نوع مقاله: مقاله پژوهشی

چکیده

با توجه به کاربرد فراوان آنزیمهای لیپولیتیک بخصوص لیپاز باکتریایی در صنایع غذایی، دارویی و بهداشتی از یک طرف و قیمت بالای آن از طرف دیگر، جهت رفع مشکل  تولید آنزیم لیپاز باکتریایی، تولید این آنزیم از یک منبع در دسترس و ارزان قیمت مورد بررسی قرار گرفته است. برای این منظور سوش جدید Pseudomonas aeruginosa HR59  از عفونت سوختگی جداسازی و شرایط کشت آن با استفاده ار روش سطح پاسخ  برای چهار فاکتور غلظت کلسیم، غلظت توئین-80، غلظت روغن زیتون و زمان انکوباسیون بهینه سازی شده است.  نتایج حاصل از این روش آماری نشان داده است که زمان انکوباسیون بیشترین تأثیر و غلظت روغن زیتون کمترین تأثیر مثبت را بر ترشح آنزیم دارند. در نتیجه اعمال شرایط بهینه شده در محیط کشت باکتری (3 میلی مولار کلسیم، V/V 1.5  روغن زیتون، V/V 0.4 توئین-80 و 72 ساعت آنکوباسیون)، ترشح آنزیم به حداکثر مقدار خود می رسد. 

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Isolation of Pseudomonas aeruginosa HR59 lipase from burn infection and optimization of medium by use of Box-Behnken Design (BBD)

چکیده [English]

By attention to this fact that bacterial lipase has important role in different industries, in present investigation potential of Pseudomonas aeruginosa from burn infection for lipase secretion was studied. Optimization procedure using response surface methodology (RSM) based on Box-Behnken Design (BBD) with four factors (Ca2+ ion, olive oil and tween-80 concentration and incubation time) was used in order to investigate the effect of these parameters on the production of lipase from newly isolated bacterium; Pseudomonas aeruginosa HR59. According to the results of RSM, concentrations of Ca+2, tween-80 and incubation time were very important role on enzyme production. As a result of this optimization, maximum lipase activity was achievable at Ca+2 (3 mM), olive oil (1.5 % V/V), tween-80 (0.4 %V/V) and incubation time (72 h).

کلیدواژه‌ها [English]

  • Optimization
  • Lipase
  • Box- Behnken Design (BBD)
  • RSM

جداسازی آنزیم لیپاز از باکتری Pseudomonas aeruginosa HR59 حاصل از عفونتهای سوختگی و بهینه سازی محیط کشت آن با استفاده از روش Box-Behnken 

نجمه هادی زاده شیرازی1، بیژن رنجبر*1 و خسرو خواجه2

1تهران، داشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم زیستی، گروه بیوفیزیک

2تهران، داشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم زیستی، گروه بیوشیمی

تاریخ دریافت: 8/9/89                 تاریخ پذیرش: 22/1/91

چکیده

با توجه به کاربرد فراوان آنزیمهای لیپولیتیک بخصوص لیپاز باکتریایی در صنایع غذایی، دارویی و بهداشتی از یک طرف و قیمت بالای آن از طرف دیگر، جهت رفع مشکل  تولید آنزیم لیپاز باکتریایی، تولید این آنزیم از یک منبع در دسترس و ارزان قیمت مورد بررسی قرار گرفته است. برای این منظور سوش جدید Pseudomonas aeruginosa HR59  از عفونت سوختگی جداسازی و شرایط کشت آن با استفاده ار روش سطح پاسخ  برای چهار فاکتور غلظت کلسیم، غلظت توئین-80، غلظت روغن زیتون و زمان انکوباسیون بهینه سازی شده است.  نتایج حاصل از این روش آماری نشان داده است که زمان انکوباسیون بیشترین تأثیر و غلظت روغن زیتون کمترین تأثیر مثبت را بر ترشح آنزیم دارند. در نتیجه اعمال شرایط بهینه شده در محیط کشت باکتری (3 میلی مولار کلسیم، V/V 1.5  روغن زیتون، V/V 0.4 توئین-80 و 72 ساعت آنکوباسیون)، ترشح آنزیم به حداکثر مقدار خود می رسد.

واژه های کلیدی: لیپاز باکتریایی، عفونت سوختگی، بهینه سازی محیط کشت، روش آماری سطح پاسخ، Box- Behnken Design (BBD)  

* نویسنده مسئول، تلفن: 82882005 ، پست الکترونیکی: ranjbarb@modares.ac.ir

مقدمه

 

