باکتریهای بالقوه بیماریزای Xanthomonas campestris در خاک کشتزارهای ری و کرج 

نیره علی‌مددی، محمدرضا صعودی^*، شایسته سپهر و پریناز قدم

تهران، دانشگاه الزهرا (س)، دانشکدة علوم، گروه زیست‌شناسی، بخش میکروبیولوژی

تاریخ دریافت: 15/1/89               تاریخ پذیرش: 1/9/90 

چکیده

باکتریهای جنس Xanthomonas از مهم ترین باکتریهای بیماریزای گیاهان زراعی بوده و از عوامل مهم فساد پس از برداشت و خسارت اقتصادی می‌باشند. در این مطالعه 71 نمونه از خاک کشتزارهای حومة شهرهای ری و کرج جمع‌آوری شد. غربالگری باکتریها بر روی محیط نیمه‌انتخابی SX agar، انجام آزمونهای ریخت‌شناسی و بیوشیمیایی و بررسی دو شاخص ویژة ویرولانس منجر ‌به جداسازی تعدادی جدایة X. campestris در میان باکتریهای رشد یافته احتمالی شد. تراکم نسبی X. campestris در مقایسه با تراکم کل باکتریهای رشد یافته بر‌روی محیط SX agar، 69/0 درصد بود. قابلیت تولید اگزوپلی‌ساکارید با میانگین تراکم g l^-1 98/10 و میانگین ویسکوزیتة cP 1403 و نیز وجود پیگمان زانتومونادین با شاخص جذب نوری بیشینه در طول موجهای nm 7/444- 0/441 به عنوان دو شاخص اصلی‌ ویرولانس این باکتریها مورد بررسی و تأیید قرار‌گرفت. شناسایی مولکولی 25 درصد از جدایه‌های واجد فاکتورهای ویرولانس که بطور تصادفی انتخاب شدند، تعلق به گونة X. campestris را به واسطة وجود مارکر ژنی اختصاصی hrcC تأیید کرد. این بررسی نشان می‌دهد که علی‌رغم نبود گزارشی از شیوع بیماری، باکتریهای X. campestris بالقوه بیماریزا در خاک کشتزارهای کلم در حومة ری و کرج یافت می‌شوند. به عنوان یک بررسی موردی، وجود این سویه‌ها در خاک به دلیل ایجاد خسارتهای ناشی از فساد محصولات که در ایران شایع است، حائز اهمیت می‌باشد. 

واژه‌های کلیدی: کلم (Brassica oleracea)، خاک، Xanthomonas campestris، اگزوپلی‌ساکارید، زانتومونادین

^* نویسنده مسئول، تلفن: 9-88044051 ، پست الکترونیکی: msoudi@alzahra.ac.ir

مقدمه

جنس Xanthomonas در خانوادة Xanthomonadaceae تنها خانوادة موجود در راستة Xanthomonadales و در ردة گاما- پروتئوباکتریا قرار دارد. اعضای این جنس باکتریهای میله‌ای، متحرک با یک تاژه قطبی، هوازی اجباری و کیموارگانوتروف هستند. تولید پیگمانهای زانتومونادین و اگزوپلی‌ساکارید زانتان ویژة باکتریهای این جنس است و در باکتری دیگری تا کنون گزارش نشده است. اعضای این جنس در گیاهان بیماریزا بوده و بر پایة همولوژی DNA به ۲۰ گونه تفکیک شده اند (10). بر اساس آخرین طبقه‌بندی، گونة‌ X. campestris شامل پاتووارهایی است که بیشتر در گیاهان خانواده چلیپاییان (Cruciferae) بیماری ایجاد می‌کنند؛ در‌حالی‌که در گذشته حداقل 141 پاتووار برای این گونه برشمرده می‌شد. در حال حاضر پاتووارهای موجود در این گونه تنها شامل abberans، armoraciae، barbarea، campestris، incanae و raphani می‌باشند (10). باکتری X. campestris pv. campestris عامل پوسیدگی سیاه است و پاتووارهای دیگر اغلب علائم لکه برگی را ایجاد می‌کنند (34). به طور کلی این پاتووارها بر پایة ویژگیهای ریختی قابل تمایز نیستند و شناسایی این پاتووارها نیازمند شناخت گیاه میزبان است (10). با این وجود تمایز آنها با آزمون بیماریزایی اغلب دشوار است (22) و گاهی اوقات پاتووارهای مختلف، علائم غیرقابل تمایز از یکدیگر ایجاد می‌کنند (34).

باکتری X. campestris دامنة میزبانی وسیعی دارد و حساسیت میزبان می‌تواند متفاوت باشد (34). کلم (Brassica oleracea var. capitata) و گل کلم (Brassica oleracea var. botrytis) حساسترین میزبانها می‌باشند (28). پسمانهای گیاهی، بذر و علفهای هرز به عنوان منابع مهم بیماری پوسیدگی سیاه گزارش شده اند (35). آلودگی از طریق خاک نیز می‌تواند رخ دهد (21). این باکتری به ویژه در شرایط آب و هوایی گرم و مرطوب به خوبی گسترش می‌یابد و از فصلی به فصل دیگر در بذر آلوده، در خاک و حتی به مدت بیشتر در بقایای گیاهی در خاک باقی می‌ماند و به آسانی از طریق آب باران به گیاهان مجاور منتقل می‌شود (18). لوپز و همکارانش (1999) نشان داده اند که توانایی تولید اگزوپلی‌ساکارید (EPS) نقش مهمی در بقای X. campestris در خاک دارد (21).

