نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 گروه محیط زیست، دانشکده فنی دانشگاه آزاد اسلامی، واحد دماوند، دماوند، ایران.
2 گروه محیط زیست، دانشکده فنی دانشگاه آزاد اسلامی، واحد دماوند، دماوند، ایران
3 گروه شیلات، دانشکده منابع طبیعی دریا، دانشگاه علوم و فنون دریایی، خرمشهر، ایران
4 گروه ایمونولوژی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی جندیشاپور اهواز، اهواز، ایران؛ مرکز تحقیقات سلولی و مولکولی، دانشگاه علوم
چکیده
گیاه یونجه آلفا آلفا (Medicago sativa)، از منطقه پشمینهزار اندیمشک و در فصل بهار سال 1398 جمع آوری شد. پس از کشت همسانههای هر جدایه روی محیط آگار مغذی، ویژگیهای میکروسکپی بررسی شد. جهت بیان ژن 16S rDNA ، باکتریهای ایزوله شده در محیط YMA در شرایط هوازی و در دمای 25-28 درجهی سانتیگراد کشت داده شدند. پرایمرهای عمومی و کامل باکتری سینوریزوبیوم بر اساس ژن 16s rRNA gene sequences از سایت NCBI استخراج و در توالی یابی ژنهای باکتریهای جداسازی شده در این مطالعه مورد استفاده قرار گرفتند. ترادفهای بدست آمده با استفاده از نرم افزار Chromas Pro ویرایش و با استفاده از نرم افزار بلاست در پایگاه دادههای NCBI مورد تجزیه و تحلیل و مقایسه قرار گرفتند. سه سویه از ریزوسفر گیاه یونجهی آلفا آلفا (Medicago sativa) جداسازی و شناسایی شد. در بررسی میکروسکوپی و ماکروسکوپی 3 سویه باکتری شناسایی شد. باکتری شماره 1 شناسایی شده گرم منفی و با ایجاد کلنیهای کرم رنگ و برجسته، دومین باکتری گرم منفی و دارای کلنیهای قرمز رنگ و کلنی باکتری سوم جداشده از گیاه جنس یونجه آلفا آلفا (Medicago sativa) صورتی بود. نتایج توالییابی 16S rRNA سویه جدا شده از ریزوسفر گیاه یونجه را گونه (Sequence ID= CP 021215.1) Sinorhizobium meliloti (باکتری1)(درصد همپوشانی 97 و گپ های بازی ۲ درصد)، باکتری دوم Sequence ID= CP-000738.1)) Sinorhizobium medicae (باکتری 2)(درصد همپوشانی 97 و گپ های بازی ۲درصد) و باکتری سوم (Sequence ID= DQ-145546.1) Sinorhizobium meliloti (درصد همپوشانی 04/96 و گپ های بازی 4 درصد) شناسایی شد.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Variation of rhizobium bacteria isolated from the ribosomal nodes of the root of alfalfa (Medicago sativa) plant using 16rRNA gene shear fragments
نویسندگان [English]
1 Department of Environment, Damavand Branch, Islamic Azad University,Damavand,Iran
3 Department of Fisheries, Faculty of Natural Resources of the Sea, Khormashahr University of Marine Sciences and Technology, Khormashahr, Iran.
