نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دکترای بیوشیمی
2 گروه ژنتیک ، دانشکده علوم پایه، دانشگاه شهرکرد، شهرکرد، ایران
3 دانشگاه شهرکرد
4 گروه بیوشیمی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران
چکیده
باکتریهای سرمادوست به دلیل توانایی در تولید آنزیمهایی که در دماهای پائین قادر به کاتالیز واکنشهای بیوشیمیایی میباشند، بسیار مورد توجه قرار گرفته اند. از این رو در سالهای اخیر مطالعات زیادی بر روی این باکتریها صورت گرفته است. این پژوهش نیز با هدف جداسازی و شناسایی باکتریهای تولید کننده آنزیمهای مقاوم به سرما از روده گونه جدید سختپوست گاماروس، ساکن چشمه آب سرد ارتفاعات رشته کوه زاگرس واقع در استان چهارمحال و بختیاری ایران، صورت پذیرفت. ابتدا گاماروسها جمعآوری و پس از انتقال به آزمایشگاه، از روده آنها بصورت کاملاً استریل نمونهبرداری صورت گرفت و پس از تهیه رقت در محیط لوریا-برتانی آگار در دمای ˚C5 گرماگذاری شد. کلونیهای رشد یافته، بر اساس ویژگیهای مورفولوژیکی، آزمونهای بیوشیمیایی مورد مطالعه قرار گرفتند و در نهایت تعیین هویت مولکولی بر اساس توالییابی ژن 16SrRNA صورت پذیرفت. سویه بومی جدید شناسایی شده در این پژوهش با شماره دسترسی MK961220 در GenBank ثبت شد که متعلق به باکتری سرمادوست Pseudomonas fragi میباشد. طبق بررسیهای صورت گرفته این سویه جدید توانایی تولید آنزیمهای آمیلاز، زایلوز ایزومراز، کاتالاز، اکسیداز، سرین پروتئاز و لاکاز را دارد و حداکثر فعالیت آنزیمهای بررسی شده در دمای 0 تا ˚C5 میباشد. این پژوهش برای اولین بار در کشور به منظور بررسی ظرفیت بالقوه و شناسایی منابع بومی تولید کننده آنزیمهای صنعتی با کاربرد زیست فناوری انجام گرفته است. طبق بررسیهای صورت گرفته این سویه جدید میتواند به عنوان کاندید مناسبی برای تخلیص و تولید آنزیمهای سرمادوست جهت استفاده در صنایع مختلف مورد استفاده قرار گیرد.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Isolation, identification and evaluation of enzymes of a new psychrophilic bacterium from the intestine of Crustacean Gammarus sp collected from cold springs of Saman (Chahrmahal va Bakhtiari)
نویسندگان [English]
1 Department of biology, faculty of basic sciences, Shahrekord University, Shahrekord ,Iran
2 Department of genetics, Faculty of basic sciences, Shahrekord University, Sharekord, Iran.
3 Department of genetics, Faculty of basic sciences, Shahrekord University, Sharekord, Iran.
4 Department of biochemistry, faculty of biological sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran.
چکیده [English]
Psychrophilic bacteria are useful in biotechnology due to their ability to produce different enzymes that capable of catalyzing biochemical reactions at low temperatures. Therefore, many studies have been done on these bacteria in recent years. The aim of this study was to isolate and identify the bacteria producing cold-adapted enzymes from the intestine of the new species of crustacean Gammarus species living in cold water spring of Saman in Chaharmahal va Bakhtiari province, Iran. The Gammarus samples were collected from cold spring of Saman. After transfer to the laboratory, bacteria were collected from the intestines in sterile condition. Then after, bacteria were cultured on the LB media and incubated at 5˚C temperature. Grown colonies were studied based on morphological characteristics, biochemical tests, and finally molecular identification was performed based on 16SrRNA sequence determination. A native strain of psychrophilic bacteria was isolated and identified, deposited with GenBank accession number MK961220. More experiments show that the new strain is capable of producing amylase, xylose isomerase, catalase, oxidase, and serine protease and laccase enzymes. The maximum activity and stability of most of the investigated enzymes were recorded at 5˚C. This study was conducted for the first time in the country to investigate the potential and ability of extracellular enzymes produce with biotechnological potential by the new psychrophilic strain. According to research, this strain can be used as a suitable candidate for the application of Cold adapted enzymes in various industries.
