بررسی تنوع ژنتیکی جمعیتهای سه گونه بابونه(Anthemis sp)  با استفاده از فعالیت آنزیمی پراکسیداز

مریم السادات ذکری¹، پروین صالحی شانجانی^2*، حمیده جوادی² و علی علیزاده²

¹ کرج، دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرج، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی

² تهران، موسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور

تاریخ دریافت: 14/9/91               تاریخ پذیرش: 17/2/92

چکیده

بابونه ( Anthemis sp) یکی از مهم ترین گیاهان دارویی دنیا است که با توجه به کاربرد روز افزون آن، از اهمیت بسیاری برخوردار است. گوناگونی آنزیمی جمعیتهای بابونه با استفاده ازالگوی الکتروفورز آنزیم پراکسیداز در نه جمعیت از سه گونه  Anthemis haussknechtti، A.psudocutula و  A.triumfetti  مورد بررسی قرار گرفت. از 11 آلل مشاهده شده، سه آلل نادر(با فراوانی کمتر از 05/0 درصد) در گونه  A. triumfettiدیده شد. چهار آلل مختص به محل در گونه‌های
 A pseudocutula و A. triumfetti و در لوکوسهای PXA و PXB ردیابی شد. بیشترین فاصله ژنتیکی بین گونه‌های
 A. pseudocutula  و A. triumfetti و کمترین فاصله ژنتیکی بین دو گونه A. triumfetti و A. haussknechtii  مشاهده شد. با استفاده از تجزیه به مؤلفه‌های اصلی هماهنگ نشان داد که گونه A. pseudocutula   بیشترین فاصله را از دو گونه دیگر داشته و در تجزیه خوشه ای نیز در کلاستر جداگانه ای قرار گرفت. بین داده های اکولوژیکی و فواصل ژنتیکی حاصل از تجزیه داده های آنزیمی، همبستگی دیده نشد ولی همبستگی بین طول و عرض جغرافیایی با فواصل ژنتیکی در سطح 1 درصد معنی‌دار بود. در جمعیت های مورد مطالعه، تجزیه واریانس مولکولی در میان جمعیت های هر گونه 18 درصد و درون جمعیت ها 44 درصد می باشد.

واژه های کلیدی: تنوع ژنتیکی، پراکسیداز، ایزوآنزیم، Anthemis

* نویسنده مسئول، تلفن: 44580282، پست الکترونیکی: Psalehi@rifr-ac.ir 

مقدمه

بابونه رومی (Anthemis sp) گیاهی علفی، چند ساله و از خانواده Asteraceae است. مصرف بابونه ( آلمانی و رومی) از گذشته دور در جهان مستند است و در فارماکوپه های 26 کشور آمده است (22). این گیاه، مدیترانه‌ای بوده و منشاء آن پرتغال، فرانسه و الجزایر است و در حال حاضر، مصرف سالانه بابونه در جهان شامل بابونه آلمانی و رومی، بیش از ۴ هزار تن گل خشک است(1). بابونه یکی از مهم ترین داروهای شناخته شده توسط انسان و یکی از پر‌مصرف‌ترین گیاهان دارویی در اروپا، خاورمیانه، آمریکای شمالی، استرالیا و کشورهای آفریقایی است و بر این اساس در چند دهه اخیر در مناطق مختلف جهان به ویژه در کشورهای اروپایی تحقیقات زیادی پیرامون جنبه‌های به‌زراعی و به‌نژادی این گیاه انجام گرفته و همه ساله شاهد انواع محصولات تولیدی از این گیاه می توان بود. بهمین دلیل  و با توجه به کاربرد روز افزون آن در صنایع داروسازی، آرایشی و بهداشتی، عطرسازی و تهیه چاشنی‌های غذائی، بررسی تنوع ژنتیکی بابونه جهت اصلاح و دستیابی به ژنوتیپهای برتر، امری ضروری به نظر می‌رسد.

تنوع ذخایر ژنتیکی علاوه بر کمک به پایداری پوشش گیاهی در مقابل تنشهای ناشی از عوامل زنده و غیر زنده، در اصلاح ارقام و دستیابی به ژنوتیپهای برتر نیز اهمیت دارد (15). نشانگرهای بیوشیمیایی از دهه 1950 میلادی برای مطالعه گیاهان زراعی به صورت گسترده‌ای مورد استقبال قرار گرفت. از این نشانگرها برای شناسایی گونه‌های مختلف گیاهی، تفکیک هیبریدها، تعیین خلوص واریته‌ها، بررسی روابط تکاملی و تعیین میزان حساسیت گیاه نسبت به تغییرات و تنشهای محیطی استفاده می‌شود. نشانگرهای آنزیمی یکی از مهم ترین نشانگرهای بیوشیمیایی هستند که در سطح وسیع مورد استفاده قرار می‌گیرند. در مطالعاتی که بر پایه این نشانگرها انجام می‌شود از چند‌شکلی آیزوزیمی(isozym polymorphism) استفاده می‌شود (20).

