نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

دانشگاه بین المللی امام خمینی

چکیده

پروانش یا پیچ تلگرافی (Catharanthus roseus (Linn.) G. Don) به علت وجود آلکالوئیدهای ارزشمند وین¬بلاستین و وین¬کریستین به عنوان یک گیاه دارویی بسیار مهم معرفی شده ‌است. لذا توسعه ریزازدیادی پروانش در محیط درون ‌شیشه اهمیت فراوانی دارد. در این تحقیق از دو آزمایش جداگانه برای بهینه سازی ساقه¬زاییمستقیم و یک آزمایش ریشه زایی استفاده شد. طرح آماری مورد استفاده در آزمایش¬های ساقه¬زایی مستقیم، فاکتوریل 5×3 (BAP × NAA و KN × NAA) در قالب طرح پایه کاملا تصادفی با چهار تکرار بود. آزمایش ریشه زایی به صورت فاکتوریل 5×3 (IBA ×NAA) در قالب طرح پایه کاملا تصادفی با چهار تکرار اجرا گردید. نتایج آزمایش نشان داد که با افزایش غلظت هورمون KN درصد اندام¬زایی و با افزایش غلظت هورمونNAA تعداد ساقه به ازا هر ریزنمونه افزایش یافت. ترکیب هورمونی یک میلی گرم در لیتر NAA به همراه 1/0 میلی گرم در لیتر KN با میانگین 13 گیاهچه بالاترین تعداد تولید گیاهچه را دارا بودند. مقایسه میانگین¬ها نشان داد که بهترین مقدار BAP با 87 درصد اندام¬زایی غلظت 1/0 میلی گرم در لیتر و بهترین ترکیب هورمونی 1/0 میلی گرم در لیتر BAPبه همراه 2 میلی گرم در لیتر NAA با 100% اندام¬زایی بود. در آزمایش ریشه¬زایی ترکیب 4/0 میلی‌ گرم در لیتر IBA به همراه 4 میلی‌ گرم در لیترNAA بیشترین تعداد ریشه و طول ریشه را تولید کردند و در مجموع افزایش غلظت هورمون NAA باعث افزایش طول ریشه¬ها گردید.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

In vitro Micropropagation of Catharanthus roseus (Linn.) G. Don via shoot multiplication

چکیده [English]

Periwinkle (Catharanthus roseus (Linn.) G. Don) is known as an important medicinal plant because it contains vincristine and vinblastine alkaloids. Therefore development of micro-propagation in vitro culture has high importance. The present study describes two shoot induction and one root induction optimization experiments. The experimental designs were 3×5 factorial (BAP × NAA و KN × NAA) for shoot induction trails and 3×5 factorial (IBA × NAA) for root induction trail based on completely randomized design with four replications. The best proliferation of shoot induction percent and shoot per explants was shown on the medium supplemented with high KN and NAA, respectively. In overall, KN (0.1 mg/l) + NAA (1 mg/l) combination proved to be optimal for the production of maximum number of shoots. Mean comparison showed that the highest multiplication rate was obtained with 0.1 mg/l of 6-benzylaminopurine (87%) and with 0.1 mg/l 6-benzylaminopurine + 2 mg/l naphthalene acetic acid (100%). The best condition for rooting (root number and length) was 0.4 mg/l IBA + 4 mg/l naphthalene acetic acid and the maximum root length was observed on medium supplemented with higher NAA concentration.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Catharanthus roseus
  • shoot induction. rooting
  • micropropagation

ریزازدیادی درون شیشه­ای گیاه دارویی پروانش (Catharanthus roseus (Linn.) G. Don) از طریق اندام­زایی ساقه 

جعفر احمدی*، راضیه محمدی و قاسمعلی گروسی 

قزوین، دانشگاه بین المللی امام خمینی قزوین، گروه ژنتیک و اصلاح نباتات

تاریخ دریافت: 16/12/90             تاریخ پذیرش: 15/5/92 

چکیده 

پروانش یا پیچ تلگرافی (Catharanthus roseus (Linn.) G. Don) به علت وجود آلکالوئیدهای ارزشمند وین­بلاستین و وین­کریستین به عنوان یک گیاه دارویی بسیار مهم معرفی شده ‌است. لذا توسعه ریزازدیادی پروانش در محیط درون ‌شیشه اهمیت فراوانی دارد. در این تحقیق از دو آزمایش جداگانه برای بهینه سازی ساقه­زاییمستقیم و یک آزمایش ریشه زایی استفاده شد. طرح آماری مورد استفاده در آزمایشهای ساقه­زایی مستقیم، فاکتوریل 5×3 (BAP × NAA و KN × NAA) در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی با چهار تکرار بود. آزمایش ریشه زایی به صورت فاکتوریل 5×3 (IBA ×NAA) در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی با چهار تکرار اجرا گردید. نتایج آزمایش نشان داد که با افزایش غلظت هورمون KN درصد اندام­زایی و با افزایش غلظت هورمونNAA  تعداد ساقه به ازا هر ریزنمونه افزایش یافت. ترکیب هورمونی یک میلی گرم در لیتر NAA به همراه 1/0 میلی گرم در لیتر KN با میانگین 13 گیاهچه بالاترین تعداد تولید گیاهچه را دارا بودند. مقایسه میانگینها نشان داد که بهترین مقدار BAP  با 87 درصد اندام­زایی غلظت 1/0 میلی گرم در لیتر و بهترین ترکیب  هورمونی 1/0 میلی گرم در لیتر  BAPبه همراه 2 میلی گرم در لیتر  NAA با 100 درصد اندام­زایی بود. در آزمایش ریشه­زایی ترکیب 4/0 میلی‌ گرم در لیتر IBA به همراه 4 میلی‌ گرم در لیترNAA  بیشترین تعداد ریشه و طول ریشه را تولید کردند و در مجموع افزایش غلظت هورمون NAA باعث افزایش طول ریشه­ها گردید.