اگزوپلی‌ساکارید زانتان از شاخصهای مهم بیماریزایی در Xanthomonas spp. به شمار می‌آید (11). عملکرد‌های متنوع زانتان در باکتری شامل حفظ تعادل انرژی و کربن در سلول (14)، حفاظت باکتریها در برابر ترکیبات سمی گیاه، کاهش تماس با سلولهای گیاهی و به حداقل رساندن پاسخهای دفاعی میزبان، تحریک تکثیر باکتری با طولانی کردن جذب آب توسط بافتها و پشتیبانی تهاجم یا کلونیزاسیون سیستمیک می‌باشد (12). جهش‌یافتگان EPS باکتریهای     X. oryzae pv. oryzae، X. axonopodis pv. manihotis و X. campestris pv. campestris در مقایسه با سویه‌های وحشی بیماریزایی کمتری دارند. حضور EPS با شدت بیماریزایی در این باکتری همبستگی آماری دارد. اگزوپلیمر می‌تواند با کمک به بقای باکتری در برابر شرایط تنش مانند خشک شدن و عمل ترکیبات ضدمیکروبی گیاه در پایداری تجمع شرکت کند. نقش EPS در هر دو مرحلة اپی‌فیتی و بیماریزایی در X. campestris pv. campestris پیشنهاد شده است (12). پژوهشگران دیگر گزارش کردند که اثر مهاری اگزوپلیمر زانتان بر تجمع کالوز در عفونت‌زایی Xanthomonas اهمیت دارد (32).

زانتومونادین‌ها پیگمانهای زرد رنگ متصل به پوشش سلولی و شامل مخلوطی از استرهای آریل- پلی‌ان برم‌دار می‌باشند. این پیگمانها در همة گونه‌های Xanthomonas وجود دارند اما سویه‌های بدون پیگمان نیز گاهی یافت می‌شود (10). زانتومونادین‌ها در حفاظت در برابر آسیب ایجاد شده توسط نور مرئی در حضور اکسیژن نقش دارند و در بقای اپی‌فیتی مؤثرند. بقای اپی‌فیتی برای باکتریهای جنس Xanthomonas در پایداری موفق بیماری ضروری است (23).

بیماریهای ناشی از Xanthomonas spp. در ایران اغلب توسط متخصصین کشاورزی گزارش شده است؛ هرچند که این بیماریها چندان شایع به نظر نمی‌رسند، ولی گزارشهای متعدد از رخدادهای پراکنده وجود دارد. باکتری            X. axonopodis pv. citri عامل شایع شانکر مرکبات در جنوب ایران است (3). در آمارهای مؤسسه آفات و بیماریهای گیاهی ایران (در مجلة بیماریهای گیاهی) و کنگرة سالانه گیاهپزشکی ایران گزارشهای متعدد ولی پراکنده از رخداد بیماریهای ناشی از زانتوموناد‌ها در گیاهان زراعی مانند مرکبات، پنبه، گردو، مریم گلی، نعناع، کلم و گیاهان زینتی در ایران وجود دارد. اخیراً تراکم بالای X. axonopodis pv. phaseoli در بذرهای لوبیا در استان مرکزی نشان داده شده است (1).

جنس Xanthomonas یکی از شش جنس اصلی باکتریهای مولد فساد در میوه و سبزی (بیماریهای پس از برداشت) در جهان است. لذا اگرچه این باکتریها بیماری شایعی در ایران ایجاد نمی‌کنند ولی وجود آنها در خاک می‌تواند منجر به آسیب به محصول و زیان اقتصادی شود (9). از آنجایی که تولید اگزوپلی‌ساکارید و پیگمان زانتومونادین از مهم ترین شاخصهای ویرولانس در Xanthomonas campestris می‌باشند، در این پژوهش جستجو و غربالگری سویه‌های مولد زانتان و پیگمان در خاک کشتزارهای حومة ری و کرج به عنوان نمونه، هدف این پژوهش قرار گرفت. وجود چنین سویه‌هایی در خاک کشتزارها هشدار دهنده است، زیرا وجود این باکتریها در خاک نه تنها در شرایط مساعد موجب بیماری گیاه می‌شود، بلکه می‌تواند منجر به بیماریهای پس از برداشت محصولات (post-harvest disease) یا همان فساد شده و خسارتهای اقتصادی بسیاری وارد کند. توجه به نقش این میکروارگانیسمها در کاهش سهم دور ریز محصولات کشاورزی پس از برداشت نقش به سزایی خواهد داشت.

