نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه تربیت مدرس

2 استاد/ دانشگاه تربیت مدرس

چکیده

پروتئین¬های ترشحی و خلال غشایی در بسیاری از فرایندهای زیستی نقش کلیدی دارند. نرم افزار¬های بیو¬انفورماتیکی متعددی جهت یش¬بینی این پروتئین¬ها طراحی و ساخته شده است. همچنین چندین روش تجربی نیز جهت به دام انداختن این پروتئین¬ها معرفی شده است.
سیستم ترشح مخمر یا به اختصار YST، یکی از روش¬های تجربی است که در این زمینه مورد استفاده قرار گرفته است. این سیستم شامل حامل¬های بیانی و یک سویه مخمر جهش یافته است. این سویه فاقد اینورتاز است. اینورتاز آنزیمی است که ترشح آن باعث رشد مخمر بر روی محیط انتخابی سوکرز می¬شود. سه وکتور بیانی این سیستم، اینورتاز فاقد متیونین آغازی و توالی نشانه را در سه قالب مختلف کد می¬کنند. عرضه cDNA های حاوی توالی نشانه در ابتدای اینورتاز ترشح آن و در نتیجه رشد مخمر بر روی محیط انتخابی سوکرز را فراهم می¬آورد.
هدف از این تحقیق راه¬اندازی سیستم YST جهت شناسایی پروتئین های ترشحی و خلال غشایی بود. به این منظور عملکرد دو توالی نشانه پیش¬بینی شده توسط نرم¬افزار های بیو¬انفورماتیکی، در انتهای آمین دو پروتئین انسانی Ppic و Trmt1 و توالی نشانه شناخته شدهPi16 به عنوان کنترل مثبت وتوالی نشانه میتوکندری Tfam، به عنوان کنترل منفی با این روش مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج حاصل از کنترل مثبت و منفی حاکی از کارکرد صحیح سیستم بود و در مورد توالی مورد نظر در Trmt1، همانطور که انتظار می رفت در این سیتم فاقد عملکرد بود اما توالی مورد نظر در Ppic، بر خلاف انتظار قادر به عملکرد به عنوان توالی نشانه در این سیستم نبود.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Test functionality of the human Trmt1 and Ppic predicted signal peptides by yeast secretion trap (YST)

نویسندگان [English]

  • ebrahim hosseini 1
  • bahram soltani 2
  • mehrdad behmanesh 2

1 TARBIAT MODARES UNIVERSITY

2 tarbiat modares university

چکیده [English]

Secreted and transmembrane proteins are key players in various biological processes. they are accessible to various drug delivery mechanisms and they have a critical role as diagnostic and prognosis factors in clinical states . There are several bioinformatic softwares applied in the prediction of signal peptides and there are several experimental methods to trap signal peptides and identify secreted and transmembrane proteins.
YST abbreviated form of yeast secretion trap is one of experimental methods based on pYST vectors and a host Saccharomyces cerevisiae strain 066-2. The host yeast is mutant and lacks invertase. The three pYST expression vectors encoding a mutant invertase in one of three frames and lacking the start codon and signal sequence.
In this work we intended to set up YST system and for this purpose we examined two electronically predicted signal sequences in the amino terminal of cyclophilin c (ppic) and tRNA methyl transferase (Trmt1) human proteins. In addition we used putative signal sequence of pi16 as positive control and putative mitochondrial signal sequence of Tfam as the negative control to confirm functionality of the system.
these sequences were amplified by PCR and then cloned to in frame in pYST expression vectors. Subsequently, The host yeast strain 066-2 recombinant were transformed with recombinant vectors and cultured on the selective agar media.
The results of expriments confirmed the functionally of the system. Neither trmt1 nor ppic amino terminal predicted signal sequence did not function as signal sequence in this system.

کلیدواژه‌ها [English]

  • "signal peptide
  • "yeast secretion trap (YST)
  • "Ppic
  • Trmt1

بررسی عملکرد توالی نشانه در انتهای آمین دو پروتئین Ppic و Trmt1 انسان با سیستم ترشح مخمر (YST)

سید ابراهیم حسینی، بهرام محمد سلطانی* و مهرداد بهمنش

تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم زیستی، گروه ژنتیک

تاریخ دریافت: 8/3/90                 تاریخ پذیرش: 7/8/90

چکیده

پروتئینهای ترشحی و خلال غشایی در بسیاری از فرآیندهای زیستی نقش کلیدی دارند. نرم افزار­های بیو­انفورماتیکی متعددی جهت یش­بینی این پروتئینها طراحی شده است. همچنین چندین روش تجربی نیز جهت به دام انداختن این پروتئینها معرفی شده است. YST (yeast secretion trap) ، یکی از روشهای تجربی است که در این زمینه  استفاده شده است. هدف از این تحقیق  بکارگیری سامانه YST جهت ارزیابی پروتئینهای ترشحی و ترا غشایی بود که تا کنون در کشور ایران از این سامانه در شناسایی پروتئینهای ترشحی و ترا غشایی استفاده نشده است. به این منظور عملکرد دو توالی نشانه پیش­بینی شده توسط نرم­افزار های بیو­انفورماتیکی، در انتهای آمین دو پروتئین انسانی Ppic و Trmt1 و توالی نشانه شناخته شده Pi16 (عملکرد این توالی انسانی به عنوان توالی نشانه با سامانه yst قبلاً شناخته شده است) به عنوان کنترل مثبت و توالی نشانه میتوکندری Tfam، به عنوان کنترل منفی با این روش مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج حاصل از کنترل مثبت و منفی تحقیق، حاکی از کارکرد صحیح سیستم بود، با این وجود هیچیک از دو توالی هدف پیش بینی­شده به عنوان توالی نشانه در این سیستم عملکرد توالی نشانه را نداشتند و با توجه به گزارشهای قبلی و نتایج حاصل از این تحقیق به نظر می­رسد این سامانه توانمندی بالایی در شناسایی پروتئینهای ترشحی و ترا غشایی یوکاریوتهای عالی از جمله توالیهای نشانه انسانی را ندارد .