کلیدواژهها [English]
جداسازی و شناسایی باکتری سرمادوست از روده سخت پوست گاماروس جدا شده از چشمههای آب سرد شهر سامان در استان چهارمحال و بختیاری وارزیابی آنزیمهای مختلف آن
معصومه یوسف زاده1، روح الله همتی2و3*، بهناز صفار1 و علیرضا نوری4
1 ایران، شهرکرد، دانشگاه شهرکرد، دانشکده علوم پایه، گروه ژنتیک
2 ایران، شهرکرد، دانشگاه شهرکرد، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی
3 ایران، شهرکرد، دانشگاه شهرکرد، پژوهشکده زیست فناوری، گروه بیوتکنولوژی صنعتی
4 ایران، تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم زیستی، گروه بیوشیمی
تاریخ دریافت: 12/05/1399 تاریخ پذیرش: 07/07/1399
چکیده
باکتریهای سرمادوست بدلیل توانایی در تولید آنزیمهایی که در دماهای پائین قادر به کاتالیز واکنشهای بیوشیمیایی میباشند، بسیار مورد توجه قرار گرفتهاند. از این رو در سالهای اخیر مطالعات زیادی بر روی این باکتریها صورت گرفته است. این پژوهش نیز با هدف جداسازی و شناسایی باکتریهای تولید کنندة آنزیمهای مقاوم به سرما از رودة گونة جدید سختپوست گاماروس، ساکن چشمة آب سرد ارتفاعات رشته کوه زاگرس واقع در استان چهارمحال و بختیاری ایران، صورت پذیرفت. ابتدا گاماروسها جمعآوری و پس از انتقال به آزمایشگاه، از روده آنها بصورت کاملاً استریل نمونهبرداری صورت گرفت و پس از تهیة رقت در محیط لوریا- برتانی آگار در دمای ˚C5 دمادهی شد. کلونیهای رشد یافته بر اساس ویژگیهای مورفولوژیکی، آزمونهای بیوشیمیایی مورد مطالعه قرار گرفتند و در نهایت تعیین هویت مولکولی بر اساس توالییابی ژن 16SrRNA انجام شد. سویة بومی جدید شناسایی شده در این پژوهش با شمارة دسترسی MK961220 در GenBank ثبت شد که متعلق به باکتری سرمادوست Pseudomonas fragi میباشد. طبق بررسیهای صورت گرفته، این سویة جدید توانایی تولید آنزیمهای آمیلاز، زایلوز ایزومراز، کاتالاز، اکسیداز، سرین پروتئاز و لاکاز را دارد و حداکثر فعالیت آنزیمهای بررسی شده در دمای 0 تا ˚C5 میباشد. این پژوهش برای اولین بار در کشور بمنظور بررسی ظرفیت بالقوه و شناسایی منابع بومی تولید کنندة آنزیمهای صنعتی با کاربرد زیست فناوری انجام گرفته است. طبق بررسیهای صورت گرفته این سویة جدید میتواند بعنوان کاندید مناسبی برای تخلیص و تولید آنزیمهای سرمادوست جهت استفاده در صنایع مختلف مورد استفاده قرار گیرد.
واژههای کلیدی: آنزیمهای سرمادوست، سخت پوست گاماروس، باکتریPseudomonas fragi ، ژن 16SrRNA.
* نویسنده مسئول، تلفن: 32324401 98 ، پست الکترونیکی: roohullah.hemmati@sku.ac.ir
مقدمه
بخش وسیعی از سطح زمین دارای محیطهای سرد بوده که زیستگاه میکروارگانیسمهای سازگار به سرما، بنام سایکروفیلها میباشند. بر اساس شرایط دمایی رشد، میکروارگانیسمها به سه دسته ترموفیل، مزوفیل و سایکروفیل تقسیم میشوند (25). بدلیل سهولت رشد باکتریها و مقاومتشان در فرآیندهای مختلف، یک افزایش تقاضا برای استفاده از بیوکاتالیستهای میکروبی در کاربردهای صنعتی وجود دارد. امروزه اکثر آنزیمهایی که در فرآیندهای صنعتی تولید میشوند، مزوفیل هستند. کاربرد آنزیمهای مزوفیل، بدلیل پایداری کم آنها در برابر افزیش قدرت یونی، دما، و pH، محدود میشود (3). علاوه بر این، ایجاد گرما جهت افزایش بازیابی تولیدات، در فرآیندهای صنعتی باکتریهای مزوفیل، مقرون به صرفه نمیباشد. از این رو، آنزیمهای جداشده از میکروارگانیسمهای سرمادوست میتوانند جایگزین مناسبی برای آنزیمهای مزوفیل باشند (12). در چند دهة اخیر مشخص شده است که این میکروارگانیسمها بدلیل تولید آنزیمهای سازگار با سرما، مزایای اقتصادی و زیستمحیطی بسیار مفیدی را نسبت به میکروارگانیسمهای مزوفیل و ترموفیل از خود نشان میدهند (37). آنزیمهای سازگار با سرما بدلیل ویژگیهای ساختمانی و کاتالیتیک در انجام واکنشها در دماهای پائین نسبت به رقبای مزوفیل و ترموفیل از مزیت بیشتری برخودارند. این آنزیمها با سرعتی بیش از دو برابر سرعت آنزیمهای مزوفیل قادر به کاتالیز واکنشهای شیمیایی در دماهای سرد میباشند (12 و 17). سرمادوستها به دو دستة باکتریهای Psychrophile(سرمادوست اجباری) و Psychrotroph(سرمادوست اختیاری) تقسیم میشوند. اغلب باکتریهای سرمادوست متعلق به جنسهای Pseudomonas، Vibrio، Cytophaga و Flavobacterium هستند (2).
مطالعات صورت گرفته در مورد باکتریهای سرمادوست، توانایی آنها را در تولید آنزیمهای مختلف مقاوم به سرما نظیر آمیلازها، سلولازها، پکتینازها، بتاگالاکتوزیدازها، اکسیدازها، پروتئینازها، لیپازها و غیره آشکار میسازد (39). این باکتریها بدلیل تولید آنزیمها، متابولیتها و ترکیبات جدید نظیر پروتئینهای ضد یخ از پتانسیل بالایی برای کاربردهای بیوتکنولوژی برخوردارند (5). توانایی بالقوه آنزیمهای سرمادوست منجر به افزایش سرمایهگذاری در زمینه تحقیقات و توسعه استفاده از این آنزیمها در صنایع مختلف از جمله صنایع غذایی (نظیر پکتیناز، بتا گالاکتوزیداز)، صنایع شوینده (نظیر لیپاز، آمیلاز، سلولاز)، صنایع فرآوری گوشت (پروتئاز) و غیره میشود (33 و 39). علاوه بر این آنزیمهای سرمادوست بطور موفقیتآمیزی در زیستپالایی (نظیر اکسیدازها)، تغییر و تبدیلات زیستی (متیلاز و آمینوترانسفرازها) و نیز در زیست دارویی بطور وسیع بکار میروند و تحقیقات در این زمینه بطور روزافزونی در حال افزایش است (39). با توجه به اهمیت آنزیمهای سرمادوست و کاربرد وسیع آنها در صنایع، این پژوهش با هدف شناسایی باکتریهای سرمادوست همزیست در روده سخت پوست گاماروس موجود در چشمة آب سرد ارتفاعات استان چهارمحال و بختیاری با کاربرد احتمالی در زیست فناوری و صنایع انجام شده است.
