شبیه سازی دینامیک مولکولی آنزیم استیل کولین استراز در حضور نانوذرات طلا

حنانه اکبرنژاد¹، محمد برشان تشنیزی¹، رضا حسن ساجدی² و فرامرز مهرنژاد^1*

¹ ایران، تهران، دانشگاه تهران، دانشکده علوم و فنون نوین، گروه مهندسی علوم زیستی

² ایران، تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم زیستی، گروه بیوشیمی

تاریخ دریافت: 07/05/1399          تاریخ پذیرش: 07/07/1399

چکیده

خواص ویژه نانوذرات و برهمکنش آنها با مولکول های زیستی توجه بسیاری از محققان را به خود جلب کرده است. هنگامی که نانوذرات طلا به بدن وارد می‌شوند، با مولکول‌های زیستی مختلف مانند پروتئین‌ها، لیپید‌ها، پلی ساکارید‌ها، و اسید‌های نوکلئیک مواجه می‌شوند. پروتئین‌هامی‌توانند به راحتی به سطح نانوذرات طلا متصل شده و در اطراف نانوذرات طلا تشکیل یک پروتئین کرونا دهند. شکل‌گیری کرونا می‌تواند ساختار پروتئین‌های جذب شده را تغییر دهد و در عملکرد فیزیولوژیک آن‌ها اختلال ایجاد کند. بنابر‌این مطالعه برهمکنش‌های نانوذرات طلا و پروتئین‌ها می‌تواند نقطه آغاز مطالعات اثرات زیستی این نانوذرات محسوب ‌شود. در این تحقیق، نظر به نقش‌های کلیدی آنزیم استیل‌کولین استراز در سیستم عصبی و کاربرد‌های متعدد نانوذرات طلا در حوزه‌های مختلف، نحوه برهمکنش نانوذرات طلا با آنزیم استیل‌کولین استراز با استفاده از شبیه‌سازی دینامیک مولکولی مطالعه شده است. نتایج حاصل از بررسی ساختار دوم، RMSD و شعاع ژیراسیون نشان‌دهنده‌ی القای فشردگی در ساختار پروتئین به واسطه‌ی حضور نانوذرات طلا می‌باشد. همچنین، نتایج حاصل از آنالیز‌های DSSP، نشان‌گر پایداری ساختار دوم آنزیم طی برهمکنش است. باتوجه به نتایج این تحقیق می‌توان نتیجه گرفت نانوذرات طلا در مجاورت با آنزیم استیل کولین استراز، تغییرات کنفورماسیونی قابل توجهی در این پروتئین ایجاد نمی کنند.

واژه های کلیدی: نانوذرات طلا، استیل کولین استراز، شبیه سازی دینامیک مولکولی

* نویسنده مسئول، تلفن: 02186093285 ،  پست الکترونیکی: mehrnejad@ut.ac.ir

مقدمه

کلوئید‌های طلا سال‌هاست که جهت مقاصد درمانی مورد استفاده قرار می‌گیرند و این استفاده‌ی بی‌خطر می‌تواند نشان‌دهنده‌ی عدم سمیت نانوذرات طلا باشد(9 و12).  با این وجود، از‌ آنجائیکه ویژگی‌های مواد در مقیاس نانو بسیار با حالت توده‌ای متفاوت است، بازنگری اثرات سمیت و سمیت زیست محیطی این ذرات منطقی به نظر می‌رسد( 6و 10). طی دهه‌ی گذشته مطالعات فراوانی نشان داده‌اند که نانوذرات طلا روی سلول‌های یوکاریوتی، مدل‌های حیوانی و ارگانیسم‌های متعدد که نماینده‌ی سطوح مختلف جانداران محیط‌زیست می‌باشند، اثر سمی اندکی دارند(14). این اثرات شدیداً تحت تأثیر اندازه و پوشش این نانوذرات است؛ بطوریکه خود پوشش می‌تواند از نانوذرات سمی تر باشد. مواجهه‌ی انسان با نانوذرات طلا می‌تواند تعمدی و کنترل شده باشد؛ مانند مقاصد پزشکی و سایر مقاصد ذکر شده. در این حالت نانوذرات باید بسته به نوع استفاده (تزریق وریدی، استنشاق، پوستی و...) از سد‌های مختلفی عبور کنند و سمیت احتمالی که از خود بر جای می‌گذارند در اندام‌های مختلف به مورفولوژی و فیزیولوژی آن اندام و ویژگی‌های فیزیکی-شیمیایی نانوذرات وابسته است. نوع دیگر مواجهه با نانوذرات به‌صورت ناخواسته و از طریق آلودگی‌های محیطی، هنگام کار با این نانوذرات می‌باشد( 8 و 21).