واژه های کلیدی: توالی نشانه، yeast secretion trap (YST)،  ppic و trmt1 

* نویسنده مسئول، تلفن: 02182884703، پست الکترونیکی:  bmsoltani@yahoo.com

مقدمه

 

پروتئینهای ترشحی و تراغشایی در بسیاری از فرآیندهای زیستی نقش کلیدی ایفاء می کنند، فاکتور­های رشد و گیرنده­های آنها، عوامل شرکت کننده در پیام­رسانی سلولها، بسیاری از پروتئینهای درگیر در ایجاد اتصالات سلولی و نیز بسیاری از عوامل سیستم ایمنی مثالهایی از این پروتئینها هستند. به دلیل اینکه این پروتئینها در فضای خارج سلولی قرار دارند به آسانی در دسترس داروها قرار می­گیرند و لذا نیاز تحویل دارو به سلول که همواره یک محدودیت در درمان بیماریها به شمار می­آید را برطرف می­سازند. پروتئینهای تراغشایی که ویژه سلول یا بافت ویژه­ای هستند از اهمیت ویژه­ای برخوردارند چرا که می توان داروها را به صورت هدفمند با هدف قرار دادن این پروتئینها به سمت سلول یا بافت مورد نظر هدایت کرد(2).

مسیر­های صدور پروتئینهای ترشحی و ترا غشایی به فضای خارج سلولی به دو دسته مسیر­های کلاسیک و  نا­متداول قابل تقسیم­هستند (8).

مسیر های نامتداول شامل مکانیسمهای وابسته به حضور وزیکولهای درون سلولی و مکانیسمهای مستقل از وزیکولهاست. در مکانیسم وابسته به وزیکولهای داخل سلولی، این وزیکولها می­توانند لیزوزم­های ترشحی و یا اگزوزوم­هایی باشد که از اندامکهای حفره­ای درون سلولی نشات گرفته­اند. مکانیسمهای مستقل، یکی شامل ترابری مستقیم از خلال غشاء بواسطه ناقلهای ABC (آدنوزین تری فسفات کاست) و دیگری، جوانه زنی غشاء و تولید وزیکولهای خارج سلولی می­باشد(15).

اغلب پروتئینهای ترشحی و ترا غشایی با مسیر­های کلاسیک به فضای خارج سلول راه می­یابند. این مسیرها شامل انتقال همزمان با ترجمه و انتقال پس ترجمه­ای است که اولی در تمام یوکاریوتها وجود دارد و دومی در یوکاریوتهای عالی شناخته نشده­است (8). 

مسیر­های کلاسیک ترشح وابسته به حضور توالی نشانه در انتهای آمینی پروتئینها می­باشد. توالیهای نشانه از نظر طول و توالی بسیار متنوع هستند(21).

روشهای مختلفی جهت شناسایی و پیش­بینی پروتئینهای ترشحی و ترا غشایی طراحی شده­اند که عمدتاً بر مبنای تشخیص و پیش بینی توالی نشانه طرح ریزی شده­اند و به دو دسته کلی قابل تقسیمند. روشهای نرم­افزاری و روشهای تجربی(10).

روشهای نرم افزاری توالی نشانه را ضمن تجزیه و تحلیل توالی انتهای آمین پروتئینهای ترشحی و تراغشایی پیش­بینی می­کنند و از برنامه شبکه عصبی (10) و پنهان مارکوف جهت پیش­بینی استفاده می­کنند(10).

روشهای زیستی (آزمایشگاهی) مختلف پروتئینهای ترشحی و ترا غشایی را در مقیاس وسیع شناسایی می­کنند. این روشها عبارتند از به دام اندازی توالی نشانه با ژن گزارشگر،  مهندسی ویروسها جهت شناسایی پروتئینهای ترشحی و تراغشایی و جداسازی RNA­های متصل به غشاء و کدکننده این پروتئینهاست (1، 4، 9، 11، 14 و 18).

 در مهندسی ویروسها جهت شناسایی پروتئینهای ترشحی و ترا غشایی، ویروس Sindbis، به گونه­ای دستکاری شده که پروتئین پوشش آن فاقد توالی نشانه و متیونین آغازی است و لذا تشکیل ذرات ویروسی مستلزم همسانه شدن cDNA حاوی توالی نشانه در قالب باز خواندنی پروتئین پوشش می باشد (14). یک روش زیستی برپایه جداسازی RNA های کد کننده توالی نشانه طراحی شده است که در آن RNA های کد کننده توالی نشانه درگیر در فرآیند ترجمه به دلیل بر همکنش ریبوزوم­های حاوی این RNA­ها با غشای شبکه آندوپلاسمی از سایر RNA­ها جدا و شناسایی می شوند (4).

