نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 موسسه تحقیقات و آموزش توسعه نیشکر

2 استاد-دانشگاه شهید چمران اهواز

3 استاد- دانشگاه شهید چمران اهواز

4 دانشگاه شهید چمران اهواز

چکیده

.
چکیده:
در تجزیه لیگنین، مجموعه¬ای از آنزیم¬ها تحت عنوان لیگنیناز نقش دارند. لاکاز به علت ویژگی¬های خاص خود در بین آنزیم¬های تجزیه¬کننده لیگنین از اهمیت خاصی برخوردار است. از ویژگی¬های لاکاز،اکسیداسیون انواع متعدد سوبستراها، تحمل گرمایی بالا، داشتن pH ایزوالکتریک اسیدی است. شناسایی میکروارگانسیم¬های جدید با قدرت تولید و ترشح بالاتر این آنزیم صنعتی از اهمیت انکارناپذیری برخوردار است. لذا در این تحقیق جداسازی، غربالگری و شناسایی قارچ¬های تولیدکننده لاکاز از باگاس و ریزوسفر نیشکر انجام شد. به منظور غربالگری سویه¬های مولد لاکاز از محیط کشت MEA حاوی 1/0 گرم در لیتر ABTS و 5/0 میلی¬مول در لیتر گایاکل استفاده شد. برای سنجش میزان کمی آنزیم لاکاز از روش نیکو پاولا استفاده شد. در این تحقیق از بین 22 قارچ غربالگری شده، دو جدایه Alternaria alternata و Retroconis sp با بیشترین میزان تولیدآنزیم لاکاز شناسایی شدند. دو جدایه با استفاده از تکثیرPCR و تعیین توالی ناحیه ITS DNA ریبوزومی و همچنین خصوصیات مورفولوژیک شناسایی شدند. میزان تولید لاکاز جدایه¬ها در شرایط هوادهی و سکون بررسی شد. مطالعه بر روی این جدایه¬ها نشان داد که شرایط هوادهی و سکون اثرات متفاوتی در میزان تولید لاکاز ازاین جدایه¬ها داشت.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Isolation and identification of two laccase producer fungi from bagass and sugarcane rhizosphere

نویسندگان [English]

  • Fatemeh Sheikhi 1
  • Mohammad Roayaei Ardakani 2
  • Naimeh Enayatzamir 3
  • Gholamreza Ghezelbash 4

چکیده [English]

Abstract
Complex of enzymes in the name of Ligninase are involved in lignin degradation. Special properties of Laccase among the lignin degradation enzymes make them more important. Oxidation of wide range of substrates, high heat tolerance and acidic isoelectric pH are main properties of laccase. Identification of new microorganism with higher production and secretion laccase is very valuable. In this research, laccase producing fungi was isolated, screened and identified from bagass and sugarcane rhizosphere. In order to screen laccase producing strains malt extract agar medium containing 0.1gl-1 ABTS or 0.5mMl-1 Guaiacol was used. Laccase activity was determined as described by Niku-Paavola et al. In this study, among 22 fungi screened, Alternaria alternata and Retroconis sp isolates were identified with the highest laccase production. Two species were identified using PCR amplification and sequencing of the internal transcribed spacer ‘ITS’regions of the ribosomal DNA and by basic morphology. In this research laccase activity has been determined in agitation and stationary state. These results showed that agitation and stationary conditions had different effects on laccase production rate of these isolates.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Laccase"
  • Bagass"
  • sugarcane rhizosphere"
  • Alternaria alternata & Retroconis sp

جداسازی وشناسایی دو قارچ تولیدکننده آنزیم لاکاز از باگاس و ریزوسفر نیشکر

فاطمه شیخی1*، محمد رعایایی اردکانی1، نعیمه عنایتی ضمیر2 و غلامرضا قزلباش1

1 اهواز، دانشگاه شهید چمران، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، بخش میکروبیولوژی

