مطالعه فیلوژنتیکی باکتری سودوموناس پوتیدا تولید کننده پرولین دهیدروژناز و آنالیز بیوانفورماتیکی آنزیم جداسازی شده

انور سادات کیان مهر¹ و رحمان مهدی زاده دهوسطی^2*

¹ تبریز، دانشگاه علوم پزشکی تبریز، دانشکده علوم نوین پزشکی تبریز، گروه زیست فناوری پزشکی

² بندرجاسک، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد بندر جاسک، بخش زیست­شناسی دریا

تاریخ دریافت: 25/4/90               تاریخ پذیرش: 18/7/91 

چکیده

فلاوآنزیم پرولین دهیدروژناز (EC 1.5.99.8) نقش مهمی را در زیست حسگرها و کیتهای غربالگری به منظور تشخیص بیماریهای متابولیک مرتبط با نقص پرولین ایفاء می­نماید. هدف از این تحقیق، جداسازی و تعیین مشخصات میکروارگانیسم های تولید کننده آنزیمهای دخیل در متابولیسم پرولین از نمونه­های خاک ایران بود. غربالگری آنزیمهای تخریب کننده L-پرولین از نمونه­های خاک در سه مرحله شامل تکنیک کشت غنی، کروماتوگرافی لایه نازک و سنجش فعالیت آنزیمی انجام شد. میکروارگانیسم جداسازی شده توسط واکنشهای بیوشیمیایی، آنالیز ژنهای RNA ریبوزومی s16، 16S-23S rRNA Internal Transcribed Spacer (ITS) و رسم درخت فیلوژنتیکی تعیین مشخصات گردید. مطالعات کینتیکی بر روی آنزیم شناسایی شده انجام شد و ساختار سه بعدی آن توسط روشهای بیوانفورماتیکی شبیه­سازی گردید. در بین 150 میکروارگانیسم جداسازی شده از 30 نمونه خاک، تنها یک سویه باکتری، فعالیت قابل ملاحظه­ای نسبت به اسیدآمینه L-پرولین (U/ml10) از خود نشان داد. پارامترهای ثابت میکائیلیس-منتن و سرعت ماگزیمم به ترتیب 12/0 میلی مولار و 11/0 میلی مولار بر دقیقه محاسبه شدند. سویه باکتری با استفاده از آنالیز فیلوژنتیکی ژنهای RNA ریبوزومی s16 و ITS به عنوان بیوتایپ جدیدی از سودوموناس پوتیدا شناسایی شد. ساختاز سه بعدی شبیه­سازی شده از آنزیم مذکور نیز قرار داشتن پرولین دهیدروژناز جداسازی شده در آنزیمهای خانواده سودوموناس پوتیداها را تأیید نمود. این تحقیق، اولین گزارش از تولید پرولین دهیدروژناز توسط باکتری سودوموناس پوتیدا جداسازی شده از نمونه خاک می­باشد.

