نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 پژوهشکده ژنتیک و زیست فناوری کشاورزی طبرستان

2 دانشگاه علوم‌کشاورزی و منابع‌طبیعی ساری

3 پژوهشکده ژنتیک و زیست فناوری کشاورزی طبرستان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری

چکیده

پمپ پروتونی H+-ATPase یکی از پروتئین¬های مهم موجود در غشای پلاسمایی گیاهان می¬باشد که نقش مهّمی در فیزیولوژی مولکولی پاسخ به تنش ایفاء می¬کند. گراس Aeluropus littoralis بواسطه مقاومت به برخی از استرس¬های محیطی مثل تنش شوری و عناصر سنگین مدل خوبی برای مطالعه ساختار و عملکرد این پمپ می¬باشد. در این مطالعه بعنوان نقطه آغاز، ترادف کامل ناحیه کدکننده این ژن در هالوفیت Aeluropus littoralis شناسایی و همسانه¬سازی شد. اطلاعات اولیه بدست آمده نشان می¬دهد ترادف نوکلئوتیدی پمپ پروتونی H+-ATPase غشای پلاسمایی یک ناحیه ORF کامل بطول bp 2856 می¬باشد که همولوژی معنی¬داری با گونه¬های Sorghum bicolor ، Oryza sativa و Zea mays دارد. همچنین ترادف آمینواسیدی این ژن، پپتیدی با وزن مولکولی 104567 دالتون متشکل از 951 اسیدآمینه را رمز می¬کند که از نظر نوع و ساختار دامین، بیشترین تطابق را با پروتئین¬های H+-ATPase غشای پلاسمایی گیاهی و قارچی نوع سوم (type III) از خانواده بزرگ پمپ¬های ATPase p-type دارد. همردیفی مقایسه¬ای ترادف آمینواسیدی ژن H+-ATPase غشای پلاسمایی گیاه Aeluropus littoralis (Alha) برخی گونه¬ها نشان می¬دهد که جایگزینی¬های نوکلئوتیدی نقاط حساس و عملکردی پروتئین را هدف قرار نداده و این مناطق در توالی مورد بررسی، حفاظت¬شده باقی مانده¬اند. در نهایت این ترادف با شماره دسترسیGI:346230720 در پایگاه داده NCBI ثبت گردید.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Molecular Cloning of Plasma Membrane H+-ATPase Coding Sequence from Aeluropus littoralis Halophyte Grass

نویسنده [English]

  • Najmeh Nasiri 2

چکیده [English]

H+-ATPase proton pump is one of the major proteins found in plasma membrane of plants which plays an important role in molecular physiology of stress response. Aeluropus littoralis grass due to resistance to some environmental stresses like salinity and heavy metals is a good model for studying the structure and function of the plasma H+ATPase pump. In this study as a starting point, the complete coding sequence of the gene were identified and cloned from Aeluropus littoralis halophyte. Preliminary data showed that nucleotide sequence of A. littoralis plasma membrane proton pump contains a 2856 bp full-length ORF region that shared a significant homology with Sorghum bicolor ، Oryza sativa and Zea mays. Also the predicted peptide of this gene consists of 165 amino acid residues with a molecular weight of 104567 Da which is in terms of domains type and structure, consistent with most plant and fungal plasma membrane H + ATPase protein type III (type III) from a large family pump ATPase p-type. Comparative alignment of amino acid sequence of A.littoralis plasma membrane H+ATPase with some species indicated that nucleotide substitutions did not targeted critical and functional positions of protein and these regions remained conserved. At last the sequence was submitted to GenBank with accession number of GI: 346230720.

کلیدواژه‌ها [English]

  • plasma membrane H+ATPase
  • Alha
  • Aeluropus littoralis
  • molecular physiology

همسانه­سازی مولکولی ترادف رمزکننده ژن H+- ATPase غشای پلاسمایی در گراس شورزی Aeluropus littoralis 

احسان شکری*، نجمه نصیری و قربانعلی نعمت­زاده

ساری، دانشگاه علوم­کشاورزی و منابع­طبیعی ساری، پژوهشکده ژنتیک و زیست­فناوری کشاورزی طبرستان

