نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجو کارشناسی ارشد- دانشگاه اصفهان

2 استادیار بخش میکروبیولوژی گروه زیست شناسی دانشگاه اصفهان

3 استاد تمام بخش میکروبیولوژی گروه زیست شناسی دانشگاه اصفهان

چکیده

آلودگی محیط زیست توسط فلزات سنگین به یکی از جدی‌ترین معضلات زیست محیطی امروز تبدیل شده است. در طی سالیان گذشته روش‌های مختلف فیزیکی و شیمیایی برای پاکسازی فلزات سنگین مورد بررسی قرار گرفته‌اند، اما اکثر آنها مشکل، گران و انرژی بر هستند. استفاده از میکروارگانیزم‌ها برای جذب فلزات سنگین، می‌تواند جایگزینی مناسب برای این روش‌ها باشد. در این تحقیق از سه مخمر استاندارد PTCC 5052 Saccharomyces cerevisiae، Kluyveromyces marxianus DSMZ 5422،Yarrowia lipolytica DSMZ 8218، برای بررسی مقاومت نسبت به غلظت‌های مختلف فلزات سنگین مس و سرب استفاده شد. مقاومت بیشتری نسبت به مس (یاروویا لیپولیتیکا تا 6 میلی‌مول، کلویورومایسز مارکسیانوس تا 5 میلی‌مول و ساکارومایسز سرویزیه تا 1 میلی‌مول) و مقاومت کمتری نسبت به سرب (هر سه مخمر تا غلظت 2 میلی‌مول) مشاهده شد. سپس بر اساس مقاومت‌های مشاهده شده توانایی مخمرها در جذب این فلزات سنگین مورد آزمایش قرار گرفت. میزان جذب مخمرها در غلظت-هایی که به آن حساس بودند بالاتر و در غلظت‌هایی که به آن‌ها مقاوم بودند، جذب کمتری مشاهده شد. بیشترین میزان فلزات جذب شده توسط مخمر ساکارومایسز سرویزیه شامل مس (8/16 میلی‌گرم برگرم وزن خشک) و سرب (6/54)، در مخمر کلویورومایسز مارکسیانوس شامل مس (5/75) و سرب (4/67)، و در مخمر یاروویا لیپولیتیکا شامل مس (69) و سرب (6/69) بود. در آزمایش بررسی اثر گلوکز روی جذب در غلظت‌های پایین مشاهده شد که گلوکز روی جذب سطحی بی‌اثر است ولی روی جذب داخلی موثر و باعث افزایش آن می‌گردد، زیرا جذب داخلی فرآیندی وابسته به انرژی و جذب سطحی مستقل از انرژی است.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Investigation of copper and lead tolerance and biosorption by three standard yeast strains

نویسندگان [English]

  • Alireza Hasani 1
  • Zahra Etemadifar 2
  • Iraj Nahvi 3

1 Isfahan University

2 Isfahan University

3 Isfahan University

چکیده [English]

Environmental pollution by heavy metals has become one of the most serious environmental issues today. In past years, various physical and chemical methods were evaluated and tested to remove heavy metals, but most of them happen to be tough or hazardous, complex, incomplete, expensive moreover requiring lot of energy. Using microorganisms as adsorbents for removal of heavy metal offers a potential alternative to mentioned methods. In this study, three standard yeast including Saccharomyces cerevisiae PTCC 5052, Kluyveromyces marxianus DSMZ5422 Yarrowia lipolytica DSMZ 8218, was used. Resistance of yeast to different concentrations of copper and lead were measured, The yeast were more resistant towards copper (up to 6mM by Y. lipolytica, 5mM by K. marxianus and 1mM by S. cerevisiae) and less resistant towards lead (up to 2mM by the used yeasts). Then based on the observed resistance of the yeast, their ability in metal absorption was examined. Yeast metal uptake at concentrations that they were sensitive, were more. The maximum uptake by the yeasts were 168mg/ g dry weight (g dry W) copper and 54.6mg/g dry W lead by S. cerevisiae, 75.56mg/g dry W from copper and 67.46mg/g dry W from lead by K. marxianus, and 696mg/g dry W copper and 69.66mg/g dry W from lead by Y. lipolytica. Another test was performed to investigate the effect of glucose on uptake in low concentrations. It was observed that glucose was ineffective on absorption which is energy-independent and effective on bioaccumulation which is energy-dependant.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Key words: Yeast
  • Heavy metals
  • Metal resistance
  • Biosorption
  • Atomic absorption

بررسی تحمل و جذب فلزات مس و سرب توسط سه سویه استاندارد مخمر 

علیرضا حسنی، زهرا اعتمادی فر* و ایرج نحوی

اصفهان، دانشگاه اصفهان، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی 

تاریخ دریافت: 21/4/90               تاریخ پذیرش: 4/9/91 

چکیده

آلودگی محیط زیست توسط فلزات سنگین به یکی از جدی­ترین معضلات زیست محیطی امروز تبدیل شده است. در طی سالیان گذشته روشهای مختلف فیزیکی و شیمیایی برای پاکسازی فلزات سنگین مورد بررسی قرار گرفته­اند، اما اکثر آنها مشکل، گران و انرژی بر هستند. استفاده از میکروارگانیزم­ها برای جذب فلزات سنگین، می­تواند جایگزینی مناسب برای این روشها باشد. در این تحقیق از سه مخمر استاندارد PTCC 5052  Saccharomyces cerevisiae، Kluyveromyces marxianus  DSMZ 5422،Yarrowia lipolytica DSMZ 8218، برای بررسی مقاومت نسبت به غلظتهای مختلف فلزات سنگین مس و سرب استفاده شد. مقاومت بیشتری نسبت به مس (یاروویا لیپولیتیکا تا 6 میلی­مول، کلویورومایسز مارکسیانوس تا 5 میلی­مول و ساکارومایسز سرویزیه تا 1 میلی­مول) و مقاومت کمتری نسبت به سرب (هر سه مخمر تا غلظت 2 میلی­مول) مشاهده شد. سپس بر اساس مقاومتهای مشاهده شده توانایی مخمرها در جذب این فلزات سنگین مورد آزمایش قرار گرفت. میزان جذب مخمرها در غلظتهایی که به آن حساس بودند بالاتر و در غلظتهایی که به آنها مقاوم بودند، کمتر مشاهده شد. بیشترین میزان فلزات جذب شده توسط مخمر ساکارومایسز سرویزیه شامل مس (8/16 میلی­گرم برگرم وزن خشک) و سرب (6/54)، در مخمر کلویورومایسز مارکسیانوس شامل مس (5/75) و سرب (4/67)، و در مخمر یاروویا لیپولیتیکا شامل مس (69) و سرب (6/69) بود.  در آزمایش بررسی اثر گلوکز روی جذب در غلظتهای پایین مشاهده شد که گلوکز روی جذب سطحی بی­اثر است ولی روی جذب داخلی مؤثر و باعث افزایش آن می­گردد، زیرا جذب داخلی فرآیندی وابسته به انرژی و جذب سطحی مستقل از انرژی است.

