نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه بوعلی سینا

2 پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی

چکیده

باباآدم، گیاه دارویی با اهمیتی است که حاوی ترکیبات دارویی فراوانی از جمله آرکتین و آرکتیژنین می¬باشد که خواص ضد سرطانی این متابولیت¬های ثانویه شناخته شده است. پیشرفت در روش¬های کشت بافت و باززایی این گیاه در شرایطin vitro به منظور آسان نمودن روش¬های انتقال ژن به این گیاه دارویی بسیار مهم می¬باشد. در این تحقیق، برای کالوس¬زایی در گیاه باباآدم، از ریزنمونه¬های برگ، دمبرگ و ریشه گیاهچه¬های 2 هفته¬ای استفاده شد. این ریزنمونه¬ها برای کالوس¬زایی در محیط کشت MS حاوی 5/0 درصد PVP (به عنوان آنتی¬اکسیدان)، و ترکیبی از غلظت¬های هورمونی مختلف BA و2,4-D قرار گرفتند. این آزمایشات نشان داد که از نظر تیپ ریزنمونه، ریزنمونه¬های دمبرگ بیشترین کالوس¬زایی را داشتند. از نظر غلظت¬های هورمونی، ترکیب دو هورمون در غلظت-های mg/L BA 5/0+ mg/L 2,4-D 1 و همچنینBA mg/L 1+ mg/L 2,4-D 2 بیشترین میزان تولید کالوس را نشان دادند و در نتیجه بهترین تیمارها برای القاء کالوس در گیاه دارویی باباآدم بودند.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Callus induction in Burdock (Arctium lappa L.)

نویسنده [English]

  • mehrnaz keyhanfar 1

چکیده [English]

Burdock (Arctium lappa L.) is an important medicinal plant containing arctiin and arctigenin, which are important secondary metabolits used as anticancer reagents. Due to the existence of important secondary metabolites in this plant, development of a reliable in vitro tissue culture and regeneration methods to facilitate genetic transformation in this plant is important. In the current study, for optimization of the callus induction, leaf, petiole and root explants of A. lappa were cultured in solid MS medium, which was supplemented with 0.5% PVP (as an anti-oxidant) and different concentrations and combinations of BA and 2,4-D hormones. This study revealed that the petiole explants induced highest callus rate comparing to the other tested explants. In addition, two hormones combined concentrations of 0.5 mg/L BA + 1.0 mg/L 2,4-D and 1.0 mg/L BA + 2.0 mg/L 2,4-D, produced the highest amount of callus and were the most suitable treatments for the callus induction.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Burdock
  • tissue culture
  • callus induction
  • antioxidant compounds
  • plant phytohormones

القای کالوس در گیاه دارویی باباآدم (Arctium lappa L.) 

طیبه سلیمانی1، مهرناز کیهانفر2*، خسرو پیری1 و طاهره حسنلو3

1 همدان، دانشگاه بو علی سینا، ‌دانشکده کشاورزی، گروه بیوتکنولوژی 

2 اصفهان، دانشگاه اصفهان، دانشکده علوم و فناوری­های نوین، گروه زیست­فناوری

3 کرج، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی، بخش فیزیولوژی مولکولی

تاریخ دریافت: 6/4/91                 تاریخ پذیرش: 9/4/92

چکیده

باباآدم، گیاه دارویی با اهمیتی است که حاوی ترکیبات دارویی فراوانی از جمله آرکتین و آرکتیژنین می­باشد که خواص ضد سرطانی این متابولیتهای ثانویه شناخته شده است. پیشرفت در روشهای کشت بافت و باززایی این گیاه در شرایطin vitro  به منظور آسان نمودن روشهای انتقال ژن به این گیاه دارویی بسیار مهم می­باشد. در این تحقیق، برای کالوس­زایی در گیاه باباآدم، از ریزنمونه­های برگ، دمبرگ و ریشه گیاهچه­های 2 هفته­ای استفاده شد. این ریزنمونه­ها برای کالوس­زایی در محیط کشت MS حاوی 5/0 درصد PVP (به عنوان آنتی­اکسیدان)، و ترکیبی از غلظتهای هورمونی مختلف BA و2,4-D قرار گرفتند. این آزمایشات نشان داد که از نظر تیپ ریزنمونه، ریزنمونه­های دمبرگ بیشترین کالوس­زایی را داشتند. از نظر غلظتهای هورمونی، ترکیب دو هورمون در غلظتهای mg/L BA 5/0+ mg/L 2,4-D 1 و همچنینBA  mg/L 1+ mg/L 2,4-D 2 بیشترین میزان تولید کالوس را نشان دادند و در نتیجه بهترین تیمارها برای القای کالوس در گیاه دارویی باباآدم بودند.