واژه­های کلیدی: آنالیز فیلوژنتیکی، غربالگری، پرولین دهیدروژناز، سودوموناس پوتیدا

* نویسنده مسئول، تلفن: 09177612925، پست الکترونیکی: Rahman.biochem@gmail.com 

مقدمه

میکروارگانیسم ها مهمترین و ایده آل ترین منبع تولید کننده آنزیمهای مختلف با دامنه کاربردهای گسترده به شمار می­آیند. از مزایای آنزیمهای میکروارگانیسم ها می توان به امکان کنترل فیزیولوژیکی و فیزیکو شیمیایی، تنوع آنزیمی و مقادیر بالای تولید اشاره نمود (1). در این راستا، جداسازی و غربالگری آنزیمهای جدید با خصوصیات موثر و بهینه از میکروارگانیسمهای ساکن طبیعت به عنوان اولین مرحله در مسیر تحقیق و توسعه محصولات آنزیمی محسوب می­شود (2). گروه مهمی از آنزیمها که مطالعات غربالگری گسترده­ای بر روی آنها انجام شده است، کاتالیزور زیستی پرولین دهیدروژناز می باشد (13 و 14). این آنزیم که نقش مهمی در مسیر متابولیسم پرولین به گلوتامات ایفاء می­نماید از منابع مختلف باکتریایی، گیاهی و حیوانی گزارش شده است (5). در اولین مرحله از این مسیرمتابولیکی، پرولین دهیدروژناز در حضور کوفاکتور FAD پرولین را به ترکیب حدواسط ∆-پیرولین-5-کربوکسیلات تبدیل می­نماید. FADH₂ تولید شده نیز الکترونهای خود را به پذیرنده های زنجیره انتقال الکترون منتقل می­کند. در دومین مرحله، ∆-پیرولین-5-کربوکسیلات در یک واکنش غیر آنزیمی به گلوتامات-γ-سمی آلدئید هیدرولیز شده و سپس توسط آنزیم ∆-پیرولین-5-کربوکسیلات دهیدروژناز و در حضور کوآنزیم NAD⁺ به گلوتامات تبدیل می­شود (14). در تمام یوکاریوتها و برخی از باکتریها نظیر ترموس ترموفیلوس (thermus thermophilus) ، دو دومن این فلاوآنزیم توسط دو ژن جداگانه کد می­شوند (6). نقص ژنتیکی در مسیر متابولیکی پرولین به گلوتامات باعث بروز بیماری هایپرپرولینمیا در انسان می­شود (7). هرچند که شواهدی نیز در خصوص ارتباط بین نقص مسیر متابولیسم پرولین و بروز بیماری اسکیزوفرنی و همچنین نقش آنزیم پرولین دهیدروژناز در مهار سرطان کشف شده است (8). هدف از این تحقیق، جداسازی و شناسایی باکتریهای تولید کننده پرولین دهیدروژناز با خصوصیات کینتیکی مناسب بود. برای این منظور نمونه های مختلفی از شهر تهران جمع آوری شده و مطالعات غربالگری گسترده­ای بر روی آنها صورت گرفت. بدیهی است که این آنزیمهای باکتریایی می­توانند مدلهای مناسبی برای انجام مطالعات ساختاری و درک آنزیمهای همتای آنها در انسان باشند. این مطالعه، اولین گزارش از جداسازی سودوموناس پوتیدا (Pseudomonas putida ) تولید کننده پرولین دهیدروژناز می باشد.

مواد و روشها

مواد: L-پرولین و پلیتهای TLC سیلیکاژل 20 ´20cm از شرکت Merck آلمان تهیه شدند. INT (2-(p-iodophenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium chloride)، Phenazine methosulfate (PMS) و NAD⁺ از شرکت Sigma-Aldrich خریداری گردیدند.

جمع آوری نمونه­های خاک: نمونه­های خاک از مناطق مختلف شهر تهران در درکه، دربند و فرحزاد در طی فصول پاییز و زمستان سال 1386 جمع آوری شدند. نمونه­ها در کیسه های فریزر استریل قرارداده شده و تا زمان آزمایش در 4 درجه سانتی گراد نگهداری شدند.  

غربالگری آنزیمهای تخریب کننده L-پرولین:‌ روشهای اصلی غربالگری برای تولید کنندگان آنزیم­های متابولیزه کننده پرولین، به شرح زیر بودند:

تکنیک کشت غنی: غربالگری اولیه باکتریهای تولید کننده آنزیمهای دخیل در متابولیسم پرولین توسط تکنیک کشت غنی در محیط کشت حاوی پرولین به عنوان تنها منبع کربن و نیتروژن، انجام شد. یک گرم از هر نمونه خاک به 5 میلی لیتر محیط انتخابی PYP که حاوی 5 درصد (w/v) L-پرولین، یک گرم در لیتر کلرید سدیم، دو گرم در لیتر دی پتاسیم هیدروژن فسفات، نیم گرم در لیتر سولفات منیزیم، ، 5/0 گرم در لیتر عصاره مخمر و 5 گرم در لیتر پلی پپتون با 0/7 =pH بود اضافه شد و به مدت 48 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد و دور rpm140  انکوبه گردید. از هر نمونه تا ^4-10 سریال رقت تهیه شده و پس از کشت در پلیتهای آگار در دمای 37 درجه سانتی گراد و به مدت 24 ساعت انکوبه شدند. تک کلنیهای رشد کرده براساس خصوصیات مورفولوژیکی متمایز گردیده و سپس هر کلنی به یک محیط آگار جدید انتقال داده شد (2).

