نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی دکترای بیوتکنولوژی، دانشکده علوم و فناوری زیستی، دانشگاه شهید بهشتی، تهران، ایران

2 گروه بیوتکنولوژی ، دانشکده علوم و فناوری زیستی، دانشگاه شهید بهشتی، تهران، ایران

3 دانشجوی دکترای شیمی دارویی، دانشگاه علوم پزشکی، مشهد،

چکیده

عفونت ناشی از ویروس SARS-COV-2 یکی از عوامل اصلی مرگ و میر در قرن 21 است. پژوهش های زیادی با هدف معرفی ترکیبات موثر ضد ویروس SARS-COV-2 بویژه ترکیبات گیاهی در حال انجام است. هدف از پژوهش حاضر، غربالگری بیوانفورماتیکی مهار کننده های پروتئاز اصلی (Mpro ) و پروتئین S ویروس از میان ترکیبات فنولی و ترپنوئیدی گیاهی می باشد. ساختار سه بعدی و شیمیایی پروتئین های ویروس و ترکیبات فنولی و ترپنوئیدی گیاهی از پایگاه  داده های پروتئین و Pubchem دریافت شد. در نهایت ترکیبات گیاهی بر روی پروتئاز اصلی (Mpro ) و پروتئین S ویروس به روش داکینگ مولکولی با استفاده از نرم افزار iGemdock 2.1  بررسی سپس خصوصیات فیزیکوشیمیایی ترکیبات از نظر نفوذپذیری، حلالیت و جذب گوارشی با استفاده از نرم افزار Swiss ADME پیش بینی شد. 4 ترکیب ترپنوئیدی گلیسریزیک اسید ( glycyrrhizic acid)، سیکوساپونین B2 ( Saikosaponin B2 )، پولیفیلین I ( Polyphyllin I )  و ویتافرین A ( Withaferin A ) و 7 ترکیب فنولی EGCG ، رزماریک اسید ( Rosmarinic acid ) ، سیلیبینین ( Silibinin ) ، کلروژنیک اسید ( Chlorogenic acid ) ، پروآنتوسیانیدین ( Proanthocyanidin ) ، پروسیانیدین B2 ( Procyanidin B2 ) و آنتوسیانین ( Anthocyanin ) با داشتن انرژی اتصال قوی در مقایسه با  ترکیبات دارویی مرجع مانند آزیترومایسین ( Azithramycine ) و رمدیسیویر ( Remdesivir) و غیره ، کاندیدهای فیتوشیمیایی بسیار مناسبی برای مهار گلیکوپروتئین S و پروتئاز اصلی ویروس (Mpro ) می باشند. 
طبق نتایج هر دو ترکیب فنولی و ترپنوئیدی در مقایسه با داروهای شیمیایی ، قدرت مهار مناسبی برای پروتئاز Mpro و پروتئین S ویروس دارند و می توانند نامزدهای مناسبی جهت بررسی های in vitro و in vivo  باشند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Investigate the inhibitory effects of plant secondary metabolites Compared with standard drugs on Mpro protease and spike glycoprotein SARS-CoV-2 by Molecular Docking

نویسندگان [English]

  • Donya Poy 1
  • Masoud Tohidfar 2
  • Mahda Sadat Nasrollahzadeh 3

1 PhD student of Biotechnology, College of Life Science and Biotechnology, Department of Biotechnology, Shahid Beheshti University, Tehran, I.R. of Iran

2 College of Life Science and Biotechnology, Department of Biotechnology, Shahid Beheshti University, Tehran, I.R. of Iran

3 Mashhad University of Medical Sciences, Department of Medicinal Chemistry,Pharmacy Faculty

چکیده [English]

The Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) infection is one of the common factors of mortality worldwide in the 21st century. A lot of research is being done in the world with the aim of introducing new and effective SARS-COV-2 antiviral compounds, especially herbal compounds. The purpose of this study to screening main protease (Mpro) inhibitors and spike glycoprotein from among plant phenolic and terpenoid compounds using bioinformatics tools.Three dimension and chemical structures of virus proteins and plant phenolic and terpenoid compounds were retrieval from Protein Data Bank and Pubchem database respectively. Finally, plant compounds on the main protease (Mpro) and virus S virus, molecular docking was investigated using iGemdock 2.1 software and then,In the next step, physicochemical properties of the candidate plant compounds for  permeability, solubility and gastrointestinal absorption were predicted using SwissADME software.4 terpenoid compounds, glycyrrhizic acid, Saikosaponin B2, Polyphyllin I and Withaferin A and 7 phenolic compounds, EGCG ، Rosmarinic acid ، Silibinin ، Chlorogenic acid ، Proanthocyanidin ، Procyanidin B2 , Anthocyanin with Strong binding energy compared to reference medicinal compounds such as Azithramycine and Remdesivir are good candidate for inhibiting spike Glycoprotein and the main protease of the virus (Mpro).According to results both phenolic and terpenoid compounds compared to standard chemical drugs had good inhibitory effects for Mpro proteinase and Spike glycoprotein virus and can be good candidates for in vitro and in vivo studies.