واژه های کلیدی: پروانش، ساقه­زایی، ریشه­زایی، ریزازدیادی.

* نویسنده مسئول، تلفن: 09123128278 ، پست الکترونیکی:njahmadi910@yahoo.com 

مقدمه

 

کاتارانتوس روزئوس (Catharanthus roseus (Linn.) G. Don) گیاهی خزنده متعلق به تیره خرزهره (Apocynaceae) و جنس وینکا (Vinca) می­باشد که در ایران به آن پروانش یا پیچ تلگرافی گفته می­‌شود. پروانش به علت وجود آلکالوئیدهای ارزشمند در اندامهای رویشی و ریشه به عنوان یک گیاه دارویی بسیار مهم معرفی شده ‌است. این گیاه به علت دارا بودن آلکالوئیدهای مهم وین­بلاستین و وین­کریستین که هر دو اثر ضد توموری و ضدسرطانی دارند، در صنایع داروسازی اهمیت بسیاری دارد. مقدار این آلکالوئیدها در این گیاه بسیار کم است، به طوری که یک تن برگ خشک پروانش فقط حاوی 3 گرم وین­کریستین می­‌باشد و ارزش هر گرم آلکالوئید وین­کریستین در حدود 4000 دلار است. کشت وسیع آن برای مصارف دارویی در نواحی مختلفی از جهان مثل آفریقا، هند، تایلند، استرالیا، آمریکا، آلمان، مجارستان، ایتالیا، انگلستان، روسیه و فلسطین ‌اشغالی در سطوح وسیع انجام می ‌شود (3 و 19). از آنجا که تقاضای بسیار برای وین­بلاستین و وین­کریستین وجود دارد و میزان آنها در مواد خام اولیه استخراج شده از پروانش کم است، اهمیت مطالعه بر روی این گیاه چند برابر می‌شود. کشت اندامهای گیاهی برای تولید گیاهان درون‌ شیشه که در نهایت به خاک منتقل می‌شوند، تولید متابولیتهای ثانویه بیشتری نسبت به گیاهان کنترل که از ابتدا در خاک کشت شده­­اند، می­کند. لذا توسعه ریزازدیادی پروانش در محیط درون ‌شیشه اهمیت فراوانی دارد و شاید راه حل مناسبی برای جمع ‌آوری مواد خام جهت بازیافت این ‌آلکالوئید‌ها باشد. آزمایش نشان داده است که در بسیاری موارد توانایی تولید متابولیتهای ثانویه وابسته به مراحل اندام ‌زایی است (20). میورا و همکارانش از کالوسهای حاصل از پروانش مواد مؤثره آن را استخراج کردند، ولی به این دلیل ‌که کالوس منبع پایدار و با ثباتی برای تولید آلکالوئیدها نیست آنها به کشت قطعه­ای از اندام که تولید مستقیم اندامهای انبوه و فراوان کند، پرداختند. زیرا اندام زایی از طریق کالوس هم میزان عملکرد را پایین می ‌آورد و هم بسیار زمان بر است (18). در آزمایش آنها بذر‌ها ضد عفونی و در محیط MS جامد کشت شده و گیاهچه­های 7 تا 10 روزه به محیط حاوی یک میلی گرم در لیتر  N6-Benzylaminopurine (BAP)  جهت تولید ساقه  منتقل شدند. نتایج نشان داد که استفاده از هورمونBAP  با یک اکسین مثل indole-3-acetic acid (IAA) یا naphthaleneacetic acid (NAA) میزان رشد را 2 تا 3 برابر سریع ‌تر می کند (18). یوآن و همکارانش اثر ترکیبات مختلف اکسین و سیتوکینین را در تولید ساقه در کشت درون‌ شیشه‌ای پروانش بررسی کردند. آزمایش آنها نشان داد که 7 میلی گرم در لیترBAP  به همراه یک میلی‌ گرم در لیتر  NAAبه شدت ساقه زایی را تحریک می‌کند (24). هانداپانی و همکارانش برای تولید ساقه از پتیول، نوک ساقه و گره ساقه پروانش در محیط حاویBAP, 2,4-D, NAA  و TDZ استفاده کردند. 5/0 میلی گرم در لیتر Thidiazuron  ( (TDZبا یک میلی گرم در لیتر  NAAبه همراه 5/0 میلی گرم در لیترBAP  بهترین اندام­زایی را نشان دادند. این ساقه‌ ها در محیط MS و 1/2 MS و غلظتهای مختلف Indole-3-butyric acid  (IBA) ریشه­زایی کرده و به گیاه کامل تبدیل شدند. غلظت 1/2 MS و 5/0 میلی گرم در لیتر  IBA برای ریشه­زایی مناسب ترین محیط را تشکیل دادند (8).

طاها و همکارانش از کشت قطعات نوک ساقه، برگ، ساقه و ریشه پروانش در محیط جامدMS  به همراه2,4-D , NAA , KN , BAP  در طی30 روز کالوس به ‌دست آوردند. نوک ساقه در محیط حاوی یک میلی‌ گرم در لیتر2,4-D  به همراه یک میلی‌ گرم در لیتر KN  بهترین کالوس­زایی را داشت. همچنین با نسبتهای مختلف اکسین و سیتوکینین ساقه­زایی از اندامها القاء شد. ساقه­زایی در محیط حاوی یک میلی‌ گرم در لیتر  BAPبه علاوه یک میلی ‌گرم در لیتر  NAA در نوک ساقه بهترین نتیجه را نشان داد (22). عطایی عظیمی و همکارانش پس از اندازه‌ گیری میزان کالوس زایی و ریشه ‌زایی قطعات برگ در محیط MS جامد حاوی غلظتهای مختلفNAA  و  KN پروانش، بهترین محیط را ترکیب هورمونی 1/0 میلی‌ گرم در لیتر  KNبه همراه 5 میلی‌ گرم در لیتر BAP انتخاب کردند (6). لیو و همکارانش توانستند از بذرهای رسیده چمن ژاپنی در محیط MS حاوی نسبتهای مختلفBAP  به همراه 3  میلی‌ گرم در لیتر2,4-D  کالوس به دست آورند. سپس کالوسها در محیط حاوی 2,4-D و KN با موفقیت ساقه ‌زایی کردند (16).