ایزوآنزیمها اشکال متفاوت و قابل مشاهده الکتروفورزی آنزیمها هستند که توسط ژنهای متفاوت و جایگاههای متفاوت ژنی کد می‌شوند. هر ژن می‌تواند در یک مکان ژنی، آللهای متفاوتی داشته باشد که این آللها با تغییرات جزئی، پروتئینهای تغییر یافته را کد می‌کنند. این پروتئینها زیر دسته‌ای از ایزوزیم‌ها یعنی آلوزیم‌ها هستند که ناشی از تفاوتهای آللی اند. بررسی گوناگونی آلوزیمی که ناشی از تغییرات در توالیهای DNA رمز کننده پروتئین می‌باشد، از روشهای متداول در زیست‌شناسی جمعیتهای گیاهی است(23 و 25).

آنزیم پراکسیداز به شماره اندکس (EC1.11.1X) و از گروه آنزیمهای اکسیدوردوکتاز است. گیاهان در برابر عوامل تنش‌زای محیطی پروتئینهایی با نام کلی پروتئینهای وابسته به عوامل بیماری‌زا ( PRPs: Pathogen Related Proteins) تولید می‌کنند. این پروتئینها به گروههای مختلفی تقسیم می‌شوند. تحقیقات نشان داده‌اند که اعضای یک تا پنج این پروتئینها (PRP1-PRP5) فعالیت آنزیمی ندارند ولی از PRP6 تا PRP11 همگی دارای فعالیت آنزیمی هستند و آنزیم پراکسیداز در خانواده PRP9 قرار دارد (12، 13 و 24). در همین رابطه فعالیت آنزیم پراکسیداز در پسته رقم احمد‌آقایی آلوده به قارچ آسپرژیلوس( 10)، سیب‌های رقم زرد آلوده به باکتری سودوموناس(2) و قارچ پنسیلیوم و خیارهای آلوده به فوزاریوم(9) مورد بررسی قرار گرفته است. حداکثر فعالیت این آنزیم در فصول سرد سال گزارش شده است. با استفاده از این آنزیم می‌توان تأثیر تنش سرما بر گیاهان را مطالعه کرد و از این طریق می‌توان به گیاهانی مقاوم تر به سرما نیز دست پیدا کرد( 4). آنزیم پراکسیداز، از مهم ترین آنزیمها در سیر تحولات فیزیولوژیک گیاهان می‌باشد و به دلیل فراوانی باندها و نیز امکان وضوح باندها جهت مطالعات ایزوزیمی، همواره از جایگاه خاصی برخوردار بوده و بسیاری از محققین برای بررسی تنوع ژنتیکی گیاهان از تفسیر زیموگرامهای الکتروفورزی این آنزیم استفاده کرده اند (5، 6، 7، 19 و 21). البته برای بررسی تنوع ژنتیکی، تنها از آنزیم پراکسیداز استفاده نمی‌شود و گاهی، سایر آنزیمهای گیاهی به عنوان مارکرهای شیمیایی برای بررسی تنوع ژنتیکی مورد مطالعه قرار می‌گیرند(5، 11، 16، 17).

هدف از انجام این تحقیق شناسایی تنوع ژنتیکی و پلی‌مورفیسم درون گونه‌ای و میان گونه‌ای بابونه با استفاده از آنزیم پراکسیداز است تا از این طریق بتوان کارآیی آنزیم پراکسیداز را به عنوان یک نشانگر مناسب جهت بررسی تنوع ژنتیکی گونه‌های متفاوت بابونه مورد مطالعه قرار داد. همچنین هدف دیگر، معرفی مناسب‌ترین والدین جهت هیبریداسیون است تا از این طریق و با استفاده از مطالعات آتی، مانند انتقال ژن بتوان جهت اصلاح گیاه دارویی بابونه اقدام نمود.