کلیدواژه‌ها [English]

  • "SARS-COV-2"
  • "Mpro proteinase"
  • "Spike glycoprotein"
  • "Phytochemical compounds"
  • "Molecular Docking"

بررسی مهارپذیری متابولیت های ثانویه گیاهی در مقایسه با داروهای شیمیایی بر روی پروتئاز اصلی Mpro و Spike گلیکوپروتئین ویروس SARS-CoV-2 (nCov-19) به روش داکینگ مولکولی

دنیا پوی1، مسعود توحیدفر1* و مهدا سادات نصراله زاده2

1 ایران، تهران، دانشگاه شهید بهشتی، دانشکده علوم و فناوری زیستی، گروه بیوتکنولوژی

2 ایران، مشهد، دانشگاه علوم پزشکی، گروه شیمی دارویی

تاریخ دریافت: 9/4/99                  تاریخ پذیرش: 7/8/99

چکیده

عفونت ناشی از ویروس SARS-COV-2 یکی از عوامل اصلی مرگ و میر در قرن 21 است. پژوهش های زیادی با هدف معرفی ترکیبات موثر ضد ویروس SARS-COV-2 بویژه ترکیبات گیاهی در حال انجام است. هدف از پژوهش حاضر، غربالگری بیوانفورماتیکی مهار کننده های پروتئاز اصلی (Mpro) و پروتئین S ویروس از میان ترکیبات فنولی و ترپنوئیدی گیاهی می باشد. ساختار سه بعدی و شیمیایی پروتئین های ویروس و ترکیبات فنولی و ترپنوئیدی گیاهی از پایگاه  داده های پروتئین و Pubchem دریافت شد. در نهایت ترکیبات گیاهی بر روی پروتئاز اصلی (Mpro) و پروتئین S ویروس به روش داکینگ مولکولی با استفاده از نرم افزار iGemdock 2.1  بررسی سپس خصوصیات فیزیکوشیمیایی ترکیبات از نظر نفوذپذیری، حلالیت و جذب گوارشی با استفاده از نرم افزار Swiss ADME پیش بینی شد. 4 ترکیب ترپنوئیدی گلیسریزیک اسید (glycyrrhizic acid)، سیکوساپونین B2 (Saikosaponin B2)، پولیفیلین I (Polyphyllin I) و ویتافرین A (Withaferin A) و 7 ترکیب فنولی EGCG ، رزماریک اسید (Rosmarinic acid) ، سیلیبینین (Silibinin) ، کلروژنیک اسید (Chlorogenic acid) ، پروآنتوسیانیدین (Proanthocyanidin) ، پروسیانیدین B2 (Procyanidin B2) و آنتوسیانین (Anthocyanin) با داشتن انرژی اتصال قوی در مقایسه با  ترکیبات دارویی مرجع مانند آزیترومایسین (Azithramycine) و رمدیسیویر (Remdesivir) و غیره ، کاندیدهای فیتوشیمیایی بسیار مناسبی برای مهار گلیکوپروتئین S و پروتئاز اصلی ویروس (Mpro) می باشند.

طبق نتایج هر دو ترکیب فنولی و ترپنوئیدی در مقایسه با داروهای شیمیایی ، قدرت مهار مناسبی برای پروتئاز Mpro و پروتئین S ویروس دارند و می توانند نامزدهای مناسبی جهت بررسی های in vitro و in vivo  باشند.

واژه های کلیدی : ویروس SARS-COV-2 ، پروتئاز Mpro ، گلیکوپروتئین S ، ترکیبات گیاهی، داکینگ مولکولی

* نویسنده مسئول ، تلفن : 00989124627014+ ، پست الکترونیکی : gtohidfar@yahoo.com

مقدمه

 

کرونا ویروس ها (CoVs) باعث ایجاد انواع بیماری ها از جمله بیماری های تنفسی ، روده ، کلیه ، مغز و اعصاب در انسان و حیوانات  