پژوهش‌های سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران)

افزایش پایداری دمائی پروتئاز سالینی ویبریو پروتئولیتیکوس AF-2004 با استفاده از جهش زایی هدفمند مکانی

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم پایه و فنی مهندسی، دانشگاه گنبدکاووس، گنبدکاووس، ایران

2 دانشیار / گروه زیست‌شناسی سلولی و مولکولی و میکروبیولوژی، دانشکده علوم و فناوری زیستی، دانشگاه اصفهان، اصفهان، ایران

چکیده

روش‌های جهش‌زایی هدفمند مکانی، یکی از موثرترین روش‌ها در بهبود فعالیت و پایداری آنزیم‌های صنعتی است. در مطالعه حاضر، اثر جایگزینی آمینواسید آلانین 56 به ایزولوسین، بر پایداری دمائی متالوپروتئاز تولید شده توسط یک باکتری نسبتا هالوفیل به نام سالینی‌ویبریو پروتئولیتیکوس بررسی شد. به منظور تهیه سویه جهش یافته مورد نظر، از پرایمرهای جهش‌زا (موتاژنیک) و سپس تیمار با آنزیم محدود الاثر Dpn I استفاده شد. ژن جهش یافته حاصله در سازه بیانی pQE80L، به سویه‌های بیانی مختلف اشریشیا کلای (مانند سویه‌های XL1-Blue، BL21(DE3) pLysS و Top10) ترنس‌فورم شد. سپس بیان آنزیم نوترکیب تحت شرایط مختلف کشت، بهینه‌سازی گردید. آنزیم جهش یافته و آنزیم طبیعی، از ژل زیموگرافی استخراج شدند. در نهایت، پایداری دمائی و فعالیت آنزیم جهش یافته و آنزیم طبیعی، بررسی شد. حداکثر میزان بیان آنزیم، با استفاده از سویه میزبانی E.coli BL21 (DE3) pLysS ، در محیط‌کشت Terrificبراث، در حضور IPTG 1 میلی مولار و بعد از 24 ساعت انکوباسیون در دمای°C37، به دست آمد. آنزیم طبیعی و جهش یافته، به ترتیب حدود 42 و 24 درصد از فعالیت خود را بعد از انکوباسیون در دمای °C70 به مدت 20 دقیقه از دست دادند. از طرفی، فعالیت آنزیم جهش یافته نسبت به آنزیم طبیعی، حدود 11 درصد بیشتر بود. بنابراین، فعالیت و پایداری دمائی متالوپروتئاز باکتری سالینی‌ویبریو پروتئولیتیکوس جهش یافته (جایگزینی آلانین 56 به ایزولوسین) نسبت به آنزیم طبیعی بهبود یافت.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Enhancement of Salinivibrio Proteolyticus Strain AF-2004 Protease Thermostability Using Site Directed Mutagenesis

نویسندگان [English]

  • Matia Sadat Borhani 1
  • Zahra Etemadifar 2

1 Biology Department, Faculty of Sciences, Gonbad Kavous University, Golestan, Iran

2 Associate Professor/Department of Cell and Molecular Biology & Microbiology, Faculty of Biological Science and Technology, University of Isfahan, Isfahan, Iran

چکیده [English]

Abstract: Site-directed mutagenesis is one of the most effective methods for enhancing the activity and stability of industrial enzymes. In this study, the influence of Alanine 56 substitution to isoleucine on the thermostability of a metalloprotease produced by a moderately halophilic bacterium named Salinivibrio Proteolyticus (SVP) Strain AF-2004 was investigated. The given mutation was constructed using the mutagenic primers and DpnI restriction enzyme treatment. The resulted mutant gene in the pQE-80L vector was transformed into the various expression strains of Escherichia coli (XL1-Blue، BL21 (DE3) pLysS, and Top10). Then, the enzyme expression was optimized using different cultural conditions. Subsequently, the wild and mutant enzymes were extracted from zymography gel. Finally, the thermostability and activity of wild and mutant enzymes were assayed. The maximum expression of the enzyme was achieved using E.coli BL21 (DE3) pLysS, in Terrific broth medium, in the presence of 1 mM IPTG, and after 24 h induction at 37 ºC. The extracted wild and mutant enzymes lost 42 and 24 percent of their activity after incubation at 70 ºC for 20 min, respectively. However, the activity of the mutant enzyme was 11 percent more than the wild enzyme. Therefore, the activity and thermostability of the mutant SVP metalloprotease (A56I) were improved compared to the wild enzyme.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Optimization
  • Metalloprotease
  • Expression cloning
  • Halophile
  • Zymography

افزایش پایداری دمایی پروتئاز سالینی ویبریو پروتئولیتیکوس AF-2004 با استفاده از جهش زایی هدفمند مکانی

ماتیا سادات برهانی 1 و زهرا اعتمادی­فر2

1 ایران، گنبدکاووس، دانشگاه گنبدکاووس، دانشکده علوم پایه و فنی مهندسی، گروه زیست‌شناسی

 2 ایران، اصفهان، دانشگاه اصفهان، دانشکده علوم و فناوری زیستی، گروه زیست‌شناسی سلولی و مولکولی و میکروبیولوژی

تاریخ دریافت: 15/07/1399          تاریخ پذیرش: 17/12/1399

چکیده

روشهای جهش­زایی هدفمند مکانی، یکی از مؤثرترین روشها در بهبود فعالیت و پایداری آنزیمهای صنعتی است. در مطالعه حاضر، اثر جایگزینی آمینواسید آلانین 56 به ایزولوسین، بر پایداری دمایی متالوپروتئاز تولید شده توسط یک باکتری نسبتاً هالوفیل به نام سالینی­ویبریو پروتئولیتیکوس بررسی شد. به منظور تهیه سویه جهش یافته مورد نظر، از پرایمرهای جهش­زا (موتاژنیک) و سپس تیمار با آنزیم محدود الاثر Dpn I استفاده شد. ژن جهش یافته حاصله در سازه بیانی pQE80L، به سویه­های بیانی مختلف اشریشیا کلای (مانند سویه‌های XL1-Blue، BL21(DE3) pLysS و Top10) ترنسفورم شد. سپس بیان آنزیم نوترکیب تحت شرایط مختلف کشت، بهینه­سازی گردید. آنزیم جهش یافته و آنزیم طبیعی، از ژل زیموگرافی استخراج شدند. در نهایت، پایداری دمایی و فعالیت آنزیم جهش یافته و آنزیم طبیعی، بررسی شد. حداکثر میزان بیان آنزیم، با استفاده از سویه میزبانی E.coli BL21 (DE3) pLysS ، در محیط­کشت Terrificبراث، در حضور IPTG 1 میلی مولار و بعد از 24 ساعت انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتی گراد، به دست آمد. آنزیم طبیعی و جهش یافته، به ترتیب حدود 42 و 24 درصد از فعالیت خود را بعد از انکوباسیون در دمای 70 درجه سانتی گراد به مدت 20 دقیقه از دست دادند. از طرفی، فعالیت آنزیم جهش یافته نسبت به آنزیم طبیعی، حدود 11 درصد بیشتر بود. بنابراین، فعالیت و پایداری دمایی متالوپروتئاز باکتری سالینی­ویبریو پروتئولیتیکوس جهش یافته (جایگزینی آلانین 56 به ایزولوسین) نسبت به آنزیم طبیعی بهبود یافت.