در به دام اندازی توالی نشانه توسط ژن گزارشگر، استخراج RNA، از سلول یا بافت مورد نظر صورت می­گیرد. سپس رشته اول cDNA  با استفاده از آغازگر شش نوکلئوتیدی تصادفی ساخته می­شود. ساخت رشته دوم و تکثیر آن در نسخه­های متعدد با روش5′ RACE ، صورت می­گیرد. این نسخه­ها در بالا دست ژن گزار که فاقد توالی نشانه و متیونین آغازی است و روی یک حامل تعبیه شده است همسانه می گردد. کتابخانه حاملهای نوترکیب به سلول میزبان انتقال می­یابد. سلول میزبان فاقد ویژگی است که ژن گزارشگر بیان می­کند. هر یک از cDNA­ هایی که حاوی توالی نشانه و متیونین آغازی باشد و این توالی را در قالب صحیح به ژن گزارشگر عرضه کند با بیان و ترشح محصول ژن گزارشگر ویژگی آن را بروز خواهد داد. سلول میزبان حامل ناقل نوترکیب با بیان ویژگی ژن گزارشگر از بقیه سلولها تمیز داده می­شود. در نهایت حامل نوترکیب از سلول میزبان استخراج می­شود و واکنش توالی­یابی صورت می­پذیرد و توالی cDNA در بانک اطلاعاتی جستجو می­شود بدین ترتیب می توان فهمید که توالی نشانه به کدام ژن تعلق دارد(1، 9، 11 و 18).

تعدادی از ژنهای گزارشگر عبارتند از β- لاکتاماز،  که آمپی­سیلین را تجزیه می­کند و ترشح آن به فضای پری پلاسمی باعث نجات باکتری روی محیط انتخابی حاوی آمپی­سیلین می­گردد(18). CD4، پروتئین تراغشایی را کد می­کند که در سطح سلول با آنتی بادی منوکلونال ردیابی می­شود(9). گیرنده اینترلوکین جهش یافته که یک گیرنده رشد مستقل از فاکتور رشد را در سطح سلول کد می­کند و باعث نجات سلول در محیط کشت انتخابی می­گردد(11). آلکالین فسفاتاز یک آنزیم تراغشایی را کد می­کند و یک واکنش تولید رنگ را در سطح سلول راه اندازی می­کند(1).

اینورتاز که در این تحقیق مورد استفاده قرار گرفت، ساکارز را به فروکتوز و گلوکز تجزیه می­کند(12). و ترشح آن به خارج سلول باعث نجات مخمر جهش یافته روی محیط انتخابی ساکارز می­شود. سامانه حاصل از ژن گزارشگر اینورتاز و مخمر جهش یافته جهت شناسایی پروتئینهای ترشحی و تراغشایی موسوم به YST، می باشد (شکل1). یک راه کار جهت بهینه­سازی این سیستم استفاده از سه ناقل (pYST0، pYST1 و pYST2) هر یک حاوی ژن گزارشگر اینورتاز با قالبهای باز خواندنی متفاوت می­باشند  و انطباق صحیح cDNA­ها را از نظر قالب باز خواندنی با اینورتاز فراهم می­نمایند(12) (شکل 2).

 

 



 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


شکل 1- نمایی شماتیک از مراحل اصلی  .YSTیک کتابخانه cDNA از بافت یوکاریوتی و یا سلول دلخواه با الحاق cDNA ها در حامل YST، که حاوی یک نسخه فاقد توالی پپتید نشانه ژن گزارشگر اینورتاز(SUC) می­باشد، تهیه می­شود. این کتابخانه سپس به یک سویه مخمر نا کارآمد از لحاظ عملکرد اینورتاز منتقل گردیده و روی محیط انتخابی کشت می­شود. اینورتاز جهت هیدرولیز ساکارز الزامی است و رشد سلولها را در محیط ساکارز فراهم می­آورد. اما هنگامی­که پپتید نشانه حذف شده باشد، اینورتاز تولید وترشح نمی­شود و منجر به تولید سلولهای مخمری خواهد شد که قادر به رشد روی محیط انتخابی نمی­باشند( سمت چپ ) اگر cDNA های یوکاریوتی کد کننده یک پروتئین ترشحی همراه با پپتید نشانه باشند، مخمر جهش یافته قادر به رشد و نجات خواهد شد، چراکه پروتئین نوترکیب اینورتاز را ترشح می­کند.

 

 

 

 


شکل 2- نمایی شماتیک از وکتور YST به کار گرفته شده در تولید کتابخانه cDNA. سه وکتور مختلف تولید می شوند که در تعداد بازهای سیتوزین، بلافاصله پس از جایگاه برش Not1، متغییر می­باشند. محل آنزیمهای (Not1  ، EcoR1) جهت همسانه­سازی cDNA با خط زیرین مشخص شده است. PADH2: جایگاه راه انداز ژن الکل دهیدروژناز؛ EColi ori: مبدا همانندسازیEcoli ؛ TADH2: خاتمه گر ژن الکل دهیدروژناز؛ SphI: جایگاه برش آنزیم محدودگر SphI؛ Amp: ژن مقاوم به آمپی سیلین؛ 2μ ori: مبدا همانند سازی 2μ؛ SUC-SP: اینورتاز ناقص فاقد توالی نشانه و متیونین آغازی.