واژه های کلیدی: باباآدم، کشت بافت، کالوس­زایی، ترکیبات آنتی اکسیدانی، هورمونهای رشد گیاهی

* نویسنده مسئول، تلفن: 37934402-031، پست الکترونیکی: m.keyhanfar@ast.ui.ac.ir

مقدمه 

 

گیاه باباآدم با نام انگلیسی Burdock و نام علمی
 Arctium lappa L. گیاهی از خانواده کاسنی می­باشد (2) و دارای ترکیبات لیگنانی فراوانی ازجمله آرکتین و آرکتیژنین می­باشد (10 و 14) که این متابولیتهای ثانویه دارای فعالیتهای بیولوژیکی متنوعی از جمله ضد سرطان، ضدالتهاب، آنتی­اکسیدان و اثرات ضدمیکروبی می­باشند. خاصیت ضد سرطانی این متابولیتهای ثانویه بر روی رده­های سلولهای سرطانی پانکراس و سرطان کلون و در نتیجه القای مرگ سلولی برنامه ریزی شده در این سلولها گزارش شد (6، 27و 30). همچنین دی­آرکتیژنین که از بذر گیاه مذکور جدا شده است، به عنوان بازدارنده تولید نیتریک­اکساید در ماکروفارژها می­باشد. قابل ذکر است که نیتریک­اکساید نوعی رادیکال آزاد است که در پروسه­های فیزیولوژی و فیزیولوژی بیماری، از جمله در ایجاد شوکهای عفونی و تصلب شریان نقش مهمی دارد (17). علاوه بر این چندین ترکیب لیگنانی با اثرات ضد ویروس (به خصوص ضد ویروس HIV)، در این گیاه شناسایی شده­اند (26). گیاه A. lappa دارای خواص دارویی متعددی می­باشد. خصوصیات آنتی­آسکوربوتیک این گیاه آن را داروی گیاهی مناسب برای درمان التهاب، کمبود ویتامین C و دردهای روماتیسمی می­سازد. این گیاه به عنوان یک تسکین دهنده طبیعی به منظور شستشوی سطحی زخمها و اختلالات و ناهمواریهای پوستی مورد استفاده قرار می­گیرد (10). ریشه باباآدم دارای اثر تصفیه کننده خون، مدر و معرق است و مصرف آن به منظور درمان نقرس، روماتیسم، سنگ کلیه و بیماریهای پوستی نظیر، اگزما و خشکی پوست، جوشهای صورت، دانه­های غرور و سرخک از گذشته معمول بوده است. همچنین ریشه گیاه مذکور در معالجه زخمهای حاصل از سوختگی، التهاب مخاط دهان و گلو مؤثر است (10).

با توجه به اهمیت گیاه دارویی باباآدم و پایین بودن میزان ترکیبات دارویی موجود در گیاه طبیعی، استفاده از روشهایی برای افزایش تولید متابولیتهای ثانویه مهم در این گیاه، ضروری به نظر می­رسد. همچنین برداشت بی رویه آن از طبیعت ممکن است باعث انقراض نسل این گیاه دارویی شود. استفاده از روشهای بیوتکنولوژی شامل، کشت بافت و ریزازدیادی به تولید انبوه این گیاه با اهمیت در یک سطح محدود و جلوگیری از انقراض نسل آن منجر می­گردد.

