نوع مقاله : مقاله پژوهشی
چکیده
پنی سیلیوم جنسی از رده هیفومایستها (گروهی از قارچهای ناقص) می باشد و اولین بار توسط لینک در سال 1809 توصیف گردید. این قارچ با دارا بودن 150 گونه شناخته شده دارای گسترش جهانی در تمام دنیا می باشد. شناسایی گونه های مختلف پنی سیلیوم به دلیل گستردگی در طبیعت و نقش مهمی که در زندگی انسان دارند، از اهمیت خاصی برخوردار است. به طور معمول جهت شناسایی گونههای این جنس از روشهای مورفولوژیک استفاده میگردد ولی این روشها بسیار وقتگیر وفاقد دقت کافی میباشند. در دو دهه گذشته استفاده از تکنیکهای مولکولی در تمایز گونه های قارچها از جمله پنیسیلیوم بسیار معمول گردیده است. در این تحقیق از تکنیک پکتیک زایموگرام برای شناسایی گونه و تعیین تنوعات بین گونهای در این جنس استفاده گردید. الگوهای زایموگرام به دست آمده گونههای این جنس را به راحتی از یکدیگر تفکیک نمود. به نظر میرسد این روش یک روش سریع و دقیق تری نسبت به صفات مورفولوژیک جهت شناسایی گونههای مختلف جنس پنیسیلیوم باشد.
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
Using pectic zymogram technique to identify interspecies variation of some Penicillium species
چکیده [English]
Penicillium is a genous of Hyphomycetes (a group of Deuteromycetes) and was created by Link in 1809. This fungi with 150 recognized species has a worldwide distribution. The world-wide distribution and the importance of the role of the genus in human life are the reasons that make the identification of the species of this genus important. Some Penicillium species are responsible for hard disease. Because of producing a wide varity of enzymes, the species of this genus are important elements in industry and agriculture. Basically the morphological characters use to identify the species of Penicillium, but such identification is time consuming and lack of high accuracy. During last two decades using molecular and biochemical techniques have been vastly used in fungal species identification including Penicillium. In this study pectic zymogram technique was used to identify Penicillium species and inter-specific variations. Based on obtained zymogram patterns it seems that this technique is quick and more reliable than using morphological characters to distinguish different species.
کلیدواژهها [English]
بررسی تنوعات بین گونهای برخی از گونههای جنس پنیسیلیوم با استفاده از روش پکتیک زایموگرام
سید صدرالدین قائم مقامی1،* و غلامرضا بلالی2
1 خرمشهر، دانشگاه علوم و فنون دریایی خرمشهر، دانشکده علوم دریایی، گروه زیست دریا
2 اصفهان، دانشگاه اصفهان، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی
تاریخ دریافت: 8/12/90 تاریخ پذیرش: 1/6/91
چکیده
پنی سیلیوم جنسی از رده هیفومایستها (گروهی از قارچهای ناقص) می باشد و اولین بار توسط لینک در سال 1809 توصیف گردید. این قارچ با دارا بودن 150 گونه شناخته شده دارای گسترش جهانی در تمام دنیا می باشد. شناسایی گونه های مختلف پنی سیلیوم به دلیل گستردگی در طبیعت و نقش مهمی که در زندگی انسان دارند، از اهمیت خاصی برخوردار است. به طور معمول جهت شناسایی گونههای این جنس از روشهای مورفولوژیک استفاده میگردد ولی این روشها بسیار وقتگیر وفاقد دقت کافی میباشند. در دو دهه گذشته استفاده از تکنیکهای مولکولی در تمایز گونه های قارچها از جمله پنیسیلیوم بسیار معمول گردیده است. در این تحقیق از تکنیک پکتیک زایموگرام برای شناسایی گونه و تعیین تنوعات بین گونهای در این جنس استفاده گردید. الگوهای زایموگرام به دست آمده گونههای این جنس را به راحتی از یکدیگر تفکیک نمود. به نظر میرسد این روش یک روش سریع و دقیق تری نسبت به صفات مورفولوژیک جهت شناسایی گونههای مختلف جنس پنیسیلیوم باشد.
واژه های کلیدی: پنی سیلیوم، پکتیک زایموگرام، تنوعات بین گونه ای.