 

هدف از این تحقیق اجرایی نمودن روش تجربی (YST)- بر پایه ژن گزارشگر اینورتاز- جهت شناسایی پروتئینهای ترشحی و ترا غشایی سلولهای انسانی بود چرا که این سامانه تاکنون در کشور ایران اجرا نشده است- و نیز ارزیابی عملکرد توالیهای نشانه پیش­بینی شده با نرم افزار­های بیوانفورماتیکی در انتهای آمین دو پروتئین انسانی(peptydil prolyl cis transe isomerase) Ppic و(tRNA methyl transferase 1) Trmt1 با این سامانه بود. Ppic انسان در مجوعه پروتئینهایی که با روش تجربی جهت شناسایی پروتئینهای ترشحی- بر مبنای جداسازی RNAهای متصل به غشا ( RNA و ریبوزم متصل به غشای شبکه آندوپلاسمی) توسط Dihen M و همکاران- پی­ریزی شده بود به عنوان یک پروتئین بالقوه ترشحی گزارش شده بود (4). با تحقیق در مورد Ppic متوجه شده که تا کنون جایگاه عملکرد آن در انسان مکان­یابی نشده­است. Trmt1  نیز با نام FLJ20244 در مطالعاتی که با روش بیو انفورماتیکی توسط Welsh J و همکاران- تحت عنوان شناسایی  پروتئینهای نشانگر زیستی  ترشحی و موجود در سرم با افزایش بیان در سرطان در مقیاس وسیع- صورت گرفت به عنوان پروتئین بالقوه ترشحی با افزایش 3.7 درصد بیان در سرطان سینه (از نوع گیرنده استروژن منفی) گزارش شده بود(22). به منظور اطمینان از کارکرد صحیح سامانه YST، از یک کنترل مثبت (توالی نشانه پروتئین  Pi16(protease inhibitor 16)، که عملکرد مثبت آن در این سامانه قبلاً گزارش شده است) و نیز از توالی نشانه میتوکندریایی پروتئین(mitochondrial transcription factor) Tfam به عنوان کنترل منفی آزمایش استفاده گردید. 

مواد و روشها

روشهای به کار گرفته شده در این تحقیق شامل روشهای نرم­افزاری و روشهای آزمایشگاهی بود. 

جهت پیش­بینی توالی نشانه در انتهای آمین پروتئینهای مورد نظر از سه نرم افزار ایج  در این زمینه شامل SignalP 3.0، TargetP و Predisi  استفاده شد. همچنین جهت طراحی آغازگرها از نرم افزار Oligo 4.0 استفاده گردید.

ابتدا با استفاده از روش مرسوم اقدام به استخراج DNA ژنومی از خون انسان به عنوان  Template شد(16). سپس با واکنش زنجیره­ای پلیمراز، قطعات کد کننده توالی انتخابی (مستعد به داشتن عملکرد توالی نشانه با پیش بینی نرم افزار) تکثیر گردید. توالی آغازگرها در جدول 1 قابل مشاهده می باشد.

پس از تکثیر قطعات، با استفاده از کیت miniperep شرکت Bioneer اقدام به استخراج ناقلهای pYST0 و pYST2 از باکتریهای حامل آنها شد. این حاملها توسط لی و همکاران طراحی و ساخته شده است (12) و با انجام مکاتبات از ایشان تهیه شد (شکل  2 ).

 

 

جدول 1- توالی آغازگرها و دمای ذوب آنها

TM(ċ)

Sequence

Name

58

5- GAGGAATTCTGTGACCTGGGTGCAACCA-3'

pi16 F1

56

5- GGGGGCGGCCGCGGTAGAGGTTGTGCAGCTC-3'

pi16 R1

58

5'- TATAGAATTCGCCCTGGCTTGAACTGAGA-3'

tfam F1

58

5- ATATGCGGCCGCGAGCGCAGTCGACTTCCACA-3'

tfam R1

60

5'- ATATGAATTCGGGTCGCGAGTCTGAACTTGG-3'

ppic F1

62

5'- ATATGCGGCCGCTCACCTTGGCCGTCACCGAGGGG-3'

ppic R1

58

5-ATATGAATTCTGTGGCTACGAGAGCAGGT-3'

trmt1

57

5'- ATATGCGGCCGCTCGGTGACTGTCGTCTCCT-3'

trmt1

GAATTC: توالی شناسایی آنزیم محدودگر EcoR1؛ GCGGCCGC: توالی شناسایی آنزیم محدودگر Not1

 

هریک از قطعات تکثیر یافته و ناقلها همزمان با دو آنزیمNot1  و EcoR1، طبق دستور­العمل شرکت Fermentase مورد هضم آنزیمی قرار گرفتند.  پس از شستشوی محصولات هضم آنزیمی با کیت تخلیص PCR شرکت Roche، هریک از قطعات با ناقل متناظر از نظر قالب صحیح، مطابق با دستور­العمل آنزیم T4DNAligase شرکت Fermentase الحاق داده شد (شکلهای 2 و 3).

توالیهای مستعد عملکرد توالی نشانه (ppic و trmt1) در حاملهای منطبق (pYST0 و pYST2) و قطعات کد کننده توالیهای pi16 و ppic با حامل pYST0 منطبق بوده و توالیهای trmt1 و tfam، با داشتن یک نوکلئوتید اضافه در انتهای آغازگر برگشت و در ادامه توالی شناسایی آنزیم محدودگر Not1، با حامل pYST2، با دو نوکلوئتید سیتوزین اضافه در بالادست ژن گزارشگر منطبق می­باشد، این سه نوکلئوتید با هم یک آمینو اسید اضافه پرولین کد می­کنند و قالب صحیح بازیابی می­شود.

ناقل های نوترکیب حاصل با انتقال شیمیایی به باکتری مستعد DH5α انتقال داده­شد(17). پس از تکثیر ناقلهای نوترکیب در باکتری مستعد، ناقلها از باکتری استخراج و با الکتروپوریشن به مخمر جهش یافته مستعد منتقل گردید (19). و سپس مخمر­ها را بر روی محیط انتخابی سوکروز کشت داده­شد.

