نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 عضوهیات علمی دانشگاه آزاد واحد تهران شمال

2 دانشگاه آزاد اسلامی واحد خمین

3 عضو هیئت علمی دانشگاه آزاد اسلامی واحد قم

4 عضوهیات علمی دانشگاه آزاد اسلامی واحد خمین

چکیده

فلزات سنگین نظیر کادمیوم، جیوه، نیکل و اکسی آنیون های تلوریت و کرومات از عناصر سمی هستند که به طرق مختلف وارد محیط زیست شده و برای سیستم¬های بیولوژیکی، بالاخص انسان، حیوانات و گیاهان زیان آور می باشند، لذا حذف آن ها از محیط زیست ضروری است. میکروارگانیسم ها و به ویژه باکتری ها نقش بسیار مهمی در حذف زیستی فلزات سنگین داشته و در بیوتکنولوژی کاربرد دارند. در این پژوهش شمارش کلی فرم های روده ای و جداسازی سویه های مقاوم به فلزات سنگین از پساب های صنعتی، خانگی و قسمت های مختلف سیستم تصفیه پساب شهر اراک انجام شده است. در این مطالعه چهار جنس از خانواده باکتری های روده ای شامل Klebsiella spp، Escherichia coli، spp Citrobacter و spp Enterobacter از نمونه پساب های فوق جداسازی شدند و حداقل تراکم متوقف کننده رشد MIC)در مقابل غلظت های مختلف فلزات سنگین نظیر کلرید کادمیوم، سولفات نیکل، کلرید جیوه، کرومات پتاسیم و تلوریت پتاسیم با استفاده از روش رقت در آگار، تعیین گردید و مقاومت آنها در برابر تعدادی از آنتی بیوتیک ها با روش دیسک متد مشخص شد. در این تحقیق برای اولین بار MIC بسیار بالا ی 22mM نسبت به کادمیوم، 20mM نسبت به کروم، 20mM نسبت به تلوریت، 10mM نسبت به نیکل و 1mM نسبت به جیوه برای باکتری Klebsiella spp بدست آمد.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Evaluation of Resistance in Intestinal Coli Forms Isolated from Industrial Wastewater, Domestic Wastewater and Various Parts of the Wastewater Treatment System of Arak City

نویسندگان [English]

  • Abbas Akhavan 1
  • sahar sharifian 2
  • Mohammad reza Zolfaghari 3
  • Mohammad Khalily dermany 4

2 Islamic Azad University ,khomein Branch

3 Islamic Azad University , Qom Branch

4 Islamic Azad University, Khomein branch

چکیده [English]

Heavy metals such as cadmium, mercury, nickel and Oxyanions for example chromate and tellurite are toxic elements that entering into the environment in different ways and are harmful for biological systems, especially humans, animals and plants, so to remove it from the environment is essential. Microorganisms, especially bacteria have a very important role in the biological removal of heavy metals and are used in biotechnology. In this study, has been done the counting intestinal coli forms and heavy metals resistant strains isolated from industrial wastewater , domestic wastewater and various parts of the wastewater treatment system of Arak city. In this study 4 genus of bacteria intestinal including Klebsiella spp., Escherichia coli, Citrobacter and Enterobacter were isolated from effluent samples above and were determined the minimum inhibitory concentration (MIC) against the concentration of various heavy metals such as cadmium chloride, nickel sulfate, mercuric chloride, potassium chromate and potassium tellurite using the agar dilution method, and were reported their resistance against some antibiotics by disk method. In this study, for first time, high MIC, 22mM (4032μg/ml) than cadmium, 20mM (3884μg/ml) than chromium, 20mM (6157 μg / ml) than telluride, 10mM (2628μg/ml) than nickel and 1mM (271.5μg/ml) than mercury, were reported for Klebsiella spp. bacteria

کلیدواژه‌ها [English]

  • "intestinal coli forms"
  • "heavy metal resistant"
  • " antibiotic resistance"

بررسی میزان مقاومت کلیفرمهای روده­ای­ جدا شده از پسابهای صنعتی، خانگی و بخشهایی از تصفیه خانه شهر اراک به فلزات سنگین

عباس اخوان سپهی1* ، سحر شریفیان2 ، محمدرضا ذوالفقاری3 و محمد خلیلی درمنی 2 

1 تهران، دانشگاه آزاد اسلامی واحد تهران شمال، گروه زیست شناسی

2  خمین، دانشگاه آزاد اسلامی واحد خمین، گروه زیست شناسی

۳ قم، دانشگاه آزاد اسلامی واحد قم، گروه زیست شناسی

تاریخ دریافت: 27/3/90               تاریخ پذیرش: 27/8/92

چکیده

فلزات سنگین  نظیر کادمیوم، جیوه، نیکل و اکسی آنیونهای تلوریت و کرومات از عناصر سمی هستند که به طرق مختلف وارد محیط زیست شده و برای سیستمهای بیولوژیکی، بالاخص انسان، حیوانات و گیاهان زیان آور می­باشند، لذا حذف آنها از محیط زیست ضروری است. میکروارگانیسم­ها و به ویژه باکتریها نقش بسیار مهمی در حذف زیستی فلزات سنگین داشته و در بیوتکنولوژی کاربرد دارند. در این پژوهش شمارش کلیفرمهای روده­ای و جداسازی سویه­های مقاوم به فلزات سنگین  از پسابهای صنعتی، خانگی و  قسمتهای مختلف سیستم تصفیه پساب شهر اراک انجام شده است. در این مطالعه چهار جنس از خانواده باکتریهای روده­ای شامل Klebsiella spp، Escherichia coli، spp  Citrobacter و   spp Enterobacter  از نمونه پسابهای فوق جداسازی شدند و حداقل تراکم متوقف کننده رشد MIC)) در مقابل غلظتهای مختلف فلزات سنگین  نظیر کلرید کادمیوم، سولفات نیکل، کلرید جیوه، کرومات پتاسیم و تلوریت پتاسیم با استفاده از روش رقت در آگار، تعیین گردید و مقاومت آنها در برابر تعدادی از آنتی بیوتیکها با روش دیسک متد مشخص شد. در این تحقیق  برای اولین بارMIC  بسیار بالای 22mM (4032μg/ml) نسبت به کادمیوم، 20mM (3884μg/ml) نسبت به کروم، 20mM (6157 μg/ml) نسبت به تلوریت، 10mM (2628μg/ml) نسبت به نیکل و 1mM ( (271.5μg/mlنسبت به جیوه برای باکتری Klebsiella spp به دست آمد.