ازدیاد در شرایط in vitro دارای پتانسیل عظیمی برای تولید گیاهان دارویی با کیفیت بالا می­باشد که این مهم، می­تواند از طریق روشهای مختلف ریزازدیادی به دست آید. ریزازدیادی در گونه­های گیاهی متنوعی از جمله تعداد زیادی از گیاهان دارویی شامل، Catharanthus roseus، Cinchona ledgeriana، Digitalis spp، Datura melet، Bacopa monnieri و Chlorophytum borivilianum نتایج مطلوبی را نشان داده است (15 و 28). در تکثیر گیاهان دارویی، باززایی گیاه از کالوس، نیز به منظور تکثیر گیاهان دارویی کاربرد فراوانی دارد (19). باززایی گیاه از کالوس در گیاهان دارویی چون Plumbago rosea، Dioscorea alata، Mentha arvensis و  Echinacea pallida و چندین گونه گیاه دارویی دیگر گزارش شده است (28). همچنین بافت کالوس گیاهی علاوه بر ازدیاد گیاهان، قابلیتهای متنو ع دیگری نیز دارد که از جمله می­توان به استفاده از آنها در انتقال ژن به گیاه و یا کاربرد آن در تهیه کشتهای سوسپانسیون سلولی به منظور تولید متابولیتهای ثانویه و یا ترکیبات مفید دیگر حاصل از آنها اشاره نمود (15).

گزارشات در مورد کشت بافت و القای کالوس در گیاه دارویی باباآدم بسیار محدود می­باشد و تنها یک مورد، توسط هی و همکاران در سال 2006، گزارش شده است (12). در تحقیق حاضر سعی بر آن بوده است که بهینه­سازی کالوس­زایی در ریزنمونه­های گیاه باباآدم انجام شود. قابل ذکر است که کالوس­زایی در گیاه دارویی باباآدم بومی ایران، تا کنون گزارش نشده است و برای اولین بار در این تحقیق انجام گرفت.

مواد و روشها

جمع آوری، استریل کردن و کشت بذور باباآدم : بذور گیاه دارویی باباآدم از باغ گیاهان دارویی استان همدان جمع آوری شد و پس از استریل کردن به وسیله محلول هیپوکلریت سدیم 2 درصد (v/v) به مدت 13 دقیقه و اتانول 70 درصد (v/v) به مدت 1 دقیقه، با آب مقطر شستشو داده شد و سپس به منظور جوانه­زنی بر روی کاغذ صافی مرطوب و استریل کشت گردید و در اتاق رشد با دمای  2±25 درجه سانتی گراد نگهداری شد.

بهینه­سازی القای کالوس در گیاه باباآدم: برای تولید کالوس در ریزنمونه­های باباآدم از سه اندام برگ، دمبرگ و ریشه گیاهچه­های 3 هفته­ای ریزنمونه تهیه شد. همچنین از غلظتهای هورمونی مختلف 2,4-dichlorophenoxy acetic acid (2,4-D) و Benzyladenine (BA) به صورت ترکیب با هم و مطابق جدول 1 استفاده شد (12). این آزمایش در قالب طرح کاملاً تصادفی و در دو سطح (سطح اول شامل غلظتهای هورمونی مختلف، سطح دوم نوع ریزنمونه) انجام شد. همچنین از 4 تکرار و در هر تکرار از سه ریزنمونه استفاده گردید. در تمامی مراحل آزمایش، علاوه بر ترکیبات هورمونی مورد نظر، ترکیب پلی وینیل پیرولیدون (PVP) به نسبت 5/0 درصد نیز به محیط کشت  MS جامد حاوی g/L 30 ساکارز و g/L 7 آگار، اضافه شد (23) . لازم به توضیح است که مشاهدات در این تحقیق نشان داد که ریزنمونه­های گیاه باباآدم در شرایط کشت in vitro قهوه­ای شده و از بین رفتند که می­تواند به دلیل ترشح ترکیبات فنولی باشد (5). استفاده از PVP (یا هر ترکیب آنتی­اکسیدان مناسب دیگر) می­تواند مانع ترشح ترکیبات فنولی از ریزنمونه­های باباآدم شده و در نتیجه از قهوه­ای شدن بافت ریزنمونه­ها و محیط کشت حاوی آنها جلوگیری ­کند (5). آزمایشات بهینه­سازی در این مطالعه نشان داد که استفاده از PVP در غلظت 5/0 درصد از قهوه­ای شدن ریز نمونه­ها جلوگیری کرد (3). کشت­ها در اتاق رشد با شرایط دمای 2±25 درجه سانتی گراد و در شرایط تاریکی قرار گرفتند. یک ماه بعد، مشاهده ماکروسکوپی برای بررسی تولید یا عدم تولید کالوس انجام گرفت. تجزیه آماری داده­ها با استفاده از نرم افزار (sas (ver 9.1 و به روش آماری GLM انجام شد و به منظور مقایسه میانگینها از آزمون چند دامنه­ای دانکن در سطح احتمال 5%= α استفاده گردید.