واژه­های کلیدی: بهینه­سازی،همسانه­سازی بیانی، متالوپروتئاز، هالوفیل، زیموگرافی

* نویسنده مسئول، تلفن: 03137932367 ، پست الکترونیکی:z.etemadifar@sci.ui.ac.ir

مقدمه

 

به منظور استفاده از پروتئازها در صنعت، حفظ فعالیت و پایداری آنها در شرایط غیرفیزیولوژیک مانند pH بالا، دمای بالا و در حضور عوامل چلاته­کننده یونها و دترجنتها، ضروری است (12). ناتوانی پروتئازهای گیاهی و حیوانی در پاسخگویی به نیازهای مطرح در بخش صنعت، منجر به توجه روزافزون به پروتئازهای میکروبی و مخصوصاً باکتریایی شده است. به ویژه آنکه برخی از سویه­های میکروبی اکسترموفیل مانند آلکالوفیل­ها، ترموفیل­ها و هالوفیل­ها، منابعی ارزشمندی در جهت تولید پروتئازهای با خصوصیات منحصر به فرد محسوب می­گردند. با این وجود، از آن جایی که شرایط فیزیکوشیمیایی مورد نیاز در صنایع مختلف، در تکامل طبیعی پروتئازها وجود نداشته است، اغلب پروتئازها در این شرایط ناپایدار یا غیرفعال هستند (20). روشهای جهش­زایی هدفمند مکانی، یکی از روشهای پرطرفدار بهبود خصوصیات آنزیم یک سویه صنعتی است. در این روش، برخلاف روشهای تصادفی مانند روش تکامل هدایت شده (Directed evolution method)، نیاز به دانستن ژن و ساختار پروتئین مربوطه است (16). تاکنون تحقیقات بی شماری در ارتباط با جهش­زایی هدفمند مکانی پروتئازها، که پرکاربردترین آنزیم­های مورد استفاده در صنعت هستند، صورت گرفته است. در اغلب موارد، هدف از جهش­زائی هدفمند مکانی، افزایش پایداری آنزیم و همچنین تغییر در ویژگی و طیف سوبسترایی آنزیم بوده است  (10،17،18،20،23).  

در این مطالعه، به بررسی افزایش پایداری دمایی پروتئاز یک سویه نسبتاً هالوفیل به نام سالینی­ویبریو پروتئولیتیکوس AF-2004 (IBRC-M 10218) پرداخته شده است. به منظور آشنایی بیشتر با باکتری و پروتئاز آن، ابتدا به بررسی نتایج مطالعات گذشته پرداخته می­شود. جنس سالینی­ویبریو متعلق به خانواده ویبریوناسه، راسته ویبریونالس و رده گاماپروتئوباکتریا می­باشد. این باکتری، باسیل گرم­منفی خمیده، نسبتاً هالوفیل، بی­هوازی اختیاری، متحرک با یک فلاژله قطبی، بدون اسپور، اکسیداز منفی و کاتالاز مثبت است. بهینه رشد این سویه در دمای32-35 درجه سانتی گراد و در 5/8-8= pH و در حضور 10-5 درصد نمک کلرید سدیم اتفاق می­افتد. سویه AF-2004 قادر به رشد در عدم حضور نمک و همچنین در غلظت 20 درصد نمک نیست (5). لازم به ذکر است که ژن پروتئاز تولید شده توسط این سویه، از طریق ساخت کتابخانه ژنومی در سازه (وکتور) pBluescript و بررسی 10 هزار سلولهای ترنسفورم شده حاصله، بر روی محیط لوریا­برتانی آگار حاوی شیر بدون چربی و آمپی­سیلین یافت شد. تنها همسانه (کلون) دارای فعالیت پروتئازی از این کتابخانه ژنی، دارای قطعه‌ای حدود kb 6/3 بود که آنالیزهای ژنتیکی متعاقب بر روی این همسانه، نشان داد که این همسانه دارای یک قالب باز خواندن (ORF) به طول bp 1836 و در نتیجه آنزیمی دارای 611 اسید­آمینه است. همچنین در مطالعات گذشته، ژن کامل این آنزیم به منظور افزایش بیان پروتئاز، در سازه pQE-80L همسانه­سازی و به سویه اکلای (DE3) BL21ترنسفورم گردید. آنالیزهای پروتئینی صورت گرفته بر روی این آنزیم، مشخص کرده است که آنزیم بالغ دارای اسیدهای آمینه 200 تا 511 در ساختار خود می‌باشد و در واقع در طی فرآیند بلوغ خود آمینواسیدهای 199-1 انتهای N-ترمینال و آمینواسیدهای 611-512 انتهای C-ترمینال خود را از دست می دهد. در واقع آنزیم مربوطه، همانند دیگر پروتئازهای خانواده خود (خانواده متالوپروتئازهای M4)، ابتدا به صورت یک پروتئین غیرفعال ساخته شده و با برش در انتهای N-ترمینال و C-ترمینال خود، به صورت آنزیم فعال و بالغ در می‌آید. وزن مولکولی فرم بالغ این آنزیم که در هر دو انتهای N-ترمینال و C-ترمینال خود برش یافته است، حدود 34 کیلودالتون بوده و با توجه به نتایج SDS-PAGE آنزیمی مونومر است (14).

آنالیز توالی اسید­آمینه‌ای پروتئین حاصل از این ژن، نشان داد که آنزیم کد شده یک متالوپروتئاز حاوی روی (Zn) می­باشد و دارای یک موتیف محافظت شده زینک متالوپروتئازی است (HEXXH-E) که در خانواده M4 متالوپروتئازها (خانواده ترمولیزین) بسیار حفاظت شده است. ترمولیزین یک پروتئاز گرمادوست (ترموفیل) با کاربرد در صنعت به ویژه سنتز پپتید بوده و از باکتری باسیلوس ترموپروتئولیتیکوس به دست می آید (1و2). این موتیف (HEVSH) بین اسید آمینه 350-346 این آنزیم یافت می‌شود. همچنین نتایج آزمایشگاهی مطالعات قبلی نشان داده است که این آنزیم با چلاتورهای فلزات مانند EDTA (اتیل دی آمین تترا استات) و با چلاتور اختصاصی یون روی (Zn) یعنی 1و10-فنانترولین مهار می‌شود، اما با مهار کننده‌های سرین، سیستین و آسپارتیل پروتئازها مهار نمی­گردد. از طرفی فعالیت آنزیم با فسفورامیدون (phosphoramidon) که یک مهارکننده پپتیدی رقابتی برای پروتئازهای مشابه ترمولیزین است، مهار می‌گردد. بنابراین می­توان گفت پروتئاز سویه AF-2004، جز متالوپروتئازهای مشابه ترمولیزین می­باشد (7 و 14).