واژه های کلیدی: کلیفرمهای روده­ای، مقاومت به فلز سنگین، مقاومت آنتی بیوتیکی

* نویسنده مسئول، تلفن: 22977860 ، پست الکترونیکی: akhavansepahy@gmail.com

مقدمه

 

فلزات سنگین عناصری هستندکه دارای چگالی۳g/cm۵ می­باشند. فلزات سنگین شامل: جیوه، کادمیوم، نیکل، آرسنیک، مس، سرب، کبالت، نقره وکروم می­باشند برخی از فلزات سنگین به مقدار کم برای رشد سلولی نیاز هستند، و تنها در غلظتهای بالا سمی هستند.

فلزات سنگین از جمله مواد آلوده کننده طبیعت به شمار می­آیند که طی عملکردهایی نظیر استخراج معادن و ورود پسابهای کارخانجات صنعتی از جمله کارخانجات رنگ و رزین، نساجی، دباغی، ذوب فلزات و آبکاری به محیطهای طبیعی وارد می گردند این ترکیبات غالباً به صورت محلول یا ذراتی در اتمسفر در محیطهای آبی و خاکی رها می شوند و گاه غلظت آنها در طبیعت به حد خطرناکی می رسد و باعث آلودگی اکوسیستمهای طبیعی مانند خاک، آبهای سطحی و زیرزمینی می شوند و از سویی موجودات زنده را نیز تحت تأثیر قرار می دهند از طرف دیگر مواد آلاینده به اعماق زمین نفوذ کرده و سفره های آب زیرزمینی را در معرض آلودگی قرار می­دهند (12).

شناسایی میکروارگانیسم­های مقاوم به فلزات نقش مهمی را در رابطه با آلودگی محیط و نهایتاً تیمار این محیطها ایفاء می­کنند به این صورت که با توجه به سطوح بالای برخی از فلزات در پسابها و به طور کلی در محیط­های آلوده به فلز، میکروارگانیسم­ها، مکانیسم مقاومتی را ایجاد می­کنند که منجر به انتخاب گونه­های مقاوم با توانایی تحمل سمیت فلزی می­شوند. معمولاً این نوع میکروارگانیسم­ها در نتیجه تماس با محیطهای آلوده به فلز ظاهر می شوند، محیطهای آلوده به طور اتفاقی می­توانند با تحول و دگرگونی در ساختار ژنتیکی باکتری یا تغییر در عملکرد باکتری، باعث انتخاب همزمان فاکتورهای مقاومت شوند، بر حسب میزان آلودگی ممکن است ظرفیت پلاسمیدی یا ساختار سلولی آنها تغییر یابد تا به آنجا که قدرت تحمل غلظتهای بالاتر ترکیبات سمی را داشته باشند از طرف دیگر باکتریهای مقاوم قادرند با انتقال عناصر ژنتیکی به سویه های دیگر تعداد سویه­­های مقاوم را افزایش دهند (10).

مقاومت باکتریها به آنتی بیوتیکها و عوامل فیزیکی و شیمیایی ضد میکروبی دیگر عموماً ناشی از وجود ژنهای مقاومت بر روی DNA خارج کروموزومی (پلاسمید) است. پلاسمیدها معمولاً برای بقای سلول میزبان ضروری نیستند ولی در شرایط خاص (مثلاً قرار گرفتن در برابر عوامل ضد میکروبی) قادر به ایجاد مقاومت و تضمین بقای سلول هستند (7).

امروزه به دلایل مختلفی نظیر افزایش جمعیت، بالا بودن مصرف سرانه آب در شهرها و به تبع آن ایجاد پساب قابل توجه، محدودیت منابع آب در دسترس، انسان مجبور به تأمین آب مورد نیاز خود از منابع آبی غیر متعارف بوده که مصرف پساب فاضلابهای شهری یکی از این روشها می تواند باشد. از طرفی افزایش یونهای فلزی سمی در فاضلابهای شهری و صنعتی، مسئله نگران کننده­ زیست محیطی می­باشد. در شهر اراک صنایع کوچک و بزرگ بسیاری وجود دارند که فاضلاب خود را وارد شبکه­ جمع­آوری فاضلاب شهری می­کنند. این موضوع باعث بالا رفتن مقادیر این فلزات در فاضلاب شهری و در نهایت پساب خروجی از تصفیه خانه می­شود. با توجه به اینکه این مواد خاصیت تجمع پذیری دارند، لذا تعیین مقادیر این مواد در پساب خروجی تصفیه خانه ضروری به نظر می رسد. در کنار مزایای متعدد استفاده از آبهای بازیافتی در کشاورزی ، مخاطراتی نیز متصور است، یکی از این مخاطرات میکروب­های بیماری­زا می­باشد که باکتریهای بیماری زای روده­ای بیشترین عامل بیماری­زای میکروبی هستند که در پساب یافت می­شوند (1).

