. Litchfield, (2011) Potential for industrial products  from the halophilic Archaea, Journal of industrial microbiology & biotechnology, 38:1635-1647.

7. Carroll J.O., Boyce C.O.L., Wong T.M., Starace C.A., (1987) Bread antistaling method. Patent application US4654216.

8. Crabb W.D., Mitchinson C., (1997) Enzymes involved in the processing of starch to sugars. Trends in Biotechnology, 15:349-352.

9. Demirjian D. C., Moris- Varas F., Cassidy C. S., (2001) Enzymes from extremophiles, Current Opinion in Chemical Biology, 5:144-151.

10. Dussault  H., ) 1955( An improved technique for staining red halophilic bacteria. Journal of Bacteriology, 70 (4): p. 484.

11. Dyall-Smith M, (2009) The Halohandbook : Protocols for halobacterial genetics,  P. 69.

12. Forbes B., Sahm D., Weissfeld A., (2007( Bailey and Scott’s Diagnostic Microbiology. 12th Edn., p. 8089.

13. Good W.A., Hartman P.A., (1970) Properties of the Amylase from Halobacterium halobium, Journal of bacteriology, 104: 601-603.

14. Gomes I., Gomes J., Steiner W., (2003) Highly thermostable amylase and pullulanase of the extreme thermophilic eubacterium Rhodothermus marinus: production and partial characterization, Bioresource Technology, 90:207-214.

15. Grant W., et al., )2001( Class III. Halobacteria class. nov. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology,: p. 294-301.

16. Gutiérrez and González C., )1972 (Method for simultaneous detection of proteinase and esterase activities in extremely halophilic bacteria. Applied Microbiology, 24(3): p. 516.

17. Henrissat B., (1991) A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochemical Journal, 280:309-316.

18. Hutcheon, G.W., Vasisht N., Bolhuis A., (2005) Characterisation of a highly stable amylase from the halophilic archaeon Haloarcula hispanica. Extremophiles. 9(6): p. 487-495.

19. Kelkar, H.S., Deshpande, M., (1993) Purification and characterization of a pullulan-hydrolysing  glucoamylase  from Sclerotium rolfsii. Starch/Sta¨rke, 45:361-368.

20. Kim O.S., Cho Y.J., Lee K., Yoon  S.H., Kim  M., Na  H., Park S.C., Jeon Y.S., Lee  J.H., Yi  H., Won S., Chun J. (2012) Introducing EzTaxon-e: a prokaryotic 16S rRNA Gene sequence database with phylotypes that represent uncultured species. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 62:716–721.

21. Kobayashi T, Kanai H, Hayashi T, Akiba T, Akaboshi R, Horikoshi K , (1992) Haloalkaliphilic maltotriose-forming amylase from  the  archaebacterium  Natronococcus  sp.  Strain  Ah-36 Journal of bacteriology, 174:3439-3444.

22. Madern D., Ebel C., Zaccai G., (2000) Halophilic adaption of enzymes. Extremophiles, 4:91-98.

23. Makhdoumi Kakhki A., Amoozegar M. A., Mahmodi Khaledi E., (2011) Diversity of hydrolytic enzymes in haloarchaeal strains isolated from salt lake, International Journal of Environmental Science and Technology, 8(4): 705-714.

24. Mancinelli R.L., et al. (2009) Halorubrum chaoviator sp. nov., a haloarchaeon isolated from sea salt Baja California, Mexico,Western Australia and Naxos, Greece, international Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 59:1908-1913.   

25. Melasneimi H, (1987) Effect of  Carbon Source on Production of  Thermostable a-Amylase, Pullulanase and α-Glucosidase by Clostridium thermohydrosulfuricum, Journal of General Microbiology, 133: 883-890.

26. Miller G., (1959) Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars. Analytical chemistry, 31:426-8.

27. Mohaparta B.R., Baberjee  U.C., Bapuji  M., )1998) Characterization of a fungal amylase from Mucor sp. associated  with  the  marine  sponge  Spirastrella  sp. Journal of biotechnology, 60:113-117.

28. Nair S. U., Singhal R. S., Kamat M. Y., (2007) Induction of pullulanase production in Bacillus cereus FDTA-13, Bioresource Technology, 98: 856-859.

29. Onishi H., (1972) Halophilic Amylase from a Moderately Halophilic Micrococcus, Journal of bacteriology, 109: 570-574.

30. Oren A., Ventosa A.­, and Grant W.­, (1997( Proposed minimal standards for description of new taxa in the order Halobacteriales. International journal of systematic bacteriology, 47: p. 233.

31. Pastuska  G. (1961) Untersuchungen uber die qualitative und quantitative Bestimmung der Zucker mit Hilfe der Kiesel-gelschicht-Chromatographie. Fresenius' Zeitschrift für analytische Chemie, 179: 427-429.

32. Pérez-Pomares F., Bautista V., Ferrer J., Pire C., Marhuenda-Egea F.C., Bonete M.J., (2003) Amylase activity from the halophilic archaeon Haloferax mediterranei. Extremophile 7:299-306.

33. Prakash B., Vidyasagar M., Madhukumar M.S., Muralikrishna G., Sreeramulu K., (2009) Production, purification, and characterization of two extremely halotolerant,thermostable, and alkali-stable a-amylases from Chromohalobacter sp. TVSP 101, Process Biochemistry, 44:210-215.

34. Rohban R., Amoozegar M. A., Ventosa A., (2009) Screening and isolation of halophilic bacteria producing extracellular hydrolyses from Howz Soltan Lake, Iran. Journal of industrial microbiology & biotechnology, 36: 333-340.

35. Shafiei M., Ziaee A., Amoozegar,  M. A., (2011)  Purification and characterization of an organic-solvent-tolerant halophilic a-amylase from the moderately halophilic Nesterenkonia sp. strain F. Journal of industrial microbiology & biotechnology, 38:275-281.

36. Subhash U. Nair, Rekha S. Singhal, Madhusudan Y. Kamat (2006) Enhanced Production of  Thermostable Pullulanase Type 1 Using Bacillus cereus FDTA 13 and Its Mutant, Food technology and Biotechnology, 44:275–282.

37. Sudharhsan S., Senthilkumar S., (2007) Physical and nutritional factors affecting the production of amylase from species of bacillus isolated from spoiled food waste, African Journal of Biotechnology. 6: 430-435.

38. Takata H., Kuriki T., Okada  S., Takesada Y., Iizuka  M., Imanaka,­T., (1992) Action of neopullulanase. Neopullulanase catalyzes both hydrolysis and transglycosylation at alpha-(14) and alpha-(16) glucosidic linkages Journal of Biological Chemistry, 267: 18447-18452.

39. Wainø M., Ingvorsen K., (2003) Production of β-xylanase and β-xylosidase by the extremely halophilic archaeon Halorhabdus utahensis, Extremophiles, 7: 87-93.