واژه های کلیدی: مخمر، فلزات سنگین، جذب زیستی، مقاومت به فلزات سنگین، جذب اتمی.

* نویسنده مسئول، تلفن: 37932456-031 ، پست الکترونیکی:  z_etemadifar@yahoo.com

مقدمه

 

یکی از بزرگترین مشکلات جوامع بشری در قرن بیست و یکم آلودگیهای محیطی است. از مهم ترین این آلوده کننده­ها فلزات سنگین هستند که مقدار آنها در محیط با توجه به استخراج روزافزون آنها، در حال افزایش است. فلزات سنگین با ورود به محیط  وارد چرخه­ای می­شوند که طی آن بین محیط و موجودات زنده مورد تبادل قرار می­گیرند و اثرات سمی بر موجودات زنده می­گذارند، تجمع زیستی در هر مرحله­ای از زنجیره غذایی می­تواند اتفاق بیفتد، این مشکل به خصوص برای انسان به عنوان مصرف کننده نهایی  از اهمیت خاصی برخوردار است. اگر تجمع زیستی در یکی از ارگانهای بدن انسان اتفاق بیفتد، علایم زیان­آور مختلفی مثل علائم گوارشی، عصبی و ایمونولوژیکی بروز پیدا می­کنند. از آنجا که این فلزات تجزیه پذیر نیستند تنها راه پاکسازی آنها خارج کردن آنها از محیط و بازیابی و استفاده مجدد از آنها در صورت امکان است(5) . روشهای مختلف فیزیکی و شیمیایی مانند اسمز معکوس، دیالیز، تشعشع گاما، اولترا فیلتراسیون، رسوب لخته­ای، استخراج حلال، اکسیداسیون(توسط ازون و پراکسید هیدروژن)، هیدرولیز، الکترولیز، تیمار کروم و کروماتوگرافی برای پاکسازی فلزات سنگین مورد بررسی و آزمایش قرار گرفته­اند، اما اکثر آنها  مشکل، پرخطر، پیچیده و ناکامل، گران و انرژی بر هستند. استفاده از میکروارگانیزم­ها برای جذب فلزات سنگین، می­تواند جایگزینی مناسب برای روشهای فوق باشد، زیرا یا از ارگانیزم­هایی استفاده می­شود که فراوان هستند، مثل علف دریایی، و یا از زیست توده دورریز کارخانه­های تخمیری استفاده می­گردد (12).

مس کوفاکتور ضروری بسیاری از آنزیمهای مختلف است که این آنزیمها در واکنشهایی مثل تنفس، از بین بردن رادیکالهای آزاد، هموستازی  آهن نقش دارند. مقادیر اضافی مس موجب تولید گونه­های فعال اکسیژن از طریق واکنش فنتون می­شود، اتصال فلزات را مختل می­کند، به طور نامناسبی به پروتئینها متصل می­شود و هموستازی را بر هم می­زند (26). در میکروارگانیزم­ها نمکهای مس فراوانی نوکلئوتیدهای اشتباه در جریان همانندسازی DNA را افزایش می­دهند. مس به راحتی با رادیکالها از جمله رادیکالهای اکسیژن برهمکنش می­کند و این امر باعث سمی شدن آن می­شود. اساس سمیت مس نسبت به میکروارگانیزم­ها تولید رادیکالهای هیدروپراکسید و برهمکنش با غشاء از طریق اتصال به ترکیبات تیول دار است (16).

در یوکاریوتها میزان مس از طریق سیستمهای دریافت و خروج خاص کنترل می­شود. مس حاصل از فرآیندهای آنابولیکی به پروتئینهای چاپرون درون سیتوزول متصل می شود که این امر جلوی فعالیتهای مخرب آن­را می­گیرد (20). مس مازاد توسط ATPaseهای نوع P به خارج سلول فرستاده می­شود، این نوع پروتئینها در همه فرمانروهای حیات وجود دارند (22).

در مخمر مس به ترکیبات مختلفی متصل می­شود، بخشی از آن با اتصال به گلوتاتیون ترکیب مس-گلوتاتیونات را تشکیل می­دهد و متالوتیونین­های مخمر مثل Cup1p و Crs5p نیز به یونهای موجود متصل شده و مس را برای تولید آنزیمهایی مثل سیتوکروم c اکسیداز ذخیره می­کند (19).

انحلال­پذیری پایین سرب باعث شده که این فلز از نظر زیستی کمتر در دسترس باشد و همین امر موجب حساسیت بسیاری از میکروارگانیزم­ها نسبت به این فلز است. سرب به گروههای سولفیدریل پروتئینهای مختلف متصل می­شود و جلوی عملکرد زیستی و متابولیکی آنها را می­گیرد، بنابراین پروتئینهای دارای گروههای سولفیدریل آزاد نسبت به سرب آسیب­پذیرند (18).

ساکارومایسز سرویزیه مدل ایده­آلی برای مطالعات جذب در سطح مولکولی است و به فهم بهتر این مکانیزمها کمک می­کند، زیرا توالی ژنومی آن در دسترس بوده و دستکاری ژنتیکی آن ساده است (27). مخمر یاروویا لیپولیتیکا هم از محلهای آلوده به فلزات سنگین جدا شده است و توانایی مقاومت در برابر فلزات سنگین، نمک­ها و دیگر آلوده­کننده­ها را دارد. مکانیزمهای مقاومت و سمیت­زدایی فلزات سنگین که توسط سویه­های مختلف یاروویا لیپولیتیکا به کار می­روند بررسی و مطالعه شده است. از مکانیسمهای فوق تولید ملانین و سوپراکسید دیسموتاز واجد روی است که در مقاومت نسبت به فلز مس مشخص شده است. منحنی رشد یاروویا لیپولیتیکا در حضور 4-2 میلی­مول فلز مس تقریباٌ بی­تغییر باقی می­ماند و تنها فاز تأخیری اندکی طولانی­تر می­شود و در سیتوسل این سلولها مقدار اندکی فلز مس مشاهده می­شود که دلیل این امر احتمالاٌ وجود سیستم ترشح به خارج فلز در این مخمر است. این سیستمها بر اثر قرار گرفتن در معرض مقادیر مشخصی از فلز مربوطه القاء شده و فلز را به خارج سلول می­رانند. تولید دائمی مقادیر پایه­ای از رنگدانه قهوه­ای ملانین که نقش مهمی در اتصال و جمع­آوری فلز مس دارد نیز از دلایل مقاومت سلولهای یاروویا لیپولیتیکا به مس است. دیواره سلولی نیز نقش مهمی در جلوگیری از ورود مس و سایر فلزات سنگین به درون سلول دارد. به علاوه مقادیر آنزیم سوپراکسید دیسموتاز واجد روی در درون سلولها افزایش یافته زیرا این آنزیم سلول را در مقابل گونه­های فعال اکسیژن که با حضور فلز در سلول ایجاد می­شوند، محافظت می­کند (3).