2 اهواز، دانشگاه شهیدچمران، دانشکده کشاورزی، گروه خاکشناسی، بخش بیولوژی خاک

تاریخ دریافت: 30/2/91               تاریخ پذیرش: 10/11/91 

چکیده

در تجزیه لیگنین، مجموعه­ای از آنزیمها تحت عنوان لیگنیناز نقش دارند. لاکاز به علت ویژگیهای خاص خود در بین آنزیمهای تجزیه­کننده لیگنین از اهمیت خاصی برخوردار است. از ویژگیهای لاکاز، اکسیداسیون انواع متعدد سوبستراها، تحمل گرمایی بالا، داشتن pH ایزوالکتریک اسیدی است. شناسایی میکروارگانسیم­های جدید با قدرت تولید و ترشح بالاتر این آنزیم صنعتی از اهمیت انکارناپذیری برخوردار است. لذا در این تحقیق جداسازی، غربالگری و شناسایی قارچهای تولیدکننده لاکاز از باگاس و ریزوسفر نیشکر انجام شد. به منظور غربالگری سویه­های مولد لاکاز از محیط کشت MEA حاوی 1/0 گرم در لیتر ABTS و 5/0 میلی­مول در لیتر گایاکل استفاده شد. برای سنجش میزان کمی آنزیم لاکاز از روش نیکو پاولا استفاده شد. در این تحقیق از بین 22 قارچ غربالگری شده، دو جدایه Alternaria alternata و Retroconis sp با بیشترین میزان تولیدآنزیم لاکاز شناسایی شدند. دو جدایه با استفاده از تکثیرPCR  و تعیین توالی ناحیه ITS، DNA ریبوزومی و همچنین خصوصیات مورفولوژیک شناسایی شدند. میزان تولید لاکاز جدایه­ها در شرایط هوادهی و سکون بررسی شد. مطالعه بر روی این جدایه­ها نشان داد که شرایط هوادهی و سکون اثرات متفاوتی در میزان تولید لاکاز ازاین جدایه­ها داشت.

واژه­های کلیدی: لاکاز، باگاس، ریزوسفرنیشکر، Alternaria alternata و Retroconis sp 

* نویسنده مسئول، تلفن: 09124636142 ، پست الکترونیکی: fatemehsheikhi87@yahoo.com

مقدمه

 

یکی از ترکیبات عمده زیست توده، لیگنوسلولز می­باشد که تقریباً نیمی از مواد حاصل از فرآیند فتوسنتز را شامل می شود(14). لیگنوسلولز از سه نوع پلیمر سلولز، همی سلولز و لیگنین تشکیل شده که از لحاظ شیمیایی توسط پیوندهای غیرکووالانسی و اتصالات عرضی کووالانسی به یکدیگر متصل شده­اند(7). برخی میکروارگانیسم­ها خصوصاً انواع قارچها، سیستمهای آنزیمی خاصی را توسعه داده­اند تا توانایی تخریب لیگنین را به دست آورند (2 و 9). این قارچها را بر اساس ریخت­پوسیدگی به سه نوع قارچهای پوسیدگی سفید، پوسیدگی قهوه­ای و پوسیدگی نرم تقسیم می­کنند. واکنشهایی که توسط قارچها، بالاخص قارچهای پوسیدگی سفید برای تأثیر بر لیگنین انجام می­دهند، غالباً توسط مجموعه­ای از آنزیمهای پراکسیداز خارج سلولی تحت عنوان لیگنیناز انجام می­گیرد که شامل لاکاز (Lac:EC 1.10.3.2)، لیگنین­پراکسیداز (Lip:EC 1.11.1.14)، منگنزپراکسیداز(Mnp:EC1.11.1.13) و … می­باشند. از بین آنزیمهای لیگنولیتیک، فنل­اکسیدازها با نام لاکاز و پراکسیدازها مانند لیگنین­پراکسیداز و منگنزپراکسیداز نقش اساسی در تجزیه لیگنین دارند (11). لاکاز (بنزودیول :اکسیژن اکسیدوردکتاز EC:1.10.3.2) گروهی از آنزیمها هستند که اکسیدازهای مس آبی نامیده می­شوند (19). لاکاز از اکسیژن به عنوان پذیرنده الکترون استفاده کرده و کوینون تولید می­کند و به این دلیل جزء خانواده فنل اکسیداز می­باشد(16). این آنزیم طیف وسیعی از سوبستراهای آلی شامل مونو، دی و پلی­فنل­ها، آمینهای آروماتیک، اسیدهای کربوکسیلیک و نیز سوبستراهای غیرفنلی و غیرآلی را اکسید می­کند. البته تمایل آن به اکسیدکردن پارا دی­فنول بیشتر است. این آنزیم به علت قدرت اکسیدکنندگی ترکیبات فنلی و غیرفنلی ترکیبات لیگنین می­تواند ترکیبات مشابه که در طبیعت بسیار سخت تجزیه­پذیر هستند را نیز تجزیه و در حذف آلاینده­ها نقش داشته باشد. لاکاز درطبیعت به طور وسیع پراکنده می باشد به طوری که در بسیاری از گیاهان آلی، قارچها، باکتریها و حتی در بعضی از حشرات دیده شده است(4). لاکازها درانواع قارچها از جمله آسکومیست­ها، دترومیست­ها و به ویژه در تعدادی از بازدیومیست­ها تحت عنوان قارچهای پوسیدگی سفید به وفور یافت می گردد. از تولیدکنندگان لاکاز از قارچهای آسکومیکوتا می­توان به قارچهای Gaeumannomyces graminis Melanocarps albomyces, Monocillium ,Neurospora crassa, Podospora anserina , Aspergillus, Curvularia  وPenicillium اشاره کرد(4). با توجه به اهمیتی که آنزیم لاکاز در بیوتکنولوژی و کاربردهای فراوان آن در صنعت دارد. تحقیقات بسیار گسترده­ایی در حال حاضر در سراسر دنیا برای جداسازی انواع میکروارگانیسم­های تولید کننده خوب این آنزیم و استفاده از آنها در صنعت انجام می­شود. در ایران نیز صفری و همکاران (2006) بررسی مقایسه­ایی در رابطه با تولید لاکاز خارج سلولی تحت شرایط مختلف داشتند، در این مطالعه تولید لاکاز از انواع قارچهای بازدیومیست و دترومیست در شرایط مختلف محیط کشت بررسی گردیده است(15)، اما تاکنون هیچ تحقیقی مبنی بر جداسازی قارچهای مولد لاکاز از ایران وجود نداشته است. لذا این پژوهش در راستای جداسازی قارچهای مولد لاکاز از زیست بوم ایران و تعیین بهترین سویه تولید کننده آن انجام شد .همچنین در این تحقیق اثر هوادهی بر میزان تولید لاکاز از جدایه های برتر مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روشها