 پس از یک هفته ناقل  را از مخمرها (چه آنهایی که نجات یافته بودند و چه آنهایی که به صورت پس زمینه­ای وجود داشتند) استخراج شدند و پس از ازدیاد در باکتری مستعد و استخراج مجدد از باکتری، مورد واکنش توالی­یابی قرار گرفتند.

نتایج

به منظور پیش بینی حضور توالی نشانه در انتهای آمینی پروتئینهای مورد نظر(Trmt1 و Ppic)، 70 اسید آمینه انتهای آمینی این پروتئینها با سه نرم افزاز SignalP 3.0، TargetP و Predisi مورد ارزیابی قرار گرفت. همچنین جهت کنترل، توالی نشانه شبکه آندوپلاسمی (70 اسید آمینه انتهای آمینی Pi16) و توالی نشانه میتوکندری (70 اسید آمینه انتهای آمین Tfam) نیز با نرم افزارهای مذکور مورد سنجش قرار داده­شد. نرم افزارهای  SignalP 3.0 و Predisi فقط قادر به شناسایی توالی نشانه شبکه آندوپلاسمی (SP) می­باشند، بنابر این پیش بینی خود از حضور یا عدم حضور توالی نشانه را به ترتیب با SP و NO نشان می­دهند که احتمال صحت این پیش بینی را با دادن نمره (Score) بیان می­کنند. نرم افزار  TargetP قادر به تمیز دادن توالی نشانه شبکه اندوپلاسمی از توالی نشانه میتوکندری می­باشد و پیش بینی حاکی از حضور توالی نشانه شبکه اندوپلاسمی، توالی نشانه میتوکندری و یا عدم حضور توالیهای مذکور را به ترتیب با SP، MS و NO نشان می­دهد و احتمال صحت این پیش بینی را با دادن نمره (Score) بیان می­کند کار گرفته شده در این تحقیق در جدول 2  قابل مشاهده است.

همه نرم افزار ها توالی انتهای آمین Pi16 (کنترل مثبت) را با احتمال بالا به عنوان توالی نشانه پیش بینی کردند. نرم افزار های SignalP 3.0 و Predisi قادر به تمیز دادن نشانه میتوکندری از شبکه اندوپلاسمی نمی­ باشند و توالی انتهای آمین Tfam (کنترل منفی)را به عنوان توالی نشانه پیش بینی کردند.

 

 

 

شکل 3- نمایی شماتیک از الحاق قطعات کد کننده توالی نشانه (pi16)، توالی نشانه میتوکندری (tfam) و توالیهای مستعد عملکرد توالی نشانه (ppic و trmt1) در حامل های منطبق (pYST0 و pYST2). قطعات کد کننده توالیهای pi16 و ppic با حامل pYST0 منطبق می­باشد و توالیهای trmt1 و tfam، با داشتن یک نوکلئوتید اضافه در انتهای آغازگر برگشت و در ادامه توالی شناسایی آنزیم محدودگر Not1، با حامل pYST2، با دو نوکلوئتید سیتوزین اضافه در بالادست ژن گزارشگر منطبق می­باشد، این سه نوکلئوتید با هم یک آمینو اسید اضافه پرولین کد می­کنند و قالب صحیح بازیابی می­شود.

 

 

جدول-2- نتایج حاصل از پیش بینی نرم افزارهای SignalP 3.0، TargetP و Predisi

TargetP

Predisi

SignalP(HMM)

SignalP(NN)

Software

prediction

Score

prediction

Score

prediction

Score

prediction

SP

0.97

SP

0.99

SP

0.99

SP

Pi16

MS

0.92

SP

0.58

SP

0.98

SP

Tfam

SP

0.89

SP

0.76

SP

0.98

SP

Ppic

MS

0.91

NO

0.35

SP

0.81

SP

Trmt1

SP: توالی نشانه شبکه اندوپلاسمی؛ MS: توالی نشانه میتوکندری؛ NO: فاقد توالی نشانه شبکه اندوپلاسمی، میتوکندری

 

شکل 4- واکنش زنجیره ای پلیمراز کلنی های حاصل از انتقال حامل های نوترکیب a: pYST0-pi16(486 bp)؛ b: pYST2-tfam (653 bp)؛ c: pYST2-trmt1(469 bp)؛ d: pYST0-ppic (334 bp) .

 

 







 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


شکل 5-  نتیجه حاصل از انتقال حامل های نوترکیب به مخمر جهش یافته و کشت روی محیط انتخابی ساکارز.

 

 

نرم افزار TargetP قادر به تمیز دادن نشانه میتوکندری از شبکه اندوپلاسمی می­ باشد و به درستی و با احتمال زیاد توالی نشانه میتوکندری را پیش بینی می کند.. هر سه نرم افزار با احتمال نسبتاً بالایی توالی انتهای آمین   Ppic را به­عنوان توالی نشانه(شبکه اندوپلاسمی) پیش بینی کردند. نرم افزار SignalP 3.0 توالی نشانه را با احتمال نسبتاً بالایی در انتهای آمینی Trmt1 پیش بینی کردند، این در حالی است که احتمال حضور توالی نشانه با پیش بینی نرم افزار Predisi، در این ناحیه بسیار پایین می­باشد و نرم افزار TargetPآن را به عنوان توالی نشانه میتوکندری پیش بینی کرد.