مواد و روشها
جداسازی گونة سختپوست گاماروس از چشمة آب سرد: چشمة آب سردی که در این پژوهش از آن نمونه برداری صورت گرفت در فاصله 85 کیلومتری شهرکرد در ارتفاعات رشته کوههای زاگرس استان چهارمحال و بختیاری واقع شده است. دمای آب آن از ˚C 5 تا ˚C 15 در فصول سرد و گرم سال متغیر است. این نمونهها پس از جمع آوری، توسط فلاسک در دمای˚C5 به آزمایشگاه منتقل شدند.
جداسازی باکتریهای سرمادوست از رودة گونة جدید سخت پوست گاماروس: ابتدا سطح گاماروسها توسط الکل رقیق و نیز اشعه UV بطور کامل ضدعفونی و از رودة آنها بهصورت کاملاً استریل نمونهبرداری صورت گرفت. نمونهها پس از تهیة رقت، در محیط لوریا-برتانی آگار در دمای ˚C4 گرماگذاری شدند. در این دما فقط یک نوع کلونی رشد یافت که جهت اطمینان از خالص بودن، بصورت جداگانه به پلیت LB آگار منتقل و برای 3-4 بارمتوالی کشت داده شد. کلنی جداشده بر اساس ویژگیهای مورفولوژیکی، آزمونهای بیوشیمیایی مورد مطالعه قرار گرفت و در نهایت تعیین هویت مولکولی بر اساس توالییابی ژن 16SrRNA انجام شد.
بررسی خصوصیات مورفولوژی و آزمونهای بیوشیمیایی: خصوصیات ظاهری کلنی و خصوصیات ظاهری سلول، پس از رنگآمیزی گرم توسط میکروسکوپ نوری بررسی و ثبت شد. بمنظور شناسایی نسبی و اولیة سویة جداشده، یکسری از آزمونهای بیوشیمیایی میکروبی از جمله رنگآمیزی گرم، آزمون مصرف سیترات، آزمون کاتالاز، آزمون اکسیداز، آزمون متیل رِد-وگس پروسکائر (MR-VP test)، آزمون سولفید-ایندول-تحرک (SIM test)، و هیدرولیز نشاسته، بر اساس کتاب سیستماتیک باکتریشناسی برگی انجام شد (40). در نهایت جهت تشخیص نهایی، شناسایی مولکولی بر اساس توالییابی ژن 16SrRNA صورت پذیرفت.
بررسی مولکولی باکتری جدا شده: برای این منظور از پلیت حاوی کشت خالص، یک کلنی تک برداشته و در cc10 محیطLB مایع، در دمای ˚C5 بمدت 20 ساعت کشت داده شد. سپس محیط کشت نامبرده جهت رسوبگیری در دورrpm 9000 بمدت 5 دقیقه سانتریفیوژ گردید. از رسوب حاصل، برای استخراج DNA با استفاده از کیت Cell DNA Isolation kit تهیه شده از شرکت Gene All استفاده شد. برای اطمینان از صحت کار، محصول استخراج ژنوم توسط دستگاه الکتروفورز (BioRad) بر روی ژل 1 درصد آگارز مشاهده شد. پس از استخراج ژنوم، ژن 16SrRNA با تکنیک PCR و با استفاده از پرایمرهای universal با نامهای F و R تکثیر شد (28 و 29). آغازگرهای مورد استفاده در این پژوهش عبارتند از:
Primer F: 5' –GAGTTTGATCCTGGCTCAG -3'
Primer R:5'-CGGTTACCTTGTTACGACTT -3'
اجزا واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR) عبارتند از: 5/2 میکرولیتر بافر X10، 75/0 میکرولیتر Mgcl2 (50 میلی مولار)، 5/0 میکرولیتر dNTPs (10 میلی مولار)، 5/0 میکرولیتر از هریک از آغازگرهای پیشرو و معکوس (10 میکرومولار)، 1 میکرولیتر DNA ژنومی، 25/0 میکرولیتر آنزیم Polymerase Taq DNA که با آب تزریقی به حجم نهایی 25 میکرولیتر رسید.
برای انجام واکنش زنجیرهای پلیمراز، واسرشت سازی اولیه با دمای˚C 94 بمدت 5 دقیقه و 35 چرخة تکرارشونده شامل واسرشتسازی ثانویه در دمای˚C 94 به مدت 45 ثانیه، اتصال پرایمرها در دمای ˚C56 بمدت 1 دقیقه و سنتز در دمای˚C 72 بمدت 1 دقیقه و 30 ثانیه و مرحله طویل شدن نهایی نیز در دمای˚C 72 بمدت 10 دقیقه در نظر گرفته شد.