مواد و روشها

بذر جمعیتهای مورد مطالعه از بانک ژن مؤسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور تهیه گردید. جمعیتها شامل شش جمعیت از گونه triumfetti .A از استانهای مازندران، گلستان و آذربایجان غربی، دو جمعیت از گونه
 A. haussknechtti از استانهای ایلام و گلستان و یک جمعیت از گونه A. pseudocotula  از استان گلستان بود. مشخصات جغرافیایی و اقلیمی هر منطقه در جدول 1 آمده است. بذور ابتدا نشاکاری شده و بعد از انتقال به مزرعه تحقیقاتی واقع در ایستگاه البرز کرج( مؤسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور) در قالب طرح بلوکهای کامل تصادفی در 10 تکرار کشت شدند. پس از رشد کافی و رسیدن به اندازه مورد نظر، نمونه‌برداری در اردیبهشت ماه از بوته‌های یکساله انجام گرفت. از 90 نمونه متعلق به نه جمعیت مورد مطالعه(از هر جمعیت 10 تکرار) به میزان یک گرم برگ جدا شد و به  نسبت 1:2 با محلول استخراج (EDTAII  1 درصد،pvp40  1 درصد و مرکاپتواتانول 1 درصد) به خوبی در هاون سرد همگن شد. نمونه‌ها با دور 4000 و به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شده و عصاره آن خارج گردید. الکتروفورز به روش ژل پلی آکریل آمید حاوی ژل با غلظت 12 درصد انجام شد. از هر نمونه به میزان 70 میکرولیتر در داخل هر چاهک تزریق و ولتاژ منبع الکتریکی روی حالت max و آمپر بر روی 90 میلی‌آمپر( برای هر دو ژل) تنظیم شد. هنگامی که حرکت آنزیم درژل به 8 سانتیمتر رسید، ژل از دستگاه جدا شده و درون محلول پراکسیداز گذاشته شد. بعد از حدود 12 ساعت ژل، از این محلول خارج شده و در آب مقطر قرار داده شد.

اطلاعات حاصل از ژل آنزیم به صورت لوکوسهای PXA، PXB و PXC  نشان داده شد و با توجه به این سه لوکوس و با شمارش تعداد باندهای به وجود آمده در هر لوکوس، ماتریس داده‌ها ترسیم گردید. میانگین تعداد آلل در هر لوکوس(Na)، تعداد آللهایی با فراوانی مساوی یا بیش از 25 درصد و 50 درصد و آللهای نادر( با فراوانی کمتر و یا مساوی 05/0 درصد) ، هتروزیگوسیتی و درصد پلی‌مورفیسم با نرم افزار Gene Alex محاسبه گردید. تسهیم گوناگونی ژنتیکی درون و میان گروهی توسط آزمون واریانس مولکولی(AMOVA) و برنامه نرم‌افزاری ARLEQUIN 101 تعیین گردید. اهمیت هر جزء واریانس با آزمون Excoffier  مطالعه و فاصله ژنتیکی براساس معادله Nei برآورد گردید. با استفاده از فاصله ژنتیکی، تجزیه به مولفه‌های اصلی و تجزیه خوشه‌ای به روش UPGMA انجام گرفت.

برای معرفی گیاهان مورد مطالعه، از حرف اول نام گونه و سپس نام شهر محل جمع آوری گیاه استفاده شد.

نتایج

تفسیر زیموگرام پراکسیداز از روش Thiebaut و همکاران انجام شد. ژل پراکسیداز به وسیله 3 لوکوس ژنی رمز می‌شود، به طوری که دو زون دارای فعالیت کافی و پایدار هستند و تحت عنوان PXB و  PXC مورد بررسی قرار می‌گیرند و زون سوم(PXA) وابسته به فصل می‌باشد که با مشاهدات صورت گرفته بر روی ژلهای پراکسیداز در این تحقیق لحاظ گردید. در لوکوس  PXAاختلافات آللی وجود نداشت و تنها در جمعیت گرگان از گونه
A. pseudocutula فراوانی آللA  و B برابر با 500/0 بود. لوکوس PXB با 5 آلل، دارای اختلافات آللی قابل توجهی بود به طوری که فراوانی آللی از 000/0 تا 800/0 متغیر بود. بیشترین فراوانی آللی مربوط به آلل B  درگونه haussknechtii A. و در جمعیت ایوان(800/0) و کمترین فراوانی، مربوط به آلل  Aدر گونه A. triumfetti  و در جمعیتهای گرگان و رامیان(050/0) بود. در لوکوس PXC چهار آلل دیده شد که بیشترین فراوانی مربوط به آلل A در گونه triumfetti  A. و در جمعیت زیراب (875/0) و کمترین فراوانی در آلل  Dدر جمعیت رامیان متعلق به گونه A. triumfetti(050/0) بود. در مجموع سه آلل نادر با فراوانی 050/0 در آللهای A و D گونه A. triumfetti (در لوکوسهای PXB و  PXC) دیده شد. چهار آلل مختص به محل در گونه‌های A. triumfetti  و A. pseudocutula متعلق به جمعیت گرگان و در لوکوسهایPXA  و PXB نیز مشاهده شد(جدول 2).