هنگامی که نانوذرات طلا به بدن وارد می‌شوند، با مولکول‌های زیستی مختلف مانند پروتئین‌ها، لیپید‌ها، پلی ساکارید‌ها، و اسید‌های نوکلئیک مواجه می‌شوند. پروتئین‌هامی‌توانند به راحتی به سطح نانوذرات طلا متصل شده و در اطراف نانوذرات طلا تشکیل یک پروتئین کرونا دهند که انرژی سطحی آزاد نانوذرات طلا را کاهش داده و در توزیع این ذرات در بافت‌ها و اندام‌های مختلف نقش مهمی ایفا می‌کند(5 و 15). شکل‌گیری کرونا می‌تواند ساختار پروتئین‌های جذب شده را تغییر داده و در عملکرد فیزیولوژیک آن‌ها اختلال ایجاد کند. بنابر‌این درک برهمکنش‌های نانوذرات طلا و پروتئین‌ها می‌تواند به عنوان نقطه‌ی آغاز مطالعات اثرات زیستی این نانوذرات محسوب می‌شود

کولین استراز‌ها خانواده‌ای از آنزیم‌ها هستند که هیدرولیز استیل کولین و تبدیل آن به کولین و استات را کاتالیز می‌کنند. این فرآیند برای بازیابی نورون‌های کولینرژیک ضروری می‌باشد. کولین استراز‌ها شامل استیل کولین استراز (AChE; EC 3.1.1.7.) و بوتیریل کولین استراز (BuChE; EC 3.1.1.8) می‌باشند(1 و16 و 20). شباهت این دو آنزیم بالاست (بیش از 50%) اما از نظر اهمیت و محل قرارگیری آنها در بدن، بسیار متفاوت هستند. استیل کولین استراز در نورون‌های کولینرژیک بیان می‌شود و در سلول‌های خونی نیز فعالیت نسبتاً بالای این آنزیم مسئول تجزیه‌ی استیل کولین پلاسما می‌باشد(11 و 17). این آنزیم با هیدرولیز استیل کولین، در انتقالات عصبی کولینرژیک ایفای نقش می‌کند و نام این آنزیم نیز از همین سوبسترای طبیعی (استیل کولین) گرفته شده است. استیل کولین انتقال دهنده‌ی عصبی عمومی است و سیستم عصبی کولینرژیک بر پایه‌ی این انتقال دهنده‌ی عصبی استوار است. ساختار استیل کولین استراز از دهه‌ی 1990 به طور گسترده مورد بررسی قرار گرفته است. با توجه به در دسترس بودن استیل کولین استراز در گونه‌ی electric eel (Torpedo californica)، آزمایشات اولیه بر روی آنزیم این گونه‌ی جانوری انجام شد(23). جایگاه فعال آنزیم استیل کولین استراز، همانند کل ساختار آن، طی تکامل حفظ شده است و دارای نواحی مشابه سایر سرین هیدرولازهاست. کولین استراز‌ها هیدرولازهایی از نوع α/ß هستند که دارای یک مارپیچ α می‌باشند که به صفحه‌ای ß و دارای دومین کاتالیتیک، متصل است(18). این دومین دارای مجموعه‌ی سه تایی کاتالیتیک Ser – His – Glu می‌باشد که در استیل کولین استراز، بوتیریل کولین استراز و لیپازها مشترک است(3 و 7).