تاریخ دریافت: 24/12/90             تاریخ پذیرش: 16/9/91 

چکیده 

پمپ پروتونی H+-ATPase یکی از پروتئینهای مهم موجود در غشای پلاسمایی گیاهان می­باشد که نقش مهّمی در فیزیولوژی مولکولی پاسخ به تنش ایفاء می­کند. گراس Aeluropus littoralis به واسطه مقاومت به برخی از استرسهای محیطی مثل تنش شوری و عناصر سنگین مدل خوبی برای مطالعه ساختار و عملکرد این پمپ می­باشد. در این مطالعه به عنوان نقطه آغاز، ترادف کامل ناحیه کدکننده این ژن در هالوفیت Aeluropus littoralis شناسایی و همسانه­سازی شد. اطلاعات اولیه به دست آمده نشان می­دهد ترادف نوکلئوتیدی پمپ پروتونی H+-ATPase غشای پلاسمایی یک ناحیه ORF کامل به طول bp 2856 می­باشد که همولوژی معنی­داری با گونه­های Sorghum bicolor ، Oryza sativa و Zea mays دارد. همچنین ترادف آمینواسیدی این ژن، پپتیدی با وزن مولکولی 104567 دالتون متشکل از 951 اسیدآمینه را رمز می­کند که از نظر نوع و ساختار دامین، بیشترین تطابق را با پروتئینهای H+-ATPase غشای پلاسمایی گیاهی و قارچی نوع سوم (type III) از خانواده بزرگ پمپهای ATPase p-type دارد. هم ردیفی مقایسه­ای ترادف آمینواسیدی ژن H+-ATPase غشای پلاسمایی گیاه Aeluropus littoralis (Alha) برخی گونه­ها نشان می­دهد که جایگزینیهای نوکلئوتیدی نقاط حساس و عملکردی پروتئین را هدف قرار نداده و این مناطق در توالی مورد بررسی، حفاظت­شده باقی مانده­اند. در نهایت این ترادف با شماره دسترسیGI:346230720 در پایگاه داده NCBI ثبت گردید.

واژه های کلیدی: H+-ATPase غشای پلاسمایی، Alha ، Aeluropus littoralis ، فیزیولوژی مولکولی

٭ نویسنده مسئول، تلفن: 09305332193 ، پست الکترونیکی e.shokri62@gmail.com : 

مقدمه

 