نتیجه واکنش زنجیره ای پلیمراز کلنی های ترانسفورم شده با ناقلهای نوترکیب حاصل از همسانه سازی قطعات تکثیریافته در حاملهای منطبق در شکل 3، قابل مشاهده می­باشد.

در نتایج حاصل از انتقال حاملهای نوترکیب به مخمر و کشت روی محیط انتخابی همانگونه که انتظار می­رفت مخمر­های حاوی حامل نوترکیب pYST0-pi16 (کنترل مثبت) و تشکیل کلنی روی محیط انتخابی سوکروز بود. همچنین با توجه به انتظاری که می رفت مخمرهای دریافت کننده حامل نوترکیب pYST2-tfam (کنترل منفی)، قادر به رشد بر روی محیط اتخابی سوکروز و تشکیل کلنی نبودند (شکل5). مخمرهای ترانسفورم شده با حاملهای  pYST2-trmt1و pYST0-ppic نیز قادر به تشکیل کلنی روی محیظ انتخابی سوکروز نبودند.

نتیجه حاصل از تعیین توالی و تأیید انطباق صحیح قالب قطعه ورودی با قالب اینورتاز در حاملهای نوترکیب را می توان در شکلهای 6، 7، 8 و 9 مشاهده کرد.

 

 

 



 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


شکل 6-  نتیجه توالی یابی و تایید انطباق صحیح قالب قطعه pi16 با قالب اینورتاز در ناقل pYST0؛ خط چین سمت چپ: توالی قطعه pi16  کد کننده توالی نشانه؛ خط چین سمت راست: توالی حامل pYST0؛ کادر:  توالی هشت نوکلئوتیدی شناسایی آنزیم محدودگر Not1  و سیتوزین اضافه در انتهای آغازگر برگشت که سه اسید آمینه آرژنین، گلیسین و آرژنین را کد می­کنند و قالب صحیح حفظ می­شود.

 


بحث

در این تحقیق جهت اطمینان از کار آمدی سیستم YST، در شناسایی عملکرد توالی نشانه از یک کنترل مثبت و یک کنترل منفی نیز استفاده شد.

کنترل مثبت 43 اسید آمینه انتهای آمین پروتئین Pi16 اننخاب شد که قبل از این، عملکرد آن به عنوان توالی نشانه شناسایی شده بود (6) . همچنین 30 اسید آمینه انتهای آمین Tfam، که یک فاکتور رونویسی میتوکندریایی است و جایگاه عملکرد آن میتوکندری است به عنوان کنترل منفی آزمایش انتخاب شد. بررسی توالی انتخاب شده در انتهای آمین Tfam، با دو نرم افزار Signalp 3.0 و Predisi، توالی نشانه را در این ناحیه پیش بینی می­کند در حالی که بررسی ناحیه مذکور با نرم افزار Targetp، این توالی را به عنوان نشانه میتوکندری پیش بینی می­کند.

نتایج حاصل از پیش بینی توالی انتهای آمین trmt1، مشابه با نتایج حاصل از پیش بینی نرم افزارها در خصوص  توالی انتهای آمین Tfam، می باشد و به نظر می رسد این توالی، توالی نشانه میتوکندری باشد.

هر سه نرم افزار Signalp 3.0 ،Targetp و  Predisiتوالی انتهای آمین کد شده توسط رونوشتهای ppic را همانند پیش بینی ارائه شده در خصوص توالی انتهای آمین pi16 (کنترل مثبت) به عنوان توالی نشانه پیش­بینی می­کنند و با توجه به پیش بینی با احتمال بسیار زیاد این نرم افزارها به نظر می رسد این توالی، توالی نشانه شبکه آندوپلاسمی باشد.

 

 

 

 



 
 

 

 

 

 

 

 


شکل 7- نتیجه توالی یابی و تایید انطباق صحیح قالب قطعه tfam با قالب اینورتاز در ناقلpYST2؛   خط چین سمت چپ: توالی قطعه tfam کد کننده توالی نشانه میتوکندری؛ خط چین سمت راست: توالی حامل pYST2؛ کادر:  توالی هشت نوکلئوتیدی شناسایی آنزیم محدودگر Not1  و سیتوزین و تیمین اضافه در انتهای آغازگر برگشت و دو سیتوزین اضافه در بالادست ژن گزارشگر اینورتاز در ناقلpYST2 که در مجموع این 12 نوکلوئتید 4 اسید آمینه سرین، آرژنین، پرولین و پرولین را کد می­کنند و قالب صحیح حفظ می­شود.

                 : دو سیتزین اضافه در بالادست ژن گزارشگر اینورتاز در حامل  pYST2

 

 

 



 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


شکل 8 - نتیجه توالی یابی و تایید انطباق صحیح قالب قطعه ppic با قالب اینورتاز در ناقل pYST0؛ خط چین سمت چپ: توالی قطعه ppic کد کننده توالی نشانه پیش بینی شده با نرم افزار؛ خط چین سمت راست: توالی حامل pYST0؛ کادر:  توالی هشت نوکلئوتیدی شناسایی آنزیم محدودگر Not1  و آدنین اضافه در انتهای آغازگر برگشت که سه اسید آمینه سرین، گلیسین و آرژنین را کد می­کنند و قالب صحیح حفظ می­شود.