* نویسنده مسئول، تلفن:09132227001 ، آدرس پست الکترونیکی: s_sadra2003@yahoo.com
مقدمه
معرفی جنس پنیسیلیوم: پنی سیلیوم جنسی از رده هیفومایستها (گروهی از قارچهای ناقص) می باشد و اولین بار توسط Link در سال 1809 توصیف گردید. گونه های این جنس تولید زنجیری از کنیدیها را بر روی اندامهایی به اسم فیالید (که خودشان به صورت چرخه ای قرار دارند) می کنند (23 و 24). این قارچ با دارا بودن 150 گونه شناخته شده دارای گسترش جهانی در تمام دنیا می باشد. برآورد اهمیت این قارچ در طبیعت و در کارهای انسان مشکل است. آنها به عنوان بزرگترین گروه از قارچها در خاک محسوب می گردند. و عده ای از آنها، سبزیجات در حال فساد را ترجیح می دهند و بعضی در زیستگاههای خشکتر و شرایط کم رطوبت نسبی زندگی می کنند. آنها در این زیستگاهها به عنوان قارچهای تجزیه کننده عمل می کنند (1، 12 و22). Penicillium digitatum با تولید اتیلن سبب رسیدن زود هنگام مرکبات در انبار شده و سرانجام تمام میوه ها توسط حجم انبوهی از کنیدیهای سبز زیتونی پوشیده می گردند. گونهP. expansum سبب پوسیده شدن سیبهای ذخیره شده می گردد (15، 18، 19، 20، 25، 26 و 28). کاربرد اصلی پنی سیلیوم در غرب برای به عمل آوردن پنیرهاست که به خاطر رنگ آبی این قارچ آنها را به نام پنیرهای آبی می نامند. گونه P. roqueforti مسئول مرغوبیت بالای پنیر Roquefort می باشد وP. camemberti هم برای تهیه پنیر camembert به کار میرود (1، 12 و 18). گونهP. marneffei از شگفتیهایی است که اخیراً شناسایی شده است. این قارچ ابتدا از زخمهای موش خیزران در آسیا جداسازی شده بود و هنگامی که کاشف آن به طور اتفاقی خودش را آلوده کرد، پاتوژن انسانی به حساب آمد. از آن زمان این گونه به عنوان عامل بیماری پنیسلیوزیس(penicilliosis) در شرق وجنوب شرقی آسیا معرفی شده است (1 و 12).
اهمیت زیاد و وجود تنوعات در این جنس نیاز به شناسایی گونه های آن را برجسته و متمایز می کند. از سوی دیگر برای فهم روابط اکولوژیکی بین گونه ها، به حداقل رساندن خسارات آنها، شناسایی دقیق گونه ها یک امر ضروری است (4، 5، 17، 22 و 23).
نکته مهمی که در اینجا شایان ذکر است این مطلب است که گونه های پنی سیلیوم دارای تغییرپذیری ظاهری وابسته به شرایط محیط رشد هستند. علاوه بر این صفات ریخت شناسی معرفی شده برای گونه های مختلف از لحاظ اندازه و حالت همپوشانی و شباهتهای بسیار زیادی با هم دارند. همچنین برای تمایز گونه های این قارچ نیاز به شرایط کنترل شده و محیطهای کشت استاندارد مختلفی است که نیاز به صرف وقت زیاد جهت تهیه محیطهای کشت استاندارد برای داشتن کلیه ویژگیها، کاهش تأثیر عوامل محیطی، ناپایداری برخی از صفات و همپوشانی بسیاری از ویژگیهای بین گونههای مختلف این قارچ سبب شده است که کوششهایی جهت شناسایی سریعتر و دقیقتر گونههای پنی سیلیوم با کمک روشهای مولکولی صورت گیرد (4، 5، 6، 8، 10، 16، 22 و 23). نظر به اینکه اکثر گونههای پنی سیلیوم توانایی تولید آنزیمهای پکتیناز را دارند (4، 5،6، 7 و 10)، در این مطالعه علاوه بر بررسی ویژگیهای مورفولوژی برای تفکیک گونهها از روش زایموگرم (Zymogram) که الگوی الکتروفورزی حاصل از آنزیمهای پکتیک خارج سلولی را مورد مقایسه قرار میدهد استفاده گردید.
Pitt اعتقاد دارد که تنها 70 تا 80 درصد جدایهها حتی اگر در مکانهای عادی (و نه از شرایط ویژه زیست محیطی) باشند، در حال حاضر به آسانی قابل شناسایی هستند و باقی مانده (20 درصد بعدی) می توانند شناسایی شوند ولی شناسایی آنها به مهارت و تجربه زیاد تاکسونومیست متکی می باشد (14، 23، 24و 25).
کاربرد روش پکتیک زایموگرام در تعیین تنوع ژنتیکی پنی سیلیوم: بسیاری از قارچها از جمله پنی سیلیوم توانایی آزاد کردن یک سری آنزیمهای خارج سلولی جهت تجزیه پکتین دیواره سلولی اغلب گیاهان را دارند(4، 5، 6، 7، 10 و 11) .