غشای پلاسمایی که محیط سیتوپلاسم و هسته را در بردارد یک غشاء دولایه­ای سیال است که از لحاظ بیولوژیکی بسیار فعال می­باشد. پروتئینهای موجود در این غشاء که در سطح یا عمق آن مستقر هستند می­توانند نقشهای مختلف آنزیمی، ناقلی، ساختمانی و غیره داشته باشند. از مهم ترین اعمال بیولوژیکی غشای پلاسمایی خاصیت نفوذپذیری انتخابی نسبت به یونها، مولکولهای آلی و کنترل تردد ترکیبات به داخل و خارج سلول است. همچنین این غشاء نقش مهّمی در پاسخ به محرکهای بیرونی و ایجاد سازگاری در مواجه با تنشهای زنده و غیرزنده همچون سرما، گرما، خشکی، شوری و غیره ایفاء می­کند. یکی از پروتئینهای تراغشایی مهم موجود در غشای پلاسمایی گیاهانH+-ATPase  می­باشد.H+-ATPase  غشای پلاسمایی نقش مهّمی در ایجاد و کنترل انتقالات از عرض غشاء ایفاء می­کند. این آنزیم با استفاده از انرژی هیدرولیز ATP یون H+ را فعالانه به فضای آپوپلاستی هدایت می کند. عمل پمپ­کردن پروتون به خارج، باعث ایجاد شیب­الکتروشیمیایی در عرض غشاء گردیده و این اختلاف غلظت یون زمینه لازم را برای فعالیت سایر ناقلین غشایی فراهم می­آورد. عمل هم انتقالی (Symport) و انتقال تبادلی (Transport) ناقلین غشاء باعث جذب مواد ضروری، دفع یون، آلاینده­ها و ترکیبات سمی از سلول می­شود (7). بنابراین پمپ H+-ATPase غشای پلاسمایی طیف وسیعی از فرآیندهای فیزیولوژیک و اساسی گیاه همچون جذب، دفع، بارگیری آوندها، باز و بسته شدن روزنه­ها، رشدونمو و طویل شدن سلولها و غیره را از طریق ایجاد فشار پروتون و تنظیم pH سلول تحت تأثیر قرار می­دهد. از لحاظ ساختاری  H+-ATPaseیک پمپ بیولوژیک محسوب می­شود که تنها از یک زنجیره­ پلی­پپتیدی عملکردی با جرم­مولکولی  kDa100 تشکیل شده است. این پروتئین می­تواند از طریق الیگومریزاسیون (Oligomerize) کمپلکسهای هگزامری و دایمری ایجاد کند (8). پایانه­های کربوکسیلی (C) و آمینی(N)  این پروتئین در فضای سیتوپلاسم رها شده است (5). در ساختار H+-ATPase پلاسمایی 5 دامین به نامهای A، M، P،N و R وجود دارد. دامین A (فعال­کننده- Actuator) شامل انتهای آمینی(N)  و یک لوپ کوچک می­باشد. دامین M (دامین غشایی) یک دامین تراغشایی با 10 ناحیه هلیکس به نامهای M1 تا M10 می­باشد. دامین P (جایگاه فسفوریلاسیون) در لوپ بزرگ قرار دارد و دامین N (Nucleotide binding) دربین دو ناحیه توالی تشکیل­دهنده دامین P قرار گرفته است. دامین R (تنظیم­کننده) نیز پایانه کربوکسیلی پروتئین را شامل می­شود که نقش خودبازداری (Autoinhibitory) دارد (5 و 11). فعالیت  H+-ATPase غشای پلاسمایی گیاهان با مداخله این بخش پایین نگه داشته می­شود. به نظر می­رسد خاصیت بازدارندگی این دامین مربوط به واکنش (تداخل) نواحی R I و R II با دامینهای سیتوپلاسمی باشد (6 و 12). سیکل کاتالیکی H+-ATPase غشایی با دو وضعیت فضایی E1  و E2 تعریف می­شود. بر این اساس در وضعیت E1 جایگاههای اتصال ناحیه تراغشایی کشش بالایی برای پروتون و مولکول ATP دارند در حالی که در وضعیت E2 تمایل کمی برای این لیگاندها وجود دارد. وضعیتهای E1  و E2 در طول انتقال به صورت متناوب عمل می­کنند (3). دامینهای سیتوپلاسمی A، N و P مسئول هیدرولیز ATP هستند. تغییرات فضایی در این دامینها هنگام فرآیند کاتالیز منجر به تحرکات همزمان در بخشهای فرورفته در غشاء گردیده و انتقال پروتون را هدایت می­کند. واحد انتقال­دهنده پروتون یک سیستم گیرنده / دهنده پروتون را در مرکز ناحیه تراغشایی تشکیل می­دهد که شامل آمینواسید­های آسپارتیک اسید (Asp684)، آسپارژین اسید (Asn106)، آرژنین (Arg655) و یک حفره مرکزی بزرگ که احتمالاً با آب پر می­شود، می­باشد (3). آسپارتیک اسید در تماس نزدیک با آسپارژین اسید می­باشد. در وضعیت E1 پروتونه شدن آسپارتیک اسید(Asp684)  باعث می­شود بین این دو اسیدآمینه پیوند هیدروژنی تشکیل شود. در حالی که فسفوریلاسیون باعث ایجاد وضعیت E2 و آزاد شدن پروتون از آسپارتیک اسید (Asp684) می­گردد. پیشنهاد شده است آسپارتیک اسید نقش مهّمی در رهاسازی و پمپ­کردن پروتون در پتانسیلهای غشایی بالا دارد. بار مثبت آرژنین (Arg655) در نزدیکی آسپارتیک­اسید (Asp684)  باعث آزادسازی پروتون از آسپارتیک­اسید (Asp684) می­شود و مانع پروتونه شدن مجدد آسپارتیک اسید(Asp684) می­گردد (3). به نظر می­رسد به ازاء هر واحد ATP، یک واحد پروتون انتقال یابد (11). پمپ  H+-ATPaseغشایی توسط یون پتاسیم (K+) تحریک می­شود (11). یون پتاسیم به دامین فسفوریلاسیون P در سیتوپلاسم متصل می­شود و باعث دفسفوریلاسیون وضعیت فسفوریله شده E1  می گردد (13). همچنین پمپ  H+-ATPaseغشای پلاسمایی گیاهان برای فعالیت خود نیاز مبرم به Mg2+ داشته و تنها قادر است که از انرژی هیدرولیز ATP استفاده نماید. امروزه تحقیقات به روشنی اهمیت پمپ H+-ATPase غشای پلاسمایی گیاهان را به واسطه تنوع فراوان اعمال حیاتی و نقش ضروری آن در سازگاری با تغییرات محیط به اثبات رسانیده است (10). تا کنون نقش این پمپ در بارگذاری سوکروز و انتقال سایر ترکیبات آلی در آوندهای آبکش، جذب عناصرمعدنی در ریشه­ها، رشد ریشه­های مویی و لوله گرده، باز و بسته شدن روزنه­ها، حفظ فشار تورگر، تنظیم حرکات و جهت­یابی در گیاه، انرژی­دهی ترانسپورترها و تنظیم PH سیتوپلاسم و بسیاری از اعمال فیزیولوژیک دیگر (4، 9 و14) برای این پمپ گزارش شده است. در این مطالعه گیاه Aeluropus littoralis به عنوان یکی از هالوفیتهای بومی ایران که در اراضی شور نواحی خشک و نیمه خشک کشور متکامل شده است به عنوان منبع ژن، به منظور جداسازی ترادف کد­کننده ژن H+-ATPase غشای پلاسمایی مورد استفاده قرار گرفت. از آنجایی که انتظار می­رود بخشی از مقاومت گیاه Aeluropus littoralis به عنوان یک گیاه شورزی در مواجه با برخی تنشهای محیطی مثل شوری و عناصر سنگین مربوط به چگونگی ساختار و عملکرد پمپ H+-ATPase غشای پلاسمایی آن باشد، اطلاعات به دست آمده در این تحقیق می­تواند در آتیه مطالعات فیزیولوژی تنش و ایجاد گیاهان تراریخته مقاوم سودمند واقع شود.

مواد و روشها

تهیه مواد گیاهی: به منظور تهیه مواد اولیه گیاهی مورد نیاز در این تحقیق، بذرهای گیاهA.littoralis ، پس از انجام بررسیهای گیاه­شناسی و تأیید گونه، از رویشگاههای طبیعی آن در مناطق شمالی کشور (استان مازندران) جمع­آوری و به گلخانه پژوهشکده ژنتیک و زیست­فناوری کشاورزی طبرستان، منتقل گردید. پس از انجام ضدعفونی سطحی بذرها در ماسه شسته کشت گردیدند. یک ماه پس از کشت به منظور افزایش سطح ترانسکریپتوم پاسخ­دهنده به شوری در گیاه و سهولت جداسازی، تیمار شوری 250 میلی­مولار نمک کلریدسدیم به مدت 14روز اعمال شد و سپس برگهای گیاه جهت استخراج RNA برداشت گردید.