کروماتوگرافی لایه نازک: در غربالگری ثانویه، توانایی تخریب L-پرولین در میکروارگانیسمهای جداسازی شده توسط روش کروماتوگرافی لایه نازک، بررسی شد. به مقدار دو ماکرولیتر از هر یک از محیطهای کشت میکروارگانیسمهای رشد کرده بر روی پلیتهای سیلیکاژل کروماتوگرافی لایه نازک قرار داده شد و تخریب پرولین توسط قراردادن پلیت در حلال فاز متحرک تشکیل شده از آب واتانول، بررسی و شناسایی گردید. پلیتها پس از خشک شدن برروی Hot plate در محلول نین هیدرین 2 درصد قرار داده شدند. ظهور لکه صورتی بر روی پلیت به منزله عدم تخریب پرولین و ترشح نشدن آنزیم پرولین دهیدروژناز در سویه­ها بود که به عنوان نتیجه منفی در غربالگری تلقی می­شد. میکروارگانیسمهایی که لکه های صورتی رنگ بر روی پلیتها تشکیل ندادند به منزله نتیجه مثبت در غربالگری محسوب شده و جهت انجام آزمایشات بعدی انتخاب گردیدند (9).

کشت باکتری و تولید آنزیم: تولید آنزیم در محیط مشابه استفاده شده برای غربالگری انجام شد با این تفاوت که در آن آگار اضافه نشد. سویه­های انتخاب شده در محیط تولید تلقیح شده و در دمای 37 درجه سانتی گراد و دور rpm150 به مدت 18 ساعت در انکباتور شیکردار (Kühner shaker Switzerland ISF-1-W) انکوبه شدند. سلولهای رشد کرده در اواخر فاز لگاریتمی در g 5000 و دمای 4 درجه سانتی­گراد به مدت 30 دقیقه سانتریفیوژ شدند و بعد از خارج کردن محلول روئی، رسوب حاصل دو مرتبه با محلول سوم فیزیولوژیکی، شستشو داده شد. سلولهای شستشو داده شده پس از حل شدن در  50 میلی لیتر از بافر 100 میلی مولار (0/8 =pH) Tris-Hcl توسط سونیکاتور  و به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی­گراد لیز شدند. سپس سلولها و مواد نامحلول توسط سانتریفیوژ جدا شده و از محلول رویی در ادامه آزمایشات استفاده گردید.

سنجش فعالیت آنزیمی: فعالیت آنزیمی پرولین دهیـدروژنـاز با احیاء INT در حضور L-پرولین در طول موج 490 نانومتر توسط اسپکتروفتومتر Shimadzu uv-visible-1601PC-spectrophotometer, Japan)) مورد سنجش قرار گرفت. مخلوط واکنش با حجم 1 میلی لیتر شامل محلول 200 میلی مولار پرولین، 5/0 میلی مولار INT، 2/0 میلی مولار PMS، بافر 200 میلی مولار (5/7=pH) Tris-HCl، 2/0 میلی مولار FAD و محلول آنزیم بود. در شاهد، سوبسترای اسید آمینه به وسیله آب جایگزین گردید. 

شناسایی سوش جدا شده: شناسایی باکتری توسط مشخصات مورفولوژیکی، روشهای بیوشیمیایی و تکثیر اختصاصی PCR انجام شد (10و11).

مشخصات مورفولوژیکی: بررسی خصــوصیات مورفــولوژی کلونی باکتـریها به وسیلـه کشت آنها در سه محیـط Nutrient agar, Blood agar  و MacConkey agar(MAC) انجام شد (11).

روشهای بیوشیمیایی: مهم ترین تستهای بیوشیمیایی به شرح زیر بودند:Triple Sugar Iron Agar (TSIA)، مصرف سیترات، متیل قرمز، Voges –Proskauer test (VP)، تست حرکت، هیدرولیز اوره، تولید ایندول، اکسیداز، کاتالاز، تولید سولفید هیدروژن و تولید پلی ساکارید لوان که به این منظور سوش مورد نظر در محیط PYP حاوی 5/1 درصد آگار و 10 درصد ساکاروز کشت داده شد. تشکیل کلونیهای بزرگ و موکوئیدی نشان دهنده سودوموناس فلورسانس بودن و عدم تشکیل این کلونیها از ویژیگی سودوموناس پوتیدا بود (10و11).  

تخلیص DNA ژنومی برای واکنش PCR:  DNA ژنومی باکتری با استفاده از روش Dr. R.H. Doi استخراج گردید و صحت خلوص با استفاده از الکتروفورز برروی ژل آگاروز 7/0درصد تأیید گردید (12).