 تحقیق حاضر بر اساس طرح تحقیقاتی در شرکت آب و فاضلاب استان مرکزی  بر روی باکتریهای کلیفرم مدفوعی نظیر Citrobacter، Escherichia coli Klebsiella spp و  Enterobacter انجام گردیده است.

انتروباکتریاسه ها گروه بزرگی از باسیلهای گرم منفی، بدون اسپور هوازی و بی هوازی اختیاری بوده که در حالت طبیعی در روده انسان و حیوان زندگی می کنند. در این خانواده، چندین جنس مانند اشرشیا، کلبسیلا، انتروباکتر، سیتروباکتر، سراشیا، شیگلا، سالمونلا و پروتئوس وجود دارند برخی از این باکتریها مانند E.coli ساکن روده بوده و بخشی از فلور طبیعی روده هستند و گاهی هم ایجاد بیماری می کنند (3).

هدف این پژوهش بررسی میزان مقاومت و انتخاب چند سویه مقاوم از بین سویه­های اشرشیاکلی، کلبسیلا، انتروباکتر و سیتروباکتر جداسازی شده از نمونه های پساب صنعتی، خانگی و قسمتهای مختلف تصفیه خانه فاضلاب شهر اراک می­باشد.

تحقیقات نشان داده که یک ارتباطی بین تحمل فلز و مقاومت به آنتی بیوتیک در محیط وجود دارد. به دلیل این احتمال که ژنهای مقاومت به هر دو نزدیک به یکدیگر و بر روی یک پلاسمید قرار گرفته­اند بنابراین به احتمال زیاد در محیط با یکدیگر منتقل می گردند به دلیل افزایش حضور باکتریهای پاتوژن مقاوم به آنتی بیوتیک، درمان بیماریهای عفونی مشکل­تر و گران­تر از قبل شده بنابراین نه تنها باید در استفاده مؤثر از آنتی بیوتیکها در جامعه تأکید نمود بلکه باید نسبت به استفاده از دیگر مواد ضد میکروبی از جمله فلزات سنگین که وارد محیط می­گردند آگاه بود(12).

تاکنون ارتباط بین تحمل فلز و مقاومت به آنتی بیوتیک چندین بار گزارش شده است و با نتایج حاصل از این تحقیق مطابقت دارد که از همه این گزارشات چنین بر می­آید که ژنهای کد کننده مقاومت به فلزات و آنتی بیوتیکها بر پلازمیدهای قابل انتقال قرار گرفته اند (7).

ابتدا میزان مقاومت این باکتریها در مقابل غلظتهای مختلف فلزات سنگین (کلرید کادمیوم، سولفات نیکل، کلرید جیوه، کرومات پتاسیم و تلوریت پتاسیم) توسط MIC تعیین گردید، مقاومت آنها در برابر تعدادی از آنتی بیوتیکها مشخص شد و نیز مطالعه ارتباط بین مقاومت باکتریهای مقاوم به فلزات سنگین مورد آزمایش و مقدار فلزات سنگین و نوع پسابهای مورد آزمایش مورد بررسی قرار گرفت.

کادمیوم یکی از فلزات سنگین سمّی است که از راههای مختلف نظیر پسابهای صنعتی، خانگی، کشاورزی و مکانهای دفن غیربهداشتی مواد زاید شهری و صنعتی وارد منابع آب می شود. استنشاق مزمن ترکیبات کادمیوم، به شکل بخارات یا گرد و خاک، ایجاد ورم ریوی می­کند که در این حالت کیسه­های کوچک هوایی بزرگ شده و عاقبت در اثر حجم کم ریه تخریب می­شوند (16).

عنصر کروم و ترکیبات حاوی آن به صورت Cr3+ معمولاً سلامتی را به خطر نمی اندازد ولیکن به صورت Cr6+  می تواند سمی باشد. کروم از طریق پوستی، گوارشی و تنفسی جذب می شود. استنشاق ترکیبات شش ظرفیتی کروم در دراز مدت باعث سرطان ریه می شود (18).

همچنین تلوریت پتاسیم دارای اثرات حاد و مزمن بر روی انسان و حیوانات می باشد که از اثرات حاد آن تاثیر بر روی سیستم تنفسی، سیستم گوارشی، پوست و بیماریهای چشمی را می توان نام برد عنصر تلوریوم دارای دو اکسی آنیون سمی تلوریت و تلورات می باشد، به نحوی که سمیت تلوریت نسبت به تلورات به مراتب بالاتر می باشد که این امر به دلیل حلالیت بسیار بالای تلوریت است اکسی آنیونهای سمی کرومات و تلوریت با اکسیداسیون گروههای تیولی آنزیمهای مختلف سلولی، جانشینی با گروه های سولفورآمینواسیدها، القای موتاسیون و غیره اثرات زیان باری را به دنبال دارد (11).

نیکل به طور گسترده در بیوسفر وجود دارد و از نظر فراوانی در پوسته زمین بیست و چهارمین عنصر نسبت به عناصر دیگر می باشد. به علاوه نیکل یکی از عمومی ترین فلزات در آبهای سطحی می باشد. استفاده های صنعتی وتجاری از نیکل شامل استنلس استیل، آبکاری، رنگها، سرامیکها می باشد. نیکل در کوتاه مدت مشکلاتی ایجاد نمی­کند اما درطولانی مدت می­تواند باعث کاهش وزن بدن، صدماتی به قلب، کبد، تحریک و حساسیت بالا شود (13).

جیوه یکی از سمی ترین فلزات سنگین است به علت توانایی آن در ترکیب شدن با فلزات دیگر، مصرف صنعتی قابل توجهی دارد ترکیبات جیوه در صنایع باطری سازی، دستگاههای الکتریکی، در کشاورزی به عنوان قارچ کش، علف کش و باکتری کش استفاده می شود (2).