جدول 1- غلظتهای هورمونی مورد استفاده برای کالوس زایی

هورمون (mg/L)

A

B

C

D

BA

0

5/0

1

2

2,4-D

0

1

2

3

نتایج و بحث

تاثیر نوع ریزنمونه بر میزان کالوس­زایی: آزمون میانگین کالوس­زایی در ریزنمونه­های گیاه باباآدم نشان داد که ریزنمونه­های مورد استفاده تفاوت معنی­داری در میزان تولید کالوس داشتند (شکل- 1). ریزنمونه دمبرگ بیشترین مقدار و ریشه کمترین مقدار کالوس­زایی را نشان دادند.

نوع ریزنمونه یک فاکتور با اهمیت برای تشکیل کالوس است. بر اساس این نتایج، بافت دمبرگ در گیاهچه­های باباآدم، بهترین ریزنمونه برای تولید کالوس می باشد.

 

شکل 1- میانگین کالوس­زایی در ریزنمونه­هابی مختلف گیاه دارویی باباآدم. حروف a و b در بالای ستونها معنی­دار بودن یا عدم معنی دار بودن اختلاف بین تیمارها در سطح احتمال 5%= α  را نشان می­دهد.

 

شکل 2-  میانگین کالوس­زایی گیاه دارویی باباآدم در سطوح هورمونی مختلف. حروف a، b و c در بالای ستونها معنی­دار بودن یا عدم معنی­دار بودن اختلاف بین تیمارها در سطح احتمال 5%= α را نشان می­دهد.

همچنین گزارش شده است که انواع مختلف ریزنمونه­ها، به منظور القای کالوس در گیاه Cannabis sativa L. مورد بررسی قرار گرفت و مشخص شد که در این گیاه، ریزنمونه­های دمبرگ، مستعدترین بافت برای القای کالوس می­باشد (21). بر خلاف نتایج این تحقیق، خرمی­راد و همکاران (2012)، اثر ریزنمونه­های مختلف را بر روی القای کالوس در گیاه Anthurium andreanum مورد بررسی قرار دادند و نشان دادند که استفاده از ریزنمونه دمبرگ برای القای کالوس در این گیاه، مناسب نیست (16).

همچنین نتایج تحقیق حاضر نشان داد که،  ریزنمونه  ریشه

برای القای کالوس در گیاه دارویی باباآدم مناسب نیست. همانند نتایج این تحقیق، ویجی و همکاران (2010)، پس از بررسی ریزنمونه­های مختلف برای تولید کالوس در گیاه Citrus jambhiri، گزارش کردند که از ریزنمونه­های ریشه، کمترین میزان تولید کالوس حاصل گردید (29).

تأثیر غلظتهای هورمونی بر میزان کالوس­زایی در گیاه دارویی باباآدم: در نتایج آزمون میانگین کالوس­زایی تحت تأثیر سطوح هورمونی مورد استفاده (شکل-2)، مشاهده شد که سطوح هورمونی مختلف به طور معنی­داری بر میزان تولید کالوس اثر داشته­اند و تیمار ریزنمونه­ها با سطح هورمونیB  یعنی mg/L BA 5/0+ mg/L 2,4-D 1، بیشترین تأثیر را بر کالوس­زایی نشان داد. در حالی که تیمار ریزنمونه­ها با mg/L BA 2+ mg/L 2,4-D 3 (سطح هورمونیD) کمترین تأثیر را بر میزان کالوس­زایی گیاه داشته است.

 

 

شکل 3- مقایسه نوع ریزنمونه و سطوح هورمونی (میلی گرم بر لیتر)، در میزان کالوس زایی. حروف  a، b، c و d معنی­دار بودن یا عدم معنی دار بودن اختلاف بین تیمارها در سطح احتمال 5%= α را نشان می­دهد.