مواد و روشها 

موقعیت و نمونه‌ برداری: نمونه ‌برداری از خاک سطحی کشتزارهای حومة شهرهای ری و کرج طی شهریور تا اسفند 1386 انجام گرفت. نمونه‌ها به روش تصادفی با نمونه ‌برداری دستی به صورت ستونهایی از خاک با قطر تقریبی cm 5/3 و ارتفاع cm 25 از سطح در کیسه‌های پلاستیکی نازک جمع‌آوری و در 4 درجه سانتی گراد حداکثر تا سه هفته نگهداری شد (17). موقعیت جغرافیایی محل نمونه ‌برداری تعیین شد. pH خاک در محلول کلسیم کلراید 01/0 مولار و رطوبت نسبی نمونه‌ها طبق روشهای استاندارد اندازه‌گیری شد (7).

جداسازی و غربالگری باکتریها: مقدار g 10 خاک پس از عبور از الک با منافذ 2 میلی متری و حذف بقایای درشت گیاهی، در ml 95 محلول سدیم پیروفسفات 1/0 درصد (w/v) و سدیم کلراید 1/0 مولار سوسپانسیون شد و به مدت 15 دقیقه همزنی شد (17). پس از ته‌نشینی، از مایع رویی در محلول سدیم کلراید 85/0 درصد (w/v) سریال رقت تهیه شد. صد میکرولیتر از هر رقت‌ بر روی پلیت‌های محیط نیمه‌انتخابی Selective Xanthomonas (SX) agar با سه تکرار کشت شد (29). پلیت‌ها به مدت 5 روز در دمای 28 درجه سانتی گراد گرماگذاری شدند.

کلنیهای رشد یافته بر روی محیط SX agar که خصوصیات ریخت‌شناسی مشابه با زانتومونادها (کلنیهای نیمه‌شفاف با مرکز ارغوانی مایل به آبی و هالة هیدرولیز نشاسته) داشتند، به محیط Yeast Malt (YM) agar منتقل و به مدت 24 ساعت در دمای 28 درجه سانتی گراد گرماگذاری شدند (24). جدایه‌هایی که بر روی این محیط رشد زرد و موکوئید داشتند، انتخاب شدند. خالص‌سازی جدایه‌ها بر روی محیط آگار مغذی (Nutrient agar, NA) انجام شد.

شناسایی جدایه‌ها:

شناسایی توسط خصوصیات ریخت‌شناسی و بیوشیمیایی: شناسایی ابتدا بر اساس ویژگیهای ریخت شناسی و بیوشیمیایی انجام گرفت. آزمونهای KOH، کاتالاز، اکسیداز، حرکت، اکسیداسیون- فرمانتاسیون گلوکز (O-F)، تولید ایندول، تولید استوئین، مایع ‌کردن ژلاتین، لیپولیز توئین 80، تحمل نمک (16)، احیای نیترات، تولید هیدروژن سولفید (H₂S)، فعالیت اوره‌آز، فعالیت آرژینین دی‌هیدرولاز، خاصیت فلورسنس بر روی محیط King B، رشد موکوئید بر روی محیط NA با 5 درصد (w/v) گلوکز و یا سوکروز، تحمل دما، مهار رشد با 1/0 درصد (w/v) تری‌فنیل تترازولیوم کلراید (TTC)، هیدرولیز اسکولین، هیدرولیز نشاسته، پروتئولیز شیر، استفاده از سیترات و پروپیونات، تولید اسید از تعدادی از کربوهیدراتها (27)، رشد در تراکمهای 30 درصد، 20 درصد و 10 درصد (w/v) گلوکز، مهار رشد در دمای 4 درجه سانتی گراد و 5/4 pH، استات سرب، متیل گرین و تیونین در تراکم 01/0 درصد (w/v)، فعالیت لسیتیناز (30) و رشد بر روی محیط آسپاراژین (8) برای جدایه‌های Xanthomonas campestris احتمالی انجام شد. در تمام آزمونهای بیوشیمیایی از کشت خالص و تازة (48-24 ساعته) باکتریها بر روی محیط NA استفاده شد و آزمونها با سه تکرار انجام گرفت. باکتریهای X. campestris DSM 1706 و X. campestris سویة b82 که از  خاک  ایران  جدا  شده

بود (4) به عنوان شاهد مورد استفاده قرار گرفتند.

شناسایی با استفاده از مارکر ژنی اختصاصی گونه: شناسایی مولکولی با استفاده از ردیابی یک ژن اختصاصی گونه بر روی 9 جدایة Xanthomonas campestris احتمالی به عنوان نماینده و یک جدایة دروغین به عنوان شاهد منفی انجام گرفت. استخراج DNA به روش فنل- کلروفرم انجام شد (15). برای انجام PCR، از پرایمرهای اختصاصی گونه (HrcCF2 و HrcCR2) معرفی شده توسط زاکاردلی و همکارانش (33) که بخشی از ژن hrcC متعلق به باکتری  X. campestris را تکثیر می‌کنند، استفاده شد که توسط شرکت سیناژن (CinnaGen) ساخته شد. پس از تعیین مقادیر بهینه برای دمای اتصال و تراکم یون منیزیم، PCR نهایی در مخلوط واکنش lµ 25 حاوی µM 5/0 از هرکدام از پرایمرهای HrcCF2 و HrcCR2، µM 200 از هرکدام از دزوکسی ریبونوکلئوتیدها (dNTPs)، mM 2 MgCl₂،  U 25/1 آنزیم Taq- DNA پلیمراز و µl 25/1 از DNA به عنوان الگو انجام گرفت.

