تعیین فعالیت سلولازی آکتینومیست‌های گرما‌دوست موجود در کمپوست قارچ خوراکی به روش ارزیابی با کاغذ صافی 

نفیسه تقی‌زاده^1،*، محمد فارسی¹، علی پاکدین پاریزی² و سعید طریقی³

¹ مشهد، دانشگاه فردوسی مشهد، دانشکده کشاورزی، گروه بیوتکنولوژی

² ساری، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی، پژوهشکده  ژنتیک و زیست فناوری طبرستان 

³ مشهد، دانشگاه فردوسی مشهد، دانشکده کشاورزی، گروه بیماریهای گیاهی

تاریخ دریافت: 19/12/90             تاریخ پذیرش: 11/4/91

چکیده

آکتینومیست‌ها، به ویژه گونه‌های گرمادوست، به عنوان اصلی‌ترین اجزای میکروفلور کمپوست قارچ خوراکی دکمه‌ای شناخته ‌شده‌اند. این گروه از باکتریها در تولید آنزیمهای تجزیه‌کننده و آنتی‌بیوتیکها توانایی زیادی دارند. آکتینومیست‌های گرمادوست از مراحل مختلف تهیه کمپوست‌ با تکنیک رقیق‌سازی جداسازی شدند و کشت خالص آنها تهیه گردید. از نتایج تستهای بیوشیمیایی و تجزیه و تحلیل الگوی برشی ژن 16SrRNA برای شناسایی جدایه‌ها استفاده شد. توانایی تجزیه سلولز در هر کدام از جدایه‌ها با استفاده از روش ارزیابی با کاغذ صافی در دما و ‌pH‌‌‌‌های مختلف مورد بررسی قرار گرفت. حداکثر فعالیت آنزیمی برای هر کدام از جدایه‌ها بر اساس میلی‌گرم گلوکز آزاد شده از یک میلی‌لیتر عصاره ناخالص تعیین شد. بر اساس نتایج به دست ‌آمده، دما و pH بهینه‌ فعالیت آنزیمی برای جدایه‌های مختلف متفاوت بود. در دمای 45 درجه سانتی گراد جدایه 23 با میانگین 10/1 میلی‌گرم در میلی‌لیتر، فعال ترین ایزوله سلولازی معرفی شد. این ایزوله‌ها جهت بهینه‌سازی کمپوست قارچ به کار برده شدند.

واژه های کلیدی: آکتینومیست‌های گرمادوست، ارزیابی با کاغذ صافی، فعالیت سلولازی، کمپوست

* نویسنده مسئول، تلفن: 09363251748، پست الکترونیکی: na65_taghizadeh@yahoo.com

مقدمه

از گذشته‌های دور قارچها دارای ارزش دارویی و خوراکی برای بشر بوده‌اند. با عمومیت یافتن کشت و پرورش قارچ تولید جهانی آن افزایش یافته است. تولید قارچ می‌تواند مقادیر عظیمی از مواد زائد لیگنوسلولزی را به طیف گسترده‌ای از محصولات (دارویی، خوراکی و کود) تبدیل کند و همچنین از محیط زیست محافظت نماید (1). قارچ خوراکی دکمه‌ای سفید با سایر قارچهای خوراکی مورد کشت، از نظر تغذیه‌ای و درمانی تفاوت چندانی ندارد، اما آنچه که این قارچ را کاملاً متمایز از سایر قارچها ساخته است، گسترش جهانی تولید این قارچ است، به طوری که این قارچ در تمامی سوپرمارکتهای جهان فروش زیادی دارد (5). افزایش عملکرد قارچ خوراکی دکمه‌ای سفید وابستگی مستقیم با کیفیت کمپوست دارد. برای پژوهشگرانی که راجع‌به کمپوست تحقیق می‌کنند تعیین تنوع و ساختار جمعیت میکروبی درگیر در فرآیند کمپوست‌سازی بسیار مهم است. جمعیت میکروبی کمپوست نقش اساسی در تولید کمپوست با کیفیت مطلوب دارد (17).