طراحی آغازگرها: طراحی آغازگرهای دجنره با استفاده از نرم افزار OLIGO 5 و با استفاده از اطلاعات به دست آمده از همردیفی چندگانه برای ژن موردنظر در گونه­های ,Oryza sativa Triticum aestivum , Hordeum vulgare و سایر گونه­ها انجام گردید. توالی الیگونوکلئوتیدهای مورد استفاده در واکنش زنجیره­ای پلیمراز به صورت زیر می باشد:

Forward :

           5-ATGGG(T,C)(A,G)GGCTCG(A,G)GATC -3 

Reverse :  5- TCACACGGTGTAGTTCTGGTTG-3 

استخراج RNA، ساخت cDNA و تکثیر ژن  Alha: استخراج RNA به روش ترایزول با اندکی تغییرات انجام شد. بدین منظور 200 میلی­گرم بافت برگی تازه در ازت مایع سائیده شد و پودر به دست آمده در 1 میلی­لیتر ماده تجاری ترایزول همگن گردید. سپس با افزودن کلروفورم فاز آبی که حاوی RNA کل می­باشد از فاز آلی جداسازی و با استفاده از اتانول رسوب داده شد. ارزیابی غلظت و کیفیت RNA به دست آمده با استفاده از روش اسپکتروفتومتری و ژل آگاروز انجام شد. سپس جهت ساخت cDNA، واکنش نسخه­برداری معکوس با استفاده از آنزیم M-Mulv Reverse transcriptas (شرکت Fermentas) و آغازگر برگشت انجام گردید.  cDNA سنتز شده، به عنوان الگو در واکنش زنجیره­ای پلیمراز، جهت سنتز DNA دو رشته­ای و تکثیر ژن با استفاده از آغازگرهای رفت و برگشت و آنزیم Pfu polymerase (تاکارای ژاپن) استفاده شد. شرایط این تکثیر شامل: واسرشت اولیه 4 دقیقه، سپس 35 چرخه به صورت واسرشت سازی 1 دقیقه در دمای 94 درجه، اتصال 45 ثانیه در دمای 59 درجه و بسط 90 ثانیه در دمای 72 درجه و نهایتاً بسط نهایی در دمای 72 درجه سانتی­گراد به مدت 10 دقیقه در نظر گرفته شد. نوار bp3000 به دست آمده با استفاده از کیت استخراج DNA از روی ژل شرکت Roche، جداسازی و در وکتور  pTZ57R/T طبق دستورالعمل کیت InsTAclone™ PCR Cloning Kit (Fermentas) در باکتری  E. coli کلون شد. سپس 30 میکرولیتر از باکتری بر روی محیط گزینش حاوی IPTG، X-gal و آنتی­بیوتیک آمپی­سیلین به مدت 18 ساعت در دمای 37 کشت گردید. پس از ظهور کلونیها، استخراج پلاسمید با استفاده از روش مینی­پرپ از کلونیهای سفید انجام شد. در این روش با استفاده از بافر (گلوکز،EDTA  وTris-Hcl  با PH=8) دیواره سلولی باکتری به صورت قلیایی لیز می­شود. سپس محلول    دناتوره­کننده (حاوی NaOH و SDS ) اضافه می­گردد و در نهایت با استفاده محلول فنل/کلروفورم/ ایزوآمیل الکل، فاز آبی حاوی پلاسمید جداسازی و با استفاده از اتانول رسوب داده شد. تعیین توالی به روش تمام اتوماتیک فلورسانس و توسط شرکت Bioneer کره جنوبی انجام گردید.

آنالیزهای بیوانفورماتیکی: درخت فیلوژنتیکی به روش Neighbour joining و توسط نرم­افزار MEGA 4 و آنالیز ساختار ثانویه و پیش بینی مناطق تراغشایی به روش Kyte and Doolittle و به صورت آنلاین توسط برنامه Genetyx-Mac سرور www.expasy.org صورت پذیرفت. بازبینی قطعه توالی­یابی شده با نرم افزار Chromas و شناسایی ORF، همردیفیهای چندگانه و آنالیز توالی DNA و پروتئین با استفاده از نرم­افزار DNASISMAX   و BioEdit انجام شد. همچنین به منظور تعیین جایگاههای آمینواسیدی مهم (شکل 3) از نرم افزار TMRPres2D و توالی پپتیدی ژن AHA2  و مقاله Palmgren (2011)(11) استفاده شد.  تعیین دامینها و آزمون درجه همسانی به وسیله پایگاه ژن NCBI و برنامه BLAST انجام گردید.