کلونینگ و توالی یابی ژن RNA ریبوزومی s16: ژن  RNA  ریبوزومی s16 توسط پرایمرهای اختصاصی  S-F (5´-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3´)16 و S-R (5´-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3´)16 تکثیر شد (13). تکثیر PCR در حجم 25 ماکرولیتر  حاوی 20 پیکومول از هر پرایمر، بافر PCR1x، 2/0 میلی مولار از هر dNTP، کلریدمنیزیم 5/1 میلی مولار، 3/0 میلی گرم DNA الگو و 5/2 واحد از DNA Taq پلی مراز  در دستگاه ترمو سایکلر ( (Thermal Cycler, Eppendorf, Germanyانجام شد. محصول PCR به دست آمده در ژل آگاروز 5/1 درصد افقی آنالیز شده و پس از برش از روی ژل تخلیص گردید. rDNA ریبوزومیs 16 تکثیر شده در وکتور pJETl.2 کلون شد و به داخل اشریشیا کلی (Escherichia coli JM107 ) ترانسفورم گردید. حامل پلاسمیدی توسط پروتکل استخراج پلاسمید از کلونیهای مثبت، جدا شد. توالی یابی توسط شرکت ماکروژن (سئول کره) با پرایمرهای توالی یابی مناسب انجام شد. توالی ژن rDNA  ریبوزومی s16 سویه با توالیهای مرجع rDNA  ریبوزومی s16 با استفاده از برنامه BLAST در NCBI روی هم اندازی شد. روی هم اندازی چندگانه توالیها و محاسبات میزان شباهت توالی توسط برنامه Clustalw انجام گرفت.

تکثیر PCR و توالی‌یابی 16S-23S rRNA Internal Transcribed Spacer (ITS): ناحیه ITS توسط پرایمرهای ITS-F (5´-CTTGTACACACCGCCCGTCA-3´) و TCCGGGTACTTAGATGTTTC-3) ITS-R (5´- تکثیر شد (14). مخلوطهای واکنش همچنان که در بالا شرح داده شد تهیه شدند. محصول PCR از روی ژل آگاروز خالص شد و در حامل PJET 1.2 کلون گردید. پلاسمید نوترکیب حاوی ژن ITS توسط پرایمرهای توالی‌یابی مناسب در شرکت ماکروژن توالی‌یابی شد و جستجوی شباهت DNA توسط پایگاه NCBI با استفاده از خدمات شبکه BLAST انجام شد.

آنالیز فیلوژنتیکی ژنهای  RNA ریبوزومی s 16 و ITS: توالیهای مرجع استفاده شده برای آنالیز فیلوژنتیکی از بانک ژن به دست آمدند. ژنهای ITS وRNA  ریبوزومی s 16 سویه جدا شده و سویه‌های مرتبط از گونه‌های سودوموناس با استفاده از نرم‌افزار MEGA روی هم‌اندازی شدند. درختهای فیلوژنتیکی توسط روش Neighbor joining با استفاده از نرم‌افزار MEGA رسم شد (15) و تست BootStarp به منظور تایید صحت و اعتبار درختهای به دست آمده 1000 برابر تکرار گردید.

شماره دسترسی به توالی نوکلئوتیدی: توالیهای کامل ژنهای s 16 و ITS سوش جدا شده تحت شماره‌های دسترسی GU208206 برای 16S rDNA و Gu289189 برای ITS در بانک ژن ثبت شدند.

تعیین پارامترهای کینتیکی:  مطالعات کینتیک حالت پایا به منظور محاسبه پارامترهای ثابت میکائیلیس-منتن (K_m ) و سرعت ماکزیمم (V_max ) ، انجام شد. جهت تعیین پارامترهای کینتیکی از نمودار معکوس دو طرفه که معادله لینویور- برک نامیده می­شود، استفاده شد. برای این منظور فعالیت آنزیمی درحضور غلظتهای مختلف سوبسترا مورد سنجش قرار گرفت و نمودار به صورت عکس تغییرات غلظت سوبسترا در مقابل عکس سرعت فعالیت آنزیمی تهیه شد (2).