با توجه به اینکه این فلزات سنگین اثرات زیست محیطی فراوانی دارند، لذا وجود باکتریهای مقاوم به این  فلزات که قادر به حذف آنها از محیط باشند، می تواند کمک شایانی در سم زدایی محیط زیست از این ترکیبات سمی و جلوگیری از اثرات سمی شدید آنها بر موجودات زنده داشته باشد.

مواد و روشها

جداسازی و کشت: در این پژوهش تعداد 7 نمونه از پساب صنعتی  ، خانگی، ورودی تصفیه­خانه، برکه بی هوازی، برکه اختیاری یک، برکه اختیاری دو و خروجی تصفیه خانه شهر اراک جمع آوری شد این عمل  با استفاده از ظروف مخصوص نمونه برداری شیشه ای 250 میلی لیتری استریل صورت گرفت و دقت شد که حدود 3 سانتیمتر از بالای بطری خالی بماند تا در هنگام شروع آزمایش بتوان به راحتی نمونه را کاملاً به هم زد تاpH  نمونه ، یکنواخت شود. برای هر نمونه تاریخ برداشت، دمای محل نمونه برداری و نوع نمونه روی برچسبی که بر سطح شیشه نصب گردیده بود نوشته شد. نمونه های جمع آوری شده فوراٌ به آزمایشگاه منتقل گردید تا مراحل مختلف کار روی آنها انجام گیرد. از هر نمونه پساب صنعتی هموژن شده 1 میلی لیتر در شرایط کاملاً استریل برداشته شد و رقتهای متوالی  1-10 تا 10-10 در لوله های آزمایش حاوی 9 میلی لیتر سرم فیزیولوژی (هیدروکسید سدیم و پتاسیم دی­هیدروژن فسفات) استریل باpH  2/7 جهت بازیافت جمعیت  میکروبی استفاده شد. سپس از هر رقت 1/0 میلی­لیتر در دو پلیت حاوی محیط  EMB  آگار به روش Spread plate  کشت داده شد و سپس پلیتهای کشت داده شده در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد قرار داده شد. برای شمارش کلنیها از دستگاه کلنی کانتر استفاده شد پلیتهایی که تعداد کلنی در آنها بین 30 تا 300 بود شمارش شد.

شمارش احتمالی کلیفرمها-MPN: شمارش احتمالی  MPN با استفاده از روش چند لوله ای در کل گروه کلیفرمها انجام شد که شامل باکتریهای هوازی و بی هوازی اختیاری، گرم منفی، بدون اسپور و میله ای شکل بودند و قادر بودند لاکتوز را در فاصله 24 ساعت در حرارت 5/0±35 درجه سانتی گراد تخمیر نموده و ایجاد گاز نمایند.

روش جداسازی میکروب های مقاوم به فلزات : در این تحقیق برای بررسی میکروبهای مقاوم به فلزات از روش رقیق سازی در آگار استفاده شده است .

در روش Agar dilution پس از تهیه محیط کشت BHI آگار از این محیط با پیپت برداشته داخل ارلنهای کوچک تقسیم گردید، در اتوکلاو و در دمای 121 درجه سانتی گراد به مدت 15 دقیقه استریل شده، به طوری که بعد از اضافه کردن محلول فلز سنگین که با روش فیلتراسیون استریل شدند حجم نهایی به 25 میلی­لیتر رسید و pH محیط کشت برابر 7 تنظیم شد.

برای سنجش مقاومت سویه های باکتریایی جدا شده از پسابها الگوی مقاومت بر اساس MIC با غلظتهای 24-5/0 میلی مولار با روش رقت در آگار در دمای 35 درجه سانتی گراد، در محیط نوترینت آگار با pH 2/7 صورت گرفت. (پایین ترین تراکم از محلول فلز سنگین  که کاملاً مانع از رشد باکتری می  گردد MIC  نامیده می­شود)(14).

پس از بسته شدن محیط، پلیتها  به مدت 30 دقیقه در  37 درجه  سانتی گراد قرار داده شد تا سطح پلیت عاری از هر گونه رطوبت شود. در این مرحله 1 میلی لیتر از سوسپانسیون میکروبی که معادل با 5/0 مک فارلند تهیه شده بود را با پیپت استریل در سطح محیط کشت فلز دار ریخته و با میله شیشه ای استریل در سطح پلیت پخش گردید و پس از 24 ساعت انکوباسیون  در 37-35 درجه سانتی گراد نتیجه بررسی شد، از دو پلیت نیز به  عنوان کنترل استریلی استفاده  شد.

الف) کنترل استریلی محیط کشت

ب) کنترل استریلی محلول فلزی

پس از این مرحله به منظور نگهداری باکتریها محیط BHI  آگار حاوی فلز به صورت شیب دار تهیه کرده و کلونیها در آن کشت داده پس از 24 ساعت انکوباسیون و رشد باکتریها در یخچال 4 درجه سانتی گراد نگهداری گردید.

در مرحله بعد حساسیت باکتریها نسبت به برخی از آنتی­بیوتیکها، توسط دیسک های آنتی بیوگرام (Padtan teb)  مورد ارزیابی قرار گرفت. جهت تعیین حساسیت نسبت به آنتی بیوتیکهای:

 Amikacin (30μg/Disc), Ciprofloxacin (5μg/Disc), Gentamycin (10μg/Disc) Tobramycin (10μg/Disc), Sulfamethoxazol, Tetracycline (30μg/Disc), Ampicillin (10μg/Disc), Chloramphenicol  (30μg/Disc), Cefixime (5μg/Disc)       

از روش  دیسک پلیت در محیط Mueller-Hinton Agar (Merck)  استفاده شد و پس از کشت دادن پلیتها به مدت 16-20 ساعت در انکوباتور قرار گرفتند، سپس با توجه به ایجاد هاله عدم رشد باکتریهای مقاوم و حساس تعیین گردیدند (6).   