جدول 1- مشخصات نمونه‌های خاک جمع‌آوری شده از کشتزارهای حومة کرج و ری

^† میانگین حاصل از pH تمام نمونه‌ها در هر مزرعه                     ^* میانگین حاصل از رطوبت نسبی تمام نمونه‌ها در هر مزرعه

برنامه تکثیر شامل مراحل واسرشتی اولیه در 93 درجه سانتی گراد به مدت 3 دقیقه، 35 چرخه شامل واسرشتی در 93 درجه سانتی گراد به مدت 45 ثانیه، اتصال در 64 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه و طویل شدن در 72 درجه سانتی گراد به مدت 90 ثانیه و مرحله طویل شدن نهایی در 72 درجه سانتی گراد به مدت 7 دقیقه بود. نمونه‌های فاقد DNA الگو و فاقد یکی از پرایمرها به عنوان شاهد منفی بررسی شدند. از DNA به دست آمده از باکتری X. campestris DSM 1706 در نمونه شاهد مثبت استفاده گردید. قطعات تکثیر شده توسط الکتروفورز بر روی ژل آگارز 2 درصد و رنگ‌آمیزی‌ اتیدیوم برماید مرئی شدند. واکنش PCR برای هر جدایه با دو تکرار انجام شد. 

ارزیابی فاکتورهای ویرولانس: تولید اگزوپلی‌ساکارید: تولید اگزوپلی‌ساکارید در جدایه‌های زرد و موکوئید و باکتریهای X .campestris سویه‌های b82 و DSM 1706 به عنوان شاهد با استفاده از محیط تولید سنتزی مورد بررسی قرار گرفت. یک لوپ از کشت 24 ساعته بر روی محیط شیبدار YM agar به لوله حاوی ml ۵ محیط YM broth انتقال داده شد و به مدت یک شب در دمای ۲۸ درجه سانتی گراد گرماگذاری شد. سپس از کشت یک شبه به میزان (v/v) ۲ درصد به محیط YM broth به عنوان پیش‌کشت تلقیح و در دمای ۲۸ درجه سانتی گراد به مدت 8 ساعت گرماگذاری شد. از محیط پیش‌کشت به میزان (v/v) 5 درصد به فلاسکهای ارلن مایر -ml۲۵۰ حاوی ml ۵۰ محیط تولید تلقیح و در دمای ۲۸ درجه سانتی گراد و rpm 140 به مدت 72 ساعت گرماگذاری شد. آزمایش با چهار تکرار انجام شد. ترکیب محیط‌ تولید سنتزی عبارت است از (g l^-1): سوکروز صنعتی 20، نیتروژن 28/0، پتاسیم 28/0، فسفر 12/0، منیزیم 02/0 (7 pH).

ویسکوزیتة ظاهری مایع تخمیر توسط ویسکومتر بروک فیلد با استفاده از سوزن شماره 3 در rpm 60 در دمای اتاق (C˚2 ± ۲6) تعیین شد (5). اگزوپلی‌ساکارید با استفاده از ایزوپروپانول (5/1 برابر حجم مایع تخمیر) و سدیم کلراید رسوب داده شد (5). رسوب حاصله پس از صاف شدن به مدت 24 ساعت در 5 ± 50 درجه سانتی گراد در آون تا رسیدن به وزن ثابت خشک شد (26). تعیین معنی‌دار بودن داده‌ها با آنالیز واریانس یکطرفه و آزمون توکی (Tukey) با فاصلة اطمینان 95 درصد توسط نرم‌افزار Minitab نسخه 2/15 انجام گرفت.

استخراج پیگمان و تعیین طیف جذبی: پس از 48 ساعت رشد بر روی محیط NA، سلولهای باکتریایی از سطح برداشته و به ml 3 متانول در لوله آزمایش درپیچ‌دار اضافه شدند. لوله‌ها به مدت 5 دقیقه در حمام آب جوش قرار داده شدند و سپس به مدت 15 دقیقه در g 8000 سانتریفیوژ شدند. مایع رویی در حمام آب 60-50 درجه سانتی گراد قرار داده شد تا آب محتوی نمونه تبخیر شود و جذب نوری عصاره حاوی پیگمان به 4/0 در nm 443 برسد. سپس عصاره‌ها برای تعیین جذب بیشینه توسط اسپکتروفوتومتر پرتونگاری شدند (27). این آزمون با دو تکرار و سه بار رسم طیف در هر تکرار انجام شد. میانگین طول موجی که دارای بیشترین جذب بود، به عنوان λ_max گزارش شد.