 

 



 
 

 

 

 

 

 

 

 

 


شکل 9-  نتیجه توالی یابی و تایید انطباق صحیح قالب قطعه trmt1 با قالب اینورتاز در ناقل pYST2؛ این توالی با آغازگر برگشت ( مکمل قسمتی از توالی اینورتاز حامل pYST2) توالی یابی شده است. خط چین سمت راست: : توالی قطعه trmt1 کد کننده توالی نشانه پیش بینی شده با نرم افزار ؛ کادر:  توالی هشت نوکلئوتیدی شناسایی آنزیم محدودگر Not1  و گوانین و آدنین (مکمل آنها سیتوزین و تیمین در شکل) اضافه در انتهای آغازگر برگشت و دو سیتوزین (مکمل آنها گوانین در شکل) اضافه در بالادست ژن گزارشگر اینورتاز در ناقلpYST2 که در مجموع این 12 نوکلوئتید 4 اسید آمینه کد می­کنند و قالب صحیح حفظ می­شود.

 

نرم­افزارهای به کار گرفته شده در این تحقیق، Signalp 3.0 و Predisi قادر به تمیز دادن نشانه­های ترشحی از میتوکندریایی نمی­باشند، همچنان­که در مورد توالی نشانه میتوکندری Tfam، که در این نرم­افزار­ها به عنوان توالی نشانه پیش­بینی می­شود می توان مشاهده کرد. در حالی­که نرم افزار  Targetp، توانایی پیش بینی هردو نوع نشانه ترشح ( شبکه اندوپلاسمی) و میتوکندریایی را دارد، بنابراین پیشنهاد می شود به منظور پیش­بینی توالی نشانه حتماً نرم افزار Targetp،  در کنار سایر نرم افزارها مورد استفاده قرار گیرد.

توالیهای پیش­بینی شده به عنوان توالی­ نشانه را به همراه ناحیه ترجمه نشونده′5، (5′ UTR) بالا دست که در بر دارنده عناصر لازم جهت ترجمه است با واکنش زنجیره ای پلیمراز از ژنوم انسان جدا نموده ودر سیستم YST، مورد ارزیابی قرار گرفت (شکل 9).

از چهار توالی بررسی شده تنها توالی بررسی شده Pi16 که کنترل مثبت آزمایش بود در این سامانه به عنوان توالی نشانه دارای عملکرد تشخیص داده شد.

trm1 همولوگ trmt1 در مخمر می باشد این آنزیم دارای دو ATG آغازی در اگزون شماره یک خود می­باشد شروع فرآیند ترجمه از هریک از این  ATGها جایگاه آنزیم را درون سلول مشخص می­کند به طوری که ترجمه از ATG بالا دستی توالی نشانه میتوکندی را کد می کند وآنزیم را به میتوکندری هدایت می­کند اما ترجمه از ATG پایین دستی آنزیم را به سمت هسته هدایت می­کند (13). توالی اگزون یک  trmt1 که حاوی توالی پیش­بینی شده به عنوان توالی نشانه توسط نرم­افزار نیز بود به منظور شناسایی ATG­­های آغازی محتمل با نرم افزار Dnafsminer (dnafsminer.bic.nus.edu.sg)  بررسی گردید که شامل سه ATG با قالب باز خواندنی صحیح می­باشد (شکل 11).

از سه ATG دو  ATG(351 و 459)، در قالب باز خواندنی ژن trmt1، قرار دارند که توالی ابتدایی کد شده باATG  شماره 351، توالی مورد نظر این تحقیق بود با توجه به پیش بینی نرم افزاز TargetP که قادر به پیش بینی توالی نشانه میتوکندریایی است و نیز مکان یابی آنزیم کد شده توسط  هومولوگ مربوط به مخمر در میتوکندری به نظر می رسد این توالی که با توالی هومولوگ خود در مخمر شباهت زیادی ندارد توالی نشانه ورود به میتوکندری است.

 

 

شکل  10-  نمایی شماتیک از اگزون اول ژن های pi16، tfam، ppic و trmt1، محل اتصال آغازگرها و ناحیه کد کننده توالی نشانه.

 

 

شکل 11- نمایی شماتیک از اگزون اول trmt1 انسان و موقعیت ATGهای آغازی آن؛ MS: توالی نشانه میتوکندری پیش بینی شده با نرم افزار TargetP؛ 5′UTR: ناحیه ترجمه نشونده ′5.

 

احتمال حضور توالی نشانه در انتهای آمین پروتئین Ppic : سیکلوفیلین C موش دارای توالی نشانه شناخته شده­است و به عنوان پرونئین ترشحی از رده سلولی استرومای مشتق از مغز استخوان جدا شد. توالی نشانه پیش بینی شده در سیکلوفیلین C انسان همانندی زیادی با توالی نشانه سیکلوفیلین C موش دارد(5).

هرچند توالی پیش بینی شده به عنوان توالی نشانه درسیکلوفیلین C انسان، در سیستم  YST، عملکرد  نداشت اما با توجه به شباهت زیاد (85 درصد) این توالی با توالی نشانه هومولوگ خود در موش و پیش بینی قوی همه نرم­افزار های به کار برده شده، با احتمال زیاد این توالی نیز توالی نشانه باشد. توالی هدف در مخمر برای یافتن توالیهای مشابه جستجو گردید، چرا که ممکن است مخمر دارای توالی نشانه مشابه با توالی نشانه مورد نظر باشد و در این صورت می توان عدم عملکرد آن را به اجرای سیستم نسبت داد. اما جستجوی همانندی نتیجه ای در بر نداشت.

تعدادی از توالیهای نشانه شناخته شده پروتئینهای موش شامل H-cadherin, C10  و FLK1 نیز قبلاً با سامانه YST، مورد سنجش قرار گرفتند که در این سیتم عملکرد توالی نشانه را نشان ندادند(7).