نتایج

واکنش زنجیره­ای پلیمراز با استفاده از پرایمرهای دجنره و نمونه cDNA برگ به عنوان الگو منجر به تکثیر قطعه­ای با اندازه تقریبی 3000 جفت باز گردید.  قطعه DNA به دست آمده پس از بازیابی از روی ژل تعیین ترادف شد. آنالیز توالی­ نوکلئوتیدی آشکار شده نشان داد، ترادف به دست آمده یک ناحیه ORF کامل به طول bp 2856 می باشد که با کدون خاتمه TGA به پایان می­رسد. همچنین مشخص گردید این ترادف، پپتیدی با وزن مولکولی 104567 دالتون متشکل از 951 اسیدآمینه را رمز می­کند. به منظور دستیابی به اطلاعات بیشتر در خصوص قطعه تکثیر شده آزمون میزان درجه همسانی در Gene Bank با استفاده از توالی نوکلئوتیدی و پروتئینی انجام گردید. نتایج آنالیز هم ردیفی با استفاده از برنامه BLAST نشان داد که ژن مورد بررسی همولوژی بالا و معنی­داری در سطح DNA و اسیدآمینه با ژنهای ATPase p-type در گونه­های مختلف گیاهی، قارچها و جلبکها دارد. بر این اساس در سطح پروتئینی 92 تا 95 درصد تشابه با گونه­های Sorghum bicolor ، Oryza sativa، Brachypodium distachyon  Triticum aestivum و Zea mays  به دست آمد (جدول1). همچنین در سطح نوکلئوتیدی 90 درصد همسانی با گونه­های Sorghum bicolor، Oryza sativa و Zea mays  مشاهده گردید (جدول2).

به منظور شناسایی دقیق­تر و انتساب ترادف مورد بررسی به زیر خانواده (subfamily) صحیحی از پروتئینها، توالی پپتیدی برای کشف وجود دامینهای احتمالی با استفاده از امکانات سرور جستجوی CDD در سایت NCBI مورد آزمون قرار گرفت. بر این اساس دامینهای cation-ATPase-N ، ATPase-IIIA-H ، HHE1-E2-ATPase و HAD: halocid dehalogenase  در ترادف مورد بررسی شناسایی شد و جایگاه نسبی آن با برخی از ترادفهای گونه­های گیاهی و قارچی مقایسه گردید (شکل1). نتایج به دست آمده از همردیفی مقایسه­ای دامینهای حفاظت شده نشان داد توالی مورد بررسی از نظر نوع و ساختار دامین، بیشترین تطابق را با پروتئینهای H+-ATPase غشای پلاسمایی گیاهی و قارچی نوع سوم (type III) از خانواده بزرگ پمپهای ATPase p-type، دارد. با بررسی ساختار ثانویه در توالی آمینواسیدی مشخص شد که در پلی­پپتید مورد بررسی، 10 منطقه تراغشایی (دامین M) M1 تاM10  وجود دارد. پیش بینی الگوی هیدروفوبیسیتی نیز وجود 10 ناحیه تراغشایی را در توالی مورد بررسی تأیید می­کند (شکل2).

 

جدول1- نتیجه بلاست توالی پروتئینی ژن H+-ATPase غشای پلاسمایی  با سایر گونه­ها

نام گونه

نام ژن

میزان پوشش

ارزش E 

درصد همسانی

Sorghum bicolor

hypotical  protein similar to ha 1

%100

0

%95

Oryza sativa

ha

%100

0

%94

Brachypodium distachyon

ha 1

%100

0

%93

Zea mays 

ha 2

%100

0

%93

Triticum aestivum

ha 1

%100

0

%92

Glycine max

ha 4

%100

0

%89

Arabidopsis thaliana

ha 2

%98

0

%86

جدول2 - نتیجه بلاست توالی نوکلئوتیدی ژن H+-ATPase غشای پلاسمایی  با سایر گونه­ها 

نام گونه

نام ژن

میزان پوشش

ارزش E 

درصد همسانی

Sorghum bicolor

hypotical  protein similar to ha 1

%100

0

% 90

Oryza sativa

ha1

%100

0

% 89

Zea mays

ha2

%100

0

% 88

Triticum aestivum

ha1

%100

0

% 87

Brachypodium distachyon

ha1

%100

0

% 87

Hordeum vulgare

ha1

%99

0

% 86

Arabidopsis thaliana

ha2

%99

0

% 78

Zostera marina

ha1

%99

0

% 76

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل1- همردیفی مقایسه­ای دامینهای حفاظت­شده ژن H+-ATPase غشای پلاسمایی Aeluropus littoralis با سایر ژنهای خانواده  H+-ATPase غشای پلاسمایی در گونه­های مختلف گیاهی و قارچی. بر این اساس توالی مورد بررسی از نظر نوع و ساختار دامین، بیشترین تطابق را با پروتئینهای H+-ATPase غشای پلاسمایی گیاهی و قارچی نوع سوم (type III) دارد.

 

شکل 2- نمودار هیدروفوبوسیتی توالی آمینواسیدی ژن H+-ATPase  غشای پلاسمایی در گیاه  Aeluropus littoralis به روش(Kyte & Doolittle) با استفاده از برنامه Genetyx-Mac . محل قرارگیری مناطق ترانس ممبران (1 تا 10) در شکل نمایش داده شده است.