مواد و روشها

جوانه­زنی بذرها در محیط درون شیشه و تهیه مواد گیاهی: برای تهیه اندامهای درون شیشه­ای پروانش از بذور Catharanthus roseus (L.) G. Don استفاده شد. جهت ضدعفونی، بذرها به مدت 3 دقیقه در اتانل70 درصد به آرامی تکان داده‌ شدند، سپس 15 دقیقه در هیپوکلریت سدیم 5/1 درصد قرار ‌گرفته و در ادامه بذرها در مرحله آبکشی با آب مقطر استریل 5 مرتبه شستشو داده ‌شدند (15). بذرهای ضدعفونی شده در شیشه­های حاوی 20 میلی لیتر محیط کشتMS  بدون ترکیبات هورمونی کشت شدند. بذرها تا حدود سه هفته در اتاق کشت نگهداری و گیاهان رشد کرده برای آزمایش اندام زایی استفاده شدند. نمونه برداری در مرحله 6-8 برگی گیاهچه ها انجام شد. در یک ظرف پتری استریل با اسکالپل ریشه و برگهای گیاه جدا و ساقه حاوی گره‌های جانبی به قطعات حداقل 5/0 سانتیمتری طوری برش خوردند که در هر قطعه حاصل به عنوان ریزنمونه حداقل یک گره وجود داشته باشد (15).

تهیه محیط کشت: برای تهیه محیط کشت اندام­زایی، ساکارز با غلظت 30 گرم در لیتر به عنوان منبع کربن در آب مقطر حل شد. سپس نمک MS به میزان 2/1 و تیامین به میزان 2 میلی گرم در لیتر به محلول ساکارز افزوده شدند و pH محیط کشت روی 8/5 تنظیم شد. در آخرین مرحله آگار به میزان هفت گرم در لیتر به عنوان جامد کننده اضافه شد و به مدت 20 دقیقه در دمای 121 درجه سانتی گراد در اتوکلاو قرار داده شد. در طول مراحل تهیه محیط کشت، هورمونها که قابل اتوکلاو نیستند، پس از پایین آمدن دمای محیط کشت به آن افزوده شدند. برای تهیه محیط کشت ریشه‌زایی از بیوتین، ریبوفلاوین، فولیک اسید و تیامین به همراه  نمک MS به میزان 2/1 استفاده شد (8).

آزمایشهای ساقه زایی و ریشه زایی: از دو آزمایش جداگانه برای بهینه سازی ساقه زایی مستقیم استفاده شد. طرح آماری مورد استفاده در آزمایش اول، فاکتوریل 5×3 با دو عامل هورمون BAP در سه سطح (صفر، 1/0 و 2/0 میلی گرم در لیتر) و NAA در پنج سطح (25/0، 5/0، 75/0، 1 و 2 میلی گرم در لیتر) در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی با چهار تکرار و شش ریزنمونه در هر پتری دیش بود. طرح آماری آزمایش دوم ساقه­زایی فاکتوریل 5×3 با دو عامل هورمون KN در سه سطح (صفر، 1/0 و 2/0 میلی گرم در لیتر) و NAA در پنج سطح (25/0، 5/0، 75/0، 1 و 2 میلی گرم در لیتر) در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی با چهار تکرار و شش ریزنمونه در هر پتری دیش بود. آزمایش ریشه­زایی به صورت فاکتوریل 5×3 با دو هورمون IBA  در سه سطح (4/0، 5/0 و 6/0 میلی گرم در لیتر) و هورمون NAA در پنج سطح (صفر ، 1 ، 2، 3 و 4 میلی گرم در لیتر) در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی با چهار تکرار و پنج ریزنمونه در هر پتری دیش اجرا گردید.

شرایط محیطی کشتها: پس از کشت ریزنمونه­ها در شیشه های استریل درب آنها به دقت بسته شده و با پارافیلم پوشانده شد. شیشه‌ ها در اتاق کشت تحت شرایط دمایی 25 درجه سانتی گراد و فتوپریود 16/8 قرار گرفتند. واکشت هر 14 روز یک بار انجام شد و زمانی که ساقه­های آزمایشهای ساقه­زایی به حدود 5-6 سانتیمتر رسیدند، برای القا ریشه­زایی مورد استفاده قرار گرفتند. برای این منظور از بین تیمارهای مختلف هورمونی گیاهچه هایی که رشد مناسبی کردند، انتخاب شدند و آنهایی که دارای اندام هوایی متراکم بودند به چند قسمت تقسیم و به محیط ریشه‌زایی منتقل شدند. در آزمایش ریشه زایی ابتدا کشتها به مدت 10 روز در محیط تاریکی در اتاق کشت با دمای 25 درجه سانتی­گراد قرار گرفتند. دمای اتاق کشت 25 درجه سانتی­گراد و فتوپریود 16/8 بود. در انتقال ریزنمونه‌ها از هر یک از مرحله به مرحله بعدی دقت شد که محیط کشت به همراه بافت به مرحله بعد منتقل نشود.