به علت رفتار‌های گاهاً پیچیده‌ی پروتئین‌ها در کنار نانوذرات و با هدف پیش‌بینی، تفسیر و تکمیل نتایج به‌دست آمده در آزمایشگاه، علاوه بر روش‌های in vivo و in vitro، روش های محاسباتی جهت مطالعه‌ی رفتار و ساختارهای پروتئینی ارائه شده اند که از این میان، روش شبیه سازی دینامیک مولکولی مورد توجه بیشتری قرار گرفته ‌است(2). این تحقیق، نظر به نقش‌های کلیدی آنزیم استیل‌کولین استراز و کاربرد‌های متعدد نانوذرات طلا در حوزه‌های مختلف، به مطالعه‌ی نحوه برهمکنش نانوذرات طلا با آنزیم استیل‌کولین استراز با استفاده از روش شبیه‌سازی دینامیک مولکولی پرداخته است.

مواد و روشها

شبیه سازی دینامیک مولکولی: در این مطالعه، از نسخه‌ی 5.1.2 نرم‌افزار گرومکس به‌منظور شبیه‌سازی استفاده شده‌است(24). میدان نیروی استفاده شده برای همه‌ی شبیه سازی‌ها،GROMOS96  بوده(22) و از مدل آب(4) SPC برای حل کردن اجزای شبیه سازی استفاده شد. ساختار اولیه مولکول سیترات از پایگاه  atb builder دریافت شده و pdb اولیه‌ی استیل کولین استراز (1DX4) از بانک پروتئین بارگزاری شد(13 و 19). از آنجائیکه نانوذرات مورد استفاده در بخش آزمایشگاهی سیتراته بوده‌اند، در بخش شبیه‌سازی نیز ابتدا هسته‌ی نانوذره‌ی طلا که متشکل از 144 اتم طلا می‌باشد به مدت 100 نانوثانیه در مجاورت تعداد 100 مولکول سیترات قرار داده شد تا طی مدت شبیه سازی تعداد مطلوبی از مولکول‌ها به‌طریق فیزیکی در اطراف این هسته جمع شوند. آخرین تصویر لحظه ای شبیه سازی هسته نانوذره در کنار سیترات، پس از حدف سیترات های جذب نشده به نانوذره، به عنوان فایل pdb ورودی برای شبیه سازی پروتئین در کنار نانوذره استفاده شد. برای خنثی کردن بار محیط از نظر الکترواستاتیکی مقدار مناسبی از یون‌های Na , Cl به محیط اضافه شد. برای حذف نیروهای بزرگ، ناشی از دور بودن احتمالی از ساختار تعادلی، حذف پیوندهای خطا و رسیدن به یک سیستم پایدار، یک مرحله کمینه سازی انرژی نیز انجام گرفت. گام زمانی به کار رفته در انتگرال گیری از معادله حرکت، دو فمتو ثانیه در نظر گرفته شده و برای1000 بار تکرار شد و مختصات سیستم در هر 10 گام ثبت شد. برهمکنشهای لنارد جونز و الکتروستاتیک کوتاه برد تا شعاع 4/1 نانومتر محاسبه شدند و برهمکنشهای الکتروستاتیک دور برد با استفاده از الگوریتم PMEبه دست آمدند. شبیه سازیها نیز در دمای ثابت 300 درجه کلوین و فشار یک بار، براساس روش Parrinello‐Rahman انجام شد(19). برای مشاهده‌ی رفتار طبیعی آنزیم استیل‌کولین‌استراز، پس از قرار دادن آنزیم در آب به مدت 100 نانوثانیه امکان شبیه‌سازی پروتئین محیا شد. این شبیه‌سازی با قرار دادن آنزیم در کنار نانوذرات طلا، مرجع خوبی جهت مقایسه بدست می دهد. در مرحله بعد، نانوذره‌ی طلایی را که در بخش اول شبیه‌سازی آماده شده بود، به همراه آنزیم در باکس شبیه‌سازی قرار داده و به مدت 60 نانوثانیه امکان شبیه‌سازی و برهکنش‌ به سیستم داده شد. سپس نتایج حاصل از این مرحله در کنار نتایج حاصل از مرحله‌ی قبل قرار داده شده و آنالیز‌های زیر در مورد این سیستم‌ها صورت گرفت.

نتایج و بحث

تجمع سیترات در اطراف نانوذرات : به منظور حصول اطمینان از تجمع مولکول‌های سیترات در اطراف نانوذره، از آنالیز RDF یا تابع توزیع شعاعی استفاده شد. بدین منظور در بهش شبیه‌سازی سیترات و نانوذره، RDF این مولکول‌ها نسبت به یکدیگر در 5 نانوثانیه‌ی ابتدایی و انتهایی از شبیه‌سازی تهیه شد و مورد مقایسه قرار گرفت. همان‌طور که در شکل 1 مشاهده می‌شود، نزدیک شدن و حضور سیترات در اطراف نانوذره‌ی طلا در انتهای شبیه‌سازی به خوبی محسوس است.