اندازه گیری فلزات سنگین در پساب: در این تحقیق مقدار فلزات سنگین موجود در پساب ورودی و خروجی تصفیه خانه به کمک دستگاه جذب اتمی مدل Scientific Buck مورد بررسی قرار گرفتند(14). که نتایج حاصل در جدول 5 آورده شده است.

نتایج

در این پژوهش برای اولین بارمقاومت بالای 22 میلی­مولاری  نسبت به کادمیوم، 20 میلی­مولاری نسبت به کرومات،  20 میلی­مولاری نسبت تلوریت، 10 میلی­مولاری نسبت ­به نیکل و 1 میلی­مولاری نسبت به جیوه برای باکتری Klebsiella spp که ازپساب صنعتی و ورودی تصفیه خانه شهر اراک جدا شده بود به دست آمد. MIC 22 میلی­مولاری 4032μg/ml)) نسبت به کادمیوم، 5/5 برابر MIC گزارش شده توسط Filali و همکارانش (8) (733μg/ml & 4Mm) در مورد K. pneumonia است. همچنین 20 برابر MIC گزارش شده توسط Karbasizaed و همکارانش (19) می باشد و (200μg/ml) در مورد Kelebsiella pneumoniae  و 5/1 برابر MIC گزارش شده توسط  Sharmaو همکارانش (18) و (15mM) در مورد Klebsiella planticola سویه Cd-1 می­باشد. بنابراین می توان ادعا کرد که MIC 22 میلی مولاری به کادمیوم بالاترین MIC است که تا به حال گزارش شده است. همچنین  MIC 20 میلی­مولاری 3884μg/ml) )  نسبت به کروم، در باکتریهای Klebsiella spp، Escherichia coli، spp Citrobacter جداشده از پساب صنعتی به دست آمد، که به ترتیب 26، 19  و 5/17  برابر MIC گزارش شده توسط  Rajbanshi و همکارانش (15) است که (به ترتیب برای باکتریهای فوق 150، 200 و220 میکروگرم بر میلی­لیتر) می­باشند. همچنین  MIC 20 میلی­مولاری 6157μg/ml)) نسبت به تلوریت، MIC10 میلی­مولاری2628μg/ml) ) نسبت به نیکل و MIC 1 میلی­مولاری 271.5μg/ml)) نسبت به جیوه برای باکتری Klebsiella spp که ازپساب صنعتی و ورودی تصفیه خانه شهر اراک جدا شده بود به دست آمد.  کمترین MIC گزارش شده مربوط به سمی ترین فلز بررسی شده یعنی جیوه می باشد.

 

 

شکل ۱- درصد فراوانی باکتریهای گرم منفی موجود در پسابهای بررسی شده

 

شکل۲- حداقل میزان غلظت ممانعت کننده از رشد(MIC) ،فلزات سنگین ،برای کلیفرمهای مربوطه پساب صنعتی.  Cd: کلرید کادمیوم/ Ni: سولفات نیکل / Hg: کلرید جیوه/ Te: تلوریت پتاسیم/ Cr: کرومات پتاسیم

 

 

شکل۳- حداقل میزان غلظت ممانعت کننده از رشد(MIC) ،فلزات سنگین ،برای کلیفرمهای مربوطه پساب خانگی

 

 

شکل۴-حداقل میزان غلظت ممانعت کننده از رشد(MIC) ،فلزات سنگین ،برای کلیفرمهای مربوطه پساب ورودی تصفیه خانه

 

شکل۵-حداقل میزان غلظت ممانعت کننده از رشد(MIC) ،فلزات سنگین ،برای کلیفرمهای مربوطه پساب برکه بی هوازی

 

 

در شکل 1 نتایج حاصل از شمارش مستقیم باکتریهای گرم منفی موجود در پسابها نشان داده شده است، که پساب ورودی بیشترین سهم را  و پساب خروجی کمترین سهم  را به خود اختصاص داده است.

در بین کلیفرمهای مدفوعی جدا شده از پسابهای مختلف که میزان مقاومت آنها در برابر فلزات سنگین بررسی شد بیشترین مقاومت مربوط به کلبسیلا و کمترین الگوی مقاومتی مربوط به انتروباکتر می باشد، (شکل 2). همان طور که در شکل 2 نشان داده شده است بیشترین الگوی مقاومتی مربوط به باکتریهای موجود در پساب صنعتی می باشد که علت آن را می­توان به تماس دائمی باکتریها با فلزات سنگین ارتباط داد. با توجه به سطوح بالای برخی از فلزات در پسابهای صنعتی، میکروارگانیسم­ها، از جمله کلیفرمهای مدفوعی  مکانیسم مقاومتی را ایجاد می­کنند که منجر به انتخاب گونه­های مقاوم با توانایی تحمل سمیت فلزی می­شوند، تا به آنجا که قدرت تحمل غلظتهای بالاتر ترکیبات سمی را داشته باشند از طرف دیگر باکتریهای مقاوم قادرند با انتقال عناصر ژنتیکی به سویه های دیگر تعداد سویه های مقاوم را افزایش دهند(17).