آنزیم لیپاز یکی از انواع آنزیمهای محلول در آب است که هیدرولیز پیوندهای استری را در سوبستراهای لیپیدی انجام می دهد (20). این آنزیمها قادرند پیوندهای استری موجود در تری اسیل گلیسرولها را شکسته و آنها را به اسیدهای چرب و گلیسرول تبدیل می کند به همین دلیل آنها را نوعی استراز می دانند. تنها تفاوت آنها با استراز ها آن است که لیپاز ها قادرند سوبستراهای بلند زنجیر را نیز هیدرولیز نمایند. از لحاظ عملکردی آنزیمهای لیپاز  سوبستراهای متنوعی داشته و به علاوه انتخابگری فضایی خوبی را از خود نشان می دهند (3,9,20,21,22,24,25 ,33). بسیاری از ارگانیزمها قادر به ترشح لیپازند اما در میان آنها باکتریها اهمیت بیشتری دارند چرا که: 1) لیپازهای باکتریایی در حلالهای آلی پایدارند،  2) برای انجام فعالیت انزیمی به کوفاکتور نیازی ندارند،   3) محدوده وسیعی از سوبستراها را پوشش می دهند  و 4) انتخابگری فضایی (Enantio selectivity) خوبی دارند (22). صنایع مختلفی قابلیت استفاده از لیپاز های باکتریایی را دارند که از آن جمله می توان به صنایع تولید لوازم آرایشی، تولید دارو، مواد غذایی و نیز شوینده ها اشاره کرد (18,19,32,34 ). با توجه به اهمیت فراوانی که این نوع انزیم در صنایع گوناگون دارد تولید آن ضروری و مهم است اما به صورت طبیعی باکتری توانایی اندکی برای تولید آنزیم دارد از این رو باید با استفاده از روشهایی مانند تغییر در حلالها، مهندسی پروتئین و یا روشهای مولکولی توانایی تولید این آنزیم را افزایش داد (23,35 ). علاوه بر این لیپازهای باکتریایی اغلب آنزیمهایی ترشحی و خارج سلولی اند و به همین جهت به شدت تحت تأثیر شرایط محیط و مواد موجود در آن مانند دما، pH ، میزان نیتروژن، منابع کربنی، وجود انواع لیپیدها، یونها فلزی و میزان هوادهی قرار می گیرند (27،20،6). در میان این فاکتورها، وجود منابع کربنی، و نیز القاء کننده های روغنی از اهمیت بیشتری برخوردارند (31 ). آنزیمهای لیپاز باکتریایی به خوبی در حضور منابع روغنی نظیر روغن، توئین، نمکهای صفراوی و گلیسرول از باکتری ترشح می شوند (4,11,13,37 ). از نظر باکتری شناسی، لیپاز در فاز لگاریتمی از مراحل رشد باکتری ترشح می شود به همین دلیل دوره زمانی ترشح آن بین چند ساعت تا چند روز متغیر است (16). با توجه به مطالب فوق، ساختار محیط کشت می تواند میزان ترشح آنزیم و در نتیجه تولید آن را تحت تأثیر قرار داده و در یک شرایط بهینه آن را افزایش دهد به همین دلیل به نظر می رسد که طراحی یک محیط کشت بهینه  برای رسیدن به هدف تولید حداکثر آنزیم ضروری است. طراحی محیط کشت در آزمایشگاهها اغلب فرآیندی وقت گیر و پرهزینه است که نیازمند انجام آزمایشهای متعدد نیز می باشد)26(. روش عمومی برای طراحی یک محیط کشت بهینه، تغییر غلظت اجزاء تشکیل دهنده ان به صورت مجزا یا روش یک عامل در یک زمان است. با این روش تنها می توان غلظت مناسب برای هر فاکتور را به صورت مجزا به دست آورد اما این حقیقت که عوامل محیطی گوناگون می توانند در ترکیب با یکدیگر اثرات یکدیگر را تشدید و یا خنثی کنند در نظر گرفته نمی شود (37). امروزه برای رفع این مشکل از روشهای آماری و مهندسی محیط کشت مانند روش سطح پاسخ یا RSM( Response Surface Methodology) استفاده می شود. با استفاده از این روش تعداد کمتری آزمایش مورد نیاز بوده و برای سیستمهای چند فاکتوری نیز مفید است. در این روش رابطه میان فاکتورهای گوناگون نیز در نظر گرفته می شود (7). در این حالت، اثرات خطی و یا درجه دوم متغیرهای مورد آزمایش، نمودارهای کانتور یا نقشه های توپوگرافی و مدل مناسب را خواهند ساخت. به این ترتیب تعیین مقادیر مناسب از هر متغیر و نیز درجه اهمیت هر کدام از انها به سادگی قابل تعیین و پیش بینی است (8).

RSM خود انواع گوناگونی دارد و به صورتهای مختلفی می توان از این روش آماری استفاده کرد. یکی از انواع آن، روش Box-Behnken (BBD) است که یک طراحی درجه دو بر اساس طراحیهای فاکتوریل ناقص سه سطحی است )5(.  این روش می تواند مقدار پارامترها را در یک مدل درجه دوم تخمین زده ، طرحیهای مورد نیاز را ساخته و مقدار پارامتر عدم تطابق را محاسبه کند (12). مقایسه بین طراحی هایBBD و سایر طراحیهای سطح پاسخ ( طراحی مرکب مرکزی و یا فاکتوریل کامل) نشان می دهد که BBD از هر دو روش طراحی مرکب مرکزی و فاکتوریل کامل بسیار کارآمدتر است (12).

از آنجاییکه عفونتهای سوختگی، منبعی غیرمعمول و در عین حال ارزان قیمت برای تولید لیپاز باکتریایی است، در این تحقیق به منظورتولید آنزیم از باکتریهای بیمارستانی و  نزدیک شدن به ترکیب مناسبی برای محیط کشت اصلی باکتری از روش طراحی Box-Behnken  استفاده گردید. این روشهای اماری می توانند جزء مراحل اولیه هر تحقیق باشد. هدف آنها تمرکز روی متغیرهای مهم و یافتن مؤثرترین متغیرها در تحقیق می باشد.