جهت شناسایی نهایی باکتری مورد نظر، محصول حاصل از PCR بطول bp 1500 الکتروفورز و پس از تخلیص، برای تعیین توالی به شرکت ماکروژن کره جنوبی ارسال و بصورت دو طرفه خوانش تعیین توالی گردید. توالی حاصل، با استفاده از نرمافزار Chromas pro ویرایش و توسط نرم افزار BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)، با توالیهای ثبت شده در پایگاه داده NCBI مورد مقایسه قرار گرفت و نزدیکترین سویه بر اساس توالی ژن16SrRNA انتخاب شد.
تحلیل و رسم درخت فیلوژنتیک سویة جدا شده: بمنظور بررسی ارتباط فیلوژنی میان سویة جداسازی شده و توالیهای مشابه موجود در پایگاه داده، همردیفی توالیهای 16SrRNA توسط نرم افزار Clustal W انجام شد. درخت فیلوژنی با استفاده از نرم افزارMEGA4 (52) و الگوریتمNeibour-Joining(NJ) ترسیم شد (20 و 48). توالی بدست آمده از تحقیق حاضر در بانک ژنی NCBI ثبت گردید.
سنجش فعالیت آنزیم آمیلاز از سویه جداشده: بمنظور تأیید خاصیت هیدرولیزکنندگی نشاسته، تولید آمیلاز در پلیت آگار نشاستهدار مورد بررسی کیفی قرار گرفت (شکل 7) و سنجش کمی فعالیت آن نیز براساس روش برنفلد Bernfeld)) و با استفاده از معرف دینیتروسالیسیلیک (DNS) صورت پذیرفت (8). ابتدا سویة جداشده در محیطLB براث بمدت 48 ساعت در دمای ˚C5 کشت داده شد. سپس برای شکستن دیواره سلولی و رهاسازی آنزیمها، محیط کشت روی یخ با قدرت 80 پالس بمدت 30 ثانیه و به تعداد 13 بار سونیکیت شد. پس از سونیکیشن، محیط کشت با دور rpm 10000 بمدت 10 دقیقه و دمای ˚C4 سانتریفیوژ شد و سوپ رویی که حاوی آنزیم بود برای سنجش فعالیت آنزیم آمیلاز مورد استفاده قرارگرفت. بدین منظور، 400 میکرولیتر از محلول رویی حاوی آنزیم به 250 میکرولیتر نشاسته یک درصد محلول در 1350 میکرولیتر بافر فسفات 100 میلی مولار بعنوان سوبسترا اضافه شد (7 pH= ). جهت انجام واکنش، مخلوط حاصل بمدت 2 ساعت در دمای ˚C 5 قرار داده شد. در مرحلۀ بعد، واکنش آنزیمی با اضافه کردن یک میلیلیتر از معرف DNS به مخلوط و قراردادن آن بمدت 5 دقیقه در آب جوش پایان یافت. سپس جذب نمونهها در طول موج nm540 قرائت گردید (44).
سنجش فعالیت آنزیم زایلوز ایزومراز از سویة جدا شده: زایلوز ایزومراز آنزیم مهمی است که ایزومریزاسیون برگشتپذیر گلوکز به فروکتوز و زایلوز به زایلولوز را کاتالیز میکند و در تولید صنعتی شربت فروکتوز با درصد شیرینی بالاتر از ساکارز مورد استفاده قرار میگیرد. علاوه بر استفادة این آنزیم در صنایع غذایی، بدلیل کاربردهای بالقوة آن در صنعت سوختهای زیستی، بسیار مورد توجه قرار گرفته است (13). بدلیل اهمیت موضوع، تولید این آنزیم مهم در سویة جدید مورد بررسی قرار گرفت. در این پژوهش تولید آنزیم زایلوز ایزومراز بوسیله تست سیلوانف تصدیق شد (34 و 46). بدین منظور ابتدا سویة جدا شده در محیط LB براث کشت داده شد. در مرحلة بعد برای رهاسازی آنزیم، محیط کشت با شرایط عنوان شده در بالا سونیکیت شد. سپس برای بررسی فعالیت آنزیم زایلوز ایزومراز، پس از سانتریفیوژ محیط سونیکیت شده در دورrpm 10000 بمدت 10 دقیقه و دمای ˚C4، 5 میلی لیتر از سوپ رویی برداشته و به آن 5 میلی لیتر سوبسترای گلوکز 1 مولار اضافه شد. پس از قرار دادن مخلوط حاصل روی یخ، در زمانهای صفر، 2، 4، 6 ساعت، یک میلی لیتر از آن را برداشته و با اضافه کردن یک میلیلیتر از معرف سیلوانف و قراردادن مخلوط بمدت 5 دقیقه در آب جوش واکنش آنزیمی پایان یافت. سپس جذب نمونهها در طول موج nm560 قرائت گردید (18).
سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز از سویه جدا شده: کاتالاز آنزیمی است که تقریباً در همه موجودات از باکتریها گرفته تا گیاهان و جانوران یافت میشود و وظیفة محافظت از سلول در برابر تخریب اکسیداتیو آب اکسیژنه را بر عهده دارد. این آنزیم، آب اکسیژنه را به آب و اکسیژن تجزیه میکند (14). کاتالاز دارای بالاترین Turn over در بین آنزیمها میباشد؛ زیرا هر مولکول آنزیم قادر به تجزیة بیش از یک میلیون مولکول پراکسید هیدروژن است (21). بدلیل اهمیت کاتالاز بعنوان یکی از آنزیمهای مهم در زمینههای مختلف صنعتی و بیوتکنولوژی و کشاورزی از جمله زیست پالایی و صنایع غذایی و غیره (30 و 35)، در پژوهش حاضر کیفیت این آنزیم در سویة جدا شده مورد ارزیابی قرار گرفت. این آزمایش بر طبق دستورالعمل مندرج در مقالات پیشین با کمی تغییر صورت پذیرفت (27). بدین منظور پس از کشت باکتری و سونیکیت روی یخ، محلول رویی توسط سانتریفیوژ جدا شد. سپس 4 لام یا لوله با اندازه یکسان برداشته و درون هر یک مقدار یکسانی از پراکسید هیدروژن (300 میکرولیتر) ریخته شد (البته یکی از لولهها برای کنترل منفی است). لولهها را در دماهای مختلف مورد نظر قرارداده تا پراکسید به دمای مورد نظر برسد. سپس به هر لوله، 300 میکرولیتر از محلول رویی با همان دما اضافه شده و پس از گذشت زمان 3 دقیقه، کیفیت تشکیل حباب در لولهها مورد بررسی قرار گرفت. در این پژوهش فعالیت آنزیم در دماهای˚C 5 و ˚C 10 و ˚C 15 بررسی شد و نتایج حاصل از آن در بخش مربوطه ارائه گردید.
ارزیابی فعالیت آنزیم اکسیداز از سویه جدا شده: باکتریها اصولاً به دو روش انرژی تولید میکنند یا با تخمیر یا با اکسیداسیون مواد آلی که این گروه از باکتریها آنزیم اکسیداز دارند و اصطلاحاً اکسیداز مثبت هستند. اکسیدازها برداشت هیدروژن از سوبسترا را کاتالیز میکنند اما از اکسیژن فقط بعنوان گیرندة هیدروژن استفاده میکنند (19 و 36). اگر باکتری دارای آنزیم اکسیداز باشد (مانند Pseudomonas یا Gonococcal) در صورت مجاورت با سوبستراهایی مانند تترا متیل پی فنیلین دی آمین و یا معرف کواکس به رنگ بنفش تغییر رنگ میدهد و اگر اکسیداز منفی باشد (مانند آسینتوباکتر) تغییر رنگ نداریم. در این پژوهش فعالیت آنزیم اکسیداز بر اساس روش ارائه شده در مقالات بشرح زیر ارزیابی شد (31). ابتدا مقداری از سوپ رویی کشت سونیکیت شده روی کیتی که حاوی سوبستراست ریخته می-شود، تغییر رنگ کیت نشاندهندة وجود آنزیم اکسیداز میباشد (7 و 50).
ارزیابی فعالیت آنزیم سرین پروتئاز از سویه جدا شده: تنها 8 درصد از آنزیمهای صنعتی از منابع گیاهی و 4 درصد آن از منابع جانوری تولید میشوند و مابقی خاستگاه میکروبی دارند (10). میکروارگانیسمها از مهمترین و عمدهترین منابع تولید آنزیمها بوده که بیشتر آنها متعلق به جنس باسیلوسها و سودوموناسها هستند (6 و 9). از بین آنزیمهای باکتریایی، پروتئازها بدلیل کاربرد وسیعشان در صنایع مختلف، بسیار مورد توجه قرار میگیرند (32 و 45). در میان پروتئازها، سرین پروتئازها بعلت پایداری و فعالیت در pH بالا نقش مهمی در دناتوره کردن پروتئینها در محیط قلیایی بازی میکنند و کاربرد وسیعی در صنایع دارند (23).
بررسیهای صورت گرفته در سال 2016 بر روی گونههای مختلف سودوموناس نشان داد، برخی ازگونهها توانایی تولید آنزیم سرین پروتئاز را داشته که در دماهای مختلف فعالیت متفاوتی را نشان میدهند (4). در پژوهش حاضر بررسی کمّی وجود این آنزیم در دماهای مختلف طبق دستورالعمل موجود در مقالات پیشین با اندکی تغییرات (11 و 22) صورت گرفت. بدین منظور پس از کشت باکتری و سونیکیت روی یخ، توسط سانتریفیوژ، محلول رویی جدا شد. سپس 200 میکرولیتر از محلول رویی با 200 میکرولیتر از محلول BSA 1 درصد بعنوان سوبسترا بهمراه 200 میکرولیتر بافر فسفات در داخل لوله آزمایش با هم مخلوط و همراه با لولة بلانک (نمونة کنترل) که شامل همة مواد بجز محلول رویی بود، بمدت 10 دقیقه در داخل یخچال قرار داده شد و سپس جذب در nm280 قرائت گردید. در مرحلة بعد برای بررسی اثر مهارکنندة PMSF بر فعالیت آنزیم، در آزمایشی مشابه، ابتدا محلول رویی با مهارکننده PMSF مخلوط سپس به محلول واکنش اضافه شد و پس از گذشت زمانهای مختلف جذب در nm 280 قرائت شد. در تحقیق حاضر زمان و دماهای متفاوتی برای بررسی فعالیت این آنزیم انتخاب و نتایج آن در بخش مربوطه ارائه گردید.
نتایج
باکتری سرمادوست از رودة گونة جدید سخت پوست گاماروس بومی چشمه آب سرد کوههای زاگرس جداسازی شد. رشد بهینة این باکتری در دمای˚C5 و کمتر بود و در دمای ˚C37 هیچگونه رشدی از خود نشان نداد (شکل 1). از لحاظ مورفولوژی در زیر میکروسکوپ به شکل کوکوباسیل گرم منفی دیده شد (شکل 2). نتایج مربوط به آزمونهای بیوشیمیایی این سویه بومی نیز در جدول 1 ارائه شده است.