همان طور که در شکل 3 نشان داده شده است در بین پسابهای مورد بررسی پساب خانگی علی رغم دارا بودن تعداد کلیفرمهای روده­ای بیشتر نسبت به پساب صنعتی سهم کمتری را در وجود کلیفرمهای روده­ای مقاوم به فلزات سنگین دارد که این موضوع  را می توان چنین تفسیر کرد که در پسابهای خانگی باکتریها کمتر در معرض فلزات سنگین می­باشند. لازم به ذکر است که در پسابهای خانگی نیز باکتریهای مقاوم به فلزات وجود دارند همین طور در سنجش میزان فلزات سنگین در پساب خانگی  وجود فلزات سنگین تأیید شد که این امر می تواند به علت  وجود برخی از این مواد به میزان ناچیز در مواد شوینده و کارگاههای کوچک صنعتی نظیر کارگاههای ریخته گری، رنگ کاری، صاف کاری در سطح شهر باشد که پساب خود را وارد پساب شهری می کنند.

با توجه به شکل 4، کلیفرمهای جدا شده از پساب ورودی تصفیه­خانه الگوی مقاومتی بالایی را به فلزات سنگین نشان می­دهند که این به علت مخلوط شدن پسابهای خانگی و صنعتی در ورودی تصفیه­خانه می­باشد.

نتایج حاصل از حداقل میزان غلظت فلزات سنگین که ممانعت کننده از رشد برای باکتریهای جدا شده از برکه بی­هوازی و برکه­های اختیاری 1و 2 می­باشند، در شکلهای 5، 6 و7 آورده شده است. در پساب خروجی نیز باکتریها الگوی مقاومتی قابل توجهی را نشان می­دهند که بیشترین آن مربوط به باکتری Klebsiella spp می­باشد که حداقل غلظت کروم و کادمیوم که از رشد این باکتری ممانعت می­کنند 20 میلی­مولار می­باشد (شکل 8).

 

 

شکل۶- حداقل میزان غلظت ممانعت کننده از رشد(MIC) ،فلزات سنگین ،برای کلیفرمهای مربوطه پساب برکه تثبیت اختیاری ۱

 

 

شکل۷ - حداقل میزان غلظت ممانعت کننده از رشد(MIC)، فلزات سنگین ،برای کلیفرمهای مربوطه برکه تثبیت اختیاری شماره ۲

 

 

شکل۸-  میزان غلظت ممانعت کننده از رشد(MIC) ،فلزات سنگین ،برای کلیفرمهای مربوطه خروجی تصفیه خانه

 

جدول 1- نتایج حاصل از بررسی مقاومت و یا حساسیت کلیفرمهای جدا شده از پساب صنعتی نسبت به آنتی بیوتیکها

CFM

C

AM

TE

SXT

TOB

GM

CI

AK

سویه باکتری 

S

S

R

R

R

S

S

S

S

کلبسیلا 

R

S

R

S

R

S

S

S

S

اشرشیاکلی 

R

S

R

R

S

S

S

S

S

سیتروباکتر 

R

R

R

R

S

S

S

S

S

انتروباکتر 

جدول 2 - نتایج حاصل از بررسی مقاومت و یا حساسیت کلیفرمهای جدا شده از پساب خانگی نسبت به آنتی بیوتیکها

CFM

C(30)

AM

TE(30)

SXT

TOB

GM

CI

AK

سویه باکتری 

S

S

R

R

R

S

S

S

S

کلبسیلا 

R

S

R

S

R

S

S

S

S

اشرشیاکلی 

R

S

R

R

S

S

S

S

S

سیتروباکتر 

R

R

R

S

S

S

S

S

S

انتروباکتر 

جدول 3 - نتایج حاصل از بررسی مقاومت و یا حساسیت کلی فرم های جدا شده از پساب برکه­های بی هوازی واختیاری 1و2 نسبت به آنتی بیوتیکها

CFM

C(30)

AM

TE(30)

SXT

TOB

GM

CI

AK

سویه باکتری 

S

S

R

S

S

S

S

S

S

کلبسیلا 

S

S

S

S

S

S

S

S

S

اشرشیاکلی 

S

S

S

R

S

S

S

S

S

سیتروباکتر

R

R

R

S

S

S

S

S

S

انتروباکتر

جدول 4 - نتایج حاصل از بررسی مقاومت و یا حساسیت کلی فرم­های جدا شده از پساب خروجی تصفیه خانه  نسبت به آنتی بیوتیکها

CFM

C(30)

AM

TE(30)

SXT

TOB

GM

CI

AK

سویه باکتری

S

S

R

R

R

S

S

S

S

کلبسیلا

R

S

R

S

R

S

S

S

S

اشرشیاکلی

R

S

R

S

S

S

S

S

S

سیتروباکتر

R

R

R

R

S

S

S

S

S

انتروباکتر

 

نتایج حاصل از تست آنتی بیوگرام در جدولهای 1 تا 4 آورده شده است، الگوی مقاومت به آنتی بیوتیکها در باکتریهای جدا شده از برکه بی هوازی، برکه اختیاری یک، برکه اختیاری دو، تصفیه خانه یکسان بود لذا تنها یک جدول (جدول 3) جهت گزارش تست آنتی بیوگرام این سه منطقه آورده شده است.

نتایج حاصل از اندازه گیری مقدار فلزات سنگین موجود در پساب ورودی و خروجی تصفیه خانه­ اراک به کمک دستگاه جذب اتمی مورد بررسی قرار گرفتند. که نتایج حاصل در جدول 5 آورده نشان می­دهد که این فلزات سنگین در پسابهایی که در این بررسی آمده وجود دارند.

بحث

بر اساس اطلاعات به دست آمده از آزمایشها غلظت فلزات کادمیوم،  نیکل، کروم و جیوه در پساب خروجی به ترتیب برابر 01/0>، 1/0، 06/0و 01/0> میلی­گرم بر لیتر به دست آمد. این در حالی است که غلظت این فلزات در پساب ورودی به تصفیه­خانه­ اراک به ترتیب برابر 02/0، 25/0، 1/0 و 01/0> میلی­گرم بر لیتر می­باشد.