 

 

 

شکل 3-  ترادف اسیدهای آمینه در پروتئین H+-ATPase غشای پلاسمایی  Aeluropus littoralis. برای تعیین جایگاههای آمینواسیدی مهم از نرم افزار TMRPres2D و توالی پپتیدی ژن AHA2  و مقاله Palmgren (2011) استفاده شد. مناطق تراغشایی M1 تا M10 در مستطیلهای افقی کادربندی شده است. محل دقیق اسیدهای آمینه آرژنین (113)، آسپارژین (670) و آسپارتیک (699)، به ترتیب در مناطق تراغشایی M1، M5 و M6 و اسید آمینه ترئونین (950) در کادرهای عمودی مشخص شده است. اسیدهای آمینه لیزین (438) محل اتصال مولکولATP داخل کروشه  و آسپارتیک (603 ) و (607) به عنوان جایگاه اتصال یون منیزیوم در کادرهای دایره ای شکل نمایش داده شده است. 26 اسیدآمینه مهم دامین تنظیمی R (RI & RII) با خط زیر نشان داده شده است. اسیدهای آمینه تشکیل دهنده دامین N که دو بخش دامین P را به هم مربوط می­سازد، در مرکز پپتید با رنگ مات مشخص گردیده است.

 

 

شکل4- همردیفی مقایسه­ای توالی آمینواسیدی ژن H+-ATPase  غشای پلاسمایی گیاه A. littoralis با استفاده از الگوریتم  Clustal w توسط نرم افزار BioEdit. توالی آمینو اسیدی گونه های مورد مقایسه شامل: Triticum aestivum, Hordeum vulgare, Zea mays, Sorghum bicolor,  Zostaria marina, Arabidopsis thaliana ha1 & ha 2, Oryza sativa ha1 & ha 2

 

شکل5- درخت فیلوژنتیکی توالی پروتئینی ژن H+-ATPase  غشای پلاسمایی هالوفیت A. littoralis  با گونه­های مختلف گیاهی، قارچی و جلبک با استفاده از نرم افزار MEGA4 به روش Neighbour joining. پارامتر تکرار در ترسیم درخت معادل 1000 در نظر گرفته شد.

 

پس از پیش­بینی مناطق تراغشایی در ادامه محل دامین سیتوپلاسمی A به طول 161 آمینواسید به صورت دو قسمت مجزا قبل از اولین منطقه تراغشایی M1 و در فاصله نواحی تراغشایی M2 و M3 شناسایی شد. بخشی از دامین A که در فاصله نواحی تراغشایی M2 و M3 واقع می­شود در داخل سیتوپلاسم تشکیل لوپ می­دهد. دامینهای Pو N نیز در فاصله مناطق تراغشایی  M4 و M5  قرار گرفته­اند. بر این اساس دامین p به صورت دو قسمتی و به طول کلی 165 آمینو اسید، در مرکز ترادف پپتیدی و دامین N به طول 149 اسیدآمینه ، مابین دو بخش دامین p واقع شده است و دو قسمت آن را به هم مربوط می­سازد. در نهایت دامین R پس از آخرین ناحیه تراغشایی M10 به طول تقریبی 117 اسیدآمینه شناسایی گردید. همچنین جایگاه دو ناحیه R1 و R2 که اثر تنظیمی بر فعالیت آنزیم دارند در داخل دامین R تعیین گردید (شکل3).

علاوه بر این محل دقیق اسیدهای آمینه آسپارتیک (699 )، آسپارژین (670 ) و آرژنین ( 113) که واحد انتقال­دهنده H+ را به صورت یک سیستم گیرنده/ دهنده پروتون در مرکز دامین تراغشایی (M) تشکیل می­دهند، به ترتیب در مناطق تراغشایی M6 ، M5 و M1 مشخص گردید. همچنین در این بررسی، وجود اسیدهای آمینه ترئونین (950) که فاکتور رونویسی 3-3-14 با فسفریلاسیون آن باعث فعال­ شدن پمپ می­شود و اسیدهای­آمینه لیزین (438) محل اتصال مولکول  ATPو آسپارتیک (603 ) و (607) به عنوان جایگاه اتصال یون منیزیوم همگی در ترادف Alha  تأیید شد (شکل3).

 

 

 

شکل 6- درخت فیلوژنتیکی توالی نوکلئوتیدی ژن  H+-ATPase  غشای پلاسمایی هالوفیت A. littoralis  با گونه­های گیاهی، قارچی و جلبکی مختلف با استفاده از نرم افزار MEGA4 به روش Neighbour joining. پارامتر تکرار در ترسیم درخت معادل 1000 در نظر گرفته شد.

 