شکل1- آنالیز RDF سیترات نسبت به نانوذره طلا در 5 نانوثانیه ابتدایی و انتهایی شبیه‌سازی

تصاویر لحظه‌ای بدست آمده در طول شبیه‌سازی نشان دادند که تعداد سیترات‌های جذب شده به نانوذره تا 50 نانوثانیه رو به افزایش بود و در  نانوثانیه‌های 60،  80 و 100 ثابت باقی مانده (18 عدد). فایل pdb نهایی بدست آمده برای شبیه‌سازی در کنار آنزیم استیل‌کولین‌استراز مورد استفاده قرار گرفت. تصویر بدست آمده از یکی از این تصاویر لحظه‌ای با استفاده از نرم افزار PyMol تهیه شده و در شکل 2  نشان داده شده‌است.

شکل 2- جذب فیزیکی یون‌های سیترات به نانوذره‌ی طلا در طول شبیه‌سازی

جذر میانگین مربع انحرافات (RMSD): یکی از شاخص‌های مناسب برای تعیین ساختار پروتئین و تشخیص اینکه آیا پروتئین قادر به حفظ ساختار خود در محیط‌های مختلف است، پارامتر جذر میانگین مربع انحرافات (RMSD) می‌باشد. در شکل (A3) RMSD زنجیره آلفای پروتئین (C alpha) نسبت به ساختار اولیه در آب و در حضور نانوذرات طلا در طول زمان شبیه‌سازی نشان داده شده است. همانطور که در شکل مشاهده می­شود، حضور نانوذرات در کنار آنزیم موجب شده‌اند که میزان نوسانات در backbone کربنی آنزیم کاهش یابد و آزادی ساختار آنزیم کمی محدود‌تر شود.

جذر میانگین نوسانات (RMSF): در آنالیز RMSF می‌توانیم میزان fluctuation ها به تفکیک residue‌های آمینواسیدی و در نواحی مختلفی از پروتئین مشاهده می شود. همانطور که در شکل (B3) نشان داده شده است، در برخی ریشه‌ها نوسانات ساختار افزایش یافته و در برخی دیگر کاهش نوسانات ساختار مشاهده می شود. پس از دقت در این باقیمانده‌ها مشاده شد که در اغلب نواحی که دارای صفحات بتا و یا مارپیچ‌های آلفای بلند هستند، میزان fluctuation افزایش داشته است. اما در نواحی که فاقد ساختار هستند و بیشتر bend و یا random coil هستند این نوسانات کاهش یافته است. یعنی نواحی از پروتئین که ساختار rigid نداشتند در حضور نانوذرات کمی پایدارتر شده‌اند.

شعاع ژیراسیون (Rg): شعاع ژیراسیون هر جسم، پراکنش اجزای آن را در اطراف محور اصلی نشان می‌دهد و با محاسبه شعاع ژیراسیون می‌توان در شرایط مختلف اطلاعاتی کلی در رابطه با میزان فشردگی پروتئین بدست آورد.  نتایج این آنالیز در شکل (C3) نشان داده‌شده است. همان‌طور که مشاهده می‌شود آنزیم استیل‌کولین‌استراز در حالت آزاد در آب شعاع ژیراسیون میانگین باثباتی دارد که نشان می‌دهد خود پروتئین طی مدت زمان شبیه‌سازی پایدار بوده و دناتوره یا فشرده نشده است. از طرفی مشاهده می‌شود که پس از قرار گرفتن نانوذره در مجاورت آنزیم، این شعاع در برخی بازه‌های زمانی طی شبیه‌سازی قدری کاهش یافته است که می‌تواند نشان دهد پروتئین در حضور نانوذره‌ی طلا در برخی لحظات قدری فشرده‌تر شده است. در مناظقی نیز میانگین این دو حالت نسبتاً یکسان است که نشانی از دینامیک پروتئین می‌باشد. در نانوثانیه‌های پایانی شبیه‌سازی این دو مقدار در حال نزدیک شدن به هم هستند و ممکن است در زمان‌های طولانی‌تر شبیه‌سازی کاملا برهم منطبق شده و در همان حالت باقی بمانند و یا ممکن است این سیر دینامیک در زمان‌های طولانی‌تر نیز ادامه یابد.