 

الف

 

 

ب

 

 

ج

 

 

ه

 

 

د

 

 

شکل-4- کالوس­زایی در ریزنمونه­های گیاه باباآدم: الف و ب) کالوس­زایی در برگ،ج) کالوس­زایی در ریشه، د ) کالوس­زایی در دمبرگ،ه) نمونه­های کنترل (بدون استفاده از هورمونهای گیاهی)


برهمکنش میان نوع ریزنمونه و غلظتهای هورمونی در تولید کالوس: آزمون میانگین برهمکنش میان نوع ریزنمونه و سطوح هورمونی مختلف نشان داد که نوع ریزنمونه و سطوح هورمونی به کار رفته تفاوت معنی­داری بر تولید کالوس داشته است (شکل-3). ریزنمونه برگی در سطوح هورمونی (B و C)، ساقه در سطح هورمونی (B) و ریشه در سطح هورمونی (A و B) دارای نتایج مشابه بودند و بیشترین میزان کالوس­زایی را نشان دادند. ریزنمونه برگ در سطح هورمونی (D) کمترین میزان کالوس­زایی را نشان داد. ریزنمونه­های برگ در این سطح هورمونی در نواحی زخمی قهوه­ای شدند و تدریجاً از بین رفتند.

استفاده از غلظتهای مختلف هورمونهای گیاهی چون، 2,4-D و BA در تحقیقات مختلفی گزارش شده است. بسته به گونه گیاهی، نوع و سن ریزنمونه­های مورد استفاده، غلظت به خصوصی از این هورمونها بیشترین تأثیر را در کالوس­زایی گیاه نشان داده است. برای نمونه، هی و همکاران (2006)، اثر هورمونهای رشد گیاهی را بر کالوس­زایی گیاه باباآدم بررسی کردند و نشان دادند که 2,4-D با غلظت 2 میلی­گرم در لیتر و BA در دامنه غلظتی 1 تا 2 میلی­گرم در لیتر، بیشترین درصد فراوانی (100 درصد) را برای تولید کالوس داشتند (12). در تحقیق دیگری، دهار و جوشی (2005) اثر هورمونهای رشد را روی کالوس­زایی ریزنمونه­های مختلف (برگ، ساقه، ریشه و هیپوکوتیل) گیاه Saussurea obvallata بررسی نموده و دریافتند که ریزنمونه برگی و غلظت هورمونی 5/2 میلی­گرم BA و 10 میلی­گرم NAA بیشترین میزان کالوس­زایی را داشتند (9). ایشی و همکاران (1998) گزارش کردند که محیط کشت حاوی ترکیبی از 1/0 میلی گرم بر لیتر 2,4-D و 01/0 میلی گرم بر لیتر BA نسبت به سایر غلظتهای مورد استفاده از این دو هورمون، بیشترین تاثیر را بر کالوس­زایی گیاه Phalaenopsis داشتند (13). همچنین در گیاه
 Ceropegia candelabrum L ترکیبی از BA و 2,4-D برای القای کالوس مؤثر واقع شد (7). کالوس­زایی توسط ترکیبی از این دو هورمون گیاهی در گیاهان دیگری مانند galanga L. Kaempferia و Curcuma longa L. نیز مورد بررسی قرار گرفته و نتایج مشابهی را داشته است (25).  

در تحقیق حاضر زمانی که ترکیبی از BA و 2,4-D در سطوح هورمونی B و C یعنی  به ترتیب غلظتهای mg/L BA 5/0+ mg/L 2,4-D 1 و mg/L BA 1+ mg/L 2,4-D 2 مورد استفاده قرار گرفتند، بیشترین میزان کالوس­زایی مشاهده شد. در سطح هورمونی B، همه ریزنمونه­ها، حتی ریزنمونه­های ریشه، بیشترین میزان کالوس­زایی را نشان دادند و با افزایش غلظتهای هورمونی، به تدریج میزان کالوس­زایی هم کاهش یافت، تا آنجا که بافت ریزنمونه­های برگی، در بالاترین غلظت هورمونی مورد استفاده (سطح D)، قهوه­ای شده و این ریزنمونه­ها بدون تولید هیچ کالوسی کاملاً از بین رفتند. مشابه این نتیجه را ویجی و همکاران (2010)، برای القای کالوس در گیاه Citrus jambhiri به دست آوردند. آنها متوجه شدند زمانی که از غلظتهای کمتر 2,4-D (mg/L1) استفاده نمودند، بیشترین میزان کالوس در این گیاه به دست می آید (29).