آنزیم پروتئاز سویه AF-2004، از  خود  پایداری  خوبی  در

غلظتهای مختلف نمک، pH قلیایی و در حضور حلالهای آلی نشان داده است. با این وجود، مطالعات پایداری دمایی متالوپروتئازهای خانواده M4 نشان داده است که ناحیه N-ترمینال پروتئازهای این خانواده پایدار نیست و با مطالعات مهندسی پروتئین، می­توان پایداری دمایی این پروتئازها را به نحو مؤثری تحت تاثیر قرار داد (11). بنابراین در این مطالعه سعی بر آن بوده است که اثر جهش زایی هدفمند مکانی در ناحیه N-ترمینال متالوپروتئاز سویه AF-2004 مورد بررسی قرار گیرد. بدین منظور، از بین آمینواسیدهای ناحیه N-ترمینال در فرم بالغ این آنزیم و با توجه به نتایج هم‍ردیفی توالی آنزیم مربوطه با دیگر اعضای خانواده M4، اثر جایگزینی آمینواسید آلانین 56 به ایزولوسین (A56I) بر پایداری دمایی این آنزیم مورد بررسی قرار گرفت.  

مواد و روشها

شرایط کشت و محیطهای کشت مورد استفاده: در این مطالعه، از محیط­کشت NZY+ براث، در مرحله جهش­زایی استفاده شد. برای تهیه یک لیتر از این محیط­کشت، به هیدرولیزه کازئین (g/L 10)، عصاره مخمر (g/L 5)،کلرید سدیم (g/L 10)،کلرید منیزیم M1 (mL 5/12)، سولفات منیزیم M1 (mL 5/12) و گلوکز 20 درصد (mL20) نیاز است. همچنین به منظور بهینه­سازی بیان آنزیم نوترکیب، از محیط­های کشت LB (لوریا برتانی)، YT (عصاره مخمر- تریپتون) و TB (Terrific broth) استفاده شد. (21).

ژن و توالی اسید آمینه ای پروتئاز مورد بررسی: شماره دستیابی به توالی ژن و توالی پروتئینی آنزیم مورد مطالعه، در سایت NCBI به ترتیب برابر با DQ908958 و ABI93183 می­باشد. همچنین توالی پروتئینی آنزیم در سایت EXPASY با شماره دستیابی Q06DP6 یافت می‌شود. در شکل 1، توالی اسیدآمینه­ای و جایگاههای مربوط به برش آنزیم نابالغ و همچنین جایگاه فعال آنزیم و توالی سیگنال پپتید نشان داده شده است.

پیشگویی ساختار سه بعدی آنزیم پروتئاز: ساختار دوم پروتئین با استفاده از سرور swiss model پیش بینی شد. به منظور شبیه­سازی مدل سه بعدی آنزیم پروتئاز مورد مطالعه، از سرورهای مختلف (swiss model و phyre2) و نرم افزار (Modeller) استفاده شد. در میان پروتئازهای مشابه که ساختار سه بعدی آنها در پایگاههای اطلاعاتی مربوطه موجود بود، آنزیم الاستاز سودوموناس آئروژینوزا (PDB code = 1EZM) به عنوان الگوی ساختاری انتخاب شد. شباهت 61 درصدی بین توالی این دو آنزیم تایید می‌کند که احتمالاً مدل سه­بعدی به دست آمده، دارای درجه اطمینان بالا به منظور استفاده در آنالیزهای بیوانفورماتیکی بعدی است. سپس ساختار به دست آمده با استفاده از سرور Procheck ارزیابی گردید.

آنالیزهای بیوانفورماتیک و طراحی پرایمر برای ایجاد جهش: توالی متالوپروتئاز باکتری سالینی­ویبریو پروتئولیتیکوس با متالوپروتئازهای ترموفیل (ترمولیزین، پروتئاز مشابه ترمولیزین باسیلوس استئاروترموفیلوس)، ساکروفیل (ویبریولیزین­های MCP-02 و E495) و مزوفیل (پسودولیزین) هم خانواده خود که پایداری دمایی متفاوتی داشتند، هم‍ردیفی شد. از روی نتایج هم­ردیفی، جهش A56I انتخاب گردید. همچنین اثر جهش بر پایداری دمایی آنزیم پروتئاز، با استفاده از سرورهای بیوانفورماتیکی گوناگون (Eris، PoPMuSiC، HoT MUSiC و Maestro) مورد بررسی قرار گرفت.

 سپس پرایمرهایی که باعث ایجاد جهش­زایی هدفمند مکانی در موقعیت 56 آنزیم به ایزولوسین می‌شدند، به صورت دستی طراحی شدند (جدول 1). موقعیت اتصال پرایمرها و جهش ایجاد شده در توالی نوکلئوتیدی ژن پروتئاز مورد بررسی، در شکل 2 نشان داده شده است.  در نهایت، پرایمرهای طراحی شده از نظر دمای Tm، GC clamp، G+C%، تشکیل ساختار ثانویه سنجاق سری، تشکیل دایمر پرایمر با  خودش  و  با  پرایمر  دیگر،  مورد

ارزیابی قرار گرفتند.

 

 

شکل 1- توالی پروتئینی پروتئاز سویه سالینی­ویبریو پروتئولیتیکوس AF-2004. محل سیگنال پپتید به صورت حروف غیرپررنگ و زیرخط دار، آمینواسیدهای موجود در فرم بالغ آنزیم (آمینواسیدهای 511-200) به صورت پررنگ شده، جایگاه فعال آنزیم به صورت حروف بزرگتر، پررنگ و همچنین به صورت زیرخط دار نشان داده شده است.

جدول 1- ویژگی‌های پرایمرهای جهش­زای استفاده شده در روش جهش زایی  وابسته به جایگاه. کدون جهش یافته به صورت حروف پررنگ و زیرخط دار نشان داده شده است

Tm

(°C)

طول پرایمر (نوکلئوتید)

توالی پرایمر

نام پرایمر

4/68

41

CGGCACATCAGGCACCAACATCTTTACGTACCCATGTCCAG

A54I-F

4/68

41

CTGGACATGGGTACGTAAAGATGTTGGTGCCTGATGTGCCG

A54I-R

 

 

جهش­زائی هدفمند مکانی: سازه حاوی توالی DNA ژن پروتئاز سویه AF-2004، توسط دکتر حمیدرضا کربلائی حیدری فراهم شد (14). به منظور ساخت رشته جهش یافته، ابتدا سازه استخراج شده باکتری (کیت استخراج پلاسمید Thermo Scientific K0502)، با استفاده از پرایمرهای جهش­زا ، PCR شد. مواد مورد نیاز PCR برای انجام واکنش µL 50 شامل بافر PCR ×10 (µL 5)، DNA با غلظت ng 50-5 (µL 5/0)، هر کدام از پرایمرها با غلظت pmol10 (µL 1)، مخلوط dNTP (µL 5) و آنزیم PfuTurbo DNA polymerase  با غلظت U/µL 5/2 (µL 1) می­باشد. برنامه PCR شامل مراحل دناتوراسیون اولیه (95 درجه سانتی گراد، 30 ثانیه، 1 سیکل)، و 16 سیکل از دناتوراسیون (95 درجه سانتی گراد، 30 ثانیه)، اتصال پرایمر (55 درجه سانتی گراد، 60 ثانیه) و سنتز (68 درجه سانتی گراد، 7 دقیقه) تنظیم گردید.