اخیراً Alkorta و همکاران موفق به جداسازی یک پکتین لیاز از گونه P. italicum گردیده اند که این آنزیم در جریان حمله این گونه به مرکبات نقش بسیار مهمی دارد (2).
با توجه به توانایی تولید آنزیمهای پکتیناز در اغلب گونههای متداول پنی سیلیوم و از آنجا که در تاکسونومی این جنس مهم از قارچها، روشهای مورفولوژیک در نشان دادن و جدا کردن برخی از تاکسونهایی که از نظر فیزیولوژیک مجزا هستند، ناقص به نظر می رسند، از این روش به عنوان یک روش آسان و سریع جهت تعیین تنوعهای درون گونهای و بین گونهای این قارچ میتوان استفاده نمود. زیرا الگوهای زایموگرامی خصوصیات وسیعتری از ژنوتیپ را نسبت به خواص مورفولوژی در بر می گیرند(4، 5، 10، 13 و 21).
مواد و روشها
نمونهبرداری و جداسازی قارچ پنی سیلیوم: با توجه به طیف وسیع پراکنش گونههای مختلف قارچ پنی سیلیوم نمونههای مشکوک به آلودگی با این قارچ به آزمایشگاه منتقل گردید، سپس بخشهای آلوده به کپک تحت شرایط استریل و در کنار شعله با کمک اسکالپل یا لوپ استریل به پتریهای حاوی محیط کشت PDA منتقل شد و بعد از آن پتریهای مذکور درون انکوباتوری با دمای 25 درجه سانتی گراد و در شرایط تاریکی نگهداری شد.
تهیه کشت خالص پنی سیلیوم: پس از 48 تا 72 ساعت قارچهای رشد یافته زیر میکروسکوپ مورد بررسی قرار گرفت و کلنیهایی که ویژگیهای پنی سیلیوم را نشان میدادند به محیط کشت جدید PDA منتقل شدند.
بررسیهای مورفولوژیکی: نمونهها از نظر ویژگیهای ماکروسکوپی و میکروسکوپی مورد بررسی قرار گرفتند، برای شناسایی گونههای پنیسیلیوم از کشت قارچ در محیطهای کشت MEA, G25N, CYA استفاده گردید. برای بررسی صفات ماکروسکوپی و میکروسکوپی از کلیدشناسایی Pitt استفاده شد.
آماده سازی آنزیم پکتیناز: به ظروف شیشهای کوچکی(Bijoax Bottle) که بسته به میزان رشد گونه حاوی محیط کشت مایع سیتروس پکتین به عنوان تنها منبع کربنی با pH برابر 5/5 بودند (11)، یک بلوک به قطر 5 میلی متر از مناطق حاشیهای و در حال رشد کلنیهای مختلف پنیسیلیوم منتقل شد. محیطهای کشت به مدت 11 تا 17 روز بسته به نوع گونه در دمای 25 درجه سانتی گراد در تاریکی بدون تکان قرار داده شد سپس به آرامی و بدون آسیب رساندن به میسلیومها به منظور جلوگیری از مخلوط شدن آنزیمهای پکتیناز درون سلولی با آنزیمهای پکتیناز برون سلولی، به کمک سمپلر 100 میکرولیتر مایع زیر ریسه از هر یک از محیطهای کشت مورد نظر با 01/0 گرم سفادکس(Sephadex G-200) مخلوط و به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق نگهداری شد (4، 5، 10 و 29).
الکترفورز: برای انجام الکتروفورز روش Cruickshank and wade (1980) به کار گرفته شد. ژلهای پکتین آکریل آمید (Pectin-acrylamid gels) افقی نیز با روش Sweetigham و همکاران(1986) تهیه شد (11و 29). الکتروفورز روی شدت جریان 16 میلی آمپر تنظیم گردید و تا پایان الکتروفورز ثابت نگهداشته شد در طی مدت انجام الکتروفوز دمای صفحه فلزی زیر ژل با عبور آب سرد 6 درجه توسط دستگاهThermostatic Circulator (LKB 221) سرد نگهداشته شد تا افزایش دمای ژل که بر اثر عبور جریان الکتریسیته به وجود میآید منجر به تقلیب آنزیمی نشود. هنگامی که فاصله طی شده توسط نشانگر بروموفنل بلو به اندازه 5 سانتیمتر به طرف قطب آند میرسید جریان الکتروفورز قطع گردیده و پس از الکتروفورز ژل به مدت 5/1 ساعت در محلول DL- مالیک اسید 1/0 مولار قرار گرفت. اسید مالیک pH متغیری را برای فعال شدن ایزوزیمهای موجود در ژل ایجاد میکند سپس ژل با آب مقطر شسته شده و به مدت 18 ساعت در محلول روتینوم قرمز دو دهم در هزار در دمای 5 درجه سانتی گراد روی همزن قرار گرفت. روتینوم قرمز باعث مشخص شدن الگوهای باندهای آنزیمی میگردد، به این نحو که روتینیوم باعث قرمز شدن پکتین موجود در ژل میشود در نتیجه در نواحی که ایزوزیمهای پکتیناز روی پکتیناز اثر کرده باشند رنگی متفاوت با رنگ زمینه ژل بهوجود میآید. پس از شست و شوی ژل با آب مقطر استریل، بهمدت 20 دقیقه ژل در محلول آمونیوم پر سولفات قرار گرفت. سپس از ژل عکس تهیه گردید.