جدول 5- غلظت فلزات سنگین اندازه گیری شده  در پساب ورودی و پساب خروجی تصفیه خانه شهر اراک

آلاینده

واحد

ورودی تصفیه خانه

خروجی تصفیه خانه

کادمیوم

mg/l

0.02

0.01>

نیکل

mg/l

0.25

0.1

کروم

mg/l

0.1

0.06

جیوه

mg/l

0.01>

0.01>

جدول 6- کیفیت استاندارد سازمان حفاظت محیط زیست ایران و آمریکا در مورد فلزات سنگین موجود در پساب خروجی تخلیه شده به آبهای سطحی

استاندارد EPA

استاندارد ایران

واحد

آلاینده

۰۵/۰

۰۵/۰

mg/l

کادمیوم

۳۸/۲

۲

mg/l

نیکل

۷۱/۱

۲

mg/l

کرم

۰۱/۰>

۰۱/۰>

mg/l

جیوه

مقایسه نتایج حاصله با استاندارد محیط زیست ایران و استانداردهای مربوط به سازمان US-EPA  که در جدول 6 آورده شده­اند، حاکی از آن است که در تمام موارد نمونه برداری، مقادیر فلزات مورد آزمایش پایین تر از حد استاندارد EPA می باشد، که با توجه به وفور تعداد کارگاهها و صنایع در سطح شهر که باعث ورود فلزات سنگین به فاضلاب شهری می­گردند، انتظار می­رود که مقدار فلزات سنگین بالاتر از حد استاندارد باشد در حالی که داده­های به دست آمده نشان داد که این مقادیر پایین تر از حد استاندارد بودند.(جدول 5) این عامل می­تواند به دلیل دفع غیر مجاز فاضلاب کارخانه­ها و یا تعطیلی فصلی کارگاههای موجود در سطح شهر باشد.

یکی از مهم ترین مسائل دنیای امروز، آلودگی محیط زیست به فلزات سنگین  سمی و خطرناک می­باشد. روشهای متداول حذف فلزات سنگین از محیط آبی، تعویض یون، رسوب­دهی شیمیایی اسمز معکوس، فرآیند تبخیر،  جذب سطحی، که اغلب پر هزینه می­باشند. برای پاسخ گویی به این نیاز، مطالعه در زمینه جذب زیستی ضروری  می­باشد(4). توانایی جذب فلزات سنگین و سمی توسط میکروارگانیسم ها منجر به توجه خاص پژوهشگران به مطالعه انواع قارچها، مخمرها، جلبکها و باکتریهای مختلف در جهت جذب آنها و به دنبال آن حذف این فلزات از محیط زیست به خصوص پساب کارخانجات صنعتی، رودخانه­ها و فاضلابهای آلوده به این گونه فلزات گردیده است که به آن پاک سازی زیستی می­گویند(9).

اگرچه تعدادی از فلزات سنگین عناصر کمیاب ضروری هستند، اما بیشترشان می­توانند در غلظتهای بالا برای تمام شاخه­های حیات مانند میکروبها، با تشکیل ترکیبات کمپلکس در داخل سلول سمی باشند، فلزات سنگین بطور زیادی در زیستگاههای میکروبی به دلیل فرآیندهای صنعتی و طبیعی یافت می­شوند، از این رو بیشتر میکروبهای موجود در این محیطها دارای چندین مکانیسم تکامل یافته برای تحمل حضور فلزات سنگین هستند و یا آنها را به عنوان پذیرنده نهایی الکترون در تنفس بی هوازی به کار می­برند. اثر دیگر تحمل فلزات سنگین در محیط این است که این امر به وسیله افزایش دادن فشار انتخابی محیط باعث حذف ژنهای مقاومت آنتی بیوتیکی می­شود. این احتمال وجود دارد که ژنهای مقاومت به آنتی بیوتیک و فلزات سنگین هردو روی یک نوع پلازمید در باکتریها واقع شده باشند بنابر این به احتمال زیاد با همدیگر در محیط منتقل می شوند(5). اهمیت این موضوع زمانی مشخص می­شود که انسان و یا دامها به طور مستقیم و غیر مستقیم در معرض پسابهای آلوده به فلزات سنگین قرار گیرد و یا، با استفاده از محصولات کشاورزی که در معرض این پسابها بوده­اند خسارات جانی جبران ناپذیری برای انسان و دام به وجود می آید. حتی مسئله­ باکتریهای مقاوم به فلزات سنگین موجود در پساب خود می تواند مشکلاتی از قبیل مقاومت به درمان آنتی بیوتیکی را ایجاد کند. پس از طرفی باید پسابها را از وجود فلزات سنگین و میکروبهای بیماری زا، به ویژه باکتریهای روده­ای که در نتیجه تماس با این محیطها ممکن است مسئله مقاومت به این فلزات و در پی آن مقاومت آنتی بیوتیکی  در آنها ایجاد شده است تیمار گردد و از طرفی دیگر نمی توان از نقش همین میکروارگانیسم های مقاوم به فلزات در حذف فلزات سنگین چشم پوشی کرد زیرا از نظر صنعتی کاربرد باکتری در تصفیه پساب و حذف فلزات آلوده کننده از محیط زیست بسیار مقرون به صرفه است. باید در نظر داشت که کاربرد میکروارگانیسم ها نیز  خود مستلزم شرایط خاص و مناسبی برای آنها می باشد و چنانچه این شرایط فراهم نشود، فعالیت این موجودات نیز مقدور نخواهد بود. با پرورش باکتری و کاربرد مهندسی ژنتیک این خاصیت انتخابی را می توان تقویت کرده و طوری عمل کرد که باکتری فلز خاصی را به تنهایی و در حضور سایر فلزات جذب کند. به عنوان مثال چنانچه باکتری در محیطی که فقط یک فلز خاص دارد پرورش یابد و به تدریج غلظت فلز در محیط پرورش افزایش پیدا کند پس از گذشت چندین نسل باکتری خود را به جذب فلز مورد نظر تطبیق داده و حضور آن را در محیط به مقدار بیشتر تحمل خواهد کرد (13).