 

 

 

شکل 2- محل اتصال پرایمرهای طراحی شده برای ایجاد جهش به توالی ژنی پروتئاز سالینی ویبریو پروتئولیتیکوس. محل اتصال پرایمر به ژن پروتئاز سالینی ویبریو پروتئولیتیکوس در شکل با حروف پررنگ و محصور در کادر نشان داده شده است. محل جهش در پرایمرهای طراحی شده به صورت زیرخط دار  مشخص شده است. کدون آلانین 56 در آنزیم بالغ (با کدون GCG) با کدون ایزولوسین (با کدون ATC) در پرایمرها تغییر یافته است.

 

برای انجام جهش­زایی هدفمند مکانی از پروتکل کیت Quick change Site Directed Mutagenesis (Stratagene Cat No. 200519) استفاده شد. اساس کار این کیت به این صورت است که با استفاده از آنزیم محدود الاثر Dpn I، رشته DNA قدیمی که حاوی جهش مورد نظر نیست، به دلیل متیله بودن، توسط این آنزیم برش می‌خورد و در نتیجه تنها رشته DNA که دچار جهش شده به صورت دست­نخورده باقی­مانده و با ترنسفورماسیون آن به سلول اکلای، شکاف موجود در رشته‌ها بر طرف خواهد شد. سویه میکروبی مورد استفاده در این کیت، سویه اکلای XL1-Blue می­باشد.  

ترنسفورماسیون و بهینه­سازی بیان آنزیم جهش یافته: به منظور ترنسفورماسیون سازه حاوی ژن جهش یافته یا طبیعی پروتئاز مورد مطالعه، به سلولهای میزبان باکتریایی، از روش کلرید کلسیم و شیفت دمایی(تغییر ناگهانی دما) استفاده شد. سلولهای ترنسفورم شده حاصله، بعد از تأیید توسط تعیین توالی ژن، ابتدا از نظر بیان تولید پروتئاز بر روی پلیتهای LB آگار حاوی آمپی­سیلین و 2 درصد شیر بدون چربی بررسی شدند. یک پلیت نیز از سویه بدون سازه به عنوان شاهد یا کنترل کشت داده شد. سپس به منظور افزایش بیان آنزیم نوترکیب، چه در سویه طبیعی و چه در سویه جهش یافته، آزمایشهای مختلفی صورت پذیرفت. این آزمایشات شامل بررسی زمان انکوباسیون  بعد از القاء ( 1، 2، 4، 5 و 24 ساعت بعد از القاء)، افزودن غلظتهای مختلف IPTG به عنوان القاگر بیان (mM 1-5/0-2/0-1/0-0)، افزودن لاکتوز 3 درصد همراه با IPTG، کاهش دمای انکوباسیون بعد از القا (30 درجه سانتی گراد)، استفاده از محیطهای کشت مختلف (مانند محیطهای LB، TB و YT)، استفاده از سویه‌های بیانی مختلف از اکلای (مانند سویه‌های XL1-Blue، BL21(DE3) pLysS و Top10) می‌باشد. ژن آنزیم پروتئاز سویه AF-2004، در سازه بیانی pQE80L وارد شده است.

SDS-PAGE و زیموگرافی: تکنینک SDS-PAGE بر اساس پروتکل موجود در منبع ذکر شده انجام گردید (21). از آن جایی که آنزیم مورد مطالعه در حضور 10 درصد SDS کاهش فعالیت از خود نشان نداد، در این مطالعه از روش زیموگرافی در حضور SDS و با افزودن کازئین 65/0درصد در ژل به منظور قدرت تفکیک بهتر استفاده شد (15). همچنین لازم به ذکر است که در نمونه زیموگرافی استفاده از مارکر پروتئینی به دلیل عدم فعالیت پروتئازی باندهای پروتئینی آن استفاده نمی­گردد. در این حالت در ژل الکتروفورز عمودی حاوی دو جایگاه، ژل مربوط به SDS-PAGE و ژل زیموگرافی به صورت همزمان تحت تأثیر شرایط و محلول بافری یکسان اجرا می شوند. بعد از اتمام الکتروفورز و مرحله رنگ آمیزی، دو ژل در کنار هم قرار داده شده و وزن مولکولی باند مربوط به آنزیم در ژل زیموگرافی با باند مرتبط در ژل SDS-PAGE  و مارکر پروتئینی آن مقایسه و تخمین زده می شود.

خالص­سازی پروتئاز از ژل پلی­آکریل­آمید: برای خالص­سازی پروتئین از ژل پلی­آکریل­آمید، ابتدا نیاز است که یک زیموگرافی از پروتئین مورد نظر صورت گیرد. بعد از رنگبری ژل زیموگرافی، محل آنزیم با استفاده از تیغ برش یافت و قطعات برش یافته درون میکروتیوب قرار داده شد. سپس به هر میکروتیوب، mL 1 بافر حاوی Tris-HCl (mM 50)، NaCl  (mM 150) و EDTA  (mM 1/0) اضافه گردید. قطعات ژل با استفاده از سر سپملر خرد شدند و میکروتیوب در انکوباتور شیکردار در دمای 30 درجه سانتی گراد و دور rpm 150 به صورت شبانه نگهداری شد. به منظور جداسازی پروتئین از باقیمانده ژل بعد از گذشت انکوباسیون شبانه، سانتریفیوژ در دور ×g 7378 به مدت 10 دقیقه صورت گرفت. سوپرناتانت حاصله به میکروتیوب جدیدی انتقال یافت و حضور پروتئین و فعالیت داشتن آن، با استفاده از تست بردفورد و انجام مجدد زیموگرافی تأیید شد (21).

سنجش فعالیت آنزیمی و بررسی پایداری دمایی: به منظور سنجش فعالیت آنزیمی، بعد از طی زمان مناسب حداکثر تولید آنزیم (24 ساعت بعد از انکوباسیون)، محیط­کشت باکتری برداشت شده و سانتریفیوژ (×g 7378 ،10 دقیقه، 4 درجه سانتی گراد) گردید تا سوپرناتانت به دست آمده به عنوان عصاره خام آنزیم مورد استفاده قرار گیرد. برای اندازه گیری فعالیت آنزیم پروتئاز از روش معرف فولین­سیوکالتو مطابق منبع ذکر شده استفاده شد.

بنا به تعریف، یک واحد فعالیت آنزیمی (U/mL) به مقداری از آنزیم گفته می­شود که قادر است یک میکروگرم تیروزین را در عرض یک دقیقه تحت شرایط واکنش از پروتئین آزاد سازد (8).

به منظور بررسی پایداری دمایی آنزیم جهش یافته و طبیعی، ابتدا آنزیمهای جهش یافته و طبیعی  در بازه­های زمانی مختلف (5، 10، 15 و 20 دقیقه) در بن ماری 70 درجه سانتی گراد قرار گرفته و سپس فعالیت آنزیم در دمای 37 درجه سانتی گراد مورد بررسی قرار گرفت.

آنالیز­های آماری: تمامی آزمایشات به منظور بررسیهای آماری به صورت سه تکرار انجام شدند. نتایج به دست آمده با استفاده از آنالیز واریانس و تست Duncan’s multiple range توسط نرم افزار SPSS مورد بررسیهای آماری قرار گرفتند. زمانی تفاوت نتایج از نظر آماری معنادار گزارش شد که value -pبه دست آمده کمتر از 05/0 باشد.