مواد و روشها 

مواد و باکتری مورد استفاده: باکتری Pseudomonas aeruginosa  مورد استفاده در این تحقیق از آزمایشگاه باکتری شناسی دانشگاه تربیت مدرس تهیه شده است . نوترینت بروث به عنوان پایه محیط کشت از شرکت Liofilchem (ایتالیا) و سایر مواد مورد نیاز شامل رودامین B ، تریتون X-100، پارانیتروفنل پالمیتات (PNPP)، سولفات آمونیوم و تویین-80 از کمپانی مرک (آلمان) خریداری شده است. بافر استفاده شده برای اندازه گیری فعالیت آنزیم و خالص سازی جزئی  آنزیم 20 میلی مولار تریس- اسید کلریدریک (6/8pH  ) است.

شناسایی باکتری مولد لیپاز: مشاهده فلورسانس نارنجی از کلنیهای ترشح کننده لیپار در محیط کشت حاوی رودامین B و روغن زیتون به عنوان سوبسترا ، روش تشخیصی مناسبی برای شناسایی لیپاز باکتریایی است)30(. برای این منظور، 1 درصد حجمی/حجمی رودامین B  و 5/2 درصد حجمی/ حجمی روغن زیتون به محیط کشت اصلی (8 گرم/ لیتر نوترینت براث، 4 گرم/ لیتر کلرید سدیم و 10 گرم/ لیتر آگار) اضافه شده است. در نتیجه ترشح آنزیم از باکتری و فعالیت آن در محیط کشت، روغن زیتون به واحدهای کوچکتر تجزیه شده و اسید چرب حاصل از این فعالیت به رودامین B متصل خواهد شد. پس از 17 ساعت، کمپلکس حاصل، در برخورد با پرتوهای فرابنفش ( با طول موج 350 نانومتر) از خود فلورسانس نارنجی نشان خواهد داد)38(. در این مطالعه از این پدیده برای شناسایی باکتریهای مولد لیپاز استفاده شده است.

تعیین سوش باکتری: رابطه فیلوژنیک ، بر اساس مطالعه توالی 16S rDNA انجام شده است)2(. برای تهیه DNA ژنومی باکتری Pseudomonas aeruginosa HR59 از کیت استخراج DNA کیاژن (آمریکا) استفاده شده است. در این روش با استفاده از توالیهای بین المللی مناسب برای Pseudomonas aeruginosa تنها ژن 16S rDNA تکثیر می یابد )39 و 10(. توالی های بین المللی مورد استفاده در این تحقیق عبارتند از:

Universal forward primer: (5´_AGT TTG ATC CTG GCT CAG_3´)

Universal reverse primer: (5´-GGC/T TAC CTTGTT ACG ACT T_3´)

تولی تکثیر یافته با کمک کیت تخلیص DNA فرمنتاز خالص سازی و توالی آن توسط SEQ-LAB (آلمان) بر روی هر دو رشته توالی، تعیین شده است. رابطه فیلوژنیک این سوش جدید بر این حقیقت تأکید دارد که این باکتری از خانواده Pseudomonas aeruginosa می باشد (www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank). توالی HR59 16S rDNA در Gen Bank با شماره بازیابی HQ424906  قابل دسترسی است.

تخلیص جزئی: باکتری HR59 در محیط کشت اصلی، در دمای 30 درجه سانتی گراد و هوادهی RPM 180 کشت داده شد. محیط کشت خام پس از سانتریفیوژ،  با سولفات آمونیوم (60 درصد اشباع) رسوب دهی شده است و رسوب حاصل در حداقل بافر 20 میلی مولار تریس- اسید کلریدریک ( 0/8 pH) حل و با همین بافر نیز دیالیز شده است. تمام مراحل فوق در دمای 4 درجه سانتی گراد صورت گرفته است.

سنجش فعالیت آنزیم: پارانیتروفنل پالمیتات (PNPP) (محلول در ایزوپروپانول) سوبسترای مناسبی برای تعیین فعالیت آنزیم لیپاز در محلول سنجش فعالیت ( Assay solution ) می باشد (40). فعالیت آنزیم موجب افزایش جذب در طول موج 410 نانومتر ( زرد رنگ) می شود که به دلیل آزاد سازی پارانیترو فنل در نتیجه فعالیت انزیم است. محلول سنجش فعالیت شامل 20 میلی مولار بافر تریس – اسید کلریدریک، 10 درصد تریتون X-100 و 20 میلی مولار PNPP است . برای آغاز واکنش، 20 میکرولیتر لیپاز ناخالص به محلول سنجش با حجم نهایی یک میلی لیتر اضافه شده و در دمای اطاق تغییرات جذب آن در طول موج 410 نانومتر اندازه گیری شده است.مقدار انزیمی که در یک دقیقه یک میکرومول PNP ( پارا نیترو فنل) تولید کند دارای یک واحد فعالیت آنزیمی است.