نتایج
تعداد زیادی جدایه از منابع مختلف جدا شدند و درنهایت تعداد 100 جدایه که ویژگیهای این قارچ را نشان می دادند نگهداری شدند. با بررسیهای مورفولوژیکی بر روی این 100 جدایه، 11 گونه از لحاظ مورفولوژیکی شناسایی شدند که اسامی آنها به این شرح می باشد.
1) Penicillium chrysogenum |
2) P. crustosum |
3) P.aurantiogriseum |
4) P. miczynskii |
5) P. waksmani |
6) P. islandicum |
7) P. expansum |
8) P. commune |
9) P. olsonii |
10) P. griseofolvum |
11) P. corylophium |
|
جدایه های P. chrysogenum در بین این گونه ها دارای غالبیت بودند و پس از آنها غالبیت با جدایه های P. expansum بود.
الگوهای زایموگرامی به دست آمده از این گونهها: بررسیهای زایموگرامی در این قارچها نشان دادند که این گونه ها تفاوت قابل ملاحظه ای را در الگوی باندها دارند که این امر خود تفاوت فاحش در بیان ژنوتیپ را نشان میدهد. به عنوان مثال گونه Penicillium miczynskii یک باند پلی گالاکتوروناز قوی و یک باند پکتین استراز از خود نشان داد. اکثر جدایههای گونه P. chrysogenum تنها یک باند پلیگالاکتوروناز از خود نشان دادند، ولی در تعداد کمی از جدایهها علاوه بر این باند یک باند دیگر قابل مشاهده بود. گونه P. waksmani دو باند پلی گالاکتوروناز را از خود به نمایش گذاشت. گونه P. aurantiogriseum هم دو باند پلی گالاکتوروناز و یک باند پکتین استراز ضعیف از خود به نمایش گذاشت (شکلهای 1، 2 و 3).
شکل 1- تصاویر مربوط به الگوهای زایموگرامی به دست آمده از گونههای مختلف پنیسیلیوم (از چپ به راست): گونه P. miczynskii (یک الگو)، گونه P. corylophium (2 الگو)، P. waksmanii (2 الگو)، P. islandicum (1 الگو)
شکل 1 (ادامه): تصاویر مربوط به الگوهای زایموگرامی به دست آمده از گونههای مختلف پنیسیلیوم (از چپ به راست):
P. expansum (2 الگو)، P. aurantiogriseum (1 الگو)، و 4 الگوی آخر مربوط به گونه P. commune میباشند.
شکل 1 (ادامه)- تصاویر مربوط به الگوهای آنزیمی به دست آمده از گونههای مختلف جنس پنیسیلیوم ( از چپ به راست: P. crustosum (3 الگو)، P. chrysogenum ( 3 الگو متعلق به این گونه) ، P. olsonii (3 الگومتعلق به این گونه) و الگوی آخر مربوط به گونه P. griseofolvum میباشد.
شکل 2- تصاویر مربوط به الگوهای زایموگرام به دست آمده متعلق به جدایههای مختلف گونه P. expansum
شکل 3- تصاویر مربوط به الگوهای زایموگرام به دست آمده متعلق به جدایههای مختلف گونه P. chrysogenum
بحث و نتیجهگیری نهایی
شناسایی اغلب گونههای متعلق به قارچهای رشتهای مشکل میباشد و این امر به خوبی برای گونههای جنس پنیسیلیوم قابل تعمیم است (4، 5، 23 و 24). شناسایی گونه های این جنس از ابتدا با پیچیدگیهایی همراه بوده است. از جمله عواملی که در ایجاد این پیچیدگی دخالت دارند، می توان به تعدد گونه های موجود در این جنس اشاره کرد، به طوری که برای این جنس تا کنون 150 و در منابع دیگر 200 گونه ذکر کرده اند. عامل دیگری که شناسایی گونه های پنی سیلیوم را با مشکل مواجه کرده است، تنوع مورفولوژی جدایه های درون یک گونه است (4، 5، 23، 25، 26 و 27).