آکتینومیست‌ها به ویژه گونه‌های گرمادوست مهم ترین اجزای جمعیت میکروبی کمپوست هستند که به عنوان تجزیه‌کننده مواد سلولزی از نظر کشاورزی، بسیار حائز اهمیت‌ می‌باشند. این باکتریها منابع مهم تولید آنتی‌بیوتیکها به شمار می‌روند(4).

آکتینومیست‌های گرمادوست هوازی و غیر اسید فست هستند. این موجودات گرم مثبت و دارای فیلامنت‌های شاخه‌دار بوده و در دیواره سلولی آنها میکولیک اسید وجود ندارد (10). این گروه بیشتر بر اساس خصوصیات مورفولوژیکی از جمله تولید میسلیوم هوایی و رویشی طبقه‌بندی شده‌اند. جنسهای مختلفی در این گروه از آکتینومیست‌ها وجود دارند (21).

جنس Streptomyces یکی از مهم ترین آکتینومیست‌های گرمادوست است. گونه‌های این جنس توانایی تجزیه بسیاری از ماکرومولکولهای مختلف مانند ترکیبات سلولزی، نشاسته، لیپید و کیتین را دارا می‌باشند. نژاد‌های متفاوتی از آنها برای توانایی تجزیه سلولز مورد مطالعه قرار گرفته‌اند. نژاد‌های Streptomyces مقادیر زیادی پروتئینهای خارج‌سلولی از جمله سلولاز ترشح می‌کنند (13).

سلولاز‌ها کمپلکسی آنزیمی از سه گروه می باشند که بطور هم‌افزایی با یکدیگر عمل می‌کنند و می‌توانند پیوندهای گلوکوزیدی  (4 -1)β را هیدرولیز نمایند. این آنزیم از بتا 1و4- اندوگلوکاناز، سلوبیوهیدرولاز و بتا گلوکوزیداز تشکیل شده‌ است (20).

در مطالعه ای که توسط جانگ و چن در سال 2003 انجام شد، جدایه‌ای از جنس Streptomyces با توانایی تولید سلولاز مقاوم به حرارت معرفی شد (13). محققان دیگری نیز گونه‌های S. lividens ،S.albaduncus  ، S.reticuli را گزارش کرده‌اند که در شرایط بهینه و استفاده از پودر سلولز به عنوان منبع کربن دارای تولید آنزیم اندوگلوکاناز قابل توجهی بودند (6).

ترکیب جمعیت میکروبی کمپوست قارچ خوراکی در فاز دوم یکی از مهم ترین عوامل مؤثر در میزان عملکرد قارچ خوراکی است. شناسایی آکتینومیست‌های دارای قدرت تجزیه سلولز می‌تواند جهت دستورزی ترکیب کمپوست استفاده گردد و عملکرد قارچ در واحد سطح را افزایش دهد. هدف از این مطالعه بررسی تنوع این باکتریها و تعیین فعالیت سلولازی آنها به روش اندازه‌گیری سلولاز کل با سوبسترای کاغذ واتمن شماره 1 بود. این جدایه‌ها برای تلقیح روی کمپوست قارچ خوراکی جهت بهبود کیفیت آن به کار برده شدند.

مواد و روشها

جداسازی باکتریها: نمونه‌های کمپوست مورد استفاده در این تحقیق، از مرکز تحقیقات قارچهای خوراکی دانشکده کشاورزی دانشگاه فردوسی مشهد تهیه شد. نمونه‌برداری از مراحل مختلف فاز دوم کمپوست‌سازی انجام شد. نمونه‌ها توسط تکنیک رقیق‌سازی در محیط کشت کمپوست آگار غنی شده با محیط CYM (ترکیبات CYM (5X): Peptone 1 گرم، K₂HPO₄ 24/0 گرم،  KH₂PO₄5/0 گرم،  Yeast Extract 1 گرم، Dextrose 10 گرم و MgSO₄7H₂O 5/0 گرم در 100 میلی لیتر آب مقطر) در دمای 40 درجه سانتی گراد تا ظاهر شدن کلنی‌ باکتریها قرار داده شدند. کلنیهای با ظاهر گچی و خشبی به محیط جدید منتقل شده و کشتهای خالص از هر کدام از جدایه‌ها تهیه شد.