طراحی آزمایش و بهینه سازی: روش سطح پاسخ شامل مجموعه ای از آزمایشها است که رابطه میان فاکتورهای مورد آزمایش را ارزیابی کرده و پاسخ حاصل را اندازه گیری می کند (41). مطالعات نشان داده است که عوامل گوناگونی می تواند بر رشد باکتری و ترشح آنزیم مؤثر باشد که از آن جمله می توان به وجود القاء کننده هایی مانند سورفکتانتها، سوبستراهای بلند زنجیر و یونهای فلزی اشاره نمود(14). قبلا با استفاده از روش تک متغیر مقدار و غلظت مؤثر عوامل گوناگون برای باکتری Pseudomonas aeruginosa HR59 اندازه گیری شده است. در میان فاکتورهای مختلف گلیسرول، روغن زیتون، روغن افتابگردان، توئین-80 ، منیزیوم، کلسیم و زمانهای آنکوباسیون مختلف، چهار فاکتور یون کلسیم، روغن زیتون، توئین- 80 و زمان آنکوباسیون بیشتر از سایرین بر ترشح انزیم مؤثر بوده اند. در مرحله بعد از روش Box-Behnken برای مطالعه اثر چهار جزء مؤثر در محیط کشت استفاده شده است. آزمایشها در ارلنهای 100 میلی لیتری حاوی 20 سی سی محیط کشت در دمای 30 درجه سانتی گراد و با هوادهی RPM 180 کشت داده شده اند. طراحی فاکتوریل 3-سطح-4 فاکتور Box-Behnken با 5 تکرار در نقطه مرکزی برای تعیین پاسخ سطح درجه دو مورد استفاده قرار گرفته است. آنالیز رگرسیون برای ارزیابی دقت و صحت نتایج حاصل انجام شده است. برای این منظور، فعالیت انزیم به عنوان متغیر وابسته یا پاسخ (Y) در نظر گرفته شده است. بر اساس نتایج این روش، یک مدل چندجمله ای درجه دوم برای پیشگویی پاسخ در نظر گرفته شده است. مدل پیشنهادی برای هر پاسخ (Y) به صورت معادله 1 بوده است:

Y = β0 + β1X12X2 + β3X3 + β4X4 + β22X22 + β33X32 + β44X42+ β12X1X2+ β13X1X3+ β14X1X4+ β23X2X3+ β24X2X4+ β34X3Xs                                        معادله(1)

که در آن Y پاسخ پیشگویی شده، β0 ثابت مدل، X1، X2، X3

و X4 متغیرهای مستقل، β3, β2, β1  و β4 ضرائب خطی و β33, β22, β11  و β44 ضرائب درجه دو هستند.

برای آنالیز رگرسیون و ترسیم نمودارها از نرم افزار Design-Expert Software (V. 8.0.4 Trail, 2010) استفاده شده است. مقدار و غلظت بهینه متغیرهای فوق با کمک بررسی نمودارهای کانتور  تعیین شده است. انالیز آماری مدل به شکل آنالیز واریانس داده ها (ANOVA) نشان داده شده است.

جدول 1- جدول سطوح و کد انتخابی مربوط به کلسیم، روغن زیتون، توئین- 80 و زمان آنکوباسیون استفاده شده برای طراحی آزمایش Box-Behnken.

فاکتورهای مستقل

فاکتور

واحد

سطوح کد گذاری شده

1-

0

1

کلسیم

X1

mM

5/1

25/2

3

روغن زیتون

X2

% V/V

25/1

87/1

5/2

 Tween-80

X3

% V/V

2/0

3/0

4/0

زمان انکوباسیون

X4

h

24

48

72

بحث و نتیجه گیری

شناسایی باکتری مولد لیپاز: همان طور که قبلا گفته شد، در نتیجه فعالیت آنزیم در پلیتهای رودامین B دار، فلورسانس نارنجی در اطراف کلنیها دیده می شود )38(. بنابراین در اولین مرحله، 91 نمونه باکتری سودوموناس آئروژینوزا از عفونتهای سوختگی جدا شده که در میان این نمونه ها 48 نمونه فعالیت لیپازی را از خود نشان می دادند (تصویر 1).

 

تصویر1- a ) نشر نور فلورسانس درنتیجه فعالیت لیپازی توسط باکتری. b) نمونه بدون فعالیت لیپازی

برای ادامه تحقیق، یک نمونه که فعالیت لیپازی بهتری از خود نشان می داد، انتخاب شده است.

شناسایی سوش Pseudomonas aeruginosa HR59 : سوش جداسازی شده HR59 یک باکتری گرم منفی، میله ای شکل و هوازی است. بر اساس روشهای باکتری شناسی (15)، این سوش به جنس سودوموناس متعلق است. مولکولهای RNA ریبوزومی نقش به سزایی در تولید و سنتز پروتئینهای باکتری داشته و در تمام ارگانیزمهای زنده حفظ شده اند و توالی آنها برای طبقه بندی فیلوژنیک باکتریها به خوبی مورد استفاده قرار می گیرد. به همین منظور قطعه 16S rDNA  باکتری تکثیر یافته و توالی آن تعیین شده است. طول این قطعه تکثیر یافته1374 جفت باز است. توالیهای 16S rDNA برای جنس سودوموناس با کمک سایت اینترنتی NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov ) تهیه شده و با نرم افزار Clustal W (version 1.82) با یکدیگر مقایسه شده اند. درخت فیلوژنیک با استفاده از روش نزدیکترین همسایگی رسم شده است. مقایسه چندگانه توالیها و نیز درخت فیلوژنیک نشان داده است که سوش HR59 به جنس سودوموناس تعلق داشته و 99% تشابه توالی با 16S rDNA سودوموناس آئروژینوزا دارد (تصویر 2).

 

 

تصویر2- رسم درخت فیلوژنتیکی توالی ریبوزومی 16srDNA باکتری Pseudomonas aeruginosa HR59 با استفاده از نرم افزار ClustalW


طراحی و انطباق مدل (fitting the model): نتایج اولیه در این تحقیق نشان داده است که توئین- 80، روغن زیتون، یون کلسیم و زمان انکوباسیون ترشح انزیم را افزایش می دهد. همان طور که در جدول 1 نشان داده شده است، مقدار این فاکتورها به صورت سه کد 1- ، 0 و 1 برای برای مقادیر به ترتیب کم، متوسط و زیاد در نظر گرفته شده است. برای بهینه سازی محیط کشت، 29 آزمایش یا Run طراحی شده که اثر هر چهار فاکتور را در سطوح مختلف شامل می شود (جدول 2).