4 Department of Immunology, Faculty of Medicine, Ahvaz Jundishapur University of Medical Sciences, Ahvaz, Iran; Cellular and Molecular Research Center, Ahvaz Jundishapur University of Medical Sciences Ahvaz, Iran
چکیده [English]
The alfalfa (Medicago sativa) plant was collected from the area of Andimeshk and in the spring of 2018. To express the 16S rDNA gene, the isolated bacteria were cultured in YMA environment under aerobic conditions and at a temperature of 25-28 °c. Genomic DNA localization was performed using the DNA extraction kit of SINA Gene Co. General and complete primers of sinobium bacteria were extracted from the NCBI site based on 16s rRNA gene sequences, and were used in sequencing the isolated bacteria genes in this study. The sequencing obtained by using Chromas Pro software was edited and compared using blasting software in NCBI database of three strains of alpha-alpha (Medicago sativa) were isolated and identified. The microscopic and macroscopic studies of the bacteria were identified. Bacterium 1 was identified as Gram-negative and caused by cream and embossed colonies, the second Gram-negative bacteria, with red-colored colonies and third bacterial colony isolated from the genus Alfalfa (Medicago sativa) plant. Sequencing results of 16S rRNA strains isolated from the Rhizoum species (Sequence ID = CP 021215.1) Sinorhizobium Meliloti (bacter1) (overlapping percentages 97 and game chats 2 percent), the second bacterium Sequence ID = CP-000738.1)) Sinorhizobium Medicae (bacteria 2) (the overlap percentage of 97 and 2-percent game chats) and third bacteria (Sequence ID = DQ-145546.1) Sinorhizobium meliloti (overlapping percentages 04.96 and 4% game chats) were identified.
کلیدواژهها [English]
تنوع باکتریهای ریزوبیومی جدا شده از گرههای ریبوزومی ریشه گیاه یونجه آلفا آلفا (Medicago sativa) با استفاده از قطعات برشی ژن 16rRNA
شهرزاد گلابکش1، شهرزاد خرم نژادیان1*، ابراهیم رجب زاده قطرمی1و2 و محمد رشنو1و3و4
1 ایران، دماوند، دانشگاه آزاد اسلامی واحد دماوند، دانشکده فنی، گروه محیط زیست
2 ایران، خرمشهر، دانشگاه علوم و فنون دریایی، دانشکده منابع طبیعی دریا، گروه شیلات
3 ایران، اهواز، دانشگاه علوم پزشکی جندیشاپور اهواز، دانشکده پزشکی، گروه ایمونولوژی
4 ایران، اهواز، دانشگاه علوم پزشکی جندیشاپور اهواز، مرکز تحقیقات سلولی و مولکولی
تاریخ دریافت: 01/06/1399 تاریخ پذیرش: 24/10/1399
چکیده
گیاه یونجه آلفا آلفا (Medicago sativa)، از منطقه پشمینهزار اندیمشک و در فصل بهار سال 1398 جمع آوری شد. پس از کشت همسانههای هر جدایه روی محیط آگار مغذی، ویژگیهای میکروسکپی بررسی شد. جهت بیان ژن 16S rDNA ، باکتریهای ایزوله شده در محیط YMA در شرایط هوازی و در دمای 25-28 درجهی سانتیگراد کشت داده شدند. پرایمرهای عمومی و کامل باکتری سینوریزوبیوم بر اساس ژن 16s rRNA gene sequences از سایت NCBI استخراج و در توالی یابی ژنهای باکتریهای جداسازی شده در این مطالعه مورد استفاده قرار گرفتند. ترادفهای بدست آمده با استفاده از نرم افزار Chromas Pro ویرایش و با استفاده از نرم افزار بلاست در پایگاه دادههای NCBI مورد تجزیه و تحلیل و مقایسه قرار گرفتند. سه سویه از ریزوسفر گیاه یونجهی آلفا آلفا (Medicago sativa) جداسازی و شناسایی شد. در بررسی میکروسکوپی و ماکروسکوپی 3 سویه باکتری شناسایی شد. باکتری شماره 1 شناسایی شده گرم منفی و با ایجاد کلنیهای کرم رنگ و برجسته، دومین باکتری گرم منفی و دارای کلنیهای قرمز رنگ و کلنی باکتری سوم جداشده از گیاه جنس یونجه آلفا آلفا (Medicago sativa) صورتی بود. نتایج توالییابی 16S rRNA سویه جدا شده از ریزوسفر گیاه یونجه را گونه (Sequence ID= CP 021215.1) Sinorhizobium meliloti (باکتری1)(درصد همپوشانی 97 و گپهای بازی ۲ درصد)، باکتری دوم Sequence ID= CP-000738.1)) Sinorhizobium medicae (باکتری 2)(درصد همپوشانی 97 و گپهای بازی ۲ درصد) و باکتری سوم (Sequence ID= DQ-145546.1) Sinorhizobium meliloti (درصد همپوشانی 04/96 و گپهای بازی 4 درصد) شناسایی شد. با توجه به نقش تثبیت کنندگی این باکتریهای ریبوزومی، با تکثیر این گروههای باکتریایی و افزودن آنها به خاک میتوان، ضمن افزایش رشد گیاهان زراعی، استفاده از کودهای شیمیایی را کاهش داد.