آزمونهای بیوشیمیایی: آزمونهای احیای‌نیترات، کاتالاز، هیدرولیز اوره، اسیدفست جزئی و رنگ آمیزی گرم روی جدایه‌ها انجام شد. باکتریها برای بررسی ظاهر کلنی و اندام هوایی روی محیط کشت آب-‌آگار کشت شدند. توانایی تولید ملانین با استفاده از محیط کشت ISP₇ ]ترکیبات ISP₇: Glycerol 15 گرم، L-Tyrosine 5/0 گرم، L-Asparagine 1 گر م، K₂HPO₄ 5/0 گرم، MgSO₄7H₂O 01/0 گرم، Trace Element HO -LE 1 میلی‌لیتر (ترکیبات  Element HO-LE: H₃BO₃ 85/2 گرم، MnCl₂4H2O 8/1 گرم، Sodium Tartate 77/1 گرم، FeSO₄7H₂O 36/1 گرم، CoCl₂6H₂O 04/0 گرم، CuCl₂2H₂O  027/0 گرم، Na₂MoO₄2H₂O 025/0 گرم، ZnCl₂  02/0 گرم در 1000 میلی‌لیتر آب مقطر) و Agar 15 گرم در 100 میلی‌لیتر آب مقطر[ و تولید رنگیزه در هر کدام از جدایه‌ها با استفاده از محیط کشت ISP₅ ] ترکیبات ISP₅: Glycerol 10 گرم، L-Asparagine 1 گرم، K₂HPO₄ 1 گرم، Trace Salt Soulation 1 میلی‌لیتر (ترکیبات Trace Salt Soulation : FeSO₄7H₂O 1 گرم، MnCl₂4H₂O  0/1 گرم و ZnSO₄7H₂O 1/0 گرم در 100 میلی‌لیتر آب مقطر) و Agar 15 گرم در 1000 میلی‌لیتر[ مورد بررسی قرار گرفت (18).

شناسایی مولکولی: پس از استخراج DNA از جدایه‌های آکتینومیست، با استفاده از پرایمر‌های عمومی ژن 16SrRNA، fD1 (توالی پرایمر رفت fD1: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') و rP2 (توالی پرایمر برگشت rP2: 5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3') (22) واکنش زنجیره‌ای پلیمراز انجام گردید. چرخه حرارتیPCR  به صورت مرحله دناتوراسیون اولیه در دمای 96 درجه سانتی گراد به ‌مدت 2 دقیقه، دناتوراسیون در دمای 96 درجه سانتی گراد به ‌مدت 45 ثانیه در بقیه چرخه‌ها، مرحله اتصال در دمای 56 درجه سانتی گراد به ‌مدت 30 ثانیه، مرحله طویل‌شدن در دمای 72 درجه سانتی گراد به‌ مدت 2 دقیقه انجام گرفت. مرحله آخر طویل شدن به مدت 5 دقیقه انجام شد. این برنامه در 30 چرخه تکرار گردید. به منظور شناسایی و تعیین تنوع جدایه‌های آکتینومیستها، الگوی برشی ژن 16SrRNA برای هر کدام از جدایه‌ها پس از هضم با آنزیمهایMboI ,KpnI ,PstI ,HindIII ,SalI ,PaeI ,VspI  با استفاده از نرم افزار TotalLabTL120 تهیه شد. الگوهای برشی به دست آمده برای هر جدایه با الگوهای به دست آمده از هضم توالیهای معتبر آکتینومیست‌های ثبت شده در پایگاه اطلاعاتی NCBI که در محیط این‌سیلیکو هضم شده بود مقایسه شد. با استفاده از این نتایج آکتینومیست‌های جداسازی شده شناسایی شدند.