نتایج

جداسازی و غربالگری باکتریها: هفتاد و یک نمونة خاک از نه کشتزار در پنج منطقه در حومة شهرهای کرج و ری جمع‌آوری شد (جدول 1). میانگین تراکم کل باکتریهای رشد یافته بر روی محیط نیمه‌انتخابی SX agar در هر نمونة خاک cfu g^-1 ۱۰^۴× 16/1 به دست آمد. بر اساس ویژگیهای ریخت‌شناسی کلنیها روی محیطهای SX agar (کلنیهای نیمه‌شفاف با مرکز ارغوانی مایل به آبی) و YM agar (کلنیهای زرد و موکوئید) (شکل 1) و همچنین واکنش گرم (باکتریهای گرم منفی)، 78 جدایه از 16 نمونه پس از بررسی 71 نمونة خاک انتخاب شد. مشخصات مربوط به جداسازی باکتریها از خاک به تفکیک نمونه‌های حاوی جدایه‌های Xanthomonas campestris احتمالی و نمونه‌های حاوی جدایه‌های دروغین (جدایه‌های زرد رنگ و موکوئید دیگر) در جدولهای 2 و 3 نشان داده شده است.

جدول 2- تراکم و تعداد جدایه‌های Xanthomonas campestris

^† تعداد جدایه‌های منتخب       ^* تراکم تخمینی

میانگین تراکم جدایه‌های X. campestris احتمالی در 5 نمونة خاک حاوی این باکتریها و در کل نمونه‌ها به ترتیب cfu g^-1 ۱۰¹ × 1/7 و cfu g^-1 10⁰× 99/4 بود. در نمونه‌های مثبت میانگین درصد تراکم باکتریهای هدف نسبت به تراکم کل باکتریها 69/0 درصد بود. میانگین تراکم جدایه‌های دروغین در 12 نمونه حاوی آنها cfu g^-1 ۱۰² × 02/1 بود و میانگین درصد تراکم آنها نسبت به تراکم کل باکتریها 56/2 درصد به دست آمد.

شکل 1- ریخت جدایه‌های Xanthomonas campestris احتمالی بر روی محیطهای SX agar، کلنیهای نیمه‌شفاف با مرکز ارغوانی مایل به آبی و‌ هالة روشن هیدرولیز نشاسته در اطراف آن (A) و YM agar، کشت جدایه‌های زرد رنگ و موکوئید (B)

شناسایی براساس ویژگیهای ریخت‌شناسی و بیوشیمیایی: چهل و هشت جدایه بر اساس آزمونهای بیوشیمیایی کلیدی شامل حرکت، اوره‌آز، تولید H₂S، استفاده از آسپاراژین به عنوان تنها منبع کربن و نیتروژن، رشد بر روی مهار رشد با 1/0 درصد (w/v) TTC، تحمل نمک، رشد موکوئید بر روی 5 درصد سوکروز، اکسیداز، هیدرولیز نشاسته، تولید اسید از سوکروز و استفاده از سیترات و پروپیونات از سایر جدایه‌ها متمایز شدند. آنها همچنین در بررسی اولیه برای تولید اگزوپلی‌ساکارید و داشتن پیگمانی با طیف جذبی مشابه با زانتومونادین پاسخ منفی دادند. این باکتریها به دلیل فقدان دو فاکتور اصلی ویرولانس، جدایه‌های دروغین نامیده شدند. به این ترتیب، 30 جدایة X. campestris احتمالی واجد شاخصهای ویرولانس متمایز شدند و آزمونهای بیوشیمیایی بیشتر بر روی آنها انجام شد (جدول 4).

جدول 3- تراکم و تعداد جدایه‌های دروغین

^† تعداد جدایه‌های منتخب         ^* تراکم تخمینی

با انجام این آزمونها، شباهت فنوتیپی این جدایه‌ها به اعضای جنس Xanthomonas بیشتر مورد تأیید قرار گرفت؛ همة این جدایه‌ها در حضور تراکم 01/0 درصد متیل گرین رشد نمودند که این متفاوت از نتیجة منابع دیگر است (10 و 30). همة این جدایه‌ها که قادر به رشد بر روی محیط SX agar، دمای 36 درجه سانتی گراد و تراکم 10 درصد گلوکز، هیدرولیز نشاسته، توئین 80 و ژلاتین، پروتئولیز شیر، استفاده از سیترات و پروپیونات، تولید اسید از گلوکز، سوکروز، آرابینوز، زایلوز، فروکتوز، گالاکتوز، مانوز، مالتوز، رافینوز، ترهالوز و سلوبیوز بودند، طبق طبقه‌بندی بر اساس ویژگیهای فنوتیپی (30) متعلق به فنون X. campestris می‌باشند. بیشتر سویه‌ها قادر به مصرف لاکتوز نمی‌باشند؛ هرچند که بخشهایی از توالی اپرون لاکتوز در آنها وجود دارد و امکان احیای مصرف لاکتوز در سویه‌های جهش‌یافته نشان داده شده است (2).

در میان خصوصیات بررسی شده، تفاوتهای کمی میان 30 جدایة X. campestris احتمالی و حتی سویه‌های شاهد مشاهده شد. از مجموع 53 تست انجام شده برای سویه ها تنها در 6-1 آزمون از میان آزمونهای تحمل دما، تحمل نمک، لسیتیناز و تولید اسید از رافینوز، لاکتوز، مانیتول و مانوز میان جدایه‌ها تفاوت مشاهده شد (جدول 5).