جداسازی قارچها: برای جداسازی قارچهای تولید کننده لاکاز، نمونه­برداری هدفمند از مناطق مستعد صورت گرفت. این مناطق شامل مزارع نیشکر واقع در استان خوزستان، نمونه­هایی از باگاس، فاضلاب کارخانه­های کاغذسازی، خاک مناطق جنگلی، قطعات چوب و درختان در حال پوسیده شدن بودند. تعداد90 نمونه از مناطق مختلف به صورت تصادفی انتخاب شدند. نمونه برداری خاک ازعمق 20-15 سانتیمتری توسط وسیله­ای به نام اوگر صورت گرفت. نمونه­های فاضلاب از سه قسمت ابتدای فاضلاب، قسمت میانی و خروجی نهایی فاضلاب تهیه شدند. یک گرم از نمونه­های جامد و یک میلی­لیتر از نمونه­های مایع به 10 میلی­لیتر آب مقطر استریل اضافه و در انکوباتور شیکردار به مدت 2 ساعت در دمای30 درجه، 130 دور در دقیقه هوادهی شدند و بعد از سکون به مدت 30 دقیقه، از مایع رویی به نسبت 1 به 10 به محیط کشت غنی­کننده تلقیح شدند، سپس مدت 1 روز در انکوباتور شیکردار(30 درجه و 130 دور در دقیقه)گرماگذاری شدند و بعد از آنها به میزان 100 میکرولیتر به محیط کشت (MEA) حاوی دو آنتی­بیوتیک کلروتتراسیکلین و کلرآمفنیکل (Sigma آلمان) تلقیح شد. بعد از یک هفته انکوباسیون پلیتها در دمای 33-28 درجه سانتی گراد، پرگنه­های قارچی رشد کرده قابل رؤیت شدند، سپس با کشت متوالی، کشت خالص هر قارچ به دست آمد. به منظور غربالگری قارچهای تولید کننده لاکاز، از محیط کشت (MEA) به همراه نشانگر 1/0 گرم در لیتر ABTS  یا 02/0 درصد گایاکل (Sigma آلمان) استفاده شد(شکل1). pH محیطهای کشت برابر5/4 تنظیم گردید (8 و 15). قارچ Trametes pubecens به عنوان کنترل مثبت و از قارچ Phanerochyte crysosporium به عنوان کنترل منفی استفاده شد.

جدول1- ترکیبات محیط کرک مورد استفاده برای سنجش میزان کمی آنزیم لاکاز

مقدار مورد استفاده در یک لیتر

مواد

10 گرم

گلوکز

2 گرم

تارتارات آمونیوم

1 گرم

پتاسیم دی هیدروژن فسفات

5/0 گرم

سولفات منیزیم آبدار

5/0 گرم

کلرید پتاسیم

1 گرم

عصاره مخمر

150میکرومول

سولفات مس آبدار

ml/l 10

محلول مینرال حاوی 2/ 0گرم در لیتر سولفات آهن،01/0 گرم در لیتر سولفات روی آبدار 001/0 گرم در لیتر کلرید کبالت آبدار،003/0 گرم در لیتر پرمنگنات سدیم