یادداشت­برداری و تجزیه آماری : در آزمایشهای ساقه­زایی دو شاخص درصد ساقه­زایی و تعداد گیاهچه ثبت گردید. در آزمایش ریشه­زایی، دو هفته پس از انتقال نمونه‌ها به محیط فاقد هورمون یادداشت برداری انجام شد و تعداد و طول ریشه‌های رشد یافته به صورت میانگین تعداد و طول ریشه­ها برای هر شیشه ثبت شد. به منظور نرمال کردن داده­ها تبدیل داده جهت انجام تجزیه واریانس صورت گرفت. از نرم افزارهای آماری MSTATC برای تجزیه واریانس و مقایسه میانگینها و Excel برای رسم نمودارها استفاده گردید.

نتایج و بحث

اندام­زایی:

الف- تجزیه واریانس و مقایسه میانگین درصد اندام زایی و تعداد گیاهچه آزمایش اول ریزازدیادی: با شمارش تعداد ریزنمونه های باززا شده در هر تکرار، درصد اندام­زایی اندازه­گیری شد(شکل 1). تجزیه واریانس صفت اندام زایی (جدول 1) در مورد هورمون KN نشان داد که مقادیر مختلف این هورمون در سطح احتمال (01/0 ≥P) اختلاف معنی­دار دارند. با مقایسه میانگینها (نمودار 1)، از سه غلظت KN (صفر، 1/0 و 2/0 میلی گرم در لیتر) مورد استفاده، غلظت 2/0 میلی گرم در لیتر بالاترین بازرایی را نشان داده و مشخص شد که با افزایش غلظت هورمون KN درصد اندام­زایی افزایش یافته است. هورمون KN به دلیل افزایش اندام­زایی ساقه از ریزنمونه های مختلف مورد توجه بوده و در گیاهان زیادی از جمله باقلا و نخود فرنگی برای اندام­زایی مستقیم از نوک شاخه و گره استفاده شده است (5). آهرونی و همکارانش نیز با افزایش غلظت هورمون KN، روی ریزنمونه ساقه گل گچ نتایجی مشابه تحقیق حاضر به دست آوردند (4). سیوانسان و جونگ مشاهده کردند که با افزایش غلظت هورمون KN از 2 به 5/2 میلی گرم در لیتر درصد اندام زایی در گیاه زنجبیل کاهش یافت. اما در غلظتهای پایین تر از 2 میلی گرم در لیتر هورمون KN نتایج مشابه تحقیق حاضر بود (21). در مورد هورمون NAA اختلاف معنی‌داری بین مقادیر مختلف آن دیده نشد، اما از بین غلظتهای مختلف هورمونNAA  (25/0، 5/0، 75/0، 1 و 2 میلی‌ گرم در لیتر) بیشترین درصد اندام زایی مربوط به غلظت یک میلی گرم در لیتر با 6/96 درصد بود. در توافق با این نتایج ایلاح و همکاران (12) و قانسان و جایابالان (10)  نیز بیشترین درصد اندام­زایی را در غلظت یک میلی‌ گرم هورمون NAA گزارش دادند. اثر متقابل دو هورمون NAA × KN در سطح احتمال (01/0 ≥P) معنی‌دار شد و بیانگر رفتار متفاوت سطوح یک هورمون در سطوح مختلف هورمون دیگر بود. تجزیه واریانس صفت تعداد گیاهچه (جدول 1) برای آزمایش اول نشان داد که مقادیر مختلف هورمون KN اختلاف معنی­داری با هم ندارند. از این رو غلظتهای مختلف هورمونKN  (صفر، 1/0 و 2/0 میلی‌گرم در لیتر) بر تعداد گیاهچه تأثیر یکسانی گذاشتند. قانسان و جایابالان (10)  در مورد پنبه به نتایجی متناقض با آنچه در این تحقیق به دست آمده رسیدند. تجزیه واریانس تعداد گیاهچه بین غلظت ‌های مختلف هورمونNAA  در سطح احتمال (01/0 ≥P) اختلاف معنی‌داری نشان داد. بهترین غلظت هورمون NAA  یک میلی‌ گرم در لیتر با میانگین 25/12 ساقه  به ازای هر ریزنمونه و کمترین بازده تعداد گیاهچه مربوط به غلظت 5/0 میلی ‌گرم در لیتر هورمونNAA  با میانگین 917/9 گیاهچه بود. در این تحقیق افزایش غلظت هورمونNAA  باعث افزایش تعداد ساقه  به ازا هر ریزنمونه گردید. قانسان و جایابالان (10) در مورد پنبه و کیم و همکاران (15) در مورد سرخارگل با غلظت یک میلی‌ گرم در لیتر هورمونNAA  به نتایج مشابهی دست یافتند. در حالی که سیوانسان و جونگ (21) در مورد زنجبیل با افزایش غلظت هورمونNAA  ساقه  کمتری به ازای هر ریزنمونه به دست آوردند. اثر متقابل دو هورمون NAA × KN در سطح (01/0 ≥P) معنی­دار شد و مقایسه میانگینها (جدول 2) نشان داد که ترکیب هورمونی یک میلی گرم در لیتر NAA به همراه 1/0 میلی گرم در لیتر KN با میانگین 13 گیاهچه بالاترین و تیمار 25/0 میلی گرم در لیتر NAA بدون هورمون KN و تیمار 2 میلی گرم در لیتر NAA به همراه 2/0 میلی گرم در لیتر KN هر دو با میانگین 8 پایین ترین تعداد تولید گیاهچه را دارا بودند.