شناسایی با استفاده از پرایمرهای اختصاصی گونه: شناسایی ژنتیکی 9 جدایة‌ Xanthomonas campestris احتمالی که به عنوان نماینده و به صورت تصادفی انتخاب شدند، بر اساس پرایمرهای اختصاصی مؤید یک مارکر ژنی برای گونة X. campestris انجام گرفت که پیش‌تر توسط زاکاردلی و همکارانش معرفی شده بود (33). پس از انجام PCR، قطعه DNA مورد نظر به طول حدود bp 520 از هفت جدایه شامل SAM 3301، SAM 4101، SAM 4204، SAM 4205، SAM 4210، SAM 4213 و SAM 4217 و همچنین سویة شاهد مثبت (X. campestris DSM 1706) به دست آمد و شناسایی آنها به X. campestris را تأیید نمود، اما از DNA جدایه‌های SAM 0302، SAM 0401 و جدایة دروغین چنین نتیجه‌ای حاصل نشد (شکل 2).

فاکتورهای ویرولانس: هیچ‌کدام از 48 جدایة دروغین قادر به تولید اگزوپلی‌ساکارید در محیط سنتزی به کار رفته نبودند، اما تولید اگزوپلی‌ساکاریدی با ویسکوزیته بالا در همة جدایه‌های X. campestris احتمالی مشاهده شد (جدول 5). میانگین تولید خام اگزوپلی‌ساکارید در این جدایه‌ها g l^-1 98/10 (حداکثر g l^-1 10/12) و میانگین ویسکوزیتة ظاهری مایع تخمیر cP 1403 (حداکثر cP 1554) به دست آمد. ویسکوزیتة مایع تخمیر و میزان تولید خام اگزوپلی‌ساکارید جدایه‌های SAM 0301، SAM 0302، SAM 0401 و SAM 4205 نسبت به جدایه‌های دیگر کمتر و از لحاظ آماری متفاوت بود (05/0p<).

جدول 4- آزمونهای بیوشیمیایی متمایز کنندة جدایه‌های Xanthomonas campestris احتمالی از یکدیگر¹

¹ نتایج دیگر آزمونهایی که موجب تمایز جدایه‌های Xanthomonas campestris احتمالی از یکدیگر نشد: حرکت (+)، کاتالاز (+)، اکسیداز (-)،احیای نیترات (+)، O-F (O)، تولید H₂S (+)، تولید ایندول و استوئین (-)، اوره‌آز و آرژینین دی‌هیدرولاز (-)، فلورسنس در محیط KingB، رشد در محیط آسپاراژین (-)، هیدرولیز اسکولین، کازئین، نشاسته، ژلاتین و توئین 80 (+)، توانایی رشد در 10%، 20% و 30% گلوکز،(-)، رشد موکوئید در 5% گلوکز و سوکروز (+)، 1/0% TTC، 01/0% استات سرب و 01/0% تیونین (-) و 01/0% متیل گرین (+)، رشد در C˚4 (-)، استفاده از سیترات و پروپیونات (+)، تولید اسید از L- رامنوز، L- سوربوز، آدونیتول، سوربیتول، میو‌اینوزیتول، D- ملزیتوز، اینولین و دکسترین (-) و L- آرابینوز، ترهالوز، D- گلوکز، D- گالاکتوز، D- زایلوز، D- فروکتوز، سوکروز، سلوبیوز و مالتوز (+)                        ² آزمونها در سه تکرار انجام گرفت. ³ سویه‌های شاهد

⁴ ویژگیهای مربوط به فنون X. campestris طبق بررسی ون دن موتر و سوئینگز (30) که در اینجا به صورت زیر نمایش داده شد: +: 70% < سویه‌ها، - :30% > سویه‌ها و v: 70-30% سویه‌ها. ⁵ w: ضعیف  ⁶ v: متغیر

جدول 5- میزان رشد در محیط پیش‌کشت، ویسکوزیتة ظاهری مایع تخمیر و میزان تولید خام اگزوپلی‌ساکارید در جدایه‌های زرد رنگ و موکوئید و سویه‌های شاهد

^† این مقادیر میانگین چهار تکرار می‌باشند.               ^* تفاوت معنی‌دار در مقایسه با جدایه‌های دیگر (05/0p<)       ^** سویه‌های شاهد

جدول 6- جذب بیشینة (λ_max) پیگمان جدایه‌های X. campestris احتمالی و جدایه‌های دروغین

^† λ_max بیانگر طول موجی است که عصارة متانولی پیگمان خام در آن بیشترین جذب را دارد. این آزمون با دو تکرار و 3 بار رسم طیف جذب در هر تکرار انجام شد.               ^* سویه‌های شاهد

شکل 2- آنالیز ژل الکتروفورز محصولات PCR تکثیر شده از DNA جدایه‌های نماینده Xanthomonas campestris احتمالی با استفاده از پرایمرهای HrcCF2 و HrcCR2 (ردیف M: نشانگر وزن مولکولی، ردیف 1: یکی از جدایه‌های دروغین، ردیف 2: SAM 0302، ردیف 3: SAM 0401، ردیف 4: SAM 3301، ردیف 5: SAM 4101، ردیف6: SAM 4204، ردیف 7: SAM 4205، ردیف 8: SAM 4210، ردیف 9: SAM 4213 و ردیف 10: SAM 4217). در تصویر کنترل‌های مثبت و منفی مشاهده نمی‌شوند.