نتایج

مدل سه­بعدی پروتئاز: از آن­جایی که ساختار پروتئین توسط کریستالوگرافی اشعه ایکس یا رزونانس مغناطیسی هسته­ای تعیین نشده است، الزاماً برای داشتن دید کلی در مورد ساختار سه­بعدی آنزیم و جهش­زائی آن، از روشهای همولوژی مدلینگ سرورهای Swiss model و Phyre2 و همچنین نرم افزار Modeller استفاده شد. در میان پروتئازهای مشابه که ساختار سه بعدی آنها موجود بود، آنزیم الاستاز سودوموناس آئروژینوزا (PDB code = 1EZM) تنها آنزیم دارای ساختار سه بعدی تعیین شده بود که بالاترین شباهت را از نظر توالی آمینواسیدی با پروتئاز مورد مطالعه داشت و بنابراین به عنوان الگوی ساختاری انتخاب شد. ارزیابی مدلهای مختلف به دست آمده توسط سرور Procheck و بر اساس نمودار راماچاندران (Ramachandran) نشان داد که یکی از مدلهای به دست آمده دارای درصد بالاتری از آمینواسیدهایی قرار گرفته در مناطق مجاز بوده (6/99 درصد) و بنابراین از این مدل سه بعدی در آنالیزهای بعدی استفاده گردید (شکل 3).

 

 

شکل 3- ساختار سه بعدی آنزیم پروتئاز سویه سالینی­ویبریو پروتئولیتیکوس  AF-2004 با استفاده از نرم افزار Swiss PDB view. محل جهش (A56I) در N-ترمینال پروتئین مشخص شده است. آمینواسید­های His147, His 151, Glu 148, Glu 171 در فرم بالغ آنزیم، آمینواسیدهای کاتالیتیکی آنزیم می­باشند.

 

با توجه به این شکل و همانطور که در مطالعات قبلی نیز در مورد ساختار پروتئاز خانواده‌های M4 گزارش شده است، آنزیم یک ساختار دو دومینی دارد که جایگاه فعال بین دو دومین N-ترمینال و C-ترمینال قرار گرفته است. یون روی (Zn) و آمینواسید­های His147, His 151, Glu148, Glu 171  مشخص شده در شکل، جایگاه فعال آنزیم را تشکیل می­دهند. همانطور که در این شکل مشاهده می­شود، دومین N-ترمینال بیشتر دارای صفحات بتا می­باشد، در حالی که در C-ترمینال بیشتر ساختارهای دوم هلیکس یا مارپیچی مشاهده می­شود. موتیف اتصال به اتم روی، یعنی HEXXH در دومین N-ترمینال و لیگاند سوم اتصال به اتم روی یعنی Glu171 در دومین C-ترمینال قرار گرفته است.

آنالیزهای بیوانفورماتیکی پایداری دمایی: نتایج آنالیزهای بیوانفورماتیکی جهش A56I توسط سرورهای مختلف در جدول 2 به نمایش درآمده است. GΔΔ به تغییرات در انرژی آزاد گیبس و ΔTm به تفاوت دمای ذوب بین آنزیم جهش یافته و طبیعی اشاره دارد. بنابراین، منفی بودن عدد GΔΔ و مثبت بودن عدد ΔTm به پایدارتر شدن آنزیم جهش یافته نسبت به آنزیم طبیعی  اشاره دارد.    

با توجه جدول 2، تمام سرورهای بیوانفورماتیکی افزایش پایداری آنزیم جهش یافته را تأیید می­کردند. با این وجود همانطور که در این جدول مشاهده می گردد، از سرورهای بیوانفورماتیکی که نتایج آنالیز خود را به طور مشابه و بر اساس GΔΔ (Kcal/mol) گزارش کرده اند (سرورهای Eris ، PoPMuSiC و Maestro)، سرور Eris بالاترین میزان پایداری دمایی را بعد از انجام جهش در آلانین 56 نشان داده است. این موضوع ضرورت استفاده از چندین سرور مختلف و مقایسه نتایج آنها را خاطر نشان می کند. 

جدول 2- نتایج آنالیز سرورهای مختلف بیوانفورماتیکی در مورد اثر جهش A56I در افزایش پایداری دمایی پروتئاز سویه سالینی­ویبریو پروتئولیتیکوس.

سرور

نتیجه آنالیز

نتیجه گیری

Eris

ΔΔG= -64/14 Kcal/mol

افزایش پایداری

PoPMuSiC

ΔΔG= -79/0 Kcal/mol

افزایش پایداری

HoTMuSiC

ΔTm= 91/0 °C

افزایش پایداری

Maestro

ΔΔG= 284/0- Kcal/mol

افزایش پایداری

ترنسفورماسیون ژن پروتئاز جهش یافته: ترنسفورماسیون سازه حاوی ژن جهش یافته پروتئاز مورد مطالعه، به سلولهای XL1-Blue، 14 کلونی نتیجه داد که از بین این کلونیها، مواردی که کلونیهای ماهواره در اطراف خود نداشتند (کلونی 1و 7) برای تعیین توالی انتخاب شدند. تمامی کلونیهای به دست آمده در گلیسرول 30 درصد ذخیره­سازی شده و از بین آنها، کلونی 1 که نتیجه تعیین توالی آن تأیید شده بود، برای کارهای بعدی مورد استفاده قرار گرفت. بررسی ابتدایی تولید پروتئاز در محیط­کشت آگاردار حاوی 2 درصد شیر بدون چربی، نشان داد که پروتئاز به خوبی توسط سویه جهش یافته و طبیعی در مقایسه با سویه بدون سازه، تولید می­شود.  

بهینه­سازی بیان: نتایج اولیه در بهینه­سازی بیان آنزیم نوترکیب، به قرار زیر است. از میان محیطهای کشت مورد بررسی، بهترین مورد، محیط­کشت TB بوده است. افزودن لاکتوز 3 درصد به همراه IPTG، اثری بر افزایش بیان آنزیم نداشت. بهترین سویه میزبان بیانی، اکلای BL21 (DE3) pLysS می­باشد. بیان در سویه XL1-Blue پایین بوده و تفاوت چشمگیری بین قبل و بعد از القاء مشاهده نشد. از میان غلظتهای مختلف IPTG غلظت mM1 بهترین اثر را بر بیان آنزیم داشته است. همچنین کاهش دمای انکوباسیون از 37 به 30 درجه سانتی گراد بعد از القا اثر چشمگیری بر بیان آنزیم مورد نظر نداشت.

بیان آنزیمهای طبیعی  و جهش یافته در زمانهای مختلف یعنی قبل از القاء، 4 ساعت بعد از القاء و 24 ساعت بعد از القاء با استفاده از IPTG mM1 مورد بررسی قرار گرفت و نتایج مربوط به SDS-PAGE و زیموگرافی آن در شکلهای 4 و5 به نمایش گذاشته شده است. لازم به ذکر است در شکلهای 4 و5 سویه میزبانی اکلای BL21 (DE3) pLysS ، محیط­کشت TB، دمای انکوباسیون 37 درجه سانتی گراد و سرعت همزنی rpm 150 استفاده شده است.