ب- تجزیه واریانس و مقایسه میانگین درصد اندام زایی و تعداد گیاهچه آزمایش دوم ریزازدیادی : تجزیه واریانس (جدول 3) صفت درصد اندام­زایی برای هورمونهای BAP ،  NAAو اثر متقابل آنها در سطح احتمال (01/0 ≥P) معنی­دار شد. مقایسه میانگینها نشان داد که بهترین مقدار BAP  با 87 درصد اندام­زایی غلظت 1/0 میلی گرم در لیتر، بهترین مقادیر NAA یک و 75/0 میلی گرم در لیتر و بهترین ترکیب  هورمونی 1/0 میلی گرم در لیتر  BAPبه همراه 2 میلی گرم در لیتر  NAA با 100 درصد اندام­زایی بود. بن موسی و همکاران  نیز همین نتایج را در آزمایشی روی گیاه شویدی مشاهده کردند (7). ژانگ و همکارانش BAP را مؤثرترین هورمون سیتوکینینی برای اندام­زایی از گره معرفی کردند (25).

 

جدول 1- تجزیه واریانس درصد اندام­زایی و تعداد گیاهچه در آزمایش اول ساقه‌­زایی

منبع تغییرات

 (S.O.V)

درجه آزادی

 (df)

میانگین مربعات (MS)

درصد اندام زایی

تعداد گیاهچه

KN

2

**667/726

ns 550/4

NAA

4

ns 190

*642/10

KN × NAA

8

*310

*717/12

خطا

45

778/117

672/4

کل

59

 

 

ns، * و **: به ترتیب غیر معنی­دار، معنی­دار در سطح احتمال 5 و 1 درصد

جدول 2- مقایسه میانگین اثرات متقابل NAA × KN بر درصد اندام­زایی و تعداد گیاهچه

درصد اندام زایی

تعداد گیاهچه

NAA (میلی گرم در لیتر)

 KN(میلی گرم در لیتر)

c* 70

b* 8

25/0

0

abc  85

ab  5/11

5/0

0

a  100

a  25/12

75/0

0

ab  90

ab  25/11

1

0

bc  75

ab  75/9

2

0

ab  90

a  25/12

25/0

1/0

abc  85

b  8

5/0

1/0

abc  85

ab  25/11

75/0

1/0

a  100

a  13

1

1/0

a  95

a  5/12

2

1/0

a  100

 ab  25/11

25/0

2/0

a  95

ab  25/10

5/0

2/0

ab  90

ab  5/10

75/0

2/0

a  100

a  5/12

1

2/0

a  95

b  5/8

2

2/0

*: میانگینهای دارای حداقل یک حرف مشترک از نظر آماری با یکدیگر اختلاف معنی دار ندارند.

 

جنید و همکاران (13)، هانداپانی و همکاران (8) و ایلاح و همکاران (12) بهترین غلظت هورمون BAP برای صفت درصد اندام­زایی را 5/0 میلی گرم در لیتر بیان کردند. همچنین میرزائی اصل و همکاران (1) افزایش ظرفیت باززایی نوساقه نابجا در ریزنمونه­های برگی چغندرقند را در BAP  با غلظت یک میلی گرم در لیتر گزارش کردند. در تجزیه واریانس صفت تعداد گیاهچه در آزمایش دوم  اندام­زایی برای مقادیر مختلف هورمون BAP اختلاف معنی­داری در سطح احتمال (01/0 ≥P) نشان داد و مقایسه میانگینها بهترین سطح هورمون BAP را 1/0 میلی گرم در لیتر مشخص کرد.

 

 

نمودار 1- مقایسه میانگین درصد اندام­زایی (a, b) و تعداد گیاهچه  (c, d) در غلظتهای مختلف هورمونی

 

سطوح مختلف هورمون NAA نیز با هم در سطح احتمال (01/0 ≥P) اختلاف معنی­داری داشتند و مقایسه میانگینها یک میلی گرم در لیتر NAA را دارای بالاترین بازده و 25/0 میلی گرم در لیتر NAA را دارای پایین ترین بازده نشان دادند. اثر متقابل هورمونهای BAP ×  NAAدر سطح (01/0 ≥P) اختلاف معنی­داری نشان دادند. مقایسه میانگینها (جدول 4) ثابت کرد که 5/0 میلی گرم در لیتر NAA به علاوه 1/0 میلی گرم در لیتر BAP بالاترین تعداد گیاهچه با میانگین 75/11 را تولید کردند. کمترین تعداد گیاهچه متعلق به تیمار هورمونی 25/0 میلی گرم در لیتر NAA به همراه صفر میلی گرم در لیتر BAP و ترکیب هورمونی 2 میلی گرم در لیتر NAA به همراه 2/0 میلی گرم در لیتر BAP هر دو با میانگین 3 گیاهچه بود.

 

       
       

 

 

 

 


شکل 1- مراحل اندام­زایی گیاهچه­ها از گره در محیط درون شیشه­ای  (a در زمان کشتb ) پس از دو هفته c) پس از شش هفته

جدول 3- تجزیه واریانس درصد اندام­زایی و تعداد گیاهچه در آزمایش دوم ساقه­‌زایی

منبع تغییرات

 (S.O.V)

درجه آزادی

 (df)

میانگین مربعات (MS)

درصد اندام زایی

تعداد گیاهچه

BAP

2

**7/986

**02/28

NAA

4

**7/1956

**2/21

BAP×NAA

8

**6/2336

**2/30

خطا

45

667/86

51/1

کل

59

 

 

**: معنی دار در سطح احتمال 1 درصد

جدول 4- مقایسه میانگین اثرات متقابل  BAP × NAA بر تعداد گیاهچه

 

تعداد گیاهچه

NAA (میلی گرم در لیتر)

BAP (میلی گرم در لیتر)

 

a* 8

25/0

0

 

ab  5/11

5/0

0

 

a  25/12

75/0

0

 

ab  25/11

1

0

 

ab  75/9

2

0

 

a  25/12

25/0

1/0

 

b  8

5/0

1/0

 

b  25/11

75/0

1/0

 

a  13

1

1/0

 

a  5/12

2

1/0

 

ab  25/11

25/0

2/0

 

ab  25/10

5/0

2/0

 

ab  25/10

75/0

2/0

 

a  5/12

1

2/0

 

b  5/8

2

2/0

*: میانگین های دارای حداقل یک حرف مشترک از نظر آماری با یکدیگر اختلاف معنی دار ندارند.