 

جدول 2- جدول طراحی Box-Behnken همراه با پاسخهای اندازه گیری شده و پیشگویی شده. در این طراحی، فعالیت انزیم به عنوان پاسخ در نظر گرفته شده است.

 

Run

 

Factor X1

 

Factor X2

 

Factor X3

 

Factor X4

پاسخ حقیقی

A (U/ml)

پاسخ پیشگویی شده A (U/ml)

1

1-

0

0

1

6/17

6/17

2

0

0

0

0

1/10

7/9

3

0

0

0

0

10

7/9

4

1

1

0

0

5/11

1/11

5

1

0

0

1

6/25

5/25

6

1

1

1

0

2/10

7/9

7

1

0

1-

0

1/12

7/12

8

1-

0

1-

0

2/5

1/5

9

1

0

1

0

3/17

1/18

10

1

1-

0

0

2/19

2/18

11

0

1-

1

0

7/14

8/14

12

0

1-

0

1-

7/3

8/3

13

0

1-

0

1

1/26

8/26

14

1

0

0

1-

2/11

9/10

15

0

1

0

1-

5/9

6/9

16

0

1

0

1

7/13

3/14

17

0

0

1

1

3/26

4/25

18

0

1

1

0

2/13

8/12

19

1-

0

1

0

3/11

4/11

20

0

0

0

0

4/7

7/9

21

1

1-

0

0

4/7

7/7

22

0

0

1-

1

9/17

3/17

23

0

0

1-

1-

6/5

7/5

24

0

1-

1-

0

2/10

10

25

1-

0

0

1-

8/4

5/4

26

0

0

0

0

4/8

7/9

27

0

0

1

1-

4/9

3/9

28

0

1

1-

0

1/6

6/ 5

29

1

1-

0

0

6/7

3/7

 

 

با توجه به جدول2، روش Box-Behnken مجموعه ای از 29 آزمایش را طراحی می کند که دارای 5 تکرار در نقطه مرکزی است. مدل حاصل با معادله 2 نشان داده می شود که در ان فعالیت لیپاز (Y) به عنوان تابعی از مقدار متغیرهای مستقل است:

  معادله (2)

Activity (U/ ml) = +9.76+3.58 X1 -1.68X2 +2.93X3+ 6.92 X4 -1.88X1X2  -0.22X1X3 +0.40  X1X4 +0.65X2X3 -4.55X2X4 +1.15X3X4 +1.17X12 +0.18X22 +0.98X32 +3.74X42                                   

 

همانطور که در معادله 2 دیده می شود، ضریب سه فاکتور کلسیم، توئین- 80 و زمان انکوباسیون مثبت بوده در حالی که ضریب فاکتور روغن زیتون منفی می باشد. اثر منفی روغن زیتون بر تابع پاسخ نشانگر آن است که مقادیر بالاتر این پارامتر منجر به تولید کمتر لیپاز می شود. در میان این سه پارامتر، زمان انکوباسیون دارای بیشترین تأثیر می باشد که ضریب خطی آن (6.92) گویای این حقیقت است. پس از آن غلظت یون کلسیم با ضریب 3.58 و توئین- 80 با ضریب 2.93 به ترتیب بیشترین تأثیر را بر تولید و ترشح آنزیم دارند. پیش از این  «Kumari و همکارانش (2009)» (29)  و «Gupta و همکارانش (2007)» (17) نیز گزارش کرده اند که زمان انکوباسیون مؤثرترین فاکتور در ترشح لیپاز است. ارزیابی آماری معادله (2) با انجام F-test و آنالیز وریانس (ANOVA) مدل درجه دوم پاسخ سطح صورت گرفته و نتیجه آن در جدول 3 آورده شده است. داده های ANOVA دقت این مدل درجه دوم را تأیید می کند. پارامتر F معیاری از انحراف دیتاها از مقدار میانگین است. به طور کلی برای مدلی که نتایج آزمایش را با موفقیت پیشگویی می کند،  مقدار F معمولاً بسیار بالا است (9,25). مقدار پارامتر   > F Prob کمتر از 0500/0 نیز به معنی معنی دار بودن مدل است . F-value برای این مدل، 95/142 بوده که نشان می دهد مدل کاملاً معنی دار است. در این حالت تنها 01/0 درصد احتمال خطا برای مدل وجود خواهد داشت. در این معادله، پارامترهای خطی شامل غلظت یون کلسیم (X1)، غلظت روغن زیتون (X2)، غلظت توئین-80 (X3) و زمان انکوباسیون (X4) و پارامترهای درجه دو X12 ، X32  و X42  به همراه پارامترهای میانکنش غلظتهای کلسیم و روغن زیتون (X1X2)، غلظت روغن زیتون و زمان انکوباسیون (X2X4) و غلظت توئین- 80 و زمان انکوباسیون (X3X4)، پارامترهای شاخص مدل هستند. نتایج نشان داده است که هر چهار فاکتور مستقل اثرات چشمگیری بر میزان فعالیت آنزیم دارند. محاسبه عدم تطابق، می تواند دلیل خوبی برای صحت داده های مدل باشد. در واقع معنی دار نبودن این پارامتر مطلوب است و به این معنی است که مدل می تواند به خوبی فعالیت انزیم را در شرایط گوناگون ترکیب چهار فاکتور مستقل فوق، پیشگویی کند. مقدار این پارامتربرای رگرسیون معادله 2، معنی دار نیست ( P= 0.6077). در بررسی مدل این سؤال مطرح می شود که تا چه اندازه تغییر در پاسخ قابل توجیه بوده و در نتیجه پارامترهای آزمایشگاهی و میان کنش آنها است؟ برای پاسخ به این سؤال بایستی مقدار R-squared  را اندازه گیری کرد. مقدار این پارامتر برای تولید لیپاز، 9931/0 است که نشانگر دقت مدل است. هرچه مقدار R-squared به 1 نزدیکتر باشد، ارتباط بهتری بین نتایج آزمایشگاهی و محاسبه شده وجود دارد. در نهایت Adequate precision نسبت سیگنال به نویز را اندازه گیری می کند. نسبت بیشتر از 4 قابل قبول است. برای این مدل، نسبت سیگنال به نویز 719/43 بوده است که نشان دهنده بالا بودن مقدار سیگنال نسبت به نویز می باشد.