و در آخر با توجه به مقاومت بسیار بالای کلیفرمهای گرم منفی جدا شده از پساب می توان امیدوار بود که این سویه ها انتخاب بسیار مناسبی جهت پاک سازی زیستی پسابهای صنعتی از فلزات سنگین کادمیوم، نیکل ، جیوه و اکسی آنیونهای سمی  تلوریت و کرومات باشد. فرآیند جذب زیستی ، روشی مناسب برای زدایش فلزات سنگین از محیط آبی می باشد و هزینه آن بسیار کمتر از روشهای شیمیایی می باشد. فناوری جذب زیستی هنوز در مراحل ابتدایی توسعه قرار دارد . پیش بینی می شود در آینده هزینه آن کاهش یافته و عملکرد آن بهبود یابد. اما برای استفاده گسترده از آن در مقیاس واقعی به تحقیقات بیشتر و برقراری ارتباط با صنایع تولید کننده محصولات مشابه و صنایع مصرف کننده نیاز است. انتظار می­رود با رواج این فناوری ارزان قیمت، گام مهمی در بهبود کیفیت محیط زیست برداشته شود.

تشکر و قدردانی

بدین وسیله از مساعدت شرکت آب و فاضلاب استان مرکزی جهت تأمین هزینه و امکانات و هماهنگیهای لازمه در این مطالعه قدردانی می گردد.

1-Asano, T., Levine, A.D. 1996. Wastewater reclamation: Recycle & reuse past, present and future. Water Science and Technology. Vol. 33, Pp 1-14.

2-Barkay, T. 2003. Bacterial mercury resistance from atoms to ecosystems. Federation of European Microbiological Societies. Vol. 27, Pp 355-384.

3-Bitton, G., Wiley, J. 2005. Wastewater Microbiology. Third Edition

4-Benyehuda, G., Coombs, J., Ward, P. L., Barkay, T. 2003. Metal resistance among aerobic chemoheterotrophic bacteria from the deep terrestrial subsurface. Canadian Journal of Microbiology. Vol. 49, Pp 151 – 156.

5-Craig, B.A., Meredith, S. W., Ramunas, S., Mcarthur , J.V. 2006. Co-selection of antibiotic and metal resistance. trends in microbiology. Vol. 14, No.4, Pp 176-182.

6-Dean, R.D., Mills, A.L. 1989. Bacterial community structure and function along a heavy metal gradient. Vol. 55, No.8, Pp 2002-2009.

7-Edward, C. R., Selvam, G. S. 2009. Plasmid profile and curing analysis of pseudomonas aeruginosa as metal resistant. International journal of Environmental Science and Technology.Vol. 6, Pp 259-266.

8-Filali, B.K., Taoufik, J., Zeroual, Y., Dzairi, F.Z., Talbi, M., Blaghen. M. 2000. Waste water bacterial isolates resistant to heavy metals and antibiotics. Current Microbiology, Vol. 41, Pp. 151–156.

9-Gavrilescu, M. 2004. Removal of heavy metals from the environment by biosorption. Eng. Life. Sci. Vol. 3, Pp 219 – 232.

10-Lengeler, W. L., Drews, G., Schlegel H. G. 1999. Biology of the prokaryotes. First Edition    Blackwell science.

11-Lioyd, J. R. 2003. Microbial reduction of metals and radionuclides. Federation of European Microbiological Societies Microbiology Reviews. Vol. 27, Pp 411– 425.

12-Mara, D., Horan, N. 2003. Handbook of water and wastewater microbiology. Academic Press an Imprint of Elsevier. Pp 507-602.

13-Mulrooney, S. B., Hausinger, R. P. 2003. Nickel uptake and utilization by microorganisms. Federation of European Microbiological Societies Microbiology Reviews. Vol. 27, Pp. 239-261.

14-Parameswari, E., Lakshmanan, A., Thilagavathi, T. 2009. Biosorption of Chromium (VΙ) and Nickel (ΙΙ) by bacterial isolates from an aqueous solution. Electronic Journal of Environmental, Agricultural and Food Chemistry. Vol. 8, Pp 150- 156.

15-Rajbanshi, A. 2008. Study on heavy metal resistant bacteria in guheswori sewage treatment plant. Our Nature, Vol. 6, Pp 52-57.

16-Riazul, H., Sayyed, K. Z., Shakoor, A. R. 1999 Cadmium resistant enterobacter cloacae and klebsiella sp. isolated from industrial E.Uents and their possible role in cadmium detoxification. World Journal of Microbiology & Biotechnology Vol. 15, Pp 283-290.

17-Sabry, S.A., Ghozian, H.A., Abou-Zeid, D.M. 1997. Metal tolerance and antibiotic resistance patterns of a bacterial population isolated from sea water. Journal of applied Microbiology. Vol. 82, Pp 245-252.

18-Snow, E. 1994. Effects of Cr on DNA replication invitro. Environmental Health Perspectives. Vol. 102, Pp 41 – 44.

19-Karbasizaed, V., Badami, N., Emtiazi, G. 2003. Antimicrobial, heavy metal resistance and plasmid profile of coliforms isolated from nosocomial infections in a hospital in isfahan, iran. African Journal of Biotechnology Vol. 2, Pp. 379-383.