جدول 1- مشخصات جغرافیایی و اقلیمی مناطق مورد مطالعه

جدول شماره2- فراوانی آللی در 9 جمعیت از 3 گونه Anthemis  بر اساس داده های آنزیمی

جدول3- جدول تکثر ژنتیکی در 9 جمعیت از 3 گونه Anthemis   مورد مطالعه

جدول4- ماتریس برآورد نااریب فاصله ژنتیکی (NEI) در میان 9 جمعیت از 3 گونه Anthemis  بر اساس داده های آنزیمی

شکل1- نمودار رسته بندی (PoCA) ویژگیهای 9 جمعیت از 3  گونه Anthemis بر اساس فاصله ژنتیکی با استفاده از دو مولفه اصلی (مولفه اول03/42 و مولفه دوم 12/27)

شکل2- دندروگرام حاصل از تجزیه کلاستر به روش UPGMA بر روی 9 جمعیت از 3 گونه Anthemis   برا ساس ایزوزیم ها

مقادیر تکثر و تنوع آللی در جدول 3 در سطح جوامع مختلف نشان داده شده است. بالاترین میزان تعداد آلل(Na) متعلق به گونه A. triumfetti و جمعیت گرگان1 و کمترین تعداد آلل در گونه A. haussknechtii و در جمعیتهای  گرگان، ایوان و همچنین گونه A. triumfetti در جمعیت زیراب دیده شد (جدول3) میانگین تعداد آلل برابر با 81/1 محاسبه گردید.

نسبتهای محاسبه شده تک تک هتروزیگوت‌ها در یک لوکوس به عنوان هتروزیگوسیتی مشاهده شده(H_O) تعریف می‌شود و برای اینکه میزان هتروزیگوسیتی، مستقل از فراوانی آللی باشد، از هتروزیگوسیتی مورد انتظار استفاده شد. هتروزیگوسیتی مشاهده  شده در لوکوس  PXA برابر با 056/0، در لوکوسPXB، 499/0 و در لوکوس PXC، 448/0 بود. میزان پلی‌مورفیسم در تمام جمعیتها یکسان و برابر با 67/66 درصد بود، به استثناء گونه A. pseudocutula  که بالاترین میزان پلی‌مورفیسم (100 درصد) را دارا بود (جدول3). میانگین پلی‌مورفیسم برابر با 37/70 درصد محاسبه گردید.

برآورد نااریب فاصله ژنتیکی(Nei) در نه جمعیت مورد مطالعه نشان داد که بیشترین فاصله (095/1)و کمترین شباهت ژنتیکی بین دو گونهA. triumfetti  (جمعیت ارومیه) و A. pseudocutula( جمعیت گرگان ) و کمترین فاصله(053/0) و بیشترین شباهت ژنتیکی بین دو گونه  A. haussknechtii( جمعیت‌ ایوان) و A. triumfetti (جمعیت گرگان) وجود داشت (جدول4). از فاصله ژنتیکی بین جمعیتها برای آنالیز تجزیه به مؤلفه‌های اصلی (POCA) و تجزیه خوشه‌ای با روش UPGMA استفاده گردید. مؤلفه اصلی اول با 03/42 درصد و مؤلفه اصلی دوم با 12/27 درصد از واریانس و در مجموع سه مولفه(26/91 درصد) از کل واریانس، متغیرها را توجیه نمودند( شکل1). نتایج تجزیه کلاستر نشان داد که جمعیتهای مورد بررسی در سه کلاستر قرار دارند که کلاستر اول شامل جمعیت های H- گرگان1،T - زیراب، H- ایوان وT-گرگان2 می‌شود. در کلاستر دوم جمعیتهای T- گرگان1، T- رامیان، T- ارومیه1 و T- ارومیه2 قرار می‌گیرند. در کلاستر سوم تنها جمعیت P- گرگان قرار گرفت. بنابراین تجزیه خوشه‌ای گونه A. pseodocutula را در کلاستر جدا و متمایز از سایر گونه‌ها قرار داد؛ در واقع این گونه بیشترین فاصله ژنتیکی را از سایر جمعیتها داشته که نشان دهنده کمترین شباهت ژنتیکی این گونه با سایر گونه و جمعیتها است( شکل2).