 

جدول3- آنالیز واریانس (ANOVA) مدل چند جمله ای درجه دو فعالیت لیپاز به عنوان تابعی از مقدار اجراء مختلف محیط کشت.

Source

Sum of squares

DF

Mean squares

F-value

Probability (p) > F

Model

1159.40

14

82.81

16.17

< 0.0001

Residual

71.71

14

5.12

-

-

Lake of fit

71.71

10

7.17

0.88

0.6077

Pure error

0

4

0

-

-

Corrected total

1231.11

28

-

-

-

R2 = 0.9931           R2 Adj = 0.9861              R2Pred = 0.9691               Adeq Precision = 43.719

 

 

تصویر3- اثر غلظت یون کلسیم ( میلی مولار) و غلظت روغن زیتون (V/V درصد) بر فعالیت لیپاز . در این نمودار غلظت توئین و زمان انکوباسیون ثابت در تظر گرفته شده است.

 

تصویر4- اثر  زمان آنکوباسیون و غلظت روغن زیتون بر فعالیت لیپاز. در این نمودار، دو پارامتر غلظت توئین- 80 و کلسیم ثابن نگه داشته شده است. 


آنالیز نتایج سطح پاسخ: اثرات چهار فاکتور فوق بر فعالیت لیپاز در قالب طرحهای گرافیکی سطح پاسخ  و نمودار کانتور در تصاویر 5-3 نشان داده شده است. در هر کدام از این تصاویر، نمودارهای سطح پاسخ به عنوان تابعی از دو پارامتر رسم شده و دو پارامتر دیگر ثابت در نظرگرفته شده است. با بررسی شکل نمودارهای سطح پاسخ (بیضی یا دایره ای) می توان تشخیص داد که رابطه بین پارامترها معنی دار است یا خیر (36). نمودار کانتور بین روغن زیتون و کلسیم و همچنین زمان انکوباسیون و توئین- 80 بیضی شکل است و به عبارت دیگر میان کنش این پارامتر ها می تواند تأثیرات قابل توجهی بر فعالیت انزیم داشته باشد.

تأثیر میان کنش غلظتهای روغن زیتون و کلسیم بر فعالیت آنزیم در تصویر 3 نشان داده شده است. با توجه به این تصویر، افزایش غلظت کلسیم تولید آنزیم را افزایش داده  درحالی که افزایش غلظت روغن زیتون نه تنها اثر چندانی بر فعالیت آنزیم ندارد بلکه در حتی در غلظتهای بالاتر همراه با کلسیم اثر بازدارنده بر فعالیت انزیم داشته است. این نتیجه را می توان در تصویر 4 نیز مشاهده کرد. در این نمودار نیز افزایش غلظت روغن زیتون اثر مثبتی بر فعالیت انزیم نداشته و زمان انکوباسیون در غلظتهای پایین روغن زیتون بیشتر بر فعالیت آنزیم موثر است. به این ترتیب برای تولید حداکثر مقدار لیپاز، باید غلظت روغن زیتون در حداقل مقدار خود ( V/V 5/1 درصد ) نگه داشته شود.

 

 

 

 

 

 تصویر5- اثر زمان انکوباسیون و توئین- 80 بر فعالیت انزیم. در این نمودار غلظت کلسیم و روغن زیتون ثابت نگه داشته شده است.

 

توئین- 80 به دلیل طبیعت چربی دوستی خود، القاء کننده مناسبی برای تولید لیپاز است. این القاء کننده نه تنها یک تولید انزیم لیپاز است بلکه در ترشح ان نیز از غشاء سلول دخالت می کند (1). نتایج نشان داده اند که در غلظتهای ثابت روغن زیتون و کلسیم، هر دو فاکتور زمان انکوباسیون و توئین- 80 اثر مثبتی بر تولید انزیم دارند ( تصویر 5). تصاویر 4 و 5 بر نقش کلیدی زمان انکوباسیون در ترشح آنزیم تأکید می کند. این نتیجه با معادله 2 همخوانی دارد.

تایید تجربی مدل: برای تأیید نتایج فوق، باکتری Pseudomonas aeruginosa HR59 در شرایط بهینه پیشنهاد شده توسط مدل،  ( 3 میلی مولار کلسیم، V/V5/1 درصد روغن زیتون، V/V 4/0 درصد توئین- 80 و 72 ساعت آنکوباسیون) کشت داده شده و فعالیت آنزیم حاصل از آن اندازه گیری شده است. در این شرایط فعالیت آنزیم U/ml 7/35 اندازه گیری شده که به مقدار پیشگویی شده بسیار نزدیک است (U/ml 04/38) (جدول 4). به این ترتیب مدل به خوبی می تواند نتایج ازمایشها را پیشگویی کرده و محیط کشت باکتری مذکور را بهینه سازی کند.