بررسی کمی آنزیم لاکاز جدایه های غربالگری شده: به منظور تولید و سنجش فعالیت آنزیم لاکاز از محیط کرک استفاده شد (جدول 1). pH محیط کشت کرک برابر 5/4 تنظیم شد(15). برای تعیین میزان فعالیت آنزیم لاکاز در هر ایزوله و تعیین بهترین جدایه تولیدکننده آنزیم لاکاز، هر کدام از ایزوله­های خالص­شده در فلاسک ml250 حاوی ml30 محیط کشت کرک کشت داده شد. بدین منظور چهار قرص پنج میلی­متری از حاشیه پرگنه­های هفت تا ده روزه جدایه مولد لاکاز به فلاسکهای ارلن حاوی محیط کشت کرک انتقال داده و فلاسکها به مدت 15روز در دمای 33-28درجه سانتی گراد بر روی شیکر دورانی با سرعت 110 دور در دقیقه قرار داده شدند. همچنین میزان فعالیت آنزیم هریک از جدایه­ها در حالت سکون نیز بررسی شد. لازم به ذکر است مقایسه بین دو حالت سکون و هوادهی در شرایط کاملاً یکسان صورت گرفت، فقط در حالت هوادهی هم زدن محیط کشت با شیکر دورانی برای تحریک تولید لاکاز انجام گرفت و در حالت سکون این فاکتور حذف شد و فلاسکهای محیط کشت در همان دما بدون حرکت قرار گرفتند تا اثر فاکتور هوادهی بر تولید لاکاز مشخص شود. برای سنجش فعالیت، از روز سوم کشت، هر روز یک میلی لیتر از مایع رویی محیط کشت در شرایط آسپتیک برداشته شد و سپس نمونه­ها به مدت 10 دقیقه در 4 درجه سانتی گراد با 10000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند و بعد از ته­نشینی اسپور قارچها، به محلول رویی 1000 واحد آنزیم کاتالاز افزوده و به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد(6). به هنگام سنجش آنزیمی هریک از جدایه­ها به نمونه­ها آنزیم کاتالاز افزوده شد تا احتمال وجود پراکسیدهیدروژن در نمونه مورد آزمایش از بین برود. میزان فعالیت آنزیمی هر سویه با روش سینیتیک و با استفاده از بافر سوکسینات با 5/4pH= به عنوان بافر واکنش، ABTS به عنوان سوبسترا با استفاده از اسپکتروفتومتر ) Spocol 2000 آلمان) در طول موج 436 نانومترسنجیده شد (شکل1). قابل ذکر است که یک واحد فعالیت آنزیم لاکاز برابر است با اکسید شدن یک میکرومول ABTS در هر دقیقه که به صورت U/L بیان می­شود (13). سنجش آنزیمی برای هرنمونه قارچی بیش از 3 بار تکرار شد.

فعالیت آنزیم (U/L)= DAbs./Dt 1/(e d) ضریب رقت

e= 48000 mol-1 cm-1 (ضریب خاموشی)

d=1 cm (قطر کوت)

ضریب رقت =1500/1150 (حجم نمونه رقیق شده/ حجم نهایی)

(U/L)= DAbs./3 min 1/(48000 mol-1 cm-1 1 cm) 1500/1150 106 mmol/mol میزان فعالیت آنزیم)) (13) 

شناسایی قارچها:.خصوصیات مورفولوژیکی تمام قارچها به روش کشت معمول قارچ بر روی پلیت انجام شد و خصوصیات کلنی قارچها به مدت یک هفته به طور روزانه بررسی شد. همچنین خصوصیات میکروسکوپی نیز در این دوره بررسی گردید و برای بررسی دقیق این خصوصیات از روش کشت روی لام استفاده شد. برای شناسایی مولکولی، جدایه­های مورد بررسی در فلاسکهای ارلن مایر حاوی محیط MEB کشت و در شرایط دمایی 25 درجه سانتی گراد به مدت 10-14 روز با سرعت 100 دور در دقیقه گرماگذاری شدند. استخراج DNA طبق روش ویلند انجام شد(17). در این روش حدود 1- 5/0 گرم میسلیوم قارچ بعد ازقرارگرفتن در ازت مایع، با استفاده از هاون چینی به خوبی پودر شد. حدود یک گرم پودر حاصل را به میکروتیوبهای 5/1 میلی لیتری منتقل کرده و 500 میکرولیتر بافر استخراج (SDS 5 درصد 20 میلی لیتر، 500 میلی مولار NaCl، 100 میلی مولارTris-HCl  با 8 pH=، 50 میلی مولار EDTA با 8 pH= و 40 میلی لیتر آب دو بار تقطیر استریل) به آن افزوده شد تا به صورت سوسپانسیون درآید. سپس به مدت 30 دقیقه در حمام آب گرم نگهداری شدند و بعد از این نمونه­ها به مدت 5 دقیقه روی یخ قرار گرفته و هم حجم محتوی میکروتیوبها مخلوط اشباع بافری فنل-کلروفرم-ایزوآمیل الکل (به نسبت 1:24:25) اضافه گردید و پس از به هم زدن به مدت 10 دقیقه با سرعت 10000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. فاز رویی به میکروتیوبهای جدید منتقل و دو تا سه برابر حجم آن کلروفرم-ایزوآمیل الکل (به نسبت 1:24) اضافه گردید. میکروتیوبها پس از هم زدن به مدت 5 دقیقه با سرعت 10000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. فاز رویی به میکروتیوبهای جدید وارد و 4/3 حجم آن، ایزوپروپانول سرد اضافه گردید و به مدت یک ساعت در دمای 20- درجه سانتی گراد قرار گرفتند. سپس به مدت 10 دقیقه با سرعت 6000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. پس از حذف فاز رویی، رسوب DNA با اتانول 70 درصد شستشو و در دمای اتاق نگهداری شد تا خشک شود. پس از خشک شدن کامل، 50 تا 80 میکرولیتر بافر TE (10 میلی مولار Tris-HCl با 8 pH=، یک میلی مولار EDTA با 8 pH=) به آن اضافه گردید(12). بافر حاوی DNA در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری شد. کیفیت DNA نمونه­ها به وسیله الکتروفورز روی ژل آگارز 1 درصد بررسی شد. حضور تک باند شفاف با وزن مولکولی بالا، نشانه DNA سالم و بدون شکستگی تلقی گردید. بررسی میزان و غلظت DNA استخراج شده و خلوص آن از طریق نانودراپ انجام گرفت. میزان خلوص DNA در نمونه­هایی که نسبت جذب آنها در طول موج 260 به 280 نانومتر مناسب در نظر گرفته شد که در محدوده 8/1 تا 2 قرار داشت. جهت انجام آزمایشات مولکولی، غلظت DNA کلیه نمونه­ها در حد ng/µl 25 تنظیم گردید. DNA استخراج شده با واکنش زنجیره ای پلی مراز (PCR) تکثیر شد. آغازگرهای مورد استفاده در این تحقیق دو آغازگر  ITS5&4 بودند(18)(جدول 2). تکثیر DNA در واکنش 25 میکرولیتری شامل 5/2 میکرولیتر بافر PCR 10X، 5/1 میکرولیتر MgCl2 (غلظت نهایی mM 15/0) ، 5/2 میکرولیتر dNTP (غلظت نهاییmM25/0)، 1 میکرولیتر از هر کدام از آغازگرهای رفت و برگشت(غلظت نهاییng 50)، 2 میکرولیتر DNA ژنومی (غلظت نهاییng 5) و 3/0 میکرولیتر آنزیم تک پلیمراز (Unit1)بود و واکنش با استفاده از دستگاه ترموسایکلر (Biorad آمریکا) انجام شد (جدول3). برنامه حرارتی برای واکنش زنجیره­ای پلیمراز شامل مراحل: 1 دقیقه در 94 درجه سانتی گراد ، 30 سیکل با 1 دقیقه در 94 درجه سانتی گراد ، 1 دقیقه در 55 درجه سانتی گراد ، 1 دقیقه در  72 درجه سانتی گراد و مرحله گسترش نهایی با 10 دقیقه در 72 درجه سانتی گراد بود(3). محصول PCR به منظور تعیین ترادف به شرکت ژن فن آوران ارسال گردید. و سپس نتایج حاصل با استفاده از نرم افزار Blast درسایت GeneBank مورد بررسی قرار گرفت.