شکل 1- (A) پلیت کشت داده شده در دمای ˚C 5 و (B) پلیت انکوبه شده در دمای ˚C37.
شکل 2- گستره سویه جداشده در زیر میکروسکوپ.
جدول 1- نتایج آزمونهای بیوشیمیایی باکتری استخراج شده از روده گاماروس
Growth at 30˚C |
Indole |
H2S |
VP test |
Glucose |
Citrate |
Starch hydrolysis |
Motility |
Oxidase test |
Catalase test |
Gram stain |
Morphology |
- |
- |
- |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
cocobacil |
شکل 3- (A) تست مربوط به حرکت سویة جداشده و (B) نمونة کنترل منفی.
استخراج ژنوم باکتری و انجام PCRجهت تکثیر قطعه 16SrRNA: ابتدا ژنوم باکتری استخراج شد (شکل 4). سپس بمنظور شناسایی مولکولی سویه جداسازی شده، تکثیر ژن 16SrRNA با استفاده از آغازگرهای اختصاصی صورت پذیرفت (شکل 5). ژن تکثیری توسط شرکت ماکروژن از دو طرف خوانش گردید. نتایج حاصل از BLAST توالی بدست آمده با توالیهای موجود در بانک اطلاعاتی NCBI، شباهت 64/99 درصدی این سویة جدید به باکتری Pseudomonas Fragi را نشان داد که با شمارة دسترسی MK961220 در GenBank ثبت شد (جدول 2).
شکل 4- محصول استخراجDNA ژنومی سویة جدا شده همراه با مارکر bp100.
شکل 5- محصول PCR ژن 16SrRNA درسویة جدا شده همراه با مارکر bp100.
جدول 2- شناسایی مولکولی سویة جداسازی شده بر اساس مقایسه توالی ژن 16SrRNA با سویههای معتبر در بانک اطلاعاتی ژنوم
شماره دسترسی ** |
نام سویه |
درصد شباهت |
MK961220 |
Pseudomonas fragi |
99/64 |
** شماره دسترسی، توالیهای ثبت شده در بانک اطلاعات ژنوم NCBI میباشد.
نتایج تحقیقات انجام شده نشان میدهد که جنسهای Pseudomonas، Azospirillum و Bacillus از جمله میکروارگانیسمهای تجاری بشمار میروند؛ یعنی نسبت به جنسهای دیگر بطور گسترده مورد بررسی قرار گرفتهاند و آنزیمهای موجود در آنها بصورت نوترکیب بمیزان وسیع در صنایع مورد استفاده قرار میگیرند (10). در تحقیق حاضر نیز سویة شناسایی شده، متعلق به جنس Pseudomonas میباشد که در تحقیقات متعدد نقشهای زیادی برای این جنس مطرح شده است (9).
بمنظور بررسی رابطة فیلوژنتیکی میان سویة شناسایی شده با نمونههای بدست آمده از BLAST، درخت فیلوژنی با استفاده از نرم افزار MEGA4 و روش Neibour-Joining (NJ) (19) رسم شد. نتایج حاصل از درخت فیلوژنی نشان میدهد که سویه مورد مطالعه (sa**) با باکتریPseudomonas fragi در یک کلاد خواهری قرار گرفته است (شکل 6). توالی بدست آمده از تحقیق حاضر در بانک ژنی NCBI ثبت شد.
شکل 6- درخت فیلوژنی باکتری شناسایی شده با استفاده از نرمافزار MEGA4و روشNeibour-Joining (NJ). باکتری جداشده با ستاره مشخص شده است.
سنجش فعالیت آنزیم آمیلاز: همانگونه که در شکل 7 مشاهده میشود هاله تشکیل شده در اطراف کلنی مورد نظر بیانگر توانایی تولید آنزیم آمیلاز توسط ایزوله جداشده میباشد و با توجه به نتایج تکمیلی بدست آمده از بررسی کمَی که با استفاده از روش بنفیلد در طول موج nm540 و در دماهای 0˚C و ˚C12 صورت پذیرفت، این باکتری از توانایی بالایی برای تولید این آنزیم برخوردار است ( شکل 8 و جدول 3). بر اساس نتایج حاصله، میزان فعالیت این آنزیم در دمای صفر درجه بیشتر از فعالیت آن در دمای 12 درجه میباشد.
شکل 7- (A) بررسی کیفی آنزیم آمیلاز تولید شده توسط سویه مورد مطالعه و (B وC) نمونههای کنترل فاقد آنزیم آمیلاز.
شکل 8- بررسی کمی آنزیم آمیلاز تولید شده توسط سویه مورد مطالعه، سمت راست میکروتیوب حاوی آنزیم وسمت چپ شاهد.
جدول 3- نتایج بررسی کمّی فعالیت آنزیم آمیلاز
دما ((˚C |
جذب (nm540) |
روی یخ (صفر درجه) |
478/0 |
12 درجه |
281/0 |
سنجش فعالیت آنزیم زایلوز ایزومراز: بررسی کمّی آنزیم زایلوز ایزومراز با سوبسترای گلوکز 1 مولار و معرف سلیوانف انجام شد (8(. ایجاد رنگ قرمز نشاندهندة وجود فروکتوز بدلیل حضور آنزیم زایلوز ایزومراز میباشد. شدت رنگ در طول موج nm 560 در 4 تکرار قرائت گردید. با توجه به نتایج، بیشترین فعالیت آنزیم بعد از 4 ساعت بدست آمد که نمودار آن در شکل 9 نشان داده شده است.