 

جدول4- ارزیابی تجربی مدل. تمام فاکتور ها در شرایط بهینه در نظر گرفته شده اند.

پارامترهای مستقل

مقدار بهینه

فعالیت محاسبه شده

فعالیت اندازه گیری شده

Ca+2 concentartion

3 mM

 

04/38

 

7/35

Olive oil

5/1 % V/V

Tween-80

4/0 % V/V

Incubation time

72 h

 


نتیجه گیری

در این تحقیق تلاش بر ان بوده است تا منبع مقرون به صرفه ای برای تولید آنزیم لیپاز باکتریایی معرفی و شرایط تولید آن بهینه سازی شود. از این رو باکتری Pseudomonas aeruginosa HR59 از عفونتهای سوختگی جداسازی شده و با تغییر شرایط کشت آن، تولید و ترشح آنزیم لیپاز بهبود یافته است. روش آماری سطح پاسخ روشی مطمئن در یافتن سریع و کم هزینه بهترین شرایط کشت باکتری است. با استفاده از این روش، اثر چهار پارامتر غلظت روغن زیتون، غلظت توئین-80، غلظت کلسیم و زمان انکوباسیون بر فعالیت و تولید انزیم مورد برررسی قرار گرفته است. نتایج حاکی از ان است که کلسیم، توئین- 80 و زمان انکوباسیون نقش بسیار مهمی در تولید انزیم دارد و تولید لیپاز به صورت ویژه ای به زمان انکوباسیون وابسته است. R2  محاسبه شده برای این مدل ( 9931/0) نشان دهنده ان است که نتایج ازمایشگاهی با داده های محاسباتی انطباق دارد. به این تریب محیط کشت بهینه برای تولید انزیم توسط باکتری Pseudomonas aeruginosa HR59 باید علاوه بر محیط اصلی، حاوی 3 میلی مولار کلسیم، V/V 5/1 درصد روغن زیتون، V/V4/0 درصد توئین- 80 بوده و 72 ساعت آنکوبه شود. در این شرایط ماکزیمم فعالیت آنزیم ( U/ml 35.7 ) حاصل خواهد شد.

تقدیر و تشکر

این مقاله به مرحوم آقای دکتر مرتضی ستاری تقدیم می شود.

1- Acıkel, U., Ersana, M., Sag˘ Ac¸ıkel, Y. 2010. Optimization of critical medium components using response surface methodology for lipase production by Rhizopus delemar. Food.bioprod. process. 88 ,31–39

2- Ash, C., Farrow, J.A.E., Wallbanks, S., Collins, M.D. 1991. Phylogenetic heterogeneity of the genus bacillus revealed by comparative analysis of small subunit ribosomal RNA sequences. Lett. App. Microbiol. 13, 202–206.

3- Beisson, F., Tiss, A., Rivière, C., Verger, R. 2000. Methods for lipase detection and assay: a critical review. Eur. J. Lipid. Sci. Technol. 133–153. 

4- Bradoo, S., Saxena, R.K., Gupta, R. 1999. Two acidothermotolerant lipases from new variants of Bacillus spp. World. J. Microbiol. Biotechnol. 15, 87–91.

5- Box, G.E.P. 1960. Behnken, D.W.,Some new three level designs for the study of quantitative variables. Technometrics. 2, 195.

6- Brune, A.K., Gotz, F. 1992. Degradation of lipids by bacterial lipases. In: Winkelman G (ED.), Microbial degradation of natural products, Wiley– VCH, Weinhein, pp. 243–266.

7- Chang, Y.C., Lee C.L., Pan T.M. 2006. Statistical optimization of media components for the production of Antrodia cinnamomea AC0623 in submerged cultures. App. Microbiol. Biotechnol. 72, 654–661.

8- Chakravarti, R., Sahai, V. 2002. Optimization of compactin production in chemically defined production medium by Penicillium citrinum using statistical methods. Process Biochemistry. 38,  481–486.

9- Gupta, J.K., Soni, S.K. 2000. Industrial uses of enzymes. J. Punjab. Acad. Sci. 2, 75–80

10- Desantis, T.Z., Dubosarkiy, I., Murray, S.R., Andersen, G.L. 2003. Comprehensive aligned sequence construction for automated design of effective probes using 16S rDNA. Bioinformatics. 19, 1461–1468.

11- Dharmsthiti, S., Pratuangdejkul, J., Theeragool, G.T., Luchai, S. 1998. Lipase activity and gene cloning of Acinetobacter calcoaceticus  LP009. J. Gen. Appl. Microbiol. 44, 139–145.

12- Ferreira, S.L.C., Bruns, R.E., Ferreira, H.S., Matos, G.D., et al. 2007. Box-Behnken design: An alternative for the optimization of analytical methods. Analytica Chimica Acta. 597, 179–186.

13- Ghosh P.K., Saxena, R.K., Gupta, R., Yadav, R.P., et al. 1996.Microbial lipases: production and applications. Sci. Prog. 79, 119–157.

14- Gilbert, E.J., Drozd, J.W., Jones, C.W. 1991.Physiological regulation and optimization of lipase activity in Pseudomonas aeruginosu EF2. J. Gen. Microbiol. 137, 2215-2221.