جدول3 - مواد مورد استفاده در هر واکنش زنجیره ای پلی مراز برای تکثیر جدایه ها

محتوای میکروتیوب

میزان مورد استفاده

آب

14 میکرولیتر

نوکلئوتیدهای تری فسفات (غلظت 25/0میلی مولار)

5/2میکرولیتر

پرایمر رفت (غلظت 50 نانوگرم)

1 میکرولیتر

پرایمر برگشت (غلظت 50 نانوگرم)

1 میکرولیتر

بافر واکنش زنجیره­ای پلیمراز (X10)

5 میکرولیتر

کلرید منیزیم (15/0میلی مولار)

5/1 میکرولیتر

ژنوم (5نانوگرم)

2میکرولیتر

آنزیم تک پلیمراز (U1)

3/0 میکرولیتر

حجم کلی

25میکرولیتر

نتایج 

از بین جدایه­های مختلف قارچی جداسازی شده، 22 جدایه قارچی با تولید هاله در اطراف کلونی قارچ در محیط کشت حاوی نشانگرها غربالگری شدند. 20 جدایه توانایی تغییر رنگ در محیط کشت حاوی گویاکل را از خود نشان دادند و هاله­ایی به رنگ قهوه­ای در اطراف کلنی قارچ ایجاد شد و 18 جدایه هاله سبز رنگ در محیط کشت حاوی ABTS ایجاد کردند.

دو جدایه از بین جدایه های غربالگری شده براساس بیشترین میزان فعالیت آنزیمی بعد از سنجش کمی آنزیم انتخاب شدند. میزان فعالیت آنزیمی دو جدایه برتر در شرایط هوادهی و سکون طی 12 روز در نمودارهای 1 و 2 آورده شده است. بیشترین میزان فعالیت لاکاز جدایه Retroconis sp در شرایط هوادهی U/L 59/24 بود در حالی که بیشترین میزان فعالیت لاکاز جدایه Alternaria alternata در شرایط سکون و به میزانU/L 52/22 به دست آمد. دو جدایه برتر با تولید لاکاز بالا از خاک اطراف ریشه نیشکر مزارع نیشکر هفت تپه و نمونه باگاس جمع­آوری شده از کشت و صنعت دعبل خزاعی جداسازی شدند.