ژن crf1 فاکتور رونویسی Crf1 را در یاروویا لیپولیتیکا کد می­کند، این فاکتور در سیتوسل سلول قرار دارد و دیده شده که در پاسخ به مقادیر بالای مس به درون هسته منتقل می­شود تا موجب بیان برخی ژنها در رابطه با مقاومت به مس شود. از آنجا که رابطه میان این فاکتور با متالوتیونین­ها و سوپراکسید دیسموتاز که نقش مهمی در مقاومت به مس دارند مشخص نشده است، بنابراین پیشنهاد شده که احتمالاً این فاکتور از طریق مکانیزم دیگری در سم­زدایی فلزات موثر است (3).

مشخص شده که غشاء و دیواره سلولی محلهای عمده تجمع مقادیر اضافی یونهای فلزی هستند. همچنین در بررسی هر فلز، رابطه معکوسی میان سمیت آن فلز و مقدار متالوتیونین تولید شده توسط سلول برقرار بود. در پاسخ به فلزات سمی متالوتیونین بیشتری تولید شده و در نتیجه مقدار آن­ فلز در سلول کمتر بود و بالعکس مقدار فلزات غیر سمی در سلول بیشتر و متالوتیونین تولید شده در پاسخ به آنها کمتر بود. این شواهد نشان­دهنده اهمیت متالوتیونین­ها در سم­زدایی فلزات سنگین است (24).

در این تحقیق از سه مخمر استاندارد PTCC 5052  Saccharomyces cerevisiae، Yarrowia lipolytica DSMZ 8218،marxianus  DSMZ 5422  Kluyveromyces  استفاده شد. اهدافی که در این تحقیق بررسی شدند عبارتند از بررسی مقاومت سویه­های مخمری موجود نسبت به فلزات سنگین، بررسی میزان جذب فلزات سنگین توسط سویه­های مخمری موجود، بررسی رابطه تحمل و جذب فلزات سنگین توسط مخمرها و همچنین بررسی اثر وجود و عدم وجود منبع انرژی بر فرآیند جذب.

مواد و روشها

محیطهای کشت مورد استفاده : برای کشت مخمر از محیط کشت YPD براث و YPD آگار استفاده شد. این محیط کشت حاوی عصاره مخمر، پپتون و گلوکز است. عصاره مخمر و پپتون کربن، نیتروژن، مواد معدنی، ریز مغذیهای مورد نیاز برای رشد مخمرها را فراهم می­کنند. گلوکز نیز منبع انرژی محیط است. به منظور تهیه این محیط کشت 50 گرم پودر خشک محیط کشت در یک لیتر آب مقطر حل و سپس در 110 درجه سانتی گراد در فشار یک بار به مدت10 دقیقه اتوکلاو گردید.

تعیین منحنی رشد مخمرها جهت شناسایی زمان انتهای فاز لگاریتمی: به منظور تعیین منحنی رشد استاندارد مخمرها، کشت شبانه­ای از مخمرها در محیط کشت YPD براث تهیه گردید و 1 میلی­لیتر از آن با کدورت 5/0 مک­فارلند در 100 میلی­لیتر از محیط YPD براث تلقیح گردید. سپس به مدت 48 ساعت در 120 دور در دقیقه شیکر شد و جذب نوری هر 4 ساعت یک بار در طول موج 600 نانومتر خوانده شد.

سنجش مقاومت مخمرها نسبت به فلزات سنگین: برای سنجش مقاومت مخمرها نسبت به فلزات سنگین از میکروپلیت­های 96 چاهک استفاده شد و منحنی رشد مخمرها در حضور غلظتهای مختلف فلز رسم شد. در هر چاهک 200 میکرولیتر محلول شامل سوسپانسیون مخمری، محیط کشت YPD براث و محلول فلزی ریخته شد. چاهک ابتدای هر ردیف به عنوان شاهد مثبت در نظر گرفته شد و فلز به آن اضافه نشد تا میزان رشد مخمرها در چاهکهای دارای فلز با آن مقایسه شود. با پیشروی در هر ردیف غلظت فلز افزایش داده شد. چاهک انتهای هر ردیف به عنوان  شاهد منفی در نظر گرفته شد و صرفاً حاوی محیط کشت بود. یک ردیف از چاهکها به عنوان شاهد و به ازای هر غلظت فلز یک چاهک فاقد مخمر در نظر گرفته شد تا بتوان کدورت حاصل از محیط کشت و محلول فلز را از کدورت حاصل از رشد مخمرها تمیز داد. چاهکها توسط سمپلر و در زیر هود بیولوژیک پر شدند. برای تلقیح چاهکهای میکروپلیت از مخمرهای انتهای فاز لگاریتمی معادل کدورت 5/0 مک­فارلند استفاده شد. در هر چاهک 50 میکرولیتر سوسپانسیون مخمری، 100 میکرولیتر محیط کشت و 50 میکرولیتر محلول فلزی با غلظت مورد نظر اضافه شد. سپس میکروپلیت در انکوباتور در دمای 28 درجه قرار داده شد و در 24 و 48 ساعت در دستگاه الایزا ریدر خوانده شد و میزان کدورت چاهکهای نمونه نسبت به چاهکهای شاهد مشخص شد. چاهکهایی که دارای 80 درصد رشد چاهک شاهد مثبت بودند به عنوان مقاوم در نظر گرفته شدند. از چاهکهایی که رشدی کمتر از 80 درصد چاهک کنترل مثبت داشتند، به وسیله لوپ نمونه برداری شد و به صورت جداگانه در پلیتهای حاوی محیط کشت YPD  آگارکشت داده شد. پلیتها در دمای 28 درجه سانتی­گراد به مدت2 روز انکوبه شدند. غلظتهایی که مخمر آنها رشد کرد به عنوان غلظت متوقف کننده رشد قارچ و غلظتهایی که مخمر آنها رشد نکرده بود به عنوان غلظت کشنده قارچ در نظر گرفته شدند (14 و 25).