ریشه­زایی

الف- تجزیه واریانس و مقایسه میانگین صفت تعداد و طول ریشه در آزمایش ریشه­زایی(شکل 2): تجزیه واریانس صفت تعداد ریشه در جدول (5) نشان داده شده‌ است. منبع تغییر هورمون IBA (4/0، 5/0 و 6/0 میلی‌گرم در لیتر) از نظر صفت تعداد ریشه‌ در سطح احتمال (01/0 ≥P) اختلاف معنی‌دار نشان داد و از این لحاظ بین غلظت های مختلف این هورمون تفاوت معنی‌داری وجود داشت. با مقایسه میانگینها (نمودار 2) بیشترین تعداد ریشه در غلظت 4/0 میلی‌ گرم در لیتر به ‌دست آمد. افزایش میزان این هورمون ابتدا باعث کاهش تعداد ریشه ها و در غلظت 6/0 میلی‌ گرم در لیتر باعث افزایش مجدد تعداد ریشه­ها شد. نتایج تحقیق جنید و همکاران (13)  نیز نشان داد که با افزایش غلظت هورمون IBA تعداد ریشه­ها کاهش پیدا می کند. هانداپانی و همکاران (8) نیز از غلظت 44/0 میلی‌ گرم در لیتر هورمون IBA بهترین نتیجه ریشه‌زایی را به ‌دست آوردند. ایلاح و همکاران (12) از غلظت 5/0 میلی‌ گرم در لیتر هورمون IBA بالاترین درصد ریشه‌زایی را گزارش کردند.

 

 

جدول 5- تجزیه واریانس صفت تعداد و طول ریشه در آزمایش ریشه­زایی

منبع تغییرات (S.O.V)

درجه آزادی (df)

میانگین مربعات (MS)

تعداد ریشه

طول ریشه

IBA

2

**787/2

**032/0

NAA

4

**625/12

**186/0

BAP×NAA

8

**788/6

**110/0

خطا

45

343/0

006/0

کل

59

 

 

**: معنی دار در سطح احتمال 1 درصد

 

 

 کاشف حسین و انیس (14) برای ریشه‌زایی ساقه ‌های کنگر فرنگی بهترین مقدار هورمون IBA را 1/0 میلی‌ گرم در لیتر با بالاترین درصد ریشه‌زایی شناسایی کردند. آنها اعلام کردند غلظتهای پایین‌ تر اکسینها نتایج بهتری در ریشه‌زایی دارد. سیوانسان و جونگ (21) برای ریشه­زایی زنجبیل انواع اکسینها را بررسی کرده و IBA با غلظت 2 میلی گرم در لیتر را مناسب ترین غلظت معرفی کردند. همچنین یاری و همکاران (2) ترکیب تیماری IBA  و IAA را در القای ریشه رقمهای مختلف گل سرخ مؤثر گزارش کردند. بین پنج غلظت هورمون  NAA(صفر، 1، 2، 3 و4 میلی‌گرم در لیتر) تفاوت معنی‌داری در سطح احتمال (01/0 ≥P)  دیده شد که دلالت بر وابستگی تعداد ریشه‌ها به این هورمون دارد. بهترین غلظت برای تولید تعداد ریشه 3 میلی‌ گرم در لیتر بود (نمودار 2) که با غلظت‌ 2 میلی‌ گرم در لیتر NAA در یک گروه قرار گرفتند. همان گونه که از نمودار مقایسه میانگینها پیداست با افزایش غلظت هورمون NAA تعداد ریشه­های تولید شده سیر صعودی داشته و در غلظت 4 میلی‌ گرم در لیتر روند نزولی نشان داد. در مقایسه با نتایج این تحقیق ونکاتاچالان و جایابالان (23) حداکثر ریشه­زایی در گیاه بادام زمینی را در غلظت 2 میلی گرم در لیتر هورمون NAA گزارش کردند. آنیتا و پولایا در سال 2002 برای استرکولیا حداکثر ریشه­زایی را در غلظت 2 میلی ‌گرم در لیتر هورمون NAA به دست آوردند (5). چویریگارای و همکاران (9) برای تعداد ریشه به ازای هر گیاهچه یک میلی گرم در لیتر هورمون NAA را در اسطوخودوس مناسب تشخیص دادند. ایلاح و همکاران (12) نیز غلظت 2 میلی‌ گرم در لیتر هورمون NAA را برای ریشه‌زایی پروانش مناسب‌تر دانستند. در تضاد با نتایج این آزمایش، آنیتا و پولایا (5) با افزایش غلظت هورمون NAA از 1/0 تا 2 میلی‌ گرم در لیتر تعداد ریشه کمتری در ساقه استرکولیا مشاهده کردند. اثر متقابل دو هورمون NAA × IBA نیز معنی‌دار شد و مقایسه میانگین‌ اثر متقابل (جدول 6) نشان داد که ترکیب 4/0 میلی‌ گرم در لیتر IBA به همراه 4 میلی‌ گرم در لیترNAA  بیشترین تعداد ریشه را تولید کردند و کمترین تعداد ریشه متعلق به ترکیب هورمونی 4/0 میلی‌ گرم در لیتر IBA بود.

با دقت در جدول 6 مقایسه میانگین اثر متقابل NAA × IBA، مشاهده می شود که در غلظتهای پایین هورمون NAA هر چه غلظت هورمون IBA افزایش یافته تعداد ریشه­ها نیز افزایش پیدا کرده است.