نتایج زیموگرافی بیان آنزیم نوترکیب در سازه بیانی pQE80L در مقایسه با سویه کنترل حاوی سازه pQE80L بدون ژن موردنظر (نمونه شماره 5) تأیید می‌کند که سویه میزبان، آنزیم مورد مطالعه را بیان کرده است. همچنین افزایش فعالیت آنزیم نوترکیب بعد از القاء با IPTG، با توجه به هاله­های شفاف­تر ایجاد شده در نمونه­های 4-3 و 9-6 نسبت  به  نمونه­های 2 و 1  نیز  مؤید  این  موضوع

می­باشد.

 

 

شکل 4- نتایج SDS-PAGE بهینه­سازی بیان پروتئاز نوترکیب سویه سالینی ویبریوپروتئولیتیکوس در سازه pQE80L در زمان­های مختلف بعد از القا با IPTG mM1. ستون 1 (مارکر پروتئین، وزن مولکولی بر حسب کیلودالتون)، ستون 2 (آنزیم طبیعی، قبل القا)، ستون 3 (آنزیم جهش یافته، قبل القا)، ستون 4 (آنزیم طبیعی، 4 ساعت بعد القا)، ستون 5 (آنزیم جهش یافته، 4 ساعت بعد القا)، ستون 6 (سویه کنترل حاوی سازه pQE80L بدون ژن موردنظر، 24 ساعت بعد القا)،  ستون 7 (آنزیم طبیعی، 24 ساعت بعد القا)،  ستون 8 (آنزیم جهش یافته، 24 ساعت بعد القا).

 

شکل 5- نتایج زیموگرافی بیان پروتئاز نوترکیب سویه سالینی ویبریوپروتئولیتیکوس در سازه pQE80L در زمانهای مختلف بعد از القاء با IPTG mM1. ستون 1 (آنزیم طبیعی، قبل القاء)، ستون 2 (آنزیم جهش یافته، قبل القاء)، ستون 3 (آنزیم طبیعی،  4 ساعت بعد القاء)، ستون 4 (آنزیم جهش یافته، 4 ساعت بعد القاء)،  ستون 5 (سویه کنترل حاوی سازه pQE80L بدون ژن موردنظر، 24 ساعت بعد القاء)،  ستون 6 و 7 (آنزیم طبیعی، 24 ساعت بعد القاء)،  ستون 8 و 9 (آنزیم جهش یافته، 24 ساعت بعد القاء).

 

بررسی پایداری آنزیم جهش یافته: نتایج بررسی فعالیت و پایداری دمایی آنزیم طبیعی  و جهش یافته در شکل 6 به صورت درصد فعالیت باقی­مانده  نسبت به کنترل، آورده شده است. با توجه به نتایج به دست آمده می‌توان گفت جهش A56I در آنزیم مورد مطالعه منجر به افزایش پایداری دمایی این آنزیم شده است. از طرفی آنزیم جهش یافته نسبت به آنزیم طبیعی  در حالت بدون تیمار حرارتی، فعالیت بیشتری از خود نشان داده است. تیمار آنزیم در دمای 70 درجه سانتی گراد به مدت 20 دقیقه منجر به از دست دادن حدود 42 درصد از فعالیت آنزیم طبیعی  و 24 درصد از فعالیت آنزیم جهش یافته شده است. بنابراین می­توان نتیجه گرفت که آنزیم جهش یافته پایداری دمایی بهتری نسبت به آنزیم طبیعی  از خود نشان داده است. از طرفی، فعالیت آنزیم جهش یافته نسبت به آنزیم طبیعی حدود 11 درصد بهبود یافت.

بحث و نتیجه­گیری

برخلاف پروتئازهای جداسازی شده از سویه­های بسیار هالوفیل که برای فعالیت و پایداری خود نیازمند غلظتهای بالای نمک می­باشند و در حضور غلظتهای پایین نمک قادر به فعالیت نیستند، آنزیمهای سویه­های نسبتاً هالوفیل، این مزیت را دارند که حتی در عدم حضور نمک فعالیت و پایداری خود را حفظ نمایند و بنابراین کاندیدهای مناسب­تری برای استفاده در صنعت می­باشند (13).

 

 

شکل 6- فعالیت و پایداری دمایی آنزیم پروتئاز طبیعی  و جهش یافته A56I سویه سالینی ویبریوپروتئولیتیکوس. نتایج بر اساس درصد فعالیت باقی­مانده نسبت به آنزیم طبیعی  بیان شده است.

 

آنزیم زینک متالوپروتئاز تولید شده توسط سویه نسبتا هالوفیل سالینی­ویبریو پروتئولیتیکوس به دلیل تحمل رنج وسیعی از غلظتهای نمک (M 4-0)، پایداری در pH قلیایی (10-5/8) و در حضور حلالهای آلی، می­تواند کاندید مناسبی در صنایع مختلف از جمله صنایع شیمیایی سنتزی باشد (4و 9). با این وجود، پایداری دمایی نیز از خصوصیت کلیدی موردنیاز پروتئازهای صنعتی است. در صورتی پروتئاز مورد استفاده در صنعت، از پایداری دمایی مناسب برخوردار نباشد، دمای بالا می‌تواند میانکنشهای غیرکووالان درون یک پروتئین تا خورده را از بین برده و منجر به از بین رفتن تاخوردگی پروتئین و در نتیجه عدم کارآیی آن شود (18). بنابراین در این مطالعه، به بهبود پایداری دمایی این آنزیم با استفاده از تکنیک جهش زایی  هدفمند مکانی پرداخته شده است.

مطالعات گذشته نشان داده است که ایجاد جهش در یک یا چند آمینواسید در  پروتئاز سالینی ویبریوپروتئولیتیکوس  می تواند منجر به افزایش پایداری دمایی آنزیم مربوطه گردد. در مطالعه Badoei-Dalfard و همکاران (2010) مشخص شد که جهشهای G203D،  A268P و  A268P/A195Eمی توانند منجر به افزایش پایداری دمایی آنزیم در حضور حلالهای آلی مختلف (متانول، ایزوپروپانول، n-پروپانول و دی متیل فورمامید) گردند. تمامی این جهش در لوپهای سطحی، برخی در نزدیکی (A195E و G203D) و برخی دور از جایگاه فعال آنزیم (A268P) قرار داشتند (6). نتایج مطالعات Asghari و همکاران (2010 و 2011) نشان داد که جهش همزمان در 4 آمینواسید پروتئاز سالینی ویبریوپروتئولیتیکوس (V189P/ A195E/G203D/A268P) منجر به افزایش پایداری آنزیم مربوطه می شود. علت این امر  به اتصال محکم تر آنزیم جهش یافته به کلسیم، نسبت به آنزیم طبیعی  بوده است. علاوه بر افزایش پایداری دمایی، آنزیم جهش یافته مذکور، پایداری بیشتری را در برابر اتولیز، pH و حلالهای آلی نیز از خود نشان داده است (3 و4).  