بررسی میزان جذب فلز در مخمرها بر اساس غلظتهای مقاومت آنها: در این آزمایش به منظور بررسی رابطه مقاومت و جذب فلزات سنگین از غلظتهای به دست آمده در آزمایش سنجش مقاومت استفاده شد. سه غلظت از هر فلز به­کار رفت، که شامل بالاترین غلظت تحمل شده در مرحله قبل و دو غلظت مجاور آن بودند. برای بررسی میزان جذب فلزات سنگین توسط مخمرها، 20 میلی­لیتر از مخمرهای انتهای فاز لگاریتمی در دو فالکون 15 میلی­لیتری ریخته شد و سپس به مدت 3 دقیقه در 3000 دور در دقیقه سانتریفیوژ گردید. مخمرهای سانتریفیوژ شده با سرم فیزیولوژی استریل شستشو داده شد و مجدداً 3 دقیقه در 3000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند (2 و 8). در این مرحله 2 فالکون نیز جهت تعیین وزن خشک مخمرها به همین صورت آماده شدند. سپس با اضافه کردن 1 میلی­لیتر سرم فیزیولوژی استریل به هر فالکون و هم زدن روی دستگاه همزن محتویات فالکونها به صورت همگن درآمدند. سوسپانسیون حاصل به ارلن 100 میلی­لیتری حاوی 43 میلی­لیتر آب مقطر دوبار تقطیر استریل اضافه شد و حجم کلی آن به 45 میلی­لیتر رسید. فرآیندهای ذکر شده برای 2 ارلن بطور یکسان انجام گرفت و ارلن دیگری با محتویات یکسان و بدون اضافه کردن مخمر بعنوان شاهد در نظر گرفته شد. ارلن­های مذکور سپس به مدت20 دقیقه در 120 دور در دقیقه روی دستگاه همزن قرار گرفتند. بعد از 20 دقیقه 2 میلی­لیتر محلول گلوکز استریل 1.25 مولار به هر ارلن اضافه شد تا غلظت گلوکز در حجم نهایی به 50 میلی­مولار برسد. سپس ارلنها برای مدت 10 دقیقه دیگر در 120 دور در دقیقه روی دستگاه هم­زن باقی ماندند (15و 28). بعد از 10 دقیقه به هر ارلن 3 میلی­لیتر از محلول فلزی با غلظت مورد نظر اضافه شد تا حجم کلی به 50 میلی­لیتر برسد. سپس pH روی 5/5 تنظیم گردید. لحظه اضافه شدن فلز به عنوان زمان صفر در نظر گرفته شد و ارلنها به مدت60 دقیقه روی همزن در 120 دور در دقیقه قرار گرفتند. در دقایق 0 و 10 و 60 از هر ارلن 10 میلی­لیتر به درون فالکونهای 15 میلی­لیتری ریخته شد وفالکونهای مذکور بلافاصله در 3000 دور در دقیقه به مدت 3 دقیقه سانتریفیوژ شدند و سوپرناتانت حاصل به درون فالکونهای دیگری ریخته شد (11و 21). سپس به هر فالکون 2 قطره اسید نیتریک غلیظ اضافه شد تا جهت بررسی توسط دستگاه طیف سنج جذب اتمی آماده شوند. در این تحقیق از یک دستگاه طیف­سنج جذب اتمی perkin-elmer  مدل 3030  با سوخت استیلن استفاده شد میزان فلز جذب شده توسط مخمرها از میزان کاهش فلز در سوپرناتانت نمونه ها نسبت به شاهد،  از  طریق  فرمول

زیر محاسبه شد :

 

در فرمول ذکر شده q میزان جذب فلز بر حسب میلی­گرم بر گرم وزن خشک مخمر، V حجم محلول بر حسب لیتر، Ci و Cf غلظت اولیه و نهایی فلز بر حسب میلی­گرم بر لیتر، W وزن خشک مخمرها بر حسب گرم است (6).

بررسی میزان جذب فلز در مخمرها در غلظتهای پایین همراه با بررسی اثر گلوکز: برای این منظور از غلظتهای ppm20 فلزات مس و سرب استفاده شد. آزمایش مانند قسمت قبلی انجام شد و به هر مخمر 2 فلز به صورت جداگانه اضافه شد اما این بار تعداد ارلنها دو برابر شد و به نیمی از آنها گلوکز اضافه نشد تا بتوان اثر گلوکز در نحوه جذب را بررسی کرد.

اندازه گیری وزن خشک مخمرها در آزمایش جذب: برای اندازه گیری میزان وزن خشک اضافه شده مخمرها در آزمایش بررسی میزان جذب فلز، هنگام سانتریفیوژ کردن مخمرهای انتهای فاز لگاریتمی جهت انجام آزمایش جذب، 2 فالکون اضافه آماده شدند. سپس این دو فالکون به مدت24 ساعت در آون در دمای 70 درجه قرار گرفتند تا آب آنها تبخیر شود. سپس وزن بدست آمده این فالکونها از وزن اولیه آنها کاسته شد و وزن خشک مخمرهای اضافه شده در آزمایش جذب مشخص شد (6).

نتایج

تعیین منحنی رشد مخمرها جهت شناسایی زمان انتهای فاز لگاریتمی: انتهای فاز لگاریتمی در مخمر ساکارومایسز سرویزیه 36 ساعت، در مخمر کلویورومایسز مارکسیانوس 34 ساعت و در مخمر یاروویا لیپولیتیکا حدود 40 ساعت بود.

سنجش مقاومت مخمرها به فلزات سنگین:

الف)مقاومت به فلز مس:  بیشترین مقاومت به فلز مس در مخمر یاروویا لیپولیتیکا مشاهده شد که برابر با 6 میلی­مولار (380 میلی گرم بر لیتر) بود. مخمر مقاوم بعدی کلویورومایسز مارکسیانوس بود که مقاومتی برابر 5 میلی­مولار (310 میلی گرم بر لیتر) داشت. کمترین مقاومت نیز در مخمر ساکارومایسز سرویزیه مشاهده شد که حداکثر مقاومت آن برابر با 1 میلی­مولار(63 میلی­گرم بر لیتر) بود. در مورد ساکارومایسز سرویزیه غلظت 5/1 میلی­مولار غلظت متوقف کننده رشد و غلظت 2 میلی­مولار و بالاتر غلظت کشنده بودند. در مورد کلویورومایسز مارکسیانوس غلظت 6 میلی­مولار و بالاتر غلظت متوقف کننده رشد بودند. در مورد یاروویا لیپولیتیکا غلظتهای 7 و 8 میلی­مولار متوقف کننده رشد بودند.