 

       
       

 

 

 


شکل 2- نمونه هایی از گیاهچه های ریشه زا شده در محیط کشت

 

 

جدول 6- مقایسه میانگین اثرات متقابل NAA × IBA بر تعداد و طول ریشه

طول ریشه

تعداد ریشه

 (میلی گرم در لیتر)NAA

 (میلی گرم در لیتر)IBA

f* صفر

00/0 f*

0

4/0

ab 45/0

25/2 cd

1

4/0

cd 27/0

75/2 c

2

4/0

bc 37/0

25/3 bc

3

4/0

a 57/0

5 a

4

4/0

ef 1/0

75/0 ef

0

5/0

def 15/0

5/1 de

1

5/0

bc 35/0

5/3 bc

2

5/0

a 57/0

5/3 bc

3

5/0

ef 1/0

5/0 ef

4

5/0

def 15/0

1 ef

0

6/0

ab 45/0

4 ab

1

6/0

cde 25/0

75/2 c

2

6/0

cd 27/0

5/2 cd

3

6/0

bc 32 /0

37/2 cd

4

6/0

         

*: میانگینهای دارای حداقل یک حرف مشترک از نظر آماری با یکدیگر اختلاف معنی دار ندارند.

در غلظت 2 میلی‌ گرم در لیتر هورمون NAA غلظت ‌های 4/0 میلی‌ گرم در لیتر و 6/0 میلی ‌گرم در لیتر IBA عملکرد یکسانی از لحاظ تعداد ریشه دیده شد. اما در غلظتهای بالای هورمون NAA با افزایش غلظت هورمون IBA تعداد ریشه­ها کاهش یافته است. در جدول (5) تجزیه واریانس طول ریشه ‌ها نشان داده شده است. در مورد هورمون IBA بین غلظتهای مختلف در سطح احتمال (01/0 ≥P) اختلاف معنی‌دار دیده شد. با توجه به مقایسه میانگین (نمودار 2) بهترین غلظت هورمون IBA برای صفت طول ریشه 4/0 میلی‌ گرم در لیتر بود. کاشف حسین و انیس (14) بلند ‌ترین طول ریشه ‌ها را برای ریشه‌زایی ساقه ‌های کنگر فرنگی در غلظت 1/0 میلی‌ گرم در لیتر هورمون IBA گزارش کردند. جنید و همکاران (13) نیز طول ریشه­ها را در دو محیط مایع و جامد مقایسه کردند و مشاهده کردند که در محیط مایع 25/0 میلی گرم در لیتر هورمون IBA و در محیط جامد 5/0 میلی گرم در لیتر هورمون IBA بلندترین ریشه­ها را تولید می­کنند.

گوپیتا و همکاران (11) نیز در محیط جامد با 75/0 میلی گرم در لیتر هورمون IBA بهترین عملکرد طول ریشه را گزارش نمودند. هورمون NAA برای صفت طول ریشه‌ها در سطح احتمال (01/0 ≥P) معنی‌ دار شد که نشان می‌دهد بین غلظتهای مختلف این هورمون تفاوت وجود دارد. با توجه به مقایسه میانگین (نمودار 2) بهترین غلظت هورمون NAA از لحاظ طول ریشه‌ها 3 میلی ‌گرم در لیتر بود.

 

 

 

 

نمودار 2- مقایسه میانگین تعداد ریشه (a, b) و طول ریشه (c, d) در غلظتهای مختلف هورمونهای NAA و IBA

 

در مجموع افزایش غلظت هورمون NAA باعث افزایش طول ریشه­ها گردید. چویریگارای و همکاران (9) برای طول ریشه 5/0 میلی گرم در لیتر هورمون NAA را در اسطوخودوس مناسب تشخیص دادند. مدهولاتا و همکاران (17) نیز بهترین محیط القا ریشه موز سبز را ترکیب 1:1 هورمونهای  IBAو NAA معرفی کردند و گزارش کردند که با افزایش غلظت NAA طول ریشه‌ها افزایش یافت. گوپیتا و همکاران (11) نیز برای ریشه­دار کردن گیاهچه­های نیشکر غلظت مناسب هورمون NAA را 5/0 میلی گرم در لیتر برای محیط مایع و 75/0 میلی گرم در لیتر برای محیط جامد گزارش کردند. اثر متقابل هورمونهای IBA ×NAA از لحاظ صفت طول ریشه در سطح احتمال (01/0 ≥P)  معنی ‌دار شد و بهترین ترکیبهای هورمونی (جدول 6) 4/0 میلی گرم در لیتر IBA به همراه 4 میلی‌ گرم در لیتر NAA و 5/0 میلی‌ گرم در لیتر IBA به همراه 3 میلی ‌گرم در لیتر NAA انتخاب شدند. گوپیتا و همکاران (11) نیز برای ریشه­دار کردن گیاهچه­های نیشکر ترکیب یک میلی‌گرم در لیتر IBA به همراه 3 میلی‌گرم در لیتر NAA را گزارش نمودند.

1- میرزائی اصل، الف. معینی، الف. هاتف سلمانیان، ع. و جلالی جواران، م. 1388. بررسی اثر پیش تیمارهای هورمونی و ژنوتیپ در تشکیل نوساقه­های نابجای مستقیم روی برگهای چغندرقند (Beta Vulgaris L.) در شرایط درون شیشه­ای. مجله زیست شناسی ایران، جلد 22(4): صفحه 719 تا 729.

2- یاری، ف. موسوی، الف. مستوفی، ی. سیدی، س.م. زمانی، ذ. لامیر، م. 1392. اثر تنظیم کننده های رشد گیاهی و نوع کلات آهن بر پرآوری و ریشه زایی درون شیشه­ای سه رقم گل سرخ شاخه بریده. مجله زیست شناسی ایران، جلد 26 (1): صفحه 99 تا 110.