در مطالعه حاضر، انتخاب جهش افزایش دهنده پایداری دمایی، بر اساس هم‍ردیفی توالی آن با پروتئازهای هم خانواده خود که دارای پایداری دمایی متفاوتی بودند و بر مبنای نتایج مطالعات Eijsink و همکاران (1995) که در مورد پروتئازهای متعلق به خانواده M4 صورت گرفته است، می باشد. نتایج Eijsink و همکاران نشان داد که در پروتئازهای این خانواده،  لوپهای ناحیه N-ترمینال نسبت به نواحی داخلی پروتئین و C-ترمینال، در برابر تغییرات دمایی بسیار حساس بوده و احتمالاً زودتر از بقیه نواحی آنزیم از حالت طبیعی خود خارج می‌شوند (11). به علاوه، در مطالعه قبلی بر روی متالوپروتئاز باکتری سالینی­ویبریو پروتئولیتیکوس با تبدیل اسید آمینه آلانین 56 به پرولین (A56P) و اسید آمینه ترئونین73 به فنیل آلانین (T73F) پایداری دمایی این پروتئاز افزایش یافته است. با این حال جهش A56P اثر کمی بر پایداری دمایی داشت (22). با توجه به هم‍ردیفی توالی متالوپروتئاز باکتری سالینی ویبریو پروتئولیتیکوس با متالوپروتئازهای ترموفیل هم خانواده خود، در موقعیت 73 فنیل آلانین و در موقعیت 56 ایزولوسین وجود داشته است. بنابراین در این مطالعه، به جای جایگزینی آلانین 56 به پرولین (A56P)، اثر جایگزینی آلانین 56 به ایزولوسین (A56I) بر پایداری دمایی آنزیم مورد بررسی قرار گرفت. به منظور اطمینان بیشتر از سرورهای بیوانفورماتیکی مختلف (Eris، PoPMuSiC، HoT MUSiC، Maestro) جهت بررسی اثر این جهش در پایداری دمایی آنزیم مربوطه استفاده شد. لازم به ذکر است که نتایج سرورهای Eris، PoPMuSiC و Maestro بر مبنای اختلاف تغییرات انرژی آزاد گیبس (ΔΔG) می­باشد. از آن جایی که این کمیت ترمودینامیکی، میزان خودبه‌خودی انجام شدن یک واکنش و پایدار بودن محصول را نشان می‌دهد، بنابراین منفی بودن آن موید این است که آنزیم جهش یافته پایداری دمایی بیشتری نسبت به آنزیم طبیعی دارد (9). در حالی که نتایج سرور HoT MUSiC بر مبنای اختلاف دمای ذوب (Tm) آنزیم جهش یافته و طبیعی  می باشد. به عبارت دیگر، به اختلاف دمایی که درآن نیمی از آنزیمها در فرآیند باز شدن ساختار پروتئین (Unfolding) قرار می­گیرند، اشاره دارد. بنابراین مثبت بودن این عدد اشاره دارد که باز شدن فولدینگ آنزیم جهش یافته در دمای بالاتری نسبت به آنزیم وجشی صورت می­گیرد و در نتیجه پایداری دمایی بیشتری دارد (19). نتایج تمامی سرورهای مورد بررسی در این مطالعه، اثر مثبت جهش A56I در پایداری دمایی آنزیم متالوپروتئاز سالینی ویبریو پروتئولیتیکوس را تأیید نمود. نتایج آزمایشگاهی این مطالعه نیز افزایش پایداری دمایی آنزیم متالوپروتئاز باکتری سالینی ویبریو پروتئولیتیکوس جهش یافته را تأیید نمود.

جهش­زایی در ژن مورد بررسی، با استفاده از PCR توسط پرایمرهای جهش­زا و سپس برش رشته قدیمی و طبیعی  DNA با استفاده از آنزیم محدود الاثر Dpn I، صورت گرفت. در نهایت ژن جهش یافته، به سویه­های مختلف بیانی اکلای ترنسفورم شد تا بیان و پایداری آنزیم مورد بررسی قرار گیرد. لازم به ذکر است که برخلاف سازه بیانیpQE-30L که در آن ژن پروتئین رپرسور lac (مهارکننده اپرون لاکتوز) به صورت ترانس در پلاسمید pREP4 موجود است و باید از سویه­های بیانی خاص حاوی پلاسمید pREP4 استفاده کرد (مانند اکلای M15  وSG13009)، سازه بیانی pQE80L دارای رپرسور lac به صورت سیس بوده و ژن وارد شده در آن می­تواند توسط هر نوع سویه میزبانی اکلای بیان گردد (24). بر اساس نتایج بهینه­سازی بیان آنزیم نوترکیب، بیشترین میزان بیان آنزیم توسط سویه BL21 (DE3) pLysS و در محیط­کشت TB، دمای 37 درجه سانتی گراد، زمان انکوباسیون 24 ساعت بعد القاء و با استفاده از غلظت  IPTG برابر با mM  1 به دست آمد. این در حالی است که در مطالعه بیگی و همکاران (2012) بالاترین میزان بیان این آنزیم که با استفاده از روش شناسی پاسخ سطح به دست آمده است برابر با غلظت IPTG برابر با mM 0089/0 و دمای 30 درجه سانتی گراد می­باشد. همچنین در مطالعه بیگی و همکاران (2012) بیان شد غلظت بالاتر IPTG منجر به کاهش بیان آنزیم می­گردد (7). با این وجود در مطالعه حاضر، بیان آنزیم با استفاده از شرایط بهینه شده توسط مطالعه Beigi و همکاران (2012) به میزان بسیار کمتری مشاهده شد. این موضوع به اهمیت بهینه­سازی شرایط بیان آنزیم نوترکیب در هر کار تحقیقاتی مجزا اشاره دارد (7).

همچنین لازم به ذکر است که با توجه به نتایج مربوط به ژل SDS-PAGE (شکل 4) وزن مولکولی به دست آمده برای پروتئاز نوترکیب حدود 5/66 کیلودالتون بوده است و این در حالی است که مطالعات قبلی صورت گرفته وزن مولکولی این پروتئاز را 34 کیلودالتون گزارش کرده اند (14). در توضیح باید گفت وزن مولکولی گزارش شده در مطالعه کربلائی حیدری و همکاران (2008) مربوط به فرم بالغ این آنزیم است یعنی آنزیم پروتئازی که در هر دو انتهای N-ترمینال و C-ترمینال خود برش یافته است (برش پروتئولیتیک که آنزیم در گذر به فرم بالغ خود متحمل می شود). از طرفی وزن مولکولی بیان شده توسط دکتر کربلائی حیدری و همکاران با استفاده از اسپکتروفتومتری جرمی و بر روی آنزیم خالص صورت گرفته است (14). در حالی که وزن مولکولی گزارش شده در مطالعه حاضر با استفاده از SDS-PAGE و بر روی آنزیمی که از بلافاصله از سویه بیانی به دست آمده و هنوز خالص سازی نشده است، می باشد. با توجه به وزن 5/66 کیلودالتون  به دست آمده، می توان این طور نتیجه گرفت که آنزیم تولید شده توسط سویه بیانی در ابتدای مسیر بلوغ خود قرار دارد و به صورت فرم نابالغ و دارای حدود 611 آمینواسید است و هنوز متحمل برش پروتئولیتیک در دو انتهای خود نشده است.

در مجموع نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که جایگزینی آلانین 56 به ایزولوسین منجر به بهبود فعالیت و پایداری دمایی در آنزیم متالوپروتئاز باکتری سالینی­ویبریو پروتئولیتیکوس شد. بنابراین روش هم‍ردیفی چندگانه و جهش زایی هدفمندمکانی با استفاده از آنزیم DpnI به ترتیب در انتخاب جهش مؤثر و تغییر در توالی پروتئینی پروتئاز مورد مطالعه مفید واقع شد. به علاوه، نتایج زیموگرافی سویه‌ها نشان دهنده حضور آنزیم پروتئاز در سویه‌های نوترکیب و عدم حضور آن در سویه فاقد سازه بودند. بنابراین تکنیک زیموگرافی به همراه تکنیک SDS-PAGE می تواند در نشان دادن فعالیت آنزیم بعد از انجام جهش زایی مفید باشد.