ب) مقاومت به فلز سرب: در مورد فلز سرب تقریبا الگوی مقاومتی یکسانی بین مخمرها مشاهده شد. هر سه مخمر تا غلظت 2 میلی­مولار (410 میلی گرم بر لیتر) از خود مقاومت نشان دادند. غلظتهای بالاتر تا 7 میلی­مولار نیز نسبت به هر سه مخمر متوقف کننده رشد بودند.

میزان جذب فلز در مخمرها بر اساس غلظتهای مقاومت آنها:

الف) جذب فلز مس: با توجه به مقاومتهای مشاهده شده در اندازه­گیری مقاومت مخمرها، غلظتهای 5/0، 1 و 2 میلی­مولار (معادل 32،5/63 و 127 میلی­گرم بر لیتر) برای مخمر ساکارومایسز سرویزیه در نظر گرفته شدند. بیشترین جذب مشاهده شده 8/16 میلی­گرم بر گرم وزن خشک است که در غلظت 127 میلی گرم بر لیتر و در زمان 60 دقیقه مشاهده شد (شکل 1).

 

غلظتهای در نظر گرفته شده برای مخمر کلویورومایسز مارکسیانوس 3، 5 و 7 میلی­مولار (معادل 190، 317 و 444 میلی­گرم بر لیتر) بودند. بیشترین جذب مشاهده شده 7/75 میلی­گرم بر گرم وزن خشک است که در غلظت444  میلی گرم بر لیتر و در زمان 60 دقیقه مشاهده شد (شکل 2).   

 

 

شکل 1- میزان جذب غلظتهای مختلف فلز مس توسط مخمر ساکارومایسز سرویزیه در زمانهای 10 و 60 دقیقه

 

شکل 2- میزان جذب غلظتهای مختلف فلز مس توسط مخمر کلویورومایسز مارکسیانوس در زمانهای 10 و 60 دقیقه

 

 

غلظتهای به کار رفته برای مخمر یاروویا لیپولیتیکا شامل 4،6 و 8 میلی­مولار (معادل 254، 381 و 508 میلی­گرم بر لیتر) بود. بیشترین جذب مشاهده شده این مخمر 69 میلی­گرم بر گرم وزن خشک است که در غلظت 508  میلی گرم بر لیتر و در زمان 60 دقیقه مشاهده شد (شکل 3).

 

 

 

شکل 3- میزان جذب غلظتهای مختلف فلز مس توسط مخمر یاروویا لیپولیتیکا در زمانهای 10 و 60 دقیقه


ب) جذب فلز سرب: با توجه به نتایج آزمایش مقاومت غلظتهای یکسانی در مورد هر سه مخمر به کار رفت. این غلظتها شامل 1، 2 و 3 میلی مولار (207، 414 و 620 میلی­گرم بر لیتر) بود. در مخمر ساکارومایسز سرویزیه  بیشترین جذب معادل 6/54 میلی گرم بر گرم وزن خشک بود که در غلظت 620 میلی­گرم بر لیتر فلز سرب مشاهده شد (شکل 4).

 

 

شکل 4- میزان جذب غلظتهای مختلف فلز سرب توسط مخمر ساکارومایسز سرویزیه در زمانهای 10 و 60 دقیقه

 

الگوی جذب در مخمر کلویورومایسز مارکسیانوس نیز تقریبا شبیه به ساکارومایسز سرویزیه است. بیشترین میزان جذب سرب برابر با 4/67 میلی­گرم بر گرم وزن خشک بود که در غلظت 620 میلی­گرم بر لیتر صورت گرفت (شکل 5).

 

 

 

شکل 5- میزان جذب غلظتهای مختلف فلز سرب توسط مخمر کلویورومایسز مارکسیانوس در زمانهای 10 و 60 دقیقه

 

 

الگوی جذب سرب در مخمر یاروویا لیپولیتیکا با دو مخمر دیگر تفاوت داشت. با افزایش غلظت فلز میزان جذب سطحی ابتدا افزایش داشت و بعد متوقف شد و جذب داخلی که با افزایش غلظت اول زیاد نشده بود، با افزایش غلظت دوم به طور محسوسی زیاد شد. بیشترین میزان فلز سرب جذب شده توسط این مخمر 6/69 میلی­گرم بر گرم وزن خشک بود که در بالاترین غلظت مشاهده شد (شکل 6).

 

 

میزان جذب فلز در مخمرها در غلظتهای پایین همراه با بررسی اثر گلوکز:

الف) جذب فلز مس: برای تمام مخمرها از غلظت ppm20 فلز مس استفاده شد. بیشترین جذب در بین سه مخمر، در کلویورومایسز مارکسیانوس در زمان 60 دقیقه و در شرایط دارای قند معادل 25/9 میلی­گرم بر گرم وزن خشک مشاهده شد (شکل 7). به طور کلی در حالت دارای قند جذب بیشتری مشاهده شد اما این افزایش در زمان 60 دقیقه که جذب داخلی نیز صورت گرفته بیشتر بود که به دلیل وابسته بودن جذب داخلی به انرژی بود.

ب) جذب فلز سرب: غلظت ppm 20 سرب برای هر سه مخمر به کار رفت. بیشترین جذب فلز سرب در مخمر کلویورومایسز مارکسیانوس در زمان 60 دقیقه و شرایط دارای قند دیده شد که معادل 9/4 میلی­گرم بر گرم وزن خشک بود (شکل 8). الگوی جذب تقریباً مشابه فلز مس بود و در زمان 60 دقیقه اثر گلوکز نمایان­تر بود.