 

                              C                                            B                                               A        

 

شکل 1- تصویرA  : سنجش آنزیمی نمونه قارچی a) نمونه شاهد b) نمونه بعد از اضافه کردن سوبسترا. تصویر  B: تصویر غربالگری قارچها بر روی محیط کشت حاوی ABTS با تولید هاله سبز. رنگ تصویر C: تصویر غربالگری قارچها بر روی محیط کشت حاوی گایاکل با تولید هاله قهوه­ایی

جدول2- آغازگرهای مورد استفاده در واکنش زنجیره ای پلی مراز برای تکثیر جدایه ها

توالی جفت آغازگر ITS5&4

 

ITS5: 5¢-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3¢

ITS4: 5¢-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3¢

 

 

 

نمودار1- نمودار فعالیت آنزیمی جدایه Ht2q  در دو حالت سکون و هوادهی (A)، نمودار2: نمودار فعالیت آنزیمی جدایه B4e در دو حالت سکون و هوادهی(B)

 

                             C                                                        B                                                         A                                   

 

شکل2- تصویر A: تصویر میکروسکوپی جدایه B4e، تصویر B: تصویر جدایه B4e بر روی پلیت، تصویر C: تصویر تصویر جدایه Ht2q بر روی پلیت

 

 

شکل3- الکترفورز محصولات واکنش زنجیره­ای پلیمراز حاصل از تکثیر ژنوم ITS5&4: از سمت چپ نوار L:مارکر یک کیلوباز، B: جدایه B4e(bp560) ، H: جدایه (bp560)Ht2q

نتایج بررسی خصوصیات مورفولوژیکی ازجمله خصوصیات ماکروسکوپی و میکروسکوپی این دو جدایه برتر نشان داد که جدایه B4e، دارای کلنی تیره که سطح آن حالت پنبه­ایی روشن با کنیدیفور و کنیدی تیره، شکل کنیدی بیضوی و یا تخم مرغی شکل، انتهای کندیفور برآمده و ظاهر کلنی به دلیل وجود کنیدی شبکه مانند بود (شکل 2)، جدایه Htq2، دارای کلنی کرم رنگ توده­ای با حاشیه مضرس و فرو رفته در محیط کشت و کنیدی زیر میکروسکوپ نامشخص بود. برای شناسایی مولکولی جدایه ها، استخراج ژنوم قارچها به صورت دستی انجام شد و نتایج حاصل با الکتروفورز ژنوم این جدایه ها تأیید شد. همان طور که انتظار می­رفت کل ژنوم یوکاریوتی سنگین بوده و در بالای ژل قرار گرفت و باندهای حاصل از استخراج ژنوم بالاتر از باند 10 کیلوباز مارکر قرارگرفت. میزان جذب ژنوم استخراج شده از قارچها در طول موجهای 280/260 بین 8/1 تا 2  بود. محصول واکنش PCR بر روی ژل آگارز الکتروفورز گردید که نتایج آن در (شکل3) مشاهده می­شود. نتایج حاصل از تعیین توالی محصول واکنش PCR جدایه های منتخب پس از بررسی با نرم­افزار Blast و توالی تکثیر یافته دو جدایه با بانک ژنی مقایسه شد. سپس توالی قطعه ITS1.5/8S.ITS 2 ژنوم جدایه­Ht2q در بانک ژنی باaccession number JQ414022   و جدایه B4e باaccession number JQ414021 ثبت شدند.

بحث

 برای جداسازی وخالص­سازی جدایه­های قارچی با توجه منابع مورد استفاده از محیط مالت اکسترکت آگار استفاده شد و با توجه به شرایط اسیدی آن، این محیط برای جداسازی قارچهای مولد لاکاز مناسب می­باشد(1). از بین دو ترکیب آروماتیک که برای غربالگری قارچها استفاده شد، روشی که در آن محیط (MEA) حاوی 1/0 گرم ABTS بود، به عنوان بهترین محیط غربالگری انتخاب گردید، ABTS سوبسترای بسیار حساسی برای لاکاز محسوب می­شود و تمامی قارچهای غربالگری شده­ایی که با این روش هاله سبز ایجاد کردند، جزء تولیدکنندگان واقعی لاکاز بودند، زیرا 100 درصد قارچهای غربالگری شده با ABTS به هنگام سنجش میزان کمی آنزیم، علی رغم افزودن آنزیم کاتالاز، فعالیت لاکازی داشتند. در حالی که 22 درصد از قارچهایی که با گایاکل غربالگری شدند در زمان سنجش کمی آنزیم، بعد از افزودن آنزیم کاتالاز توانایی اکسید کردن سوبسترا را از دست دادند و تنها 78 درصد باقیمانده این توانایی را حفظ کردند. در این تحقیق آنزیم کاتالاز به مخلوط واکنش قبل از سنجش کمی اضافه شد تا در صورت تولید آب اکسیژنه (حتی با میزان بسیار اندک) توسط قارچها، این ترکیب از مخلوط واکنش حذف شود. یکی از امتیازات آنزیم لاکاز به عنوان یک آنزیم اکسیداز نسبت به آنزیم منگنز پراکسیداز و دیگر آنزیمهای اکسیدکننده لیگنین، عدم نیاز این آنزیم به اکسیژن نوزاد جهت اکسیداسیون ترکیبات فنلی می­باشد. در این تحقیق برای حذف قارچهایی که مولد دیگر اکسید کننده­ها، از جمله منگنزپراکسیداز بودند آنزیم کاتالاز به محلول سنجش افزوده شد که در نتیجه آن 22درصد از قارچهای غربالگری شده با گایاکل حذف شدند.