 قهوه­ای شدن ریزنمونه­های باباآدم را می­توان، به دلیل وجود ترکیبات فنولی فراوان و اکسید شدن آن توسط آنزیم پلی­فنل­اکسیداز دانست. ترکیب ΡVΡ به عنوان جاذب ترکیبات فنولی عمل می­کند و در نتیجه، این ترکیبات را (ترکیبات فنولی) از دسترس آنزیم پلی­فنل­اکسیداز دور نگه داشته و مانع قهوه­ای شدن بافت می­گردد (20). از آنجایی که سنتز ترکیبات فنولی در برگ انجام می­گیرد و سپس به سایر اندامها انتقال می­یابد، بنابراین میزان ترکیبات فنولی در ریزنمونه برگی بیشتر از سایر انواع ریزنمونه­های مورد استفاده می­باشد (8).

ΡVΡ همچنین می­تواند تنظیم کننده­های رشد گیاهی را هم جذب کند (18). احتمالاً، زمانی که سطوح بالای غلظت هورمونی (سطح D) برای ریزنمونه­های برگی به کار رفت، باعث شد که این ترکیبات هورمونی، برای جذب توسط ΡVΡ، در رقابت با ترکیبات فنولی قرار بگیرند. در نتیجه این عوامل،ΡVΡ مورد نیاز برای جلوگیری از قهوه ای شدن بافت در ریزنمونه­های برگی (که در سطح هورمونی D تیمار شده بودند) کم بوده و در نتیجه منجر به قهوه­ای شدن بافت و نهایتاً مرگ این ریزنمونه­ها شده است.

اکسین و سیتوکنین به عنوان تنظیم کننده­های رشد گیاهی، فاکتورهای کلیدی برای کنترل تقسیم سلولی در شرایط کشت بافت می­باشند. از این بین استفاده از 2,4-D (به عنوان اکسین) و BA (به عنوان سیتوکنین) به منظور تولید کالوس در کشت بافت گیاهان زیادی گزارش شده است (4 و 16) . تنوع در فراوانی تولید کالوس در پاسخ به سطوح مختلف هورمونی، می­تواند به دلیل تمایز در بیان ژنهای کنترل کننده تولید کالوس باشد. همچنین ممکن است که در بعضی از سطوح هورمونی مورد استفاده، برخی از ژنهای مسئول در سنتز کالوس، به طور کامل بیان نشوند (22). به علاوه، گزارش شده است که غلظتهای خیلی زیاد هورمون 2,4-D ممکن است برای بیان ژنهای درگیر در تقسیم سلولی و تمایززدایی بافت، مهار کننده باشد (22). همچنین استفاده از BA به همراه ایندول استیک اسید (IAA) تغییرات معنی داری را در رشد اندام هوایی گیاه تاتوره تماشایی نشان داده است (1).

نتایج بررسی میانگین کالوس زایی در ریز نمونه های مختلف گیاه باباآدم نشان داد که ریزنمونه­های دمبرگ بیشترین میزان کالوس­زایی را نسبت به سایر ریزنمونه­ها دارد (شکل- 1). در مجموع، نتایج این مطالعات نشان داد که پاسخ به القای کالوس، هم به نوع ریزنمونه­ها و هم به غلظت هورمونی مورد استفاده بستگی دارد و موفقیت در کشت بافت این گیاه، با انتخاب ریزنمونه مناسب وابسته است. نتایج مشابهی برای گیاهانی مانند Holarrhena antidysenterica (24) و Lonicera japonica (11) گزارش شده­ است. این مطالعات نشان دادند که نوع ریزنمونه تأثیر به سزایی در القای کالوس در این گیاهان داشته است.