واژه های کلیدی: تنوع، باکتری ریزوبیومی، کرهک، یونجه، ژن 16rRNA.
* نویسنده مسئول، تلفن: 02176301226 ، پست الکترونیکی: Khoramnejad@damavandiau.ac.ir
مقدمه
گیاهان خانواده لگومینوز شامل 19300 گونه از 750 جنس، با تولید مقادیر بالای پروتئین و تثبیت مقادیر بالای ازت به دلیل همزیستی با باکتریهای ریزوبیومی در سراسر جهان اهمیت زیادی دارند (1). بیشتر گیاهان تیره لگوم شامل نخود، لوبیاها و شبدرها گرهها یا اجزای غده ای شکلی روی ریشههای خود دارند. این گرهها در شرایط کمبود ازت و در نتیجه آلودگی ریشههای موئین این گیاهان با دستهای از باکتریها بنام ریزوبیوم ایجاد میشوند (9). گیاه یونجه یکی از مهمترین گیاهان علوفهای بومی است که با داشتن سیستم ریشهای قوی و مقاوم به شرایط نامساعد محیطی با وجود باکتریهای همزیست ریزوبیومی، نقش بسیار مهمی در حاصلخیزی خاکها دارد (4). باکتریهای ریزوبیوم مهمترین میکروارگانیسمهای موجود در خاک هستند که در مقایسه با سایر میکروارگانیسمهای خاک نقش مهمی در تبدیل نیتروژن اتمسفر به اشکال آمونیوم و نیتروژن آلی و تثبیت ازت دارند (7،21). ریزوبیومها گروهی از باکتریها هستند که قادر به تشکیل گره بر روی ریشه گیاهان خانواده بقولات میباشند. این باکتریها هوازی بوده و قادر به استفاده از منابع مختلف قند مثل پنتوزها و هگزوزها به عنوان منبع کربن میباشند و از آمونیوم و نیترات به عنوان منبع نیتروژن استفاده میکنند. حضور این باکتریها در ساختار گیاه، علاوه بر افزایش قابلیت بقای گیاه در شرایط نامساعد نظیر شوری و دمای بالا، با انحلال فسفات و آهن خاک، جذب مواد کم مصرف و در برخی از موارد کنترل عوامل بیماریزا رشد گیاه را نیز تحریک میکنند (18). توانایی این باکتریهای ریزوبیومی در تطبیق با شرایط تنشی خاک، در بقا و همزیستی باکتری و گیاه نقش اساسی دارند. برخی از این باکتریهای همزیست دارای توانمندی بالاتری در برابر تنشها زیستی، فیزیکی و شیمیایی هستند (1). Zhang و همکاران (1991) تنوع باکتریها ریزوبیومی ریشه را در گره زایی گیاهان تیره لوگوم را مورد بررسی قرار دادند (25). Hosseini و همکاران (2014) جداسازی و شناسایی سوشهای ریزوبیوم همزیست با یونجه و شنبلیه را مورد بررسی قرار دادند (11). Tashokri و همکاران (2016) صفات فنوتیپی و خصوصیات محرک رشدی باکتریهای ریزوبیومی گرههای ریشهای سویا را مورد بررسی قرار دادند (21).