در همة جدایه‌های X. campestris احتمالی، طیف جذب نوری عصارة متانولی حاوی پیگمانهایی مشابه سویه‌‌های شاهد بود؛ درحالی‌ که در 48 جدایة دیگر، جذب بیشینة عصارة متانولی حاوی پیگمان در دامنة nm 4/425- 6/414 قرار گرفت (جدول 6). بیشتر اعضای جنس Xanthomonas جذب بیشینة اصلی در nm 445 (29) و یا nm 441 (27) نشان می‌دهند. معمولاً جذبهای بیشینة فرعی در شانه‌های چپ و راست در طول موجهای nm 22 کمتر و nm 25 بیشتر نیز وجود دارد (29).

بحث

اعضای جنس Xanthomonas تقریباً ِِِبه طور انحصاری از زیستگاههایی که با بیماریهای گیاهی در ارتباط هستند، جداسازی می‌شوند. بیشتر گزارشهای قابل اعتماد در مورد زانتومونادها در رابطه با وجود آنها در ضایعات تازه یا کهنه بر روی گیاهان آلوده می‌باشد. دربارة جداسازی Xanthomonas spp. از خاک، بقایای گیاهی و گیاهان بی‌علامت گزارشهای اندکی وجود دارد، ولی اطلاعات معتبری را در مورد زیستگاههای این باکتریها فراهم می‌کند (29). اگرچه حضور این باکتری در خاکهای زراعی در ایران پیش از این نشان داده شده است (4)، این نخستین پژوهش برای جستجو و دستیابی به سویه‌های X. campestris در خاک کشتزارهای کلم در ایران محسوب می‌شود. در این مطالعه جدایه‌های X. campestris تنها از 7 درصد نمونه‌های خاک به دست آمد و میانگین تراکم آنها در این نمونه‌ها  cfu g^-1 ۱۰¹ × 09/7 بوده‌ است. فوکوئی و همکارانش (1994) در خاک نواحی آلوده جمعیتهای cfu g^-1 10⁶ را نیز گزارش کرده اند (29).

وضعیت آب ‌و‌ هوایی و نحوه فعالیتهای کشاورزی می‌تواند شرایط لازم برای انتشار بیماری را مساعد نماید. مطالعات بقا نشان داده که دمای بالا منجر به تجزیة سریع تر بقایای گیاهی و بنابراین کاهش حفاظت از باکتری می‌گردد و رطوبت شدید محیط بی‌هوازی ایجاد می‌کند و میکروفلور خاک را تغییر می‌دهد. همچنین یک همبستگی منفی بین تعداد میکروارگانیسمهای سلولوتیک و تعداد باکتری X. campestris. pv. campestris در رطوبت نسبتاً بالا مشاهده شده است (6 و 19). علی‌رغم نبود بیماری شایع در گیاهان حساس در ایران بنابر دلایل آب و هوایی، وجود باکتری در برخی از نمونه‌های خاک کشتزارهای کلم در این بررسی قابل ملاحظه بود. گاهی گیاهان مستعد علائم بیماری را دیرتر و در هنگام ذخیره‌سازی در انبار نشان می‌دهند (28). این پدیده که بیماری پس از برداشت و به عبارت دیگر فساد نامیده می‌شود، در ایران شایع است و سهمی از دور ریز محصولات جالیز و سبزیها را به خود اختصاص می‌دهد. بیماریهای پس از برداشت منجر به کاهش کیفیت محصول و زیان اقتصادی خواهند شد. عدم برداشت صحیح میوه و سبزی، عدم آماده سازی اولیه درکشتزار، آماده‌سازی و حمل و نقل نادرست و نگهداری در شرایط نامناسب موجب تلفات بخش مهمی از میوه و سبزی می‌شود که گفته می‌شود مقدار آن در مجموع از 35 درصد تولیدات کشور بیشتر است.