تحقیق حاضر روش ساده­ای را برای القاء کالوس توسط هورمونهای گیاهی قابل دسترس ارائه می­دهد. با وجود اینکه در شرایط عدم استفاده از هورمونهای گیاهی (نمونه کنترل) هم کالوس ایجاد شد، اما کالوسهای ایجاد شده از نظر مقدار، رنگ و ساختمان با کالوس تولید شده در محیطهای کشت دارای هورمونهای گیاهی، متفاوت بودند (شکل- 4). مقدار کالوس تولید شده در نمونه­های کنترل نسبت به نمونه­های موجود در محیط هورمون­دار بسیار کمتر بوده و خیلی زود تبدیل به کالوسهای دارای رنگ قهوه­ای تیره می­شدند. همچنین این کالوسها دارای جنس نرم بودند. در صورتی که کالوسهای ایجاد شده در شرایط هورمون­دار (به خصوص کالوسهای حاصل از ریزنمونه های برگ و دمبرگ) دارای رنگ سفید یا قهوه­ای روشن، و ترد بوده و همچنین در برخی موارد به نظر می­آمد که کالوسهای جنین­زا (سفید، سفت و گرانوله یا کروی) تولید شده است. البته بررسیهای بعدی برای صحت این احتمال در حیطه این آزمایش نبوده است. هر چند به نظر می­رسد که خصوصاً ریزنمونه­های برگی در محیطهای با غلظتهای هورمونی سطح B، بالقوه توانایی تولید کالوس جنین­زا را دارند.

 

 

1- تشکری میانرودی، ح، کریمی، ف، تقی زاده، م،1390، ریز ازدیادی گیاهچه های تاتوره تماشایی(Datura innoxia)  با استفاده از IAA و BA و افزایش محتوای تروپان آلکالوئید گیاهچه ها تحت تاثیر تیمار با پوترسین، مجله زیست شناسی ایران، جلد 24، 365-355

2- زرگری، ع، 1370، گیاهان دارویی، انتشارات دانشگاه تهران، جلد 3

3- سلیمانی، ط، کیهانفر، م، پیری، خ، حسنلو، ط، 1389، کنترل ترشح ترکیبات فنولی و اثر تنظیم کننده های رشد برای القای کالوس در گیاه دارویی Arctium lappa L.، یازدهمین کنگره ژنتیک ایران، تهران، دانشگاه شهید بهشتی.

4- شرفی، ع، هاشمی سهی، ه، جورابچی، ع، 1387، بهینه سازی شرایط باززایی گیاه دارویی Artemisia annua، مجله زیست شناسی ایران، جلد 21، 565-573

 

5- Abdelwahd, R, Hakam, N, Labhilili, M and Udupa, SM, 2008, Use of an adsorbent and antioxidants to reduce the effects of leached phenolics in in vitro plantlet regeneration of faba bean, Afr. J. Biotechnol, 7(8): 997-1002.

6- Awale, S, Lu, J, Kalauni, SK, Kurashima, Y, Tezuka, Y, Kadota, S and Esumi, H, 2006, Identification of arctigenin as an antitumor agent having the ability to eliminate the tolerance of cancer cells to nutrient starvation, Cancer Res, 66(3): 1751-1757.

7- Beena, MR and Martin, KP, 2003, In vitro propagation of the rare medicinal plant Ceropegia candelabrum L. through somatic embryogenesis, In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant, 39:510–513.

8- Chamandoosti, F, 2010, The relationship between plant growth regulators for organogenesis and phenolic compound in Cotton (Gossypium hirsutum L.), Asian J. Dev. Biol, 2(1): 16-22.

9- Dhar, U, Joshi, M, 2005, Efficient plant regeneration protocol through callus for Saussurea obvallata (DC.) Edgew. (Asteraceae): effect of explant type, age and plant growth regulators, Plant Cell Rep, 24(4):195-200.

10- Dweck, A, 1995, Cosmetics and toiletries advanced technology conference, Botanicals-Research of Actives, Paris.

11- Georges, D, Chenieux, JC, Ochatt, SJ, 1993, Plant regeneration from aged callus of the woody ornamental species, Lonicera japonicacv. ‘Halls Prolific’, Plant Cell Reproduction, 13: 91–94.

12- He, WT, Hou, SW, and Wang, CY, 2006, Callus induction and high-frequency plant regeneration from hypocotyls and cotyledon explants of Arctium lappa L. In Vitro Cell, Dev. Biol. Plant, 42: 411–414.

13- Ishii, Y, Takamura, T, Goi, M and Tanaka, M, 1998, Callus induction and somatic embryogenesis of Phalaenopsis, Plant Cell Reports, 17: 446–450.