شکل 3- A) جذر میانگین مربع انحرافات (RMSD) پروتئین در حضور آب و نانوذرات طلا، B) جذر میانگین نوسانات (RMSF) آنزیم در حضور آب و نانوذرات طلا، C) مقایسه‌ی شعاع ژیراسیون آنزیم در آب و در حضور نانوذره‌ی طلا

ناحیه‌ی برهمکنش نانوذره طلا و آنزیم: به منظور دست‌یابی به فهم بهتر از برهمکنش نانوذره با استیل‌کولین‌استراز، محدوده‌ی برهمکنش نانوذره با آنزیم، با استفاده از نرم‌افزار PyMol مشخص شد. سپس این ناحیه با آنالیز‌های انرژی مورد بررسی دقیق‌تر قرار گرفت و ریشه‌های دخیل در اتصال با استفاده از این آنالیز مشخص شدند (شکل 4). تصاویر لحظه‌ای این میانکنش‌ها و ریشه‌های درگیر در شکل 5 قابل مشاهده است. همان‌طور که در این شکل پیداست طی این برهمکنش دو لوپ از ساختار آنزیم درگیر شده‌اند. آمینو‌اسید‌هایی که در حلقه‌ی اول تماس بیشتری با پروتئین داشتند، آمینواسید‌های 466، 468، 469 بودند (که در آنالیز‌ها از این ناحیه با عنوان LoopI مشخص شده است). و ناحیه‌ی دوم، لوپی بود که آمینو‌اسید‌های 497، 498، 499 آن بیشتر با نانوذره ما درگیر شده‌اند (LoopII).

شکل 4- آنالیز انرژی اتصالی کل در لوپ‌های 1 و 2 (مناطقی از آنزیم که با نانوذره در ارتباط هستند)

شکل 5- مناطق 1 و 2 درگیر در برهمکنش با نانوذره‌ی طلا. A: آمینواسید‌های درگیر برهمکنش B: نانوذره متصل به استیل‌کولین‌استراز (آمینواسید‌های قطبی با رنگ سبز و آمینواسید‌های بازی با رنگ آبی مشخص شده‌اند) C: چرخش 180 درجه ای شکل برای مشخص شدن آمینواسید‌های پشتی

آنالیز RDF لوپ‌های 1 و 2 نیز حاکی از میانکنش این نواحی با نانوذره می‌باشد. همین‌طور که در شکل 6 مشاهده می‌شود، یک پیک واضح در دو نمودار وجود دارد که مربوط به برهمکنش‌های غیرقطبی است. مشاهده می‌شود که فراوانی حضور نانوذره در مجاورت حلقه‌ی 2 طی مدت زمان شبیه‌سازی بسیار بالا بوده و این نانوذره در فاصله‌ی 1 نانومتری بیشترین حضور را در اطراف این حلقه دارد در صورتیکه در فاصله در مورد حلقه‌ی 1 بیشتر و در حدود 5/1 نانومتر بوده است. از داده های این نمودار می‌توان نتیجه گرفت که نانوذره به حلقه‌ی 2 نزدیک‌تر بوده و زمان بیشتری را با برهمکنش‌های غیرقطبی محکم‌تری با این حلقه درگیر بوده است.

شکل 6- آنالیز RDF نواحی برهمکنش‌دهنده از آنزیم با نانوذره طلا

بررسی ساختار ثانویه (DSSP): برای بررسی تغییرات احتمالی در ساختار دوم از روش DSSP استفاده شد. در داده‌های حاصل از این روش، محور عمودی نمودار، ساختمان دومی که هر یک از اسیدآمینه‌ها در طول زمان شبیه‌سازی به خود می‌گیرند و محور افقی آن مدت زمان شبیه‌سازی را بر حسب پیکوثانیه نشان می‌دهد. همانطور که در شکل‌ 7 مشاهده می­شود، تغییراتی که مشاهده می‌شوند بسیار جزئی و در حد باقیمانده‌مانده‌های آمینواسیدی هستند و تغییرات چشمگیر و قابل توجهی در ساختار‌های ثانویه‌ی آنزیم در دو حالت آزاد و متصل به نانوذره نمی‌بینیم.