به منظور آشکارسازی تفاوتها در سطح DNA و اسیدآمینه، توالی نوکلئوتیدی و پروتئینی ژن مورد بررسی  با سایر توالیهای مربوطه در گونه­های سورگوم، ذرت، برنج، گندم، جو، آرابیدوپسیس و زوستاریا همردیف شد. نتیجه این بررسی نشان داد که اگر چه تفاوتها در سطح نوکلئوتیدی بالاست (نتایج نشان داده نشده است) اما از لحاظ تغییرات اسیدآمینه بسیاری از این تفاوتها بی­معنی است، بدین مفهوم که در اکثر نقاط محل اختلاف، تغییر نوکلئوتید منجر به تغییر اسیدآمینه نگردیده است و تنها یک اسم رمز اسیدآمینه جایگزین اسم رمز دیگر آن شده است. با این وجود نتایج نشان می­دهد که در مجموعه ترادفهای مورد بررسی، جایگزینیهای نوکلئوتیدی که در نواحی واقع در نزدیکی پایانه آمینی و کربوکسیلی و همچنین یک منطقه واقع در فاصله اسید­آمینه­های شماره 440 تا 460 واقع می شوند عمدتاً باعث تغییر نوع اسیدآمینه می­شوند و مناطق یادشده از حفاظت شوندگی کمتری نسبت به سایر نقاط برخوردار هستند. همردیفی ترادف آمینواسیدی ژن H+-ATPase غشای پلاسمایی گیاه  Aeluropus littoralis (Alha) نشان می­دهد که در محل اسیدهای­آمینه شماره 26،46، 51 ،517 ،754، 804، 847 ، 849 و 896 اسید آمینه­های جایگزین شده متفاوت با سایر گونه­های مورد بررسی در این هم ردیفی می­باشد (شکل4)، با این وجود به دلیل اینکه تغییرات ایجاد شده جایگاههای حساس و عملکردی پروتئین را هدف قرار نداده و همچنین تمام اسیدآمینه­های جایگزین شده از یک گروه بیوشیمیایی و یا از گروههای بیوشیمیایی نزدیک همند، اختلافات مشاهده شده چندان نمی­تواند مهم و عامل تغییرات اساسی در ساختار یا عملکرد پمپ Alha تلقی شوند. همچنین نتیجه همردیفی نشان داد هیچ گونه تغییری، در 26 اسید آمینه مهم (شکل3) دامین تنظیمی R که تا کنون از طریق جهش­زایی نقطه­ای در گیاه مدل آرابیدوپسیس (14) مشخص شده، تغییرات در آنها باعث افزایش فعالیت  پمپ پلاسمایی می­شود ، رخ نداده و این مناطق در توالی مورد بررسی، بدون تغییر و حفاظت شده باقی مانده­اند (شکل4). بنابراین با توجه به طبیعت بسیار حفاظت شده پمپ  H+ATPase غشای پلاسمایی به نظر می­رسد اختلافات مشاهده شده در میزان فعالیت این پمپ و ایزوفرمهای آن در گونه های مختلف مربوط به المانتهای تنظیمی و نواحی بالادست این ژن و یا تغییرات پس از ترجمه باشد.

در نهایت به منظور آشکارسازی و کشف روابط خویشاوندی و تکاملی، آنالیز کلاستر توالی نوکلئوتیدی و آمینواسیدی با برخی از گونه­های گیاهی، قارچی و جلبکها انجام شد. بر این اساس مشخص شد از لحاظ ترادف پپتیدی، پروتئین Alha همراه با H+ATPase غشای پلاسمایی گونه­های گندم (ha1)، جو (ha1)، ذرت (ha2)  و سورگوم از جد ژنی مشترکی منتج شده است و لذا این گونه­ها با هم تشکیل یک clade را می­دهند. در این clade گونه­های گندم- جو، و همچنین ذرت- سورگوم مونوفیلیتیک هستند در حالی که گونه Aeluropus در هیچ یک از این گروههای مونوفیلیتیک قرار نمی­گیرد و مستقیماً از جد اولیه clade به وجود آمده است (شکل5). از لحاظ توالی نوکلئوتیدی نیز ژن مورد بررسی اگرچه قرابت نزدیکتری با ژنهای همتای خود در گونه­های C4، ذرت و سورگوم دارد ولی  از نظر جد ژنی با آنها اشتراک ندارد (شکل6).

بحث و نتیجه گیری

اثرات زیان آور غلظتهای بالای نمک به صورت کاهش رشد یا مرگ گیاهان نمایان می شود که در میان گونه های مختلف گیاهی متغییر می باشد. تنش شوری فرآیندهای عمده ای از قبیل رشد، فتوسنتز، سنتز پروتئین و متابولیسم چربی را تحت تأثیر قرار می­دهد (2) با توجه به اینکه تنشهای خشکی، شوری خاک ، برخی آلودگیهای زیست محیطی و بیماریهای گیاهی موجب کاهش کمیت و کیفیت محصولات کشاورزی می شوند، ارائه راهکارهای لازم برای مقابله با این عوامل تنش زا امری ضروری می باشد (1). در این مطالعه با استفاده از روشهای مهندسی ژنتیک، توالی کامل ناحیه کد­کننده ژن  H+-ATPase غشای پلاسمایی در گونه Aeluropus littoralis شناسایی، جداسازی و کلون گردید. درجه همسانی بسیار بالای توالی نوکلئوتیدی و پروتئینی این ژن با سایر ژنهای H+- ATPase غشای پلاسمایی گزارش شده درGeneBank ، آنالیز درخت فیلوژنتیک، کشف تمامی دامینها و موتیفهای حفاظت شده در توالی پروتئینی و عدم جایگزینیهای اسیدآمینه­ای با معنی در نواحی حفاظت شده، به انضمام اطلاعات پایه­ای که از پیش­بینی ساختارهای ثانویه و عملکرد استنباط می­شود، نشان می­دهد که به احتمال زیاد ترادف شناسایی شده یک ترادف عملکردی کامل با محصول پروتئینی شناخته شده می باشد. با این وجود بدیهی است که تعیین بیشتر خصوصیات این ژن مستلزم بیان آن در سیستم یوکاریوتی مناسب و بررسی کارکرد آن در سطوح بیوشیمیایی و آنزیمی می­باشد. در مجموع با آشکار شدن ترادف نوکلئوتیدی و پروتئینی پمپ مهم H+-ATPase غشای پلاسمایی در گراس شورزی و تک لپه Aeluropus littoralis، امکان درک بهتر مکانسیم عمل و توپولوژی پمپهای پروتونی پلاسمایی با منشاء هالوفیتی و همچنین مطالعه روند تکامل مولکولی این پمپها فراهم شده است. در نهایت با توجه به نقش گسترده­ای که پمپهای پروتونی غشای پلاسمایی در بهبود و تنظیم ابعاد مختلف فیزویولوژی مولکولی گیاه و پاسخ به شرایط محیطی دارند، از مجموع این اطلاعات می­توان برای ایجاد نسلی از گیاهان پیشرفته با قابلیتهای ویژه در پاسخ به طیفی از تنشهای زنده و غیر زنده، سود جست.