در این تحقیق تعیین میزان سوبسترای آروماتیک در محیط کشت به صورت ابتکاری انجام شد و تاکنون هیچ گزارشی برای غربالگری تولیدکنندگان لاکاز با این میزان اندک سوبسترا وجود نداشته است. لو و همکاران (2005) با میزان 55/0 گرم در لیتر ABTS موفق به جداسازی 23 سویه قارچی تولید کننده لاکاز از دریا شدند(12). دهیوب و همکاران (2005) با میزان 35/0 گرم در لیتر ABTS موفق به جداسازی 6 سویه تولید کننده لاکاز از مناطق جنگلی تانزانیا شدند (6) ، اما در این تحقیق با میزان 1/0 گرم در لیتر از این سوبسترا، 18 سویه قارچی از 22 سویه غربالگری شده  که همگی تولید کننده لاکاز بودند جداسازی شد. نتایج به دست آمده از این تحقیق نشان می­دهد که قارچهای غربالگری شده توانایی تولید میزان قابل توجهی از آنزیم لاکاز را داشتند همچنین توان ترشح لاکاز توسط این قارچها نیز بالا بوده است که این موضوع برای صنعتی شدن این میکروارگانیسم­ها حائز اهمیت می­باشد.

مزایای استفاده از ABTS حساسیت بالای آن در ایجاد هاله و تغییر رنگ در هفته اول غربالگری در پلیتها می­باشد. روش دیگر غربالگری استفاده از نشانگر گایاکل بود که یکی از روشهای متداول غربالگری تولیدکنندگان لاکاز می­باشد، این تحقیق نشان داد که گایاکل به عنوان یکی از سوبستراهای لاکاز حساسیت کمتری نسبت به ABTS دارد. لاکاز آنزیمی است که در اثر هوادهی تولید آن تحریک می­شود(15). مشاهدات در این تحقیق حاکی از این بود که علی رغم نتایج دیگر تحقیقات به عمل آمده در سراسر دنیا، گاهی قارچهای تولید کننده لاکاز با توجه به خصوصیات فیزیولوژیک خود در اثر هوادهی رشد کندتری داشته و در نتیجه تولید این آنزیم در آنها پایین می­آید و همیشه هوادهی باعث افزایش تولید لاکاز نمی­شود. جدایه Ht2q به عنوان یک قارچ آسکومیست در شرایط هوادهی میزان بیشتری آنزیم لاکاز تولید کرد و هوادهی تأثیر مثبت بر تولید آنزیم داشت. اما در مورد جدایه B4e که این سویه نیز قارچ آسکومیست بود، بیشترین تولید لاکاز در شرایط سکون با میزان U/L 22 به دست آمد. نتایج آزمایشات نشان داد، میزان تولید آنزیم به دلیل رشد بیش از اندازه جدایه B4e در شرایط سکون و تمام شدن مواد غذایی مورد نیاز، دوام چندانی نداشت، البته تولید آنزیم در شرایط هوادهی روند رو به رشدی داشت اما تولید نهایی در این شرایط کمتر از شرایط سکون بود و هوادهی تأثیر چندانی بر تولید آنزیم نداشت. تولید آنزیم در دیگر قارچهای غربالگری شده، نسبت به سویه­های منتخب کمتر بود و در بعضی از جدایه­ها تولید آنزیم حتی کمتر از 12 روز دوام داشت. با استفاده از خصوصیات مورفولوژیکی، اکثر قارچهای رشته­ای دست کم تا حد جنس قابل شناسایی می­باشند اما گاهی به دلیل تغییر شرایط زیست، قارچها به فازی از مراحل زیست خود وارد می­شوند که شناسایی مورفولوژیک امکان پذیر نمی­باشد، لذا برای شناسایی قارچها در این شرایط و همچنین برای شناسایی قارچهای تا حد گونه از ابزار مولکولی استفاده می­شود. در این تحقیق با توجه به خصوصیات مورفولوژیک و ابزار مولکولی جدایه B4e بیشترین شباهت به گونه Alternaria alternate داشت اما در جدایهHt2q  که بیشترین شباهت را به جنس Retroconis  داشت تنها از ابزار مولکولی برای شناسایی استفاده شد. هر دو جدایه قارچی Alternaria alternate , Retroconis. sp.  از شاخه آسکومیستها بوده و جدایه Alternaria alternate یک قارچ پوسیدگی نرم محسوب می­شود (10 و11). با توجه به منابع محیطی استفاده شده در این تحقیق امکان جداسازی قارچهای پوسیدگی نرم دور از انتظار نبود. تابنده و همکاران (1388) قارچهای تجزیه کننده باگاس را جداسازی کردند که این قارچها مولد مجموعه آنزیمی قادر به تجزیه باگاس بودند. در تحقیق مذکور جداسازی قارچهای مولد آنزیمهای تجزیه کننده لیگنین با تاکید بر منگنز پراکسیداز و لیگنین پراکسیداز انجام گرفت(2). اما در این تحقیق هر دو قارچ با داشتن آنزیم لاکاز از تجزیه کنندگان لیگنین می­باشند. قارچ Alternaria alternate از نمونه باگاس و Retroconis sp از ریزوسفر نیشکر مزارع نیشکر هفت تپه جداسازی شد. تاکنون هیچ گزارشی مبنی بر تولید آنزیم لاکاز توسط قارچ Retroconis sp در منابع اطلاعاتی مشاهده نشده است (4 و 5).  