برای شناسایی دقیق باکتریهای ریزوبیومی، روشهای مبتنی بر PCR به عنوان راهحلی سریع و مطمئن هستند. ژن 16rRNA یک ژن باکتریایی عمومی و محافظت شده با اعمال ثبت و مشخص است. این ژن با توالی ژنی در باکتریهای مختلف در تعیین روابط فیلوژنی یا شناسایی باکتریها مورد استفاده قرار میگیرد که این روش را به عنوان یکی از مفیدترین روشهای شناسایی باکتری معرفی میکند (22). Daduk و همکاران (2012) شناسایی فیلوژنیک باکتریهای تثبیت کننده نیتروژن جدا شده از ریزوسفر گیاه مارچوبه با استفاده از 16rRNA (6) و نیز استفاده از این ژن در مطالعهی Omidi Nasab و Khodakarmian (2017) در جداسازی باکتریهای اپیفیت یونجه نیز گزارش شده است (16). Fuskhah و Darmawati (2019) جداسازی باکتریهای ریزوبیومی با استفاده از محیط کشتهای مختلف و نقش آنها در افزایش تولید سویا را مورد بررسی قرار دادند (7). در کشور ایران به علت تنوع آب و هوایی و نوع خاک احتمالاً سویههای منحصر به فردی از نظر فیلوژنی و میزان کارایی همزیستی با یونجه وجود دارد که این امر شناسایی باکتریهای ریزوبیومی را به منظور استفاده از آنها به عنوان یک عامل بیولوژیک که با تثبیت نیتروژن، کاهش مصرف کودهای نیتروژن را به دنبال دارد را به موضوعی مهم تبدیل کرده است. علاوه بر این با توجه به توانایی تثبیت نیتروژن، میتوان از باکتریهای ریبوزومی شناسایی شده در کاهش فسفات و نیتروژن پسابهای صنعتی و شهری به عنوان یک مسیر دوستدار طبیعت استفاده کرد. از اینرو، هدف از مطالعهی حاضر شناسایی تنوع باکتریهای ریزوبیومی جدا شده از گرهکهای ریشه گیاه یونجه آلفا آلفا (Medicago sativa) است.
مواد و روشها
جمعآوری نمونه از گرهک ریشه گیاه یونجه آلفا آلفا (Medicago sativa): گیاه یونجه آلفا آلفا (Medicago sativa)، از منطقه پشمینهزار اندیمشک و در فصل بهار 1398 جمع آوری شد. به منظور جداسازی کرهگها، 15 سانتیمتر از خاک اطراف گیاه یونجه و به عمق 20 سانتیمتر کنار زده شد و ریشه گیاه یونجه بدون آسیب خارج شد. جهت حذف رطوبت و جلوگیری از انتقال آلودگی، ریشه پس از خروج از زمین با خاک اطرافی با قرار گیری درون کیسهی پلاستیکی، به آزمایشگاه انتقال پیدا کرد. در آزمایشگاه ریشهها درون ظرف پر از آب و با استفاده از جریان جاری آب به آرامی شستشو شدند. ضد عفونی کردن کرهگها با استفاده از اتانول 95 درصد (10-5 ثانیه) و هیپوکلریت سدیم 5/2 درصد (3-2 دقیقه) انجام شد. سپس گرهها 6-5 بار با آب مقطر استریل در کنار شعله شسته و سه بار آخر کرهکها به مدت 15 دقیقه در آب استریل نگهداری شدند. در هاون چینی استریل، گرهها به همراه محلول نمک 5/8 گرم در لیتر استریل له شدند. از محیط کشت YMA (دیپتاسیم فسفات 5/0 گرم، سولفات منیزیم 2/0 گرم، کلرید سدیم 1/0 گرم، مانیتول10 گرم، عصاره مخمر 5/0 گرم و آگار 15 گرم (2) برای جداسازی باکتریها استفاده شد. یک دهم میلیلیتر از سوسپانسیون گره و محلول نمک بر روی پتری دیش حاوی محیط کشت YMA پخش و در انکوباتور در دمای 28-25 درجهی سانتیگراد نگهداری شد. با مشاهده رشد کلنی باکتری در امتداد خطوط کشت، باکتریها به منظور خالص سازی جدایه ها روی محیط کشت دیگری کشت داده شدند و طی چند مرحله خالص سازی انجام گردید. پس از تهیه کشتهای خالص به منظور نگهداری طولانی مدت آنها ایزولههای جداسازی شده در لولههای مورب دارای محیط YMA کشت داده و در دمای یخچال نگهداری گردیدند. از هر سوش 5-4 نمونه تهیه گردید (7).