جداسازی ژن کد کننده پرولین دهیدروژناز و شبیه سازی ساختار سه بعدی آنزیم: ژن پرولین دهیدروژناز توسط پرایمرهای POS-F (5´-TATCATATGCTGACCTCCTCGCTCACC-3´) و AGGATCCAATCGGCGATGCGG -3) POS-R (5´- تکثیر شد. مخلوطهای واکنش همچنانکه در بالا شرح داده شد تهیه شدند. محصول PCR از روی ژل آگاروز خالص شد و در حامل pET23a کلون گردید. پلاسمید نوترکیب حاوی ژن آنزیم توالی‌یابی شد و جستجوی شباهت DNA توسط پایگاه NCBI با استفاده از خدمات شبکه BIAST انجام گرفت. با استفاده از توالی نوکلئوتیدی به دست آمده، توالی پروتئینی آنزیم توسط برنامه DNASIS MAX software  (DNASIS version 2.9, Hitachi Software Engineering Co., Ltd., Japan). پیش بینی گردید و با استفاده از توالی پروتئینی، ساختار سه بعدی توسط برنامه Modeler version 9v9  شبیه سازی شد.

جدول 1- خصوصیات فنوتیپی و  بیو شیمیایی سویه باکتری جدا شده.

نتایج و بحث

آمینواسید L-پرولین توسط آنزیمهای پرولین دهیدروژناز و دلتا پیرولین دهیدروژناز به گلوتامات تبدیل می‌شود. آنزیمهای باکتریایی شرکت‌کننده در متابولیسم پرولین، الگوهای مستعد جالب توجهی برای مطالعه ساختار و عملکرد هومولوگهای انسانی و همچنین اندازه­گیری اختصاصی پرولین پلاسما در کیتهای تشخیصی و زیست حسگرها می‌باشند (16).

با در نظر گرفتن کاربردهای پزشکی آنزیمهای کاتابولیزکننده پرولین در تشخیص نقایص مادرزادی متابولیسم پرولین باعث شد تا در این مطالعه تصمیم به جداسازی این کاتالیزورهای زیستی از میکروارگانیسم‌های ساکن خاک گردد. در جریان غربالگری اولیه در محیط حاوی L-پرولین به عنوان تنها منبع کربن و نیتروژن، 150 سویه جدا شدند. توانایی هر سوش جدا شده در تخریب L-پرولین نیز مورد آزمایش قرار گرفت. 20 تا از میکروارگانیسم‌های جدا شده که قادر به تخریب پرولین بودند توسط کروماتوگرافی لایه نازک تعیین شدند. ظاهر شدن لکه برروی ورقه کروماتوگرافی لایه نازک به عنوان عدم تخریب پرولین در نظر گرفته شد. به منظور تایید این انتخابها، سوشهای باکتریایی که قادر به استفاده از L-پرولین بودند در محیط تولید کشت داده شدند و فعالیت آنزیمی اندازه‌گیری شد. در مجموع از میان 20 سویه جدا شده، تنها سوش POS-F84 که از خاک آب گل‌آلود جدا شده بود، به عنوان سوش تخریب کننده L-پرولین در نظر گرفته شد. به منظور شناسایی سوش POS-F84، آنالیزهای مورفولوژیکی، بیوشیمیایی و ژنتیکی انجام شد. باکتری جدا شده، گرم منفی، میله‌ای شکل و متحرک بود. نتایج تستهای بیوشیمایی در جدول 1 نشان داده شده است. خصوصیات بیوشیمیایی نشان داد که سویه جداسازی شده  شبیه به سودوموناس پوتیدا می‌باشد.

تشخیص بیشتر توسط مقایسه توالی rDNA s 16 و دیگر باکتریها در پایگاه بانک ژن انجام شد. به این منظور ابتدا ژن DNA ریبوزومی s 16 توسط واکنش PCR تکثیر شد و توالی یابی گردید. شکل 1 محصول حاصل از PCR انجام شده بر روی ریبوزومی s 16 را نشان می دهد که طول محصول 1500 جفت باز تخمین زده شد. توالی ژن   DNA ریبوزومی s 16 سویه POS-F84 دارای 99 و 98 درصد شباهت به ترتیب با توالیهای سودوموناس پوتیدا و سودوموناس انتموفیلا بود. روی هم‌اندازی متعدد توالیها و آنالیز فیلوژنتیکی نشان داد که سوش جدا شده به سودوموناس انتموفیلا نزدیک‌تر بود (شکل2).

شکل 1- تصویر الکتروفورز ژل آگاروز 1 درصد از PCR انجام شده بر روی ژن RNA ریبوزومی s16 . مارکر kb 1. 1: ‍ژن  RNA ریبوزومی s16  PCR شده ( bp1500).