14- Kamkaen, N, Matsuki, Y, Ichino, C, Kiyohara, H and Yamada, H, 2006, The Isolation of the Anti-Helicobacter Pylori Compounds in Seeds of Arctium lappa Linn., Thai Pharmaceutical and Health Science Journal, 1)2): 12-18.

15- Kayser, O, and Quax, WJ, 2007, Medicinal Plant Biotechnology, Wiley-Vch Verlag GmbH & Co.

16- Khorrami Raad, M, Bohluli Zanjani, S, Ramezani Sayyad, A, Maghsudi, M, Kaviani, B, 2012, Effect of Cultivar, Type and Age of Explants, Light Conditions and Plant Growth Regulators on Callus Formation of Anthurium, American-Eurasian J. Agric. & Environ. Sci., 12(6): 706-712.

17- Kim, BH, Hong, SS, Kwon, SW, Lee, HY, Sung, H, Lee, IJ, Hwang, BY, Song, S, Lee, CK, Chung, D, Ahn, B, Nam, SY, Han,SB, and Kim, Y, 2008, Diarctigenin, a Lignan Constituent from Arctium lappa, Down-Regulated Zymosan-Induced Transcription of Inflammatory Genes through Suppression of DNA Binding Ability of Nuclear Factor-kappaB in Macrophages, J. Pharmacol. Exp. Ther, 327(2):393-401.

18- Kiong, ALP, Thing, YS, Gansau, JA and Hussein, S, 2008, Induction and multiplication of callus from endosperm of Cycas revolute Afr. J. Biotechnol, 7(23): 4279-4284.

19- Kokate, CK, 2006, Medicinal plant biotechnology, CBS publisher and distributors..

20- Krishna, H, Sairam, RK, Singh, SK, Patel, VB, Sharma, RR, Grover, M, Nain, L, and Sachdev, A, 2008, Mngo explant browning: effect of ontogenic age, mycorrhization and pre-treatments, Scientia horticulturae, 118(2): 132-138.

21- Lusarkiewicz-Jarzina, A, Ponitka, A and Kaczmarek,  Z, 2005, Influence of cultivar, explants source and plant growth regulator on callus induction and plant regeneration of Cannabis sativa L., ACTA Biologica Cracoviensia Series Botanica, 47(2): 145–151.

22- Mahmood, I, Razzaq, A, Khan, ZUD, Hafez, IA and Kaleem, S, 2012, Evaluation of tissue culture responses of  promising Wheat (Triticum  aestivum L.) cultivars and development of efficient regeneration system, Pak. J. Bot., 44: 277-284.

23- Murashige, T, and Skoog, F,  1962, A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture, Physiol Plant, 15: 473-479.

24- Raha, S, Roy, SC, 2003, Efficient plant regeneration in  Holarrhena antidysentrika Wall., from shoot segment derived callus,  In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant, 39: 151–155.

25-Saenouk, P, 2011, Callus induction and plant regeneration from leaf explant of Cornukaempferia aurantiflora Mood & Larsen, Pak. J. Bot., 43(5): 2415-2418.

26- Suzuki, S, Umezawa, T, and Shimada, M, 2002, tereochemical diversity in lignin biosynthesis of Arctium lappa L., Biosci. Biochem. 66(6): 1262-1269.

27- Sohn, E, Jang, A, Joo, H, Park, S, Kang, SC, Lee, CH and Kim,SY, 2011, Anti-allergic and anti-inflammatory effects of butanol extract from Arctium Lappa L, Clinical and Molecular Allergy, 9(4): 3-11.

28- Tripathi, L, and Tripathi, JN, 2003, Role of biotechnology in medicinal plants, Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 2(2):243-253.

29- Vijay, S, Virk, GS and Nagpal, A, 2010, Effect of Explant Type and Different Plant Growth Regulators on Callus Induction and Plantlet Regeneration in Citrus jambhiri Lush, Environ. We Int. J. Sci. Tech., 5: 97-106.

30- Zhao, F Wang, L and Liu, k, 2009, In vitro anti-inflammatory effects of arctigenin, a lignan from Arctium lappa L., through inhibition on iNOS pathway, Journal of Ethnopharmacology 122: 457–462.