اندازه‌گیری فعالیت آنزیمی: از محیط کشت تولید آنزیم سلولاز با ترکیب ((Carboxymethylcellulose) CMC 1 درصد، Yeast extract 5/0 درصد، K₂HPO₄ 05/0درصد، NaCl 02/0درصد ،MgSO₄7H₂O 02/0درصد، NH₄NO₃ 1/0درصد و FeCl₃ 002/0درصد) برای تعیین فعالیت آنزیمی جدایه‌ها استفاده شد. باکتریها در دمای 40 درجه سانتی گراد به مدت 72 ساعت در این محیط کشت قرار داده شدند. در تراکم نوری یکسان (OD_600nm=1)، محیط کشتها پس از عبور از کاغذ صافی، در rpm 6000 به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شدند. عصاره حاصل پس از عبور از فیلتر میلی پور (22/0 میکرومتر) به عنوان منبع آنزیم استفاده گردید. مقدار پروتئین در عصاره آنزیمی ناخالص با روش برادفورد اندازه‌گیری شد (7). از عصاره‌های آنزیمی به دست آمده از رشد هر جدایه برای توانایی هیدرولیز سوبسترای، فیلتر کاغذی 6×1 سانتی‌متری (واتمن شماره 1) مورد استفاده قرار گرفت. مخلوط  سوبسترا با یک میلی‌لیتر عصاره آنزیمی و یک میلی‌لیتر بافر فسفات 9-5/6 pH : به مدت 30، 60 و 90 دقیقه در حمام آب گرم با دماهای 45 تا 65 درجه سانتی گراد نگهداری شد. مقدار قند احیاء کننده آزاد شده با استفاده از روش (Dinitrosalicylic acid) DNS (16) اندازه‌گیری شد. فعالیت‌های آنزیمی به صورت واحد در میلی‌لیتر عصاره ناخالص آنزیمی گزارش شد (11).

بحث و نتیجه‌گیری

نتایج حاصل از آزمونهای بیوشیمیایی باکتریهای آکتینومیست جدا شده در جدول 1 آورده شده است. این نتایج منطبق بر خصوصیات آکتینومیست‌ها بود. 

نتایج تجزیه و تحلیل مولکولی: براساس نتایج به دست آمده از هضم این‌سیلیکوی توالیهای ژن 16SrRNA با استفاده از آنزیمهای برشی، آنزیم MboI به عنوان آنزیم کلیدی در شناسایی آکتینومیست‌های جداسازی شده انتخاب شد (9). با استفاده از الگوی برشی به دست آمده از این آنزیم (شکل 1) جدایه‌ها را می‌توان به سه گروه متمایز دسته‌بندی کرد (جدول 2).

جدول1- مشخصات جدایه‌ها همراه با نتایج تستهای بیوشیمیایی آنها

جدول2- تقسیم‌بندی باکتریها به سه گروه اصلی براساس الگوی برشی آنزیم MboI.

شکل1- الگوی برشی جدایه‌ها  بر اساس ژن 16SrRNA، توسط آنزیم برشی MboI 

شکل2- نمودار تغییرات فعالیت سلولازی جدایه‌ها بر اساس تغییرات دما در روش FPU در دماهای 65-45 درجه سانتی گراد