شکل 9- تعیین زمان بهینه برای فعالیت آنزیم در دمای صفر درجه.
سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز از سویه جدا شده: طبق نتایج مشاهده شده در شکل 10، این سویه جدید از توانایی تولید میزان بالایی از آنزیم کاتالاز برخودار بوده که فعالیت آن در دماهای پایین بیشتر از فعالیت آن در دماهای بالا است.
شکل 10- ارزیابی کیفی آنزیم کاتالاز و بررسی فعالیت آن در دماهای مختلف.
A و B و C بترتیب نشاندهندة میزان فعالیت آنزیم کاتالاز سویة جدا شده در دماهای 5 و 10 و 15 درجه میباشد در حضور استرپتوکوک بعنوان کنترل منفی برای تولید آنزیم کاتالاز(D).
سنجش فعالیت آنزیم اکسیداز از سویه جدا شده: بمنظور سنجش فعالیت آنزیم اکسیداز بصورت کیفی از کیت استفاده شد که رنگ آبی مایل به بنفش نشاندهندة وجود آنزیم اکسیداز میباشد )شکل 11).
شکل 11- ارزیابی کیفی آنزیم اکسیداز
ارزیابی فعالیت آنزیم سرین پروتئاز از سویة جدا شده: نتایج آزمون ارزیابی تولید آنزیم سرین پروتئاز در این پژوهش نشان داد که سویه شناسایی شده از توانایی تولید این آنزیم برخوردار است (جدول 4). طبق نتایج بدست آمده این آنزیم در دماهای پایین نظیر˚C 5 پایدارتر از دماهای بالا نظیر˚C 12 میباشد. بطوری که در دمای 12 درجه بعد از گذشت 20 دقیقه فعالیت آنزیم کاهش یافته در حالی که در دمای 5 درجه، با گذشت این زمان فعالیت آنزیم افزایش مییابد. همچنین نتایج موجود در در جدول 5 نشان میدهد که افزودن بازدارنده PMSF (فنیل متیل سولفونیل فلوراید) سبب مهار آنزیم سرین پروتئاز شده است.
جدول 4- نتایج مربوط به وجود آنزیم سرین پروتئاز از سویه جدا شده
دما |
پس از گذشت 10 دقیقه |
پس از گذشت 20 دقیقه |
˚C5 |
751/0 |
93/0 |
˚C12 |
86/0 |
65/0 |
جدول 5- نتایج مربوط به مهار آنزیم سرین پروتئاز با بازدارنده PMSF
پس از گذشت 10 دقیقه |
پس از گذشت 20 دقیقه |
25/0 |
03/0 |
بحث و نتیجه گیری
در سالهای اخیر بدلیل اهمیت قابل توجه میکروارگانیسمهای سرمادوست، با هدف دستیابی به آنزیمهای فعال در سرما، توجه ویژهای به اکوسیستمهای سرد و میکروارگانیسمهای آن شده است (17). تولید این آنزیمها از نظر بیوتکنولوژی بسیار مفید و از نظر اقتصادی نیز مقرون به صرفه میباشد (42). افزون بر این با افزایش دما میتوان این آنزیمها را غیر فعال نمود و به همین دلیل در مقایسه با اتواع مزوفیل و ترموفیل آلودگی زیست محیطی ایجاد نمیکنند. با مطالعات صورت گرفته در مورد باکتریهای سرمادوست، توانایی آنها در تولید آنزیمهای مختلفی نظیر آمیلازها، سلولازها، پکتینازها، بتاگالاکتوزیدازها، اکسیدازها، پروتئینازها، لیپازها و غیره اثبات شده است (39). نتایج بررسی وجود آنزیمهای مختلف از سویه بومی شناسایی شده در پژوهش حاضر و کاربردهای آن نیز در جدول 6 خلاصه شده است.
بدلیل اهمیت این موضوع، در این مطالعه باکتری جداشده از روده سخت پوست گاماروس ساکن چشمههای آب سرد ارتفاعات زاگرس استان چهارمحال بمنظور توانایی تولید آنزیمهای سرمادوست با پتانسیل بیوتکنولوژی مورد بررسی قرار گرفت. با توجه به بومی و جدید بودن گونه سخت پوست، پژوهش کنونی برای نخستین بار انجام شده است. شناسایی مولکولی این باکتری همولوژی 64/99 درصدی آن را با جنس Pseudomonas نشان داد که این نتایج با تستهای بیوشیمایی صورت گرفته تطابق دارد. طبق گزارش اخیر در سال 2019 ریزوباکتر sp Pseudomonas از ریزوسفر گیاهان بدست آمد که بصورت همزیست با گیاه و تولید متابولیتهای محرک رشد سبب افزایش رشد گیاه ونیز افزایش جوانه زنی دانه میشود (43).