شکل7- A) نمودار DSSP آنزیم در حضور آب، B) نمودار DSSP آنزیم در حضور نانوذره طلا

در ادامه برای کسب فهم بهتر و واضح‌تری از نمودار های بالا، درصد هریک از ساختار‌های ثانویه (s-count) در آنزیم، در دو حالت آزاد و متصل به نانودره، بررسی شد. نتیجه در جدول 1 نمایش داده شده‌است.

جدول 1- درصد ساختار‌های ثانویه‌ی استیل‌کولین استراز در حضور و غیاب نانوذره ی طلا

همان‌طور که مشاهده می‌شود، اتصال نانوذره موجب تغییرات چشم‌گیری در ساختار ثانویه‌ی استیل‌کولین‌استراز و درصد ساختار‌های ثانویه‌ی اصلی (α و ß) نشده است و پروتئین در‌حضور نانوذره نیز قادر به حفظ ساختار ثانویه‌ی خود بوده است.

ارزیابی فاصله (Distance): جهت درک موقعیت نانوذره نسبت به پروتئین و جذب شدن آن به سطح پروتئین، فاصله‌ی این دو جزء از شبیه‌سازی مورد سنجش قرار گرفت. همین‌طور که در شکل 8 نشان داده شده است، فاصله‌ی نانوذره از پروتئین طی شبیه‌سازی کم و کم‌تر شده که نشان‌دهنده‌ی جذب شدن نانوذره به سطح پروتئین می‌باشد.

شکل 8- فاصله‌ی نانوذره‌ی طلا از آنزیم استیل‌کولین‌استراز طی مدت شبیه‌سازی

تابع توزیع شعاعی (RDF): همبن‌طور که اشاره شد، با به‌دست آوردن تابع توزیع شعاعی، می‌توان از فراوانی و احتمال حضور یک ذره طی کل مدت شبیه‌سازی در فاصله‌ی مشخصی از یک ذره‌ی دیگر اطلاعاتی بدست آورد. بنابراین، تابع توزیع شعاعی (RDF) نانوذره نسبت به پروتئین سنجیده  شد (شکل 9).

شکل 9- نمودار تابع توزیع شعاعی نانوذره نسبت به آنزیم

این نمودار به ما نشان می‌دهد که در طول مدت شبیه‌سازی (60 نانوثانیه)، محتمل‌ترین و فراوان‌ترین فاصله‌ی بین مرکز جرم نانوذره و مرکز جرم پروتئین 5/2 نانومتر بوده است که با توجه به قطر نانوذره و این امر که نانوذره در بیشتر طول شبیه‌سازی به پروتئین متصل می‌باشد، منطقی به‌نظر می‌رسد. همچنین در نمودار در فاصله‌ی 4/0 نانومتری پیک مشخصی مشاهده می‌شود که مربوط به پیوند واندروالسی می‌باشد. بنابراین می‌توان نتیجه گرفت که پیوند بین نانوذره و پروتئین از نوع برهمکنش‌های غیرقطبی می‌باشد.

نتیجه گیری

در این مطالعـه برهمکنش نانـوذرات طـلا و آنزیـم استیـل

کولین استراز با استفاده از شبیه سازی دینامیک مولکولی مورد بررسی قرار گرفت. طی آنالیز DSSP مشاهده شد که طی برهمکنش نانوذرات طلا با استیل‌کولین استراز، تغییرات ساختار ثانویه‌ی بارزی در پروتئین رخ نمی‌دهد. از طرفی نتایج حاصل از آنالیز‌های RMSD و شعاع ژیراسیون، بیان‌گر فشردگی کم ساختار سوم پروتئین می‌باشد. بنابراین می‌توان نتیجه گرفت که ساختار پروتئین در حضور نانوذرات طلا دستخوش دگرگونی و یا بازشدن (unfolding) نشده است.. در کل  می توان نتیجه گرفت که نانوذرات طلا در آنزیم استیل‌کولین‌استراز تغییرات کنفورماسیونی شایعی ایجاد نکرده‌اند.