گروه اول که بر‌اساس الگوی برشی آنزیم MboI طبقه‌بندی شده بودند، توسط الگوی برشی حاصله از آنزیمهای ,AsnI KpnI و SphI شناسایی شدند. تمام جدایه‌های این گروه به جنس Streptomyces  تعلق داشتند. بر این اساس جنس Streptomyces، جنس غالب در میان آکتینومیست‌های گرمادوست جدا شده بود. در گزارشات سایر محققین نیز این جنس به عنوان جنس غالب معرفی شده است (6و8). در گروه دوم بر اساس الگوی برشی آنزیم MboI تنها یک جدایه وجود داشت که با استفاده از الگوهای برشی آنزیمهای AsnI, PstI, HindIII و SphI شناسایی شد. این جدایه در جنس Thermomonospora قرار گرفت. برای شناسایی تک جدایه گروه سوم در الگوی برشی آنزیم MboI، از آنزیمهای AsnI, SphI, KpnI, HindIII, SalI و Psp14061 استفاده شد. بر اساس الگوی برشی این آنزیمها، جدایه گروه سوم در جنس Saccharomonospora قرار گرفت. علت استفاده از الگوی برشی آنزیمهای برشی جهت طبقه‌بندی جدایه‌ها این بود که آنزیمهای برشی در دسترس‌تر‌ند. به علاوه در هر آزمایشگاهی می‌توانند مورد استفاده قرار گیرند در حالی که توالی‌یابی محصول PCR نیاز به امکانات بیشتر و صرف هزینه و وقت بیشتر دارد. بعلاوه در این تحقیق هدف پیدا نمودن جدایه‌های فعال جهت بهبود کیفیت کمپوست بود که با استفاده از نتایج حاصله محقق شد.

اندازه‌گیری فعالیت سلولازی: سلولازهای پروکاریوتی حداکثر فعالیت را در دما‌های متفاوت نشان می‌دهند (12)، بنابراین برای تعیین دمای بهینه فعالیت سلولازی جدایه‌ها دماهای 65-45 درجه سانتی گراد مورد بررسی قرار گرفت. شکل2، نمودار تغییرات فعالیت سلولازی عصاره ناخالص جدایه‌ها را در دماهای مختلف نشان می‌دهد.

تغییرات دما سبب تغییر در فعالیت سلولازی عصاره آنزیمی جدایه‌ها شد. فعالیت سلولازی از 45 درجه سانتی گراد شروع به افزایش نموده است و در 55 درجه سانتی گراد به حداکثر خود رسیده اما روند فعالیت سلولازی بعد از این دما کاهشی شده است (05/0=α). بنابراین در بین دماهای بررسی شده دمای 55 درجه سانتی گراد با بیشترین میانگین فعالیت سلولازی در تمام جدایه‌ها، بهترین دمای تولید سلولاز برای این جدایه‌ها است.  که البته محققین قبلی نیز این دما را به عنوان دمای بهینه گزارش نموده بودند (15و19).

نکته قابل توجه در بین جدایه‌ها مورد بررسی این بود که در هر دما جدایه‌های متفاوتی حداکثر فعالیت را از خود نشان می‌دادند. بنابراین جدایه‌های فعال در هر دما نیز مهم هستند.

جدایه‌های فعال سلولازی در دمای کمپوست: جدایه‌ها مورد بررسی از کمپوست جدا شدند و هدف نهایی آنها نیز برای بهینه‌سازی کمپوست است، بنابراین از مهم‌ترین دما‌های مورد نظر دمای 45 درجه سانتی گراد که دمای کمپوست محسوب می‌شود، است. به منظور بررسی فعالیت آنزیمی تمام جدایه‌ها در دمای 45 درجه سانتی گراد تحت شرایط یکسان در تماس با کاغذ واتمن به عنوان سوبسترا قرار گرفتند تا تفاوت فعالیت آنزیمی آنها در این دما تعیین شود و تغییرات فعالیت آنزیمی‌شان تعیین شود.

در روش سنجش آنزیمی به روش FPU در دمای 45 درجه سانتی گراد ، جدایه 23 با 10/1 واحد در میلی‌لیتر آنزیم بیشترین فعالیت آنزیمی را داشت. بعد از این جدایه جدایه‌های 12 ،18 و 24 به ترتیب با 01/1، 00/1 و 97/0 واحد در میلی‌لیتر فعالیت آنزیمی، بیشترین مقادیر را نشان دادند و بیشترین اختلاف را با سایر جدایه‌ها داشتند (05/0=α).