تقدیر و تشکر: نویسندگان مقاله از دکتر حسین محمدیان به دلیل رهنمودهایشان کمال تشکر را دارند.  

  1. صدرممتاز، افسانه. و اصغری، سید محسن. 1394. مطالعات مقایسه‌ای مقاومت پروتئازحاصل ازسودوموناس آئروجینوزا در مقایسه با ترمولیزین حاصل از باسیلوس ترموپروتئولیتیکوس در حلال‌های آلی. پژوهش‌های سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران); 28(4): 560-567.
  2. وارسته، عبدالعلی.، اصغری، سید محسن.، تقدیر، مجید.، آقا معالی، محمود رضا.، پاژنگ، محمد.، مهرنژاد، فرامرز. 1396. اثر کلسیم بر فعال سازی ترمولیزین توسط نمک. پژوهش‌های سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران); 30(1): 100-105.

 

  1. Asghari, S. M., Pazhang, M., Ehtesham, S., Karbalaei-Heidari, H. R., Taghdir, M., Sadeghizadeh, M., ... & Khajeh, K. 2010. Remarkable improvements of a neutral protease activity and stability share the same structural origins. Protein Engineering, Design & Selection, 23(8), 599-606.
  2. Asghari, S. M., Khajeh, K., Dalfard, A. B., Pazhang, M., & Karbalaei-Heidari, H. R. 2011. Temperature, organic solvent and pH stabilization of the neutral protease from Salinovibrio proteolyticus: significance of the structural calcium. BMB reports, 44(10), 665-668.
  3. Amoozegar, M.A., Schumann, P., Hajighasemi, M., Fatemi, A.Z., and Karbalaei-Heidari, H.R. 2008. Salinivibrio proteolyticus nov., a moderately halophilic and proteolytic species from a hypersaline lake in Iran. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 58, 1159-1163.
  4. Badoei-Dalfard, A., Khajeh, K., Asghari, S.M., Ranjbar, B., and Karbalaei-Heidari, H.R. 2010. Enhanced activity and stability in the presence of organic solvents by increased active site polarity and stabilization of a surface loop in a metalloprotease. Journal of Biochemistry. 148, 231-238.
  5. Beigi, L., Karbalaei-Heidari, H.R., and Kharrati-Kopaei, M. 2012. Optimization of an extracellular zinc-metalloprotease (SVP2) expression in Escherichia coli BL21 (DE3) using response surface methodology. Protein Expression and Purification. 84, 161-166.
  6. Cupp-Enyard, C. 2008. Sigma's non-specific protease activity assay-casein as a substrate. Journal of Visualized Experiments. 19, 890-899.
  7. Dehouck, Y., Kwasigroch, J. M., Gilis, D., & Rooman, M. 2011. PoPMuSiC 2.1: a web server for the estimation of protein stability changes upon mutation and sequence optimality. BMC Bioinformatics, 12(1), 151.
  8. Eijsink, V.G., van der Zee, R., van den Burg, B., Vriend, G., and Venema, G. 1991. Improving the thermostability of the neutral protease of Bacillus stearothermophilus by replacing a buried asparagine by leucine. FEBS Letters. 282, 13-16.
  9. Eijsink, V.G., Veltman, O.R., Aukema, W., Vriend, G., and Venema, G. 1995. Structural determinants of the stability of thermolysin-like proteinases. Nature Structural & Molecular Biology. 2, 374-379.
  10. Haki, G. D. and Rakshit S. K. 2003. Developments in industrially important thermostable enzymes: a review. Bioresource Technology. 89(1): 17-34.
  11. Karbalaei-Heidari, H.R., Ziaee, A.-A., Schaller, J., and Amoozegar, M.A. 2007. Purification and characterization of an extracellular haloalkaline protease produced by the moderately halophilic bacterium, Salinivibrio strain AF-2004. Enzyme and Microbial Technology. 40, 266-272.
  12. Karbalaei-Heidari, H.R., Ziaee, A.A., Amoozegar, M.A., Cheburkin, Y., and Budisa, N. 2008. Molecular cloning and sequence analysis of a novel zinc-metalloprotease gene from the Salinivibrio strain AF-2004 and its extracellular expression in E. coli. Gene. 408, 196-203.
  13. Marokházi, J., et al. 2004. Comparison of proteolytic activities produced by entomopathogenic Photorhabdus bacteria: strain-and phase-dependent heterogeneity in composition and activity of four enzymes. Applied and Environmental Microbiology. 70(12): 7311-7320.
  14. Mienda, B.S., and Yahya, A. 2011. Engineering of Microbial Proteases: Improving Stability and Catalytic Performances. Institute of Integrative Omics and Applied Biotechnology (IIOAB) Journal. 2, 10-15.
  15. Mitchinson, C., and Wells, J.A. 1989. Protein engineering of disulfide bonds in subtilisin BPN'. Biochemistry. 28, 4807-4815.
  16. Pantoliano, M.W., Whitlow, M., Wood, J.F., Rollence, M.L., Finzel, B.C., Gilliland, G.L., Poulos, T.L., and Bryan, P.N. 1988. The engineering of binding affinity at metal ion binding sites for the stabilization of proteins: subtilisin as a test case. Biochemistry. 27, 8311-8317.
  17. Pucci, F., Kwasigroch, J. M., & Rooman, M. 2020. Protein thermal stability engineering using HoTMuSiC. In Structural Bioinformatics (pp. 59-73). Humana, New York, NY.
  18. Rani, K., Rana, R., Datt, S. 2012. Review on latest overview of proteases. International Journal of Current Life Science. 2, 12-18.
  19. Sambrook, J., and Russell, D.W. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual, Cold spring harbor laboratory press.
  20. Shirdel, S. A., Khajeh, K., Asghari, S. M., & Karbalaei‐Heidari, H. R. 2014. Enhancement of thermostability and resistance against autolysis in a zinc metalloprotease. Engineering in Life Sciences, 14(2), 229-234.
  21. Takagi, H., Takahashi, T., Momose, H., Inouye, M., Maeda, Y., Matsuzawa, H., and Ohta, T. 1990. Enhancement of the thermostability of subtilisin E by introduction of a disulfide bond engineered on the basis of structural comparison with a thermophilic serine protease. Journal of Biological Chemistry. 265, 6874-6878.
  22. Tomasselli, A. G., Paddock, D. J., Emmons, T. L., Mildner, A. M., Leone, J. W., Lull, J. M., and Benson, T. E. 2008. High yield expression of human BACE constructs in Escherichia coli for refolding, purification, and high resolution diffracting crystal forms. Protein and Peptide Letters, 15(2), 131-143.
پژوهش‌های سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران)
دوره 35، شماره 4
دی 1401
صفحه 542-558
  • تاریخ دریافت: 15 مهر 1399
  • تاریخ بازنگری: 04 بهمن 1399
  • تاریخ پذیرش: 17 اسفند 1399