در جدول همبستگی صفات ژنتیکی با عوامل جغرافیایی نشان داده شد که تنها تعداد آلل با حداکثر دمای سالانه همبستگی معنی‌داری در سطح 5/0 درصد دارد. هیچ نوع همبستگی دیگری بین صفات ژنتیکی حاصل از داده‌های آنزیمی با عوامل جغرافیایی مشاهده نشد. همبستگی بین فاصله ژنتیکی حاصل از داده‌های آنزیمی با طول و عرض جغرافیایی با آزمون منتل مورد بررسی قرار گرفت که نتایج نشان داد  0004/0 = R ²  و 480/0= P است که از لحاظ آماری معنی‌دار نیست.

بحث

تفسیر زیموگرامهای الکتروفورزی آنزیم پراکسیداز، تاکنون برای بررسی تنوع و تمایز ژنتیکی بسیاری از گیاهان مورد استفاده قرار گرفته است (3، 5، 6، 7، 8، 17 ، 18 و 21). در تحقیق حاضر، گروه‌بندی جمعیتها براساس فعالیت کیفی آنزیم پراکسیداز، تمایز ژنتیکی بالا و کلاسه‌های ژنتیکی متنوعی را نشان داد.

هتروزیگوسیتی مشاهده شده در لوکوس  PXA برابر با 056/0، در لوکوس PXB، 499/0 و در لوکوس PXC، 448/0 بود و این در حالی است که میزان هتروزیگوسیتی مورد انتظار در این لوکوسها به ترتیب 111/0، 589/0 و 577/0 محاسبه شد. بنابراین هتروزیگوسیتی مشاهده شده از هتروزیگوسیتی مورد انتظار بالاتر است که این به معنای انحراف از تعادل هاردی- وینبرگ در جهت افزایش هتروزیگوت ها است.

در جمعیتهای مورد مطالعه، تجزیه واریانس مولکولی در میان جمعیتهای هر گونه 18 درصد و درون  جمعیتها 44 درصد می‌باشد. وجود تغییرات ژنتیکی درون جمعیتی، یک مزیت برای گونه‌ها در شرایط محیطی بی‌ثبات است که در اثر تبادل ژنتیکی ژنوتیپها با یکدیگر پدید می‌آید (14).

نتایج به دست آمده از تجزیه به مؤلفه‌های اصلی نشان داد که گونه A. pseudocutula بیشترین فاصله و تفاوت ژنتیکی را از سایر جمعیتها داشته است؛ در نمودار تجزیه خوشه‌ای نیز این گونه در کلاستر جداگانه‌ای قرار گرفته و این مطلب نشان می‌دهد که این گونه کاملاً از سایر گونه‌ها و جمعیتها متمایز بوده و به همین دلیل پیشنهاد می‌شود از این جمعیت برای ایجاد تنوع ژنتیکی و آزمایشهای تلاقی در ژرمپلاسم و در پروژه‌های اصلاحی استفاده شود.

با توجه به اینکه مناطق مورد مطالعه در این تحقیق دارای دامنه ارتفاعی متنوعی بودند(1332-40 متر)، معنی‌دار بودن همبستگی فواصل ژنتیکی با عوامل جغرافیایی دور از انتظار نبوده و این همبستگی می‌تواند در اثر سازگاری جمعیتها با شیب جغرافیایی و اختلاف ژنتیکی بین آنها باشد.

در تحقیق حاضر، گروه‌بندی جمعیتها براساس فعالیت کیفی آنزیم پراکسیداز، تمایز ژنتیکی بالا و کلاسه‌های ژنتیکی متنوعی را نشان داد، که با توجه به اینکه بذرهای بابونه همگی در یک منطقه کشت شده، نمونه‌برداری از بوته‌ها به صورت یکنواخت انجام گرفت و همه گیاهان تحت تأثیر شرایط محیطی یکنواختی هم بودند، چنین اختلافاتی می‌تواند ناشی از تفاوت ژنتیکی این گیاهان باشد؛ همچنین مقادیر فاصله ژنتیکی(Nei) نشان می‌دهد که آنزیم پراکسیداز جمعیتها را به خوبی از یکدیگر متمایز کرده و می‌تواند به عنوان نشانگر مناسبی برای تفکیک بین جمعیتهای این سه گونه از جنس Anthemis عمل نماید.

پیشنهاد می‌شود برای بررسی بیشتر و دقیق تر تفاوتهای ژنتیکی از سایر نشانگرها مانند نشانگرهای مولکولی برای نقشه برداری کامل از ژنوم بابونه استفاده شود.