الف ب
شکل 1- گیاه یونجه الف- گیاه و ریشه ب- تراکم گرههای ریزوبیوم
شناسایی جدایههای باکتری: شناسایی ساختار ظاهری جدایهها بر پایه راهنمای باکتریشناسی ردهبندی (سیستماتیک) کلانس و برگیز (5) انجام شد. پس از کشت همسانههای هر جدایه روی محیط آگار مغذی، به مدت سه روز در انکوباتور 28 درجهی سانتیگراد قرار داده شدند و سپس ویژگیهای میکروسکپی همسانهها شامل شکل، واکنش گرم، حرکت، سیترات، تولید H2S، اکسیداز و کاتالاز بررسی شد (20).
تکثیر قطعه 16S rDNA باکتریها با استفاده از واکنش زنجیرهای پلیمراز: خالصسازی DNA ژنومیک با استفاده از کیت استخراج DNA ساخت شرکت سینا ژن انجام شد. واکنش PCR در حجم نهایی 25 میکرولیتر و شامل 18 میکرولیتر آب PCR، 5/2 میکرولیتر بافر PCR، 1 میکرولیتر پرایمر Forward، 1 میکرولیتر پرایمر Reverse، 1 میکرولیتر DNA ژنومی، 5/0 میکرولیتر آنزیم Taq DNA Polymeraz انجام شد. آغازگرهای (پرایمر) عمومی و کامل باکتری سینوریزوبیوم بر اساس ژن 16s rRNA gene sequences از سایت NCBI استخراج و در توالی یابی ژنهای باکتریهای جداسازی شده در این مطالعه مورد استفاده قرار گرفتند( جدول ۱).
جدول ۱- آغازگرهای عمومی 16s rRNA مورد استفاده در باکتری های ریبوزومی گیاه یونجه از سایت NCBI
آغازگر |
ردیف |
AGAAGTTTGATCMTGGCTCAG |
آغازگر پیشرو (27 F) |
GGTTACCTTGTTACGACTT |
آغازگرمعکوس (1492R) |
واکنش به صورت دناتوراسیون DNA به مدت 1 دقیقه در دمای 95 درجه سانتیگراد، دناتوراسیون ثانویه در دمای 95 درجهسانتیگراد به مدت 1 دقیقه و الحاق پرایمرها به DNA هدف در دمای 50 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه و توسعه پرایمر در دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه در 30 چرخه تکرار و در انتها 10 دقیقه واکنش در 72 درجه سانتیگراد صورت گرفت. PCR توسط ژل الکتروفورز 1 درصد آگارز در بافر تریس ارزیابی و تایید گردید. ترادفهای بدست آمده با استفاده از نرم افزار Chromas Pro ویرایش و با استفاده از نرم افزار بلاست در پایگاه دادههای NCBI مورد تجزیه و تحلیل و مقایسه قرار گرفتند (17).
نتایج
سه سویه از ریزوبیوم گیاه یونجهی آلفا آلفا (Medicago sativa) جداسازی و شناسایی شد که همه جدایه ها مشخصات تست های بیوشیمیایی تیپیک باکتری های سینوریزوبیوم را نشان دادند. برخی از مشخصات بیوشیمیایی این باکتریها در جدول 1 آمده است.
جدول 1- خصوصیات بیوشیمیایی باکتریهای جدا شده از ریزوسفر گیاه یونجهی آلفا آلفا
|
رنگ آمیزی گرم |
شکل سلول |
سیترات |
حرکت |
تولید H2S |
اکسیداز |
کاتالاز |
باکتری 1 |
گرم منفی |
باسیل |
- |
+ |
- |
+ |
+ |
باکتری 2 |
گرم منفی |
باسیل |
- |
+ |
v |
+ |
+ |
باکتری 3 |
گرم منفی |
باسیل |
- |
+ |
v |
+ |
+ |
در بررسی میکروسکوپی و ماکروسکوپی، باکتری شماره 1 با ویژگی های گرم منفی و ایجاد کلنیهای کرم رنگ و برجسته بر روی محیط کشت YMA بود (شکل 2). نتایج توالییابی 16S rRNA سویه جدا شده از ریزوسفر گیاه یونجه را گونه (Sequence ID= CP 021215.1) Sinorhizobium meliloti (باکتری 1) معرفی کرد.