 

 

 

شکل 6- جذب غلظتهای مختلف فلز سرب توسط مخمر یاروویا لیپولیتیکا در زمانهای 10 و 60 دقیقه

 

 

شکل 7- میزان جذب غلظت ppm 20 فلز مس توسط سه مخمر ساکارومایسز سرویزیه، کلویورومایسز مارکسیانوس و یاروویا لیپولیتیکا در زمانهای 10 و 60 دقیقه

 

شکل 8- میزان جذب غلظت­ ppm 20 فلز سرب توسط سه مخمر ساکارومایسز سرویزیه، کلویورومایسز مارکسیانوس و یاروویا لیپولیتیکا در زمانهای 10 و 60 دقیقه


بحث

مقاومت مخمرها نسبت به فلزات سنگین: با توجه به نتایج آزمایش سنجش مقاومت مخمرها نسبت به فلز مس مقاوم­ترین مخمر به فلز مس مخمر یاروویا لیپولیتیکا بود. این مخمر تا غلظت 6 میلی­مولار فلز مس از خود مقاومت نشان داد و به خوبی رشد کرد و در غلظتهای 7 و 8 میلی­مولار رشد آن متوقف شد، اما مخمرها از بین نرفتند و در محیط فاقد مس توانستند به رشد خود ادامه دهند. مخمر کلویورومایسز مارکسیانوس نیز مقاومت خوبی تا غلظت 5 میلی­مولار از خود نشان داد ولی در غلظتهای بالاتر رشد آن متوقف شد. حساس­ترین مخمر نسبت به فلز مس مخمر ساکارومایسز سرویزیه بود که تنها تا غلظت 1 میلی­مولار مس را تحمل کرد و رشد در غلظت 5/1 میلی­مولار متوقف شد و در غلظتهای بالاتر مخمر از بین رفت و در محیط فاقد مس هم رشد نکرد. وادکرتیووا و اسلاویکوا در سال 2006 مقاومت چند سویه ساکارومایسز سرویزیه نسبت به مس را بین 2-5/0 میلی­مولار گزارش کردند (25). همچنین ایتو و همکاران در سال 2007 حضور 4-2 میلی­مولار مس را بر سرعت رشد یاروویا لیپولیتیکا بی­تأثیر گزارش کردند. آنها همچنین گزارش کردند که دلیل این مقاومت یک سیستم ترشحی فلز است که بر اثر قرار گرفتن مخمر در معرض غلظتهای خاصی از فلز مس القاء می­شود. همچنین افزایش آنزیم سوپراکسید دیسموتاز را که گونه­های فعال اکسیژن را از بین می­برد دلیل دیگر این مقاومت می­دانند (9).

مقاومت هر سه مخمر به فلز سرب تقریباً یکسان بود و هر سه مخمر تا غلظت 2 میلی­مولار این فلز رشد خوبی داشتند و در غلظتهای بالاتر رشد آنها متوقف شد. بردیسوسکی و همکاران در سال 1993 مقاومت یک سویه از ساکارومایسز سرویزیه نسبت به فلز سرب را حدود 1 میلی­مولار گزارش کردند (4).

رابطه مقاومت و جذب فلزات سنگین: در مرحله تعیین مقاومت سویه­های مخمری به­کار رفته نسبت به فلزات سنگین، مقاومتهای مختلف و مشابهی نسبت به فلزات مختلف مشاهده شد. با به کار بردن غلظتهای مختلف تحمل شده و تحمل نشده از سوی مخمرها سعی شد تا به مکانیزم مقاومت پی برده شود. مخمرهای استفاده شده در آزمایشات جذب در انتهای فاز لگاریتمی قرار داشتند.

با مشاهده نمودارهای جذب فلز موجود در بخش نتایج سه قاعده کلی مشاهده می­شود. اول آنکه جذب فلزات دو مرحله­ای است یک مرحله سریع که در 10 دقیقه اول اتفاق افتاده و بیانگر جذب سطحی است و مرحله دوم که از زمان 10 دقیقه تا 60 دقیقه اتفاق افتاده و عموماً بیانگر جذب داخلی است. یافته­های هان و همکاران با انجام آزمایش جذب فلزات مس و سرب توسط مخمر آبجو این مسئله را تأیید می­کند. آنها مشاهده کردند که سرعت جذب در 10 دقیقه ابتدایی بالاست و جذب تا زمان 60 دقیقه ادامه می­یابد (7).

نکته دوم آنکه با افزایش غلظت فلز میزان جذب سطحی و داخلی افزایش یافته است. کامب هونجو و همکاران تاثیر افزایش غلظت اولیه فلزات را بر افزایش میزان جذب آنها توسط سلولهای مخمر نشان دادند (11). همچنین وانگ و چن اشاره کرده اند که افزایش غلظت اولیه فلز در شرایط یکسان بودن وزن خشک مخمر بکار رفته، موجب افزایش میزان جذب فلز می­شود (27).

سوم آنکه میزان جذب داخلی در زمان 60 دقیقه در غلظتی که مخمر به آن حساس بوده بیشتر است، پس می­توان گفت علت حساسیت مخمر به آن غلظت خاص فلز به دلیل ورود بیش از حد فلز به درون مخمر است. در نتیجه یکی از مکانیزمهای اصلی مقاومت به فلزات سنگین می­تواند جلوگیری از ورود این فلزات به درون سلول باشد. البته در غلظتهای پایین مخمرها با استفاده از سیستمهای مختلف ترشحی، متالوتیونین­ها و فسفاتازهای نوع p و... فلزات را از درون سیتوپلاسم خود بیرون می­رانند اما با افزایش غلظت این امر مشکل­تر می­شود و در نتیجه رشد مخمرها کاهش یافته و متوقف می­شود. وجود فلزات سمی با غلظتهای بالا فرآیندهای مختلف سلول را متوقف کرده و موجب مرگ سلولها می­شود. جوهو و همکاران با بررسی جذب کادمیم در دو سویه حساس و مقاوم ساکارومایسز سرویزیه  مشاهده کردند که جذب در سویه حساس بیشتر است و نتیجه گیری کردند که مکانیسم مقاومت به کادمیم در سویه مقاوم کاهش میزان دریافت فلز و افزایش تعداد متالوتیونین­های اختصاصی فلز است (10).

اشتروهال و همکاران نحوه پاسخ یک سویه یاروویا لیپولیتیکا نسبت به 2 فلز ضروری روی و کبالت و 2 فلز سمی نیکل و کادمیم را بررسی کردند. مشخص شده که غشاء و دیواره سلولی محلهای عمده تجمع مقادیر اضافی این یونها هستند. همچنین در بررسی هر فلز، رابطه معکوسی میان سمیت آن فلز و مقدار متالوتیونین تولید شده توسط سلول برقرار بود. در پاسخ به فلزات سمی کادمیم و نیکل متالوتیونین بیشتری تولید شده و در نتیجه مقدار آن­ فلز در سلول کمتر بود و بالعکس مقدار فلزات غیر سمی در سلول بیشتر و متالوتیونین تولید شده در پاسخ به آنها کمتر بود. این شواهد نشان­دهنده اهمیت متالوتیونین­ها در سم­زدایی فلزات سنگین است (24).