جدایه‌های فعال سلولازی در دمای 55 درجه سانتی گراد: دمای 55 درجه سانتی گراد بیشترین میانگین فعالیت آنزیمی را در بین جدایه‌ها نشان داد و به عنوان بهترین دما جهت فعالیت سلولازی بالا در همه جدایه‌ها معرفی شد. در این دما جدایه 3 با 18/1 واحد در میلی‌لیتر آنزیم بیشترین فعالیت آنزیمی را داشت و بعد از این جدایه، جدایه‌های 8 ،11 و 15 بترتیب با 88/0، 87/0 و 82/0 واحد در میلی‌لیتر فعالیت آنزیمی، بیشترین مقادیر را نشان دادند و بیشترین اختلاف را با سایر جدایه‌ها داشتند (05/0=α).

از جدایه‌های فعال در هر دما استفاده‌های خاصی می‌شود. جدایه‌های فعال در دمای 45 درجه سانتی گراد و 55 درجه سانتی گراد برای بهینه‌سازی شرایط کمپوست مفید‌ند. چرا که محدوده دمایی کمپوست 55-45 درجه سانتی گراد است. بنابراین جدایه‌ها فعال این دما‌ها برای بهینه سازی کیفیت کمپوست مهم و ضروری به شمار می‌روند.

فاکتور مهم دیگر در فعالیت آنزیمی pH است. چرا که اگر در یک واکنش آنزیمی تمام عوامل فراهم باشند. اما pH نامناسب باشد، هیچ واکنشی صورت نمی‌گیرد. بنابراین به منظور تعیین pH بهینه برای جدایه‌های مورد بررسی محدوده 9-7/5=pH در نظر گرفته شد. جدول 3 تغییرات فعالیت سلولازی را در این pH‌‌ها نشان می‌دهد.

جدول 3 - تغییرات فعالیت سلولازی بر اساس تغییرات pH  در روش FPU

با افزایش pH تا 5/6 میزان فعالیت آنزیمی در تمام جدایه ها افزایش معنی‌داری نشان داده است، اما بعد از 5/6 فعالیت آنزیمی کاهش یافته تا جایی که در9 = pH به صفر رسیده است، که علت آن ‌را می‌توان در قلیایی شدن محیط جستجو نمود (05/0=α). در نتیجه pH در نقطه5/6 با بیشترین فعالیت آنزیمی در تمام جدایه‌ها به عنوان بهترین pH در محدوده بررسی شده، معرفی شده است.

pH معرفی شده مشابه کار سایر محققین بود که روی آکتینومیست‌ها کار می‌کردند به طور مثال جردیت و همکارانش در 2008 در محدوده pH مورد بررسی‌شان، 7-6=pH را برای Streptomyces Sp. (J2) مناسب دانستند (14). همچنین جانگ و چن که برای. Streptomyces T3-1، pH بهینه را 6 معرفی نمودند (13).

نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد که بررسی جمعیت میکروبی کمپوست گام مؤثری در جهت بهبود کیفیت آن می‌باشد. با توجه به تعیین تعدادی جدایه فعال و شرایط مساعد فعالیتشان، می‌توان شرایطی فراهم نمود که سلولز کمپوست به خوبی تجزیه شده و در استفاده قارچ خوراکی قرار گیرد.

کاربردهای دیگر سلولاز در صنایع نساجی برای سنگ‌شویی نمودن پارچه های جین می‌باشد. به علاوه افزودن سلولاز به پودرهای شوینده سبب جدا شدن ریزرشته های الیاف پنبه می‌شود که به طور قابل توجهی نرمی و شفافیت منسوجات پنبه‌ای را افزایش می‌دهد. در آزمایشگاههای تحقیقاتی از سلولاز جهت هضم دیواره سلولی گیاهان در تولید پروتوپلاست و مطالعات الحاق پروتوپلاست‌ها استفاده می‌شود. همچنین این آنزیم در صنایع تولیدی خوراک دام و طیور استفاده می‌گردد. سلولاز‌ها به همراه پکتیناز‌ها در شفاف‌سازی آب و عصاره میوه‌جات، هیدرولیز موسیلاژ حین استخراج قهوه، در صنایع تبدیلی و تسریع استخراج رنگهای طبیعی از پوست میوه جات و مواد گیاهی، تولید سرکه و تیمار مواد زاید مورد استفاده قرار می‌گیرد (1و2).