الف ب
شکل 2- باکتری ریزوبیومی شماره 1 (Sequence ID= CP 021215.1) Sinorhizobium meliloti، الف- کلنی باکتری، ب-درخت فیلوژنی باکتری، ج- توالی ژنی
دومین باکتری گرم منفی و دارای کلنیهای قرمز رنگ بر روی محیط کشت YMA بود (شکل 3). باکتری دوم شناسایی شده از ریزوبیوم گیاه یونجه گونه Sequence ID= CP-000738.1)) Sinorhizobium medicae (باکتری 2) بود.
کلنی باکتری شماره ۳ جداشده از گیاه جنس یونجه آلفا آلفا (Medicago sativa) صورتی بود. باکتری (Sequence ID= DQ-145546.1) Sinorhizobium meliloti شناسایی شد (شکل 4).
همترازی جفت بازی (بلاست) ژنهای ورودی در نرم افزار بلاست با تعداد بازهای ژنهای مختلف و نیز درصد همپوشانی و گپهای بازی برای سه باکتری شناسایی شده در شکل 5 نشان داده شده است.
الف ب
شکل 3- باکتری ریزوبیومی شماره 2 (Sequence ID= CP-000738.1) Sinorhizobium meliloti، الف- کلنی باکتری، ب-درخت فیلوژنی باکتری، ج- توالی ژنی
الف ب
شکل 4- باکتری ریزوبیومی شماره 3 (Sequence ID= DQ-145546.1) Sinorhizobium meliloti ، الف- کلنی باکتری، ب-درخت فیلوژنی باکتری
باکتری شماره 1 (Sequence ID= CP 021215.1) Sinorhizobium meliloti
(درصد همپوشانی 97 و گپ های بازی ۲ درصد)
باکتری شماره 2 (Sequence ID= CP-000738.1) Sinorhizobium medicae
(درصد همپوشانی 97 و گپ های بازی ۲ درصد)
باکتری شماره 3 (Sequence ID= DQ-145546.1) Sinorhizobium meliloti
(درصد همپوشانی 04/96 و گپ های بازی 4 درصد)
شکل 5- همترازی جفت بازی ژنهای باکتریهای ریزوبیومی
همترازی چندبازی با انواع ژنهای موجود در بانک ژنی و مطابقت با نوع باکتریهای مشابه براساس تطابق جفت بازهای آنها برای 3 باکتری جدا شده در شکل 6 نشان داده شده است.
باکتری شماره 1 (Sequence ID= CP 021215.1) Sinorhizobium meliloti
باکتری شماره 2 (Sequence ID= CP-000738.1) Sinorhizobium medicae
باکتری شماره 3 (Sequence ID= DQ-145546.1) Sinorhizobium meliloti
شکل 6- همترازی چندبازی ژنهای باکتریهای ریزوبیومی با انواع ژنهای موجود در بانک ژنی
بحث
در بسیاری از نقاط دنیا گونههای مختلف باکتری ریزوبیومی از گونههای مختلف یونجه به جهت استفادهی تجاری در ثبیت ازت جداسازی شدهاند. ریزوبیوم از خانواده ریزوبیاسه، مشهورترین باکتری آندوفیت طبیعی لگوم و تثبیت کنندهی نیتروژن مولکولی است که جز گروهی از باکتریها با نام ریزوباکتریها محرک رشد گیاه محسوب میشود (4،10). از طرفی این روزها، مسیرهای ژنتیکی برای تعریف و درک سیستمهای ژنتیکی ارتبط باکتریهای همزیست و میزبان آنها استفاده میشوند. توالی ژنوم نژادهایی از نودولهای ریزوبیومی سیمبیوتیک همانند E. meliloti 1021 (8)، Rlv 3841 (24)، M. loti MAFF303099 (13) یا Bradyrhizobium diazoefficiens USDA110T (14) مشخص شده و بینشهای جدیدی را در خصوص این تعاملات همزیستی ایجاد کرده است.