مطابق نتایج حاصل از این آزمایش بیشترین میزان فلزات جذب شده توسط مخمر ساکارومایسز سرویزیه شامل مس (8/16 میلی­گرم برگرم وزن خشک) و سرب (6/54) بود. بیشترین مقادیر فلز جذب شده توسط مخمر کلویورومایسز مارکسیانوس شامل مس (5/75 ) و سرب (4/67) بود. بیشترین مقادیر فلز جذب شده توسط مخمر یاروویا لیپولیتیکا شامل مس (69) و سرب (6/69) بود.

ژائو و دانکن مقدار جذب مس توسط سلولهای ساکارومایسز سرویزیه پسماند کارخانه آبجو را 1/8  میلی­گرم بر گرم وزن خشک و مقدار جذب روی را 1/7 اعلام کردند (29). همچنین ژو و شو میزان جذب فلز مس برای مخمر ساکارومایسز سرویزیه خشک شده را بین 12- 98/2 میلی­گرم بر گرم وزن خشک مخمر اعلام کردند (30).

اوزر و اوزر در سال 2003 گزارش کردند که سلولهای ساکارومایسز سرویزیه کشت شده در آزمایشگاه و خشک شده در 100 درجه سانتی­گراد میزان 270 میلی­گرم بر گرم وزن خشک جذب فلز سرب داشته­اند (17).

با توجه به گزارشات انجام شده و نتایج به ­دست آمده از این تحقیق مشخص می­شود که مخمرهای آزمایش شده پتانسیل خوبی در جذب فلزات سنگین دارند. در کل بیشترین جذب در مخمر کلویورومایسز مارکسیانوس مشاهده شد و مخمر یاروویا لیپولیتیکا نیز جذب بیشتری از ساکارومایسز سرویزیه از خود نشان داد که بخشی از این تفاوتها مربوط به کار بردن غلظتهای مختلف برای مخمرهاست. همچنین می­توان گفت مخمرهای مقاوم به فلزات لزوماٌ مخمرهای ایده­آلی برای استفاده در جذب نیستند.

بررسی اثر گلوکز: نتایج آزمایش جذب در غلظت پایین در بخش نتایج آمده است. هر دو آزمایش با و بدون وجود گلوکز انجام شدند. همانند نتایج قبلی جذب دو مرحله­ای مشاهده شد: یک مرحله سریع در 10 دقیقه ابتدایی و یک مرحله کندتر بین 10 تا 60 دقیقه. در زمان 10 دقیقه بین نمونه­های دارای گلوکز و فاقد گلوکز اختلاف زیادی مشاهده نمی­شود و در مواردی جذب سطحی برابر است و یا در نمونه­های فاقد گلوکز بیشتر است. اما در زمان 60 دقیقه نمونه­های دارای گلوکز جذب بیشتری از خود نشان می­دهند. این امر نشان­دهنده آن است که جذب در مرحله اول عموماً سطحی و مستقل از انرژی است اما در مرحله دوم جذب داخلی و وابسته به انرژی است.

نتایج این بخش نشان داد بیشترین میزان فلزات جذب شده توسط مخمر ساکارومایسز سرویزیه شامل مس (2/6 میلی­گرم برگرم وزن خشک) و سرب (68/4) بود. بیشترین مقادیر فلز جذب شده توسط مخمر کلویورومایسز مارکسیانوس شامل مس (25/9 ) و سرب (9/4) بود. بیشترین مقادیر فلز جذب شده توسط مخمر یاروویا لیپولیتیکا شامل مس (2/5) و سرب (33/4) بود.

استراسر و همکاران در بررسی جذب آهن و فلزات سمی توسط قارچها اشاره کرده­اند که جذب سطحی اتصال فلز به دیواره سلولی قارچی است و انباشت زیستی جذب فلز توسط فرآیندهای وابسته به متابولیزم می باشد که ممکن است شامل انتقال فلز به داخل سلول و حجره بندی در اجزا درون سلولی باشد (23).

همچنین وایت و گاد و موول و گاد به این نتیجه رسیده­اند که جذب فلزات توسط سلول­های قارچی در دو مرحله انجام می شود: مرحله ابتدایی که سریع و مستقل از متابولیزم سلولی انجام می­شود و به دلیل اتصال فلز به دیواره سلولی  و دیگر سطوح خارجی آن می­باشد، که با یک مرحله جذبی کندتر و وابسته به متابولیزم سلولی ادامه می­یابد. در مرحله اخیر یونهای فلزی از خلال غشاء پلاسمایی با مصرف انرژی به درون سلول راه می­یابند (15،28).

اوری و توبین گزارش کرده­اند که اضافه کردن گلوکز به سوسپانسیون مخمر، 5 دقیقه قبل از اضافه کردن محلول فلز، موجب جذب فلز استرانسیم به درون واکوئل مخمرها می­شود (1) . ماپوللو و تورتو نیز در سال 2004 مشاهده کردند که پیش­تیمار ساکارومایسز سرویزیه توسط گلوکز، موجب افزایش 40-30 درصدی جذب فلزات مس، سرب، کادمیم، کروم و روی می­شود (13).

نتیجه­گیری کلی

فلزات سنگین از آلوده کننده­های عمده محیط زیست در عصر حاضر هستند، این فلزات تجزیه­ناپذیر هستند و به هر نقطه از محیط زیست و به­خصوص سیستم آبی کره زمین که وارد شوند می­توانند در زنجیره غذایی بالا آمده و به بدن انسان برسند، بنابراین تنها راه حل این آلودگیها جمع­آوری و بازیافت این فلزات در محلهای آلودگی است. روشهای مختلف فیزیکوشیمیایی دارای  معایب مختلفی هستند و این امر باعث توجه به میکروارگانیزم­ها به عنوان جایگزینی مناسب شده است. اگرچه چندین دهه از آغاز تحقیقات در زمینه جذب زیستی فلزات سنگین می­گذرد و تحقیقات زیادی در این زمینه انجام گرفته است اما این فرآیند تا کاربردی شدن و فراگیر شدن همچنان فاصله زیادی دارد و تحقیقات در زمینه کاربردی کردن آن نیازمند تلاشهای فراوانی است. در این تحقیق تلاش شد تا پتانسیل جذب سه جنس مخمر که در صنعت نیز کاربرد دارند در شرایط مختلف سنجیده شود و نتایج نشان داد که این مخمرها پتانسیل خوبی در جذب فلزات سنگین در غلظتهای مختلف دارند. همچنین با توجه به اینکه اکثر تحقیقات انجام شده روی مخمرها در زمینه جذب زیستی بر روی مخمر ساکارومایسز سرویزیه متمرکز بوده، نتایج این تحقیق نشان می­دهد که دو مخمر یاروویا لیپولیتیکا و کلویورومایسس مارکسیانوس هم پتانسیل جذب برابر یا حتی بیشتر از ساکارومایسز سرویزیه را دارا هستند. می­توان امیدوار بود که با کاربردی شدن استفاده از جذب زیستی در پاکسازی فلزات سنگین در آینده، میکروارگانیزم­های آزمایش شده در این تحقیق و سایر تحقیقات مشابه به صورت عملی در پاکسازی زمین از این آلودگی به کار روند.