در این تحقیق جدایههای متعلق به گونه های مختلف پنی سیلیوم که از مناطق و منابع مختلف جدا گردیدند، تنوع مورفولوژیک زیادی را نشان دادند.
الکتروفورز آنزیمهای پکتیناز خارج سلولی برای یک گروه بندی اولیه گونههای موجود در زیر جنس پنیسیلیوم توسط Cruickshank and Pitt در سال 1987 استفاده گردید و سپس توسط ایزوزیم های آمیلاز و ریبونوکلئاز تأیید گردید (4، 5 و 10).
بررسیهای مورفولوژیکی 11 گونه پنی سیلیوم شناسایی شده در این مطالعه نشان داد که گونه های موجود در یک بخش تشابه زیادی از لحاظ صفات ماکروسکوپی و میکروسکوپی دارند. مثلا در بخش (section) پنی سیلیوم ارائه شده توسط Pitt، گونه هایی وجود دارند که مشکلات تاکسونومیکی زیادی را برای تاکسونومیستها ایجاد کرده اند و اختلاف نظر زیادی بر سر تاکسونومی گونه های این بخش در بین تاکسونومیستها وجود دارد. مثلا می توان از این موارد گونه P. expansum را ذکر کرد که مورفولوژی پنیسیلیوس آن بسیار شبیه به P. chrysogenum می باشد. همچنین از نظر مورفولوژی کلنی و رنگ آن یک ارتباط نزدیکی بین این گونه و گونههایP. crustosum و P. viridicatum وجود دارد و هنوز یک تاکسونومی کامل و خوب، برای گونه های این بخش به وجود نیامده است. به همین ترتیب تشابه های اشاره شده در بخشهای دیگر متعلق به زیر جنسهای دیگر مشاهده میگردد (4، 5، 17و 23) .
در زیر جنس دوم یعنی زیر جنس فورکاتوم، این روش به راحتی سه گونه شناسایی شده متعلق به این زیر جنس را از هم متمایز می کند، بدین نحو که در دو جدایه متعلق به گونه P. corylophium، دو باند پلی گالاکتوروناز ، مشاهده گردید. در گونه P. waksamanii ، دو باند پلی گالاکتوروناز ولی در موقعیتهای متفاوت نسبت به گونه قبلی مشاهده گردید و در گونه دیگر یعنی P. miczynskii ، پنج باند پلیگالاکتوروناز و یک باند پکتین استراز مشاهده گردید.
تنها گونه شناسایی شده متعلق به زیر جنس Biverticillium ، یعنی P. islandicum، باندهای مختلف و با شدت زیادی بر روی ژل بر جای گذاشت. بدین ترتیب که در این گونه پنج باند پلی گالاکتوروناز و دو باند پکتین استراز مشاهده شد.
ازگونه های P. griseofolvum ، P. corylophium، P. waksmanii، aurantiogriseum P. ، P. miczynskii ، P. olsonii، P. islandicum و P. commune در این تحقیق جدایه های کمی به دست آمد و همگی از لحاظ زایموگرام آزمون شدند. بر اساس الگوهای زایموگرامی به دست آمده، بین گونه های نامبرده تفاوتهای الگویی واضحی قابل مشاهده است. اما به دلیل تعداد اندک نمونه به دست آمده در مورد تنوع درون گونه ای آنها نمی توان بحث نمود. گونه های مجزا ولی مشابه از نظر مورفولوژیکی، الگوها و باندهای کاملا متقاوتی را نشان دادند.
در این تحقیق، جدایه های مربوط به یک گونه، الگوی
پکتیک زایموگرام مشابهی ایجاد کردند. این یافته ها با نتایج Cruickshank & Pitt در سال 1987 مطابقت دارد.
در تحقیقی که Szecsi در سال 1990 بر روی الگوهای زایموگرام گونه های Fusarium انجام داد، چنین نتیجه گیری کرد که با توجه به اینکه جدایه های وی از مناطق جغرافیایی مختلف به دست آمده بودند، پکتیک آنزیمها در طول تکامل قارچها حفظ شده اند. Cruickshank (1983) نیز توانست الگوهای پکتیک زایموگرام مشخصی برای برخی گونه های Sclerotinia به دست آورد (2،3، 7، 9 و11).