جدول 6- نتایج بررسی وجود آنزیمهای مختلف از سویه بومی شناسایی شده
آنزیمها |
کاربردها |
تولید در سویة جداشده |
آمیلاز |
در صنایع مختلف مانند صنایع غذایی، دارویی، نساجی، کاغذ، شوینده و غیره (47 و 51) |
+ |
سرین پروتئاز |
شوینده، صنایع لبنی، نساجی، تولید چرم، صنایع دارویی مثل پمادها و محلولهای شتشو (49) |
+ |
زایلوز ایزومراز |
صنایع غذایی، نوشیدنیها، صنایع نانوایی، تولید شربت فروکتوز، سوخت زیستی و غیره (13) |
+ |
کاتالاز |
تهیه اسفنج، صنایع لبنی، شویندهها، صنایع غذایی، زیست پالایی و غیره (21 و 51) |
+ |
پراکسیداز |
معرف برای تشخیص و تعیین گلوکز خون و ادرار، تعیین مقدار اتانول در مایعات بیولوژیک، تصفیه فاضلابها، دخالت در سنتز ترکیبات آروماتیکی مختلف و حذف فنولها و پراکسیدها از مواد زائد صنعتی (1 و 24) |
+ |
لاکاز |
در صنایع مختلف و نیز طیف وسیعی از فرآیندهای شیمیایی، نظیر رنگبری در صنعت نساجی، سفید کردن خمیر کاغذ، سمیت زدایی از پساب، پالایش زیستی، صنایع غذایی، تولید مواد آلی از سوبسترای فنولی و آمینی، پیلهای سوختی، زیست نانو فناوری و غیره )15 و 26) |
+ |
از این رو ما فرض کردیم که احتمالاً این سویه نیز بصورت همزیست در ریشه گیاهان قرار دارد و پس از خورده شدن ریشه گیاهان توسط سخت پوست گاماروس، وارد دستگاه گوارش این سخت پوست شده است. اگر این فرض درست باشد، بر اساس رژیم غذایی سلولزی و پروتئینی گاماروس، شاید بتوان از این سویه جدید برای تحریک جوانهزنی دانهها و بذرها در مناطق سردسیر کشور نیز بهره برد. البته تحقیقاتی در این زمینه و استفاده از این سویه جدید و بررسی تأثیر آن در رشد گیاه در حال انجام است. رشد بهینه ایزوله جدا شده این تحقیق در دماهای پایین با نتایج بدست آمده از تحقیقاتGavali, J., & Pathak, A. در سال 2015 مطابقت دارد. این محققان نیز توانستند از یخچالهای طبیعی، سویهای را جداسازی کنند که رشد بهینه آن در دمای ˚C 5 بود (41). البته، علیرغم گزارش آنها مبنی بر عدم توانایی مصرف ایزوله جداشده از نشاسته، در تحقیق حاضر سویه جدید بدلیل تولید آنزیم آمیلاز فعال، توانایی مصرف نشاسته را داشته و آزمایشات کیفی و کمی چندین بار تکرار شدند تا نتایج تأیید شوند. با وجود اینکه اطلاعات زیادی در مورد آنزیمهای موجود در Pseudomonas fragi در دست نیست ولی زنوم کامل دو سویه از آن بنامهای A22 و B25 توسط Wang, Q و همکارانش تعیین توالی شده است (53) و توالی ژنهای مختلف آن از جمله ژن تولید کننده آنزیم آمیلاز در Gene bank ثبت شده است. در خصوص آنزیم پروتئاز Pseudomonas fragi نیز گزارشهای محدودی ارائه شده است. در گزارشی Noreau و همکارانش در سال 1979 این آنزیم را جداسازی کردهاند (38). در پژوهش حاضر نیز نتایج، بیانگر تولید این آنزیم توسط سویه جدید میباشد که جهت کسب جزئیات بیشتر تحقیقات بیشتری نیاز است. این سویه همچنین قادر به تولید زایلوز ایزمراز است که در صنایع تولید آبمیوه مصرف زیادی دارد و با توجه به اینکه ژن تولید کننده این آنزیم ازPseudomonas fragi در Gene bank موجود میباشد، امکان تحقیق جامعی راجع به آن فراهم شده است. در این پژوهش ما وجود این آنزیم را در سویه جدید بررسی نمودیم. ناگفته نماند تنها از سر کنجکاوی این سویه جدید را روی پلیت حاوی متیلن بلو و در حضور سویه لاکاز منفی کشت دادیم و مشاهده کردیم که بخوبی رشد کرد و حدس میزنیم که این سویه جدید توانایی حذف آلایندهها را نیز داشته باشد. همانگونه که در بخش نتایج مشاهده شد این سویة جدید همچنین از پتانسیل بالایی برای تولید آنزیم کاتالاز سرمادوست برخوردار است که کاربرد وسیع در صنایع مختلف دارد. در پژوهشی که توسطPathak, A و Gavali, Jارائه شده، تنها به حضور و عدم حضور کاتالاز در Pseudomonas fragi اشاره شد و بررسی کیفی و کمی از آنزیم کاتالاز جهت مقایسه ارائه نشده است (41). در مورد دیگر آنزیمها نیز وضع به همین منوال است. البته در مورد گونههای دیگر Pseudomonas نظیر fluorescens و aeruginosa تحقیقات بیشتری انجام شده است؛ ولی علیرغم اهمیت آنزیمهای سرمادوست و کاربرد وسیعشان در صنایع مختلف، متأسفانه هنوز پژوهشهای زیادی در مورد آنزیمهای Pseudomonas fragi صورت نگرفته است. نطر به اینکه سویة جدید، بومی کشورمان ایران میباشد و با توجه به پتانسیل بالای آن در تولید آنزیمهای سرمادوست که در دماهای بسیار پایین قادر به فعالیت میباشند، این سویه کاندید بسیار مناسبی جهت تخلیص آنزیم به فرم طبیعی یا تولید آنزیمهای سرمادوست نوترکیب جهت استفاده در صنایع مختلف میباشد و استفاده از این آنزیمها در صنایع، موجب افزایش کیفیت محصولات شده و با ایجاد ارزش افزوده، افزایش درآمد را برای شرکتهای مربوطه در پی خواهد داشت.