یک توضیح احتمالی جهت فقدان عملکرد پپتید­های نشانه جانوری در سیستم YST، را می توان به تفاوت تمایل ماشین ترشحی ارگانیزمهای مختلف به توالیهای نشانه گوناگون نسبت داد به طوری که فرآیند انتقال همراه با ترجمه، از باکتری تا انسان به طور بسیار محافظت شده کشف شده است. این در حالی­است که در میکرو ارگانیسم­ها دو مسیر موازی یعنی انتقال پس ترجمه­ای و انتقال همزمان با ترجمه شناخته شده­است.

انتخاب هریک از این مکانیزمها به وسیله میکروارگانیسم به خصوصیات توالی نشانه و شناسایی آن توسط  SRP، مربوط می شود.

برخلاف SRP­های پستانداران که تمامی توالیهای نشانه را شناسایی می­کند. SRP های باکتری و مخمر عمدتاً به توالیهای نشانه بسیار آبگریز متصل می­شوند. پروتئینهایی که آبگریز بودن توالی نشانه آنها، پایین­تر از یک حد آستانه است به وسیله SRP مخمر شناسایی نشده و لذا مسیر انتقال پس ترجمه­ای را طی می­کنند(3 و 20). از طرفی تفاوت در عناصر لازم برای ترجمه وتفاوت در ناحیه ترجمه نشونده در بالادست توالی نشانه یو کاریوتهای عالی و ابتدایی ممکن است توجیهی جهت عدم عملکرد توالیهای نشانه یوکاریوتهای عالی در سامانه YST باشد(7).

  1. Chen, J. and J.R. Patton.  1999.  Cloning and characterization of a mammalian pseudouridine synthase. RNA, 5: 409-19.
  2. Clark, H.F. 2003. The secreted protein discovery initiative (SPDI), a large-scale effort to identify novel human secreted and transmembrane proteins: a bioinformatics assessment. Genome Res, 13: 2265-70.
  3. de Gier, J.W. 1998. Differential use of the signal recognition particle translocase targeting pathway for inner membrane protein assembly in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A, 95: 14646-51.
  4. Diehn, M. 2006. Genome-scale identification of membrane-associated human mRNAs. PLoS Genet. 2(1):e11. Epub 2006 Jan 13.
  5. Friedman, J. and I. Weissman. 1991. Two cytoplasmic candidates for immunophilin action are revealed by affinity for a new cyclophilin:p. one in the presence and one in the absence of CsA. Cell, 66: 799-806
  6.  Frost, R.J. and S.Engelhardt. 2007. A secretion trap screen in yeast identifies protease inhibitor 16 as a novel antihypertrophic protein secreted from the heart. Circulation,116(16):1768-75.
  7. Galliciotti, G. 2001. Signal-sequence trap in mammalian and yeast cells: a comparison. J Membr Biol, 183: 175-82
  8. Hansen, W. and P. Walter. 1988. Prepro-carboxypeptidase Y and a truncated form of pre-invertase, but not full-length pre-invertase, can be posttranslationally translocated across microsomal vesicle membranes from Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol, 106: 1075-81
  9. Imai, T. 1996.  Molecular cloning of a novel T cell-directed CC chemokine expressed in thymus by signal sequence trap using Epstein-Barr virus vector. J Biol Chem, 21514-21

10. Klee, E.W. and L.B. Ellis. 2005. Evaluating eukaryotic secreted protein prediction. BMC Bioinformatics, 6: 256

11. Kojima, T. and T. Kitamura. 1999. A signal sequence trap based on a constitutively active cytokine receptor. Nat Biotechnol, 17: 487-90.

12. Lee, S.J., B.D. Kim.,  J.K. Rose. 2006. Identification of eukaryotic secreted and cell surface proteins using the yeast secretion trap screen. Nat Protoc,1: 2439-47.

13. Martin, N.C.  and A.K.  Hopper. 1994. How single genes provide tRNA processing enzymes to mitochondria, nuclei and the cytosol. Biochimie, 76: 1161-7.

14. Moffatt, P. 2002.Engineered viruses to select genes encoding secreted and membrane-bound proteins in mammalian cells. Nucleic Acids Res, 30: 4285-94.

15. Nickel, W., et al., 2005. Unconventional secretory routes:p. direct protein export across the plasma membrane of mammalian cells. Traffic,6: 607-14.

16. Pietro, F., et al., 2011.  Genomic DNA extraction from whole blood  by rapid phenol-chloroform protocol: a useful tool for genetic epidemiology studies. Mol Cell Probes, 25:44-8.

17. Swords, E.W., et al., 2003. Chemical Transformation of E. coli . ethods in Molecular Biology, 235: 49-53.

18. Tan,  R., X. Jiang,  A. Jackson. 2003. E. coli selection of human genes encoding secreted and membrane proteins based on cDNA fusions to a leaderless beta-lactamase reporter.Genome Res. 13(8):p.1938-43.

19. Thompson, J.R. 1998.An improved protocol for the preparation of yeast cells for transformation by electroporation. Yeast, 14:565-71..

20. Ulbrandt, N.D.,  J.A. Newitt, H.D. Bernstein. 1997. The E. coli signal recognition particle is required for the insertion of a subset of inner membrane proteins. Cell, 88: 187-96.

21. von Heijne, G., 1990. The signal peptide. J Membr Biol, 115:195-201.

22. Welsh, J., et al., 2003. Large-scale delineation of secreted protein biomarkers overexpressed in cancer tissue and serum. Proc Natl Acad Sci U S A, 100:3410–3415