در این مطالعه از روش 16S rDNA PCR جهت شناسایی و تعیین گونههای باکتری جدا شده از ریشه یونجه آلفا آلفای استان خوزستان استفاده شد. این روش که در آن از قطعات اختصاصی باکتری استفاده میشود، در مقایسه با روشهای قدیمی امکان تشخیص دقیق روابط خانوادگی بین باکتریها را فراهم ساخته و میتوان باکتریهای هم خانواده را به درستی تشخیص داد. تکثیر ژن 16S rDNA با استفاده از آغازگرهای بیان شده منجر به تولید قطعاتی با طول 3781904- 144170 جفت باز در جدایههای باکتریایی شد. براساس میزان تشابه باکتریها با توالی ژنهای ثبت شده در NCBI، باکتریهای شناسایی شده از جنس Sinorhizobium و شامل دو گونه (Sinorhizobium meliloti و Sinorhizobium medicae شامل دو نژاد (CP 021215.1 و DQ-145546.1) بودند.
Zhang و همکاران (1991) در مطالعهی که به بررسی باکتریهای جدا شده از گرهکهای ریشه گیاهان لوگومینوز پرداخته بودند از این دو باکتری به عنوان باکتریهای ریزوبیومی سریع الرشد نام بردند (25). Shafizadeh و همکاران (2007) در بررسی لگومهای نمونههای یونجه و اسپرس (19)، Jabli و همکاران (2007) در بررسی باکتریهای همزیست دو گونه یونجه Medicago rigidula و M. sativa در همدان (12) و Norooz Nejad و همکاران (2009) در جداسازی ریزوبیومهای یونجه استان فارس، گونهی باکتری همزیست Sinorhizobium meliloti (15) را به عنوان گونهی غالب گزارش کردند. Hosseini و همکاران (2014) باکتری Rhizobium hainanense را به عنوان ریزوبیوم غالب در یونجه و شنبلیله در بیرجند گزارش کردند (11). علت تفاوت در نوع گونه باکتری و یا سویههای مختلف، شرایط محیطی متفاوت شامل شوری و خشکی است که باعث میشود به مرور زمان باکتریها مقاوم شده و توانایی استقرار بر روی ریشه و ایجاد رابطهی همزیستی را پیدا کنند. Castro Pires و همکاران (2018) در بررسی ویژگیهای باکتریهای ریزوبیومی خاک در برزیل، عنوان کردند که نوع ریزوبیوم در هر منطقه تابعی از شرایط خاک و محیط است (4). به این ترتیب در هر منطقه با توجه به وجود استرسهای محیطی نوع خاصی از ریزوبیوم بومی و به شکل همزیست با گیاه وجود دارد (3) که با توجه به وابستگی نوع باکتری ریبوزومی به شرایط محیطی، میتوان از باکتریهای شناسایی به شکلی اختصاصی برای افزایش تثبیت نیتروژن و کاهش استفاده از کودهای شیمیایی در زمینهای کشاورزی خوزستان استفاده کرد.
نتیجه گیری
بعد از نمونهبرداری و جداسازی کرهگهای گیاه یونجهی آلفا آلفا (Medicago sativa) از محیط کشت YMA برای جداسازی باکتریها استفاده شد. جداسازی باکتریهای ریزوبیومی با استفاده از روش تکثیر قطعه 16S Rdna انجام شد که طی آن 3 گروه باکتریایی شامل گونه Sinorhizobium meliloti (باکتری1)،باکتری دوم Sinorhizobium medicae (باکتری 2) و باکتری سوم Sinorhizobium meliloti شناسایی شد.
تقدیر و تشکر
با سپاس فراوان از سازمان آب و برق خوزستان در همراهی برای انجام این پژوهش.