 

3- Abdul Jaleel C., Gopi, R., Manivannan, P., Sankar, B., Kishorekumar, A., and Panneerselvam, R. 2008. Antioxidant potentials and ajmalicine accumulation in Catharanthus roseus after treatment with giberellic acid. Colloids and Surfaces. Biointerfaces. 60: 195-200.

4- Ahroni, A., Zuker, A., Rozen, Y., Shejtman, H., and Vainstein, A. 1997. An efficient method for adventitious shoot regeneration from stem-segment Explants of gypsophila. Plant Cell Tissue and Organ Culture. 49: 101-106.

5- Anitha, S., and Pullaiah, T. 2002. Shoot regeneration from hypocotyls and shoot tip explants of Sterculia foetida L. derived from seedlings. Taiwania. 47(1): 62-69.

6- Ataei-Azimi, A., Delnavaz, B., Ebrahimzade, H., and Majd, A. 2008. High in vitro production of anti-canceric indole alkaloids from periwinkle (Catharanthus roseus) tissue culture. African Journal of Biotechnology. 7(16): 2834-2839.

7- Benmoussa, M., Mukhopadhyay, S., and Desjardins, Y. 1996. Optimization of callus culture and shoot multiplication of Asparagus densifloru. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 47:91-94.

8- Dhandapani, M., Kim, D.H., and Hong, S.B. 2008. Efficient plant regeneration via somatic embryogenesis and organogenesis from the explants of Catharanthus roseus. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 44:18-25.

9- Echeverrigaray, S., Basso, R. and Andrade, L.B. 2005. Micropropagation of Lavandula dentata from axillary buds of field-grown adult plants. Biologia Plantarum.49 (3): 439-442.

10- Ganesan, M., and Jayabalan, N. 2006. Influence of cytokinins, auxins and polyamines on in vitro mass multiplication of cotton (Gossypium hirsutum L. cv. SVPR2). Indian Journal of Experimental Biology. 44:506-513.

11- Gopitha, K., Bhavani, A.L., and Senthilmanickam, J .2010. Effect of different auxins and cytokinins in callus induction, shoot, root regeneration in sugarcane. International Journal of Pharma and Bio Sciences. 1(3). 62-69.

10- Ilah, A., Mujib, A., Junaid, A., Samar, F., and  Zainal Abdin, M. 2009. Somatic embryogenesis and two embryo specific proteins in Catharanthus roseus. Biologia. 64(2):299-304.

13- Junaid, A., Mujib, A., Bhat, M.A., Sharma, M.P., and Samaj, J. 2007. Somatic embryogenesis and plant regeneration in Catharanthus roseus. Biologia Plantarum. 51(4): 641-646.

14- Kashif Husain, M., and Anis, M. 2006. Rapid in vitro propagation of Eclipta alba (L.) through high frequency axillary shoot proliferation. Acta Physiologiae Plantarum. 28(4): 325-330.

15- Kim, J.S., Lee, S.Y., Eom, S.H., and Park, S.U. 2010. Improved shoot organogenesis and plant regeneration of Echinacea angustifolia. Journal of Medicinal Plants Research. 4(7): 587-591.

16- Liu, L., Fan, X., Zhang, J., Yan, M., and Bao, M. 2009. Long-term cultured callus and the effect factor of high frequency plantlet regeneration and somatic embryogenesis maintenance in Zoysia japonica. In Vitro Cell Dev. Biol. Plant. 45:673-680.

17- Madhulatha, P., Kirubakaran, S.I., and Sakthivel, N. 2006. Effects of carbon sources and auxins on in vitro propagation of banana. Biologia Plantarum. 50 (4): 782-784.

18- Miura, Y., Hirata, K., and Kurano, N. 1987. Isolation of vinblastine in callus culture with differentiated roots of Catharanthus roseus (L). G. Don. Agric. BioL Chern. 51 (2): 611 -614.

19- Mujib, A., Ilah, A. Gondotra, N. and Abdin, M .Z. 2003. In vitro approaches to improve alkaloid yield in Catharanthus roseus.  Biotechnology and Genetic Engineering, Recent Progress in Medicinal Plants. 4: 415-440.

20- Pietrosiuk, A., Furmanowa, M., and Lata, B. 2007. Catharanthus roseus: micropropagation and in vitro techniques. Phytochem Rev. 6:459-473.

21- Sivanesan, L., and Jeong, B.R. 2007. Direct shoot regeneration from nodal explants of Sida cordifolia Linn. In Vitro Cell Dev. Biol. Plant. 43:436-441.

22- Taha, H.S., El-Bahr, M.K., and Seif-El-Nasr, M.M. 2008. In vitro studies on egyptian Catharanthus roseus (L.) G. Don.: 1- calli Production, direct shootlets Regeneration and alkaloids determination. Journal of Applied Sciences Research, 4(8):1017-1022.

23- Venkatachalam, P., and Jayabalan, N. 1997. Effect of auxins and cytokinins on efficien plant regeneration and multiple-shoot formation from cotyledons and cotyledonary-node explants of groundnut (Arachis hypogaea L.) by in vitro culture technology. Applied Biochemistry and Biotechnology. 67, 237-248.

24- Yuan, Q., Xu, H., and Hu, Z. 1999. Two Phase culture for enhanced alkaloid synthesis and release in a new airlift reactor by Catharanthus roseus. Biotechnology Techniques. 13: 107-109.

25- Zhang, S., Hanna, W., and Ozias-Akins, P. 2007. Comparison of callus induction and plant regeneration from different explants in triploid and tetraploid turf-type bermudagrasses. Plant Cell, Tissue and Organ Cult. 90:71-78.