1- حمیدی مطلق، روح اله.، نحوی، ایرج.، امتیازی، گیتی.، قزلباش، غلامرضا.(1388).جداسازی و شناسایی مخمرهای تولید کننده اتانول از قند دی­زایلوز. مجله زیست شناسی جلد 22 شماره 1.

2- تابنده، فاطمه.، رعایایی اردکانی، محمد.، بمبئی، بیژن.، ملایی، منیر.، قاسمی، فهیمه.(1388) جداسازی و شناسایی قارچهای تجزیه کننده باگاس . مجله زیست شناسی جلد 22 شماره 3 .

 

3-Alaniz, S., Leon, M., Vicent, A., Garcia-Jimenez, J., Abad-Campos, P., and Armengol, J. (2007). Characterization of Cylindrocarpon Species Associated With Black Foot Disease of Grapevine in Spin. Plant disease. (9): 1187-1193.

4- Baldrian, P .(2005). Review: Fungal­ laccases occurrence and properties. 10.1111/j.1574-4976

5-Claus, H .(2004). Laccases: structure, reactions, distribution. Micron35:93-96.

6-Dhouib, A., Hamza, M., Zouari, H., Mechichi, T., Hmidi, R., Labat, M., Jesus. M. Martinez. and Sayadi,S.)2005). Screening for ligninolytic enzyme production by diverse fungi from Tunisia. World J. Microbiol & Biotechnol 21:1415–1423.

7-EI-Gammal, A.A.)1998.( Biodegradation of lignocellulosic substances and production of sugars and lignin degradation intermediates by four selected microbial strains. Polymer Degradition.stab.61:535-542

8-Kiiskinen, L.-L., Ratto, M., and Kruuse, K.(2004).Screening for novel laccase-producing microbes. Appl Microbiol 97:640-646

9-Kirk, T.K. and Farrell, R.L.(1987).Enzymatic " combustion " :the microbial degradation of lignin. Annue. Rev. Microbial .41: 465-505.

10-Leonowicz, A., Cho, NS., Luterek, J., Wilkolazka, A., Wojtas-Wasilewska, M., Matuszewska, A., Hofrichter, M., Wesenberg, D and Rogalski, J. (2001). Review : Fungal laccase: properties and activity on lignin. J. Basic Microbiol. 41: 185–227.

11-Leonowicz, A., Matuszewska, A., Luterek, J.,Ziegenhagen, D.,Wojtas-wasilewska, M., Cho, N. S., and Hofrichtr, M. (1999). Review; Biodegradation of lignin by White rot fungi. Fung. gen. Biol.77:175-185.

12-Luo, W., Vrijmoed, L.L.P., and Gareth Jones, E.B .(2005).Screening of marine fungi for lignocellulose-degrading enzyme activities. Botanical Marina 48: 379–386.

13-Niku-Paavola, M.L., Raaska, L.and Itvaara, M.(1990). Detection of white-rot fungi by a nontoxic strain. Mycol. Res.94 : 27–31.

14-Perez, J.(2005 (.Biodegradation and biological treatments of cellulose, hemicelluloses and lignin: an overview.Int.Microbiol.5:53-63.

15-Safari,A., Emtiazi, G.and Hajrasuliha,S.(2006). Comparative studies of extracellular fungi laccase under different condition.J .Agric. Sci.Techol.9:69-76.

16-Solano, F.,Garcia, E.,Perez De Egea, E. and Sanchez-Amat, A.(1997) .Isolation and characterization of strain MMB-1(CECT 4803), a novel melanogenic marine bacterium. Appl and Environ Microbiol.63:3499-3506.

17-Weiland, J. J. (2002). Rapid procedure for the extraction of DNA from fungal spores and mycelia [On line]. Available: www.ars. usda. Gov / pandp/ pepole/ people.htm

18-White, T. J., T. Bruns, S. Lee, and J. W. Taylor. (1990). Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. Pp. 315-322 In: PCR Protocols.

 19-Xu, F.(1996).Oxidation of phenol, anilines, and benzenethiols by fungal laccases: correlation between activity and redox potentials as well as halide inhibition. Biochem. 35:7608-7614.