15- Guerrero, R. 2001. Bergey’s Manual and the classification of prokaryotes. Int.Micobiol. 4, 103-109.

16- Gupta, R., Gupta, N., Rathi, R. 2004. Bacterial lipases: an overview of production, purification and biochemical properties. Appl. Microbiol. Biotechnol. 64, 763–781.

17- Gupta, N., Sahai, V., Gupta, R. 2007. Alkaline lipase from a novel strain Burkholderia multivorans: Statistical medium optimization and production in a bioreactor. Process Biochem. 42, 518-526

18- Houde, A., Kademi, A., Leblanc, D. 2004.Lipases and their industrial applications: an overview. Appl. Biochem. Biotechnol. 118, 155–170.

19- Ito, S., Kobayashi, T., Ara, K., Ozaki, K., et al. 1998. Alkaline detergent enzymes from alkaliphiles: enzymatic properties, genetics and structures. Extremophiles. 2, 185–190.

20- Jaeger, K.E., Ransac, S., Dijkstra, B.W., Colson, C., et al.1994. Bacterial lipases. FEMS. Microbiol. Rev. 15, 29–63.

21- Jaeger, K.E,. Dijkstra, B.W., Reetz, M.T. 1999. Bacterial biocatalysts: molecular biology, three-dimensional structures and biotechnological applications of lipases. Annu. Rev. Microbiol. 53, 315– 351.

22- Jaeger, K.E., Reetz, M.T. 1998.Microbial lipases form versatile tools for biotechnology. Trends. Biotechnol . 16, 396–403.

23- Jaeger, K.E., Eggert, T., Eipper, A., Reetz, M.T. 2001.Directed evolution and the creation of enantioselective biocatalysts. Appl. Microbiol. Biotechnol. 55, 519–530.

24- Jaeger, K.E., Eggert, T. 2002. Lipases for biotechnology. Curr. Opin. Biotechnol. 13, 390–397.

25- Kazlauskas, R.J., Bornscheuer, U.1998. Biotransformations with lipases, In: Rehm HJ, Reeds G (ED.), Biotechnology, Wiley–VCH, New York, pp. 37–192.

26- Kennedy, M., Krouse, D. 1999. Strategies for improving fermentation medium performance: a review. J. Ind .Microbiol. Biotechnol. 23, 456–475.

27- Kim, S.S., Kim, E.K., Rhee, J.S. 1996. Effects of growth rate on the production of Pseudomonas fluorescens lipase during the fedbatch cultivation of Escherichia coli. Biotechnol. Prog. 12, 718–722.

28- Krishna, S.H., Manohar, B., Divakar, S., Prapulla, S.G., et al. 2000. Enzy.Microbiol Techno. 26, 131.

29- Kumari, A., Mahapatra, P., Banerjee, R. 2009. Statistical Optimization of Culture Conditions by Response Surface Methodology for Synthesis of Lipase with Enterobacter aerogenes. Brazilian. Arch.Biol.Technol. 52, 1349-1356.

30- Kouker, G., Jaeger, K.E. 1987. Specific and sensitive plate assay for bacterial lipases. App.  Enviro.Microbiol. 53, 211-213

31- Lotti, M., Monticelli, S., Montesinos, J.L., Brocca, S., et al. 1998. Physiological control on the expression and secretion of Candida rugosa lipase. Chem.Phys.Lipids. 93, 143–148.

32- Nakajima, M., Snape, J., Khare, S.K. 2000. Method in non-aqueous enzymology, In: Gupta MN (ED.),Basel, Birkhauser Verlag. p. 52–69.

33- Pandey, A., Benjamin, S., Soccol, C.R., Nigam, P., et al.1999 The role of microbial lipases in biotechnology. Biotechnol. Appl. Biochem. 29, 119–131.

34- Rajan, M. 2004. Global market for industrial enzymes to reach $2.4 million by 2009 Business Communications Company, Inc. RC-147U Enzymes for Industrial Applications  http://www.bccresearch.com/editors/RC- 147U.html.

35- Reetz, MT., Jaeger, K.E. 1999.Superior biocatalysts by directed evolution. Topics. Curr. Chem.200, 31–57.

36- Rajendran, A., Thangavelu, V. 2007. Sequential optimization of culture medium composition for extracellular lipase production by Bacillus sphaericus using statisticalmethods. J. Chem. Technol. Biotechnol. 82, 460–470.

 37- Rathi, P., Saxena, R.K., Gupta, R. 2001. A novel alkaline lipase from Burkholderia cepacia for detergent formulation. Process. Biochem. 37, 187–192.               

 38- Sandoval, G., Marty, A. 2007. Screening methods for synthetic activity of lipases. Enz.Microbio.Technol. 40, 390-393.

39- Weisburg, W.G., Barns, D.A., Pelletier, D.J., Lane. J. 1991. 16S Ribosomal DNA Amplification for Phylogenetic Study.Bacteriol. 173, 697–703.

40- Winkler, U.K., Stuckmann, M., Glycogen. 1979. Hyaluronate, and some other polysaccharides greatly enhance the formation of exolipase by Serratia marcescens.J.Bacteriol.138, 663-670.

41- Zou, X., Chen, C.F., Hang, H.F., Chu, J., et al. 2010. Response surface methodology for optimization of the erythromycin production by Fed-Batch Fermentation using an inexpensive biological nitrogen source. Chem. Biochem. Eng. Q. 24, 95–100.