تشکر و قدردانی

این مطالعه با استفاده از امکانات آزمایشگاهی و پشتیبانی مالی پژوهشکده ژنتیک و زیست فناوری کشاورزی طبرستان به انجام رسیده است. نویسندگان بر خود لازم می­دانند از مساعدت بخشهای مختلف، به ویژه ریاست محترم پژوهشکده قدردانی نمایند.

  1. خسروی، ه.، یخچالی، ب.، علیخانی، ح­، 1388. تعیین پتانسیل تعدادی از ریزوبیوم­های بومی به عنوان باکتری­های محرک رشد گیاه و نقش آنها در کاهش اتیلن تنشی. مجله زیست شناسی ایران، ج 22، ش 4. صفجه670-661.
  2. نوح­پیشه، ز.، منوچهری­کلانتری، خ. 1390. اثرات کاربرد اسپرمیدین و تنش شوری در گیاه فلفل. مجله زیست شناسی ایران، ج 24، ش 6. صفجه857-848.

3. Buch-Pedersen, M., Pedersen, P., Veierskov, B., Nissen, P. and Palmgren, M. 2009. Protons how they are transported by proton pumps. European Journal of Physiology 457:  573-579. 

4. Buch-Pedersen, M., Rudashevskaya, E., Berner, T., Venema, K. and Palmgren, M. 2006. Potassium as an intrinsic uncoupler of the plasma membrane H+-ATPase. The Journal of Biological Chemistry 281: 38285-38292.

5. Duby, G. and Boutry, M. 2009. The plant plasma membrane proton pump ATPase: a highly regulated P-type ATPase with multiple physiological roles. Pflugers Archiv European Journal of Physiology 457: 645-655.

6. Jang, Y., Qin, Y., Xie, C., Zhao, F., Zhao, J., Liu, D., Chen, S., Fuglsang, A., Palmgren, M., Schumaker, K., Deng, X. and Guo, Y. 2010. The Arabidopsis chaperone J3 regulates the plasma membrane H+-ATPase through interaction with the PKS5 kinase. The Plant Cell 22: 1313-1332.

7. Kabała, K., Janicka-Russak, M., Burzyński, M. and Kłobus, G. 2008. Comparison of heavy metal effect on the proton pumps of plasma membrane and tonoplast in cucumber root cells. Journal of Plant Physiology 165: 278-288.

8. Kanczewska, J., Marco, S., Vandermeeren, C., Maudoux, O., Rigaud, J. and Boutry, M. 2005. Activation of the plant plasma membrane H+-ATPase by phosphorylation and binding of 14-3-3 proteins convert a dimer into a hexamer.  PNAS 102: 11675-11680. 

9. Kolbert, Z., Bartha, B. and Erdei, L. 2008. Osmotic stress- and indolile-3-butyric acid induced NO generation are partially distinct processes in root growth and development in Pisum sativum. Physiologia Plantarum 133: 406-416.

10. López-Pérez, L., Martínez Ballesta, M., Maurel, C. and Carvajal, M. 2009. Changes in plasma membrane lipids, aquaporins and proton pump of broccoli roots, as an adaptation mechanism to salinity. Phytochemistry 70: 492-500.

11. Palmgren, M. 2001. Plant plasma membrane H+-ATPase : powerhous for nutrient uptake. Annual Review of Plant Physiology and Molecular Biology 52: 817-845.

12. Speth, C., Jaspert, N., Marcon, C. and Oecking, C. 2010. Regulation of the plant plasma membrane H+-ATPase by its C-terminal domain : what we know for sure?. European Journal of Cell Biology 89: 145-151.

13. Takemiya, A. and Schimazaki, K. 2010. Phosphatidi cacid inhibits blue light induced stomatal opening via inhibition of protein phosphatases1. Plant Physiology 153: 1555-1562.

14. Zandonadi, D., Santos, M., Dobbss, L., Olivares, F., Canellas, L. L., Binzel, M., Okorokova Façanha, A. and Façanha, A. 2010. Nitric oxide mediates humic acids-induced root development and plasma membrane H+-ATPase activation. Planta 231: 1025-1036.