لیکن، با درنظرگرفتن ارتباط نزدیک بین سودوموناس پوتیدا و سودوموناس انتموفیلا (2/70 درصد از ژنهای سودوموناس انتموفیلا دارای شباهت با ژنوم سودوموناس پوتیدا هستند)، این تفاوت 1 درصدی نمی‌توانست برای تشخیص دقیق سوش مورد نظر کافی باشد (17).

شکل 2- درخت فیلوژنتیکی ترسیم شده از ژن  RNA ریبوزومی s16 سوش جدا شده و باکتریهای خانواده سودوموناس ها. درخت فیلوژنتیکی توسط روش Neighbor joining و با استفاده از نرم‌افزار MEGA رسم شد.

شکل 3- درخت فیلوژنتیکی ترسیم شده از ژن ITS سوش جدا شده و باکتریهای خانواده سودوموناس ها. درخت فیلوژنتیکی توسط روش Neighbor joining و با استفاده از نرم‌افزار MEGA رسم شد.

شکل 4- تمودار لینویور- برک ترسیم شده برای پرولین دهیدروژناز در حضور سوبسترای L-پرولین.

در حقیقت، تنوع ناکافی در توالیهای ژن rRNA s 16 به منظور تمایز گذاشتن در میان ارگانیسم‌های نزدیک به هم خصوصاً در سطوح بین گونه‌ای وجود دارد (18). از این رو پیشنهاد شده است که ناحیه ITS می‌تواند به دلیل تفاوت زیادتر در طول و توالی، بر این مشکل غلبه کند. در حقیقت، استفاده از پلی مورفیسم ITS یک ابزار قدرتمند در آنالیز فیلوژنتیکی است. به این دلایل، در این تحقیق به منظور تمایز دقیق سویه جدا شده POS-F84، ناحیه ITS توالی‌یابی گردید. نوکلئوتید ITS توسط برنامه BLAST آنالیز شد و به ترتیب 97 و 94 درصد شباهت با ITS سویه‌های سودوموناس پوتیدا و سودوموناس انتموفیلا نشان داد. براساس درخت فیلوژنتیکی ترسیم شده برای توالیهای ITS ( شکل3). نتیجه گیری شد که سوش POS-F84 بیشتر شبیه به سودوموناس پوتیدا بود. بنابراین، این سویه به عنوان بیوتایپ جدیدی از سودوموناس پوتیدا تشخیص داده شد. پارامترهای ثابت میکائیلیس-منتن و سرعت ماکزیمم برای آنزیم پرولین دهیدروژناز در سودوموناس پوتیدا به ترتیب 12/0 میلی مولار و 11/0 میلی مولار بر دقیقه اندازه گیری شدند. شکل 4 نمودار لینویور- برک ترسیم شده برای آنزیم مذکور را نشان می­هد. ثابت میکائیلیس-منتن پرولین دهیدروژناز جدا شده نسبت به آنزیم مشابه در سویه­های باکتریایی دیگر نظیر سودوموناس آئروجینوزا (4)، سالمونلا تیفوموریم (Salmonella typhimurium) (5) و اشریشیا کلی (7) پایین تر بود که این خصوصیت از ویژگیهای قابل توجه آنزیم جدا شده محسوب می شد. جهت مطالعات بیوانفورماتیکی بر روی آنزیم، ساختار سه بعدی توسط برنامه Modeler  شبیه سازی شد. شکل 5 تصویر ساختار سه بعدی پرولین دهیدروژناز را در دو نمایش نواری  (Ribbon) و کره ای (Sphere) نشان می دهد. ساختار شبیه­سازی شده شباهت قابل ملاحظه­ای با آنزیمهای خانواده سودوموناسها نظیر سودوموناس آئروجینوزا و سودوموناس فلورسانس داشت (19و20). آنالیز جایگاه فعال نشان داد که دنباله های تیروزین، لیزین و آسپارژین در اتصال به کوفاکتور و واکنش کاتالیتیکی دخالت دارند که این دنباله های آمینواسیدی در پرولین دهیدروژنازهای سودوموناسها حفاظت شده می باشند.

شکل 5- ساختار سه بعدی پیش بینی شده برای پرولین دهیدروژناز. الف) نمایش نواری، ب) نمایش کره ای.