این مطالعه کارآیی نسبی محیط SX agar برای جداسازی سویه‌هایی از X. campestris را تأیید می‌کند. این کارآیی را در یک پژوهش بر روی سویه‌هایی از X. campestris و گونه‌های تجزیه‌کنندة نشاسته دیگر 23 تا 100 درصد (29) و در پژوهش دیگر 10 درصد گزارش کرده اند (13). استار (1981) به کاربرد محیط کشت SX agar برای جداسازی باکتری X. campestris اشاره کرده است. محیط نیمه‌انتخابی SX agar توسط شاد و وایت در سال 1974 طراحی شد و نخستین بار در مطالعة‌ مشابهی مورد استفاده قرار گرفت. دلایل این طراحی، قابلیت مصرف نشاسته توسط تمام سویه‌های X. campestris، اثر متیل ویولت B و متیل گرین در بهبود تمایز کلنی و انتخابی شدن بیشتر محیط و وجود عصارة گوشت برای افزایش سرعت رشد X. campestris می‌باشد (29). به‌جز X. campestris pv. campestris، باکتریهایی مانند X. campestris pv. begoniae، X. campestris pv. citri، X. campestris pv. dieffenbachiae،X. campestris pv. nigromaculans، X. juglandis pv. corylina، X. hyacinthi و X. pisi نیز می‌توانند بر روی این محیط جداسازی شوند (27). در این بررسی مشخصات کلنی و‌ هالة هیدرولیز نشاسته در مرحله غربالگری چندان مفید واقع نشدند زیرا کلنیهای بسیاری با ریخت شبیه زانتومونادها بر روی محیط SX agar رشد کرد و وجود سویه‌هایی با فعالیت آمیلازی قوی یا تعداد زیادی از سویه‌های آمیلاز مثبت مانع از تشخیص این ‌هاله برای کلنیهای دیگر ‌شد. بنابراین تعداد زیادی از کلنیها به محیط YM agar منتقل شدند. تولید پیگمان زانتومونادین و پلی‌ساکارید زانتان از ویژگیهای منحصر به فرد جنس Xanthomonas به شمار می‌آید و تشکیل کلنیهای زرد رنگ و موکوئید از خصوصیات ریخت‌شناسی مهم در این باکتریها است. استفاده از محیط YM agar و انتخاب باکتریهای زرد و موکوئید منجر به کاهش قابل توجه در تعداد جدایه‌ها شد. علاوه بر این، تولید اگزوپلی‌ساکارید و پیگمانهای زانتومونادین در بیماریزایی این باکتریها نیز نقش مهمی دارد (12 و 23). بنابراین سویه‌های دارای این دو ویژگی را می‌توان بالقوه بیماریزا به شمار آورد.

همة سویه‌های پیگمان‌دار جنس Xanthomonas، پیگمانهایی با ویژگیهای کروماتوگرافی و جذب نوری مشابه تولید می‌کنند که در باکتریهای زرد رنگ دیگر یافت نشده است (10). بررسی وجود زانتومونادین‌ها و یا وجود خوشه‌های ژنی کدکننده برای سنتز آنها می‌تواند برای نسبت دادن سویه‌های ناشناخته به جنس Xanthomonas به کار رود. نبود زانتومونادین‌ها اثر محدود‌کننده بر روی بقای اپی‌فیتی و عفونت در میزبان دارد (10). جداسازی از بافت گیاهی و خاک اغلب تعداد زیادی باکتریهای تولید کنندة پیگمان به دست می‌دهد. یک آزمون احتمالی مناسب برای شناسایی زانتومونادین‌ها تعیین طیف جذب عصاره‌های خام می‌باشد و شناسایی دقیق‌تر نیاز به تعیین ویژگیهای کروماتوگرافی آنها دارد (29). در این مطالعه تعیین طیف جذب عصاره متانولی حاوی پیگمان تمایز خوبی میان جدایه‌های  X. campestris احتمالی و جدایه‌های دروغین ایجاد کرد.

نتایج آزمونهای ریخت‌شناسی و بیوشیمیایی 30 جدایة زرد و موکوئید به خوبی با خصوصیات مربوط به باکتریهای جنس Xanthomonas (10) و فنون X. campestris (30) مطابقت داشت. در این بررسی، وجود قطعه‌ای اختصاصی در باکتری X. campestris از ژن hrcC که در خانواده ژنهای hrp قرار دارد، به صورت تصادفی در برخی از جدایه‌های احتمالی بررسی شد. این بررسی از یک سو صحت شاخصهای سنجش اگزوپلیمر و زانتومونادین را تأیید کرد و از سوی دیگر به عنوان مارکر ژنی وجود X. campestris را تأیید نمود. این جستجو توسط PCR از 7 جدایه به عمل آمد و به این ترتیب شناسایی آنها به گونة X. campestris تأیید شد، اما این قطعه از دو جدایة X. campestris احتمالی دیگر و جدایه دروغین بررسی شده حاصل نشد. ژنهای hrp برای رشد درون گیاه و ایجاد علائم بیماری ضروری هستند. محصولات این ژنها اجزای اصلی سیستم ترشحی بوده و برای بیماریزایی کاملاً ضروری هستند (33). جدایه‌های فاقد ژن hrcC ممکن است متعلق به گونه‌های دیگری باشند یا اینکه از زانتومونادهای فرصت‌طلب به شمار روند. زانتومونادهای فرصت‌طلب، جوامعی از زانتومونادها می‌باشند که در ارتباط نزدیک با گیاهان زندگی می‌کنند، اما علائم بیماری آشکاری بر روی میزبان ایجاد نمی‌کنند و فاقد ژنهای hrp معمول در اعضای بیماریزای این جنس هستند (31).

همة جدایه‌های X. campestris احتمالی به دست آمده، توانایی تولید اگزوپلی‌ساکارید و ویسکوز نمودن مایع کشت را نشان دادند که از نظر کاربرد صنعتی بسیار با اهمیت است (20 و 25)؛ تراکم‌ 2 درصد از سوکروز در محیط تولید به کار رفت و موجب تمایز میان تعدادی از جدایه‌ها شد.