تشکر و قدردانی: نویسندگان مقاله از مسئولان محترم دانشگاه اصفهان که امکان انجام این تحقیق را فراهم نمودند تشکر می­نمایند. 


 

  1. Avery SV, Tobin JM. 1992, Mechanisms of strontium uptake by laboratory and brewing strains of Saccharomyces cerevisiae. Applied and Environmental Microbiology. 58(12): 3883.
  2. Avery SV, Tobin JM. 1993, Mechanism of adsorption of hard and soft metal ions to Saccharomyces cerevisiae and influence of hard and soft anions. Applied and Environmental Microbiology. 59(9): 2851.
  3. Bankar AV, Kumar AR, Zinjarde SS. 2009, Environmental and industrial applications of Yarrowia lipolytica. Applied microbiology and biotechnology. 84: 847-865.
  4. Berdicevsky I, Duek L, Merzbach D, Yannai S. 1993, Susceptibility of different yeast species to environmental toxic metals. Environmental Pollution. 80(1): 41-4.
  5. Chojnacka K. 2011, Biosorption and bioaccumulation-the prospects for practical applications. Environment international. 36(3): 299-307.
  6. Göksungur Y, Üren S, Güvenç U. 2005, Biosorption of cadmium and lead ions by ethanol treated waste baker''''s yeast biomass. Bioresource Technology. 96(1): 103-9.
  7. Han R, Li H, Li Y, Zhang J, Xiao H, Shi J. 2006, Biosorption of copper and lead ions by waste beer yeast. Journal of hazardous materials. 137(3): 1569-76.
  8. Hockertz S, Schmid J, Auling G. 1987, A specific transport system for manganese in the filamentous fungus Aspergillus niger. Microbiology. 133(12): 3513.
  9. Ito H, Inouhe M, Tohoyama H, Joho M. 2007, Characteristics of copper tolerance in Yarrowia lipolytica. BioMetals. 20(5): 773-80.

10. Joho M, Imai M, Murayama T. 1985, Different Distribution of Cd2+ between Cd-sensitive and Cd-resistant Strains of Saccharomyces cerevisiae. Microbiology. 131(1): 53.

11. Kambe-Honjoh H, Sugawara A, Yoda K, Kitamoto K, Yamasaki M. 1997, Isolation and characterization of nickel-accumulating yeasts. Applied microbiology and biotechnology. 48(3): 373-8.

12. Kumar KK, Prasad MK, Sarma G, Murthy CVR. 2009, Removal of Cd (II) from Aqueous Solution using Immobilized Rhizomucor Tauricus. Journal of Microbial & Biochemical Technology. 1: 26-27.

13. Mapolelo M, Torto N. 2004, Trace enrichment of metal ions in aquatic environments by Saccharomyces cerevisiae. Talanta. 64(1): 39-47.

14. Marešová L, Sychrová H. 2007, Applications of a microplate reader in yeast physiology research. BioTechniques. 43(5): 667-72.

15. Mowll J, Gadd G. 1984, Cadmium uptake by Aureobasidium pullulans. Microbiology. 130(2): 279.

16. Nies DH. 2003, Efflux mediated heavy metal resistance in prokaryotes. FEMS microbiology reviews. 27: 313-339.

17. Ozer A, Ozer D. 2003, Comparative study of the biosorption of Pb (II), Ni (II) and Cr (VI) ions onto S. cerevisiae: determination of biosorption heats. Journal of hazardous materials. 100(1-3): 219-29.

18. Piechalak A, Tomaszewska B, Baralkiewicz D, Malecka A. 2002, Accumulation and detoxification of lead ions in legumes. Phytochemistry. 60: 153-162.

19. Presta A, Stillman MJ. 1997, Incorporation of copper into the yeast Saccharomyces cerevisiae. Identification of Cu (I)-metallothionein in intact yeast cells. Journal of inorganic biochemistry. 66: 231-240.

20. Rae T, Schmidt P, Pufahl R, Culotta V, V O''''Halloran T. 1999, Undetectable intracellular free copper: the requirement of a copper chaperone for superoxide dismutase. Science. 284: 805-808.

21. Ramsay LM, Gadd GM. 1997, Mutants of Saccharomyces cerevisiae defective in vacuolar function confirm a role for the vacuole in toxic metal ion detoxification. FEMS microbiology letters. 152(2): 293-8.

22. Riggle PJ, Kumamoto CA. 2000, Role of a Candida albicans P1-type ATPase in resistance to copper and silver ion toxicity. Journal of bacteriology. 182: 4899-4905.

23. Strasser H, Brunner H, Schinner F. 1995, Leaching of iron and toxic heavy metals from anaerobically-digested sewage sludge. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 14(3): 281-7.

24. Strouhal M, Kizek R, Vacek J, Trnková L, Nmec M. 2003, Electrochemical study of heavy metals and metallothionein in yeast Yarrowia lipolytica. Bioelectrochemistry. 60(1-2): 29-36.

25. Vadkertiová R, Sláviková E. 2006, Metal tolerance of yeasts isolated from water, soil and plant environments. Journal of basic microbiology. 46(2): 145-52.

26. Vulpe CD Packman S. 1995, Cellular copper transport. Annual review of nutrition. 15: 293-322.

27. Wang J, Chen C. 2006, Biosorption of heavy metals by Saccharomyces cerevisiae: A review. Biotechnology Advances. 24(5): 427-51.

28. White C, Gadd G. 1986, Uptake and cellular distribution of copper, cobalt and cadmium in strains of Saccharomyces cerevisiae cultured on elevated concentrations of these metals. FEMS microbiology letters. 38(5): 277-83.

29. Zhao M, Duncan JR. 1998, Column sorption of Cr (VI) from electroplating effluent using formaldehyde cross-linked Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology letters. 20(6): 603-6.

30. Zhu J, Xu L. 1998, Simulated experiment of Cu2+ treatment using Saccharomyces cerevisiae. Chinese Journal of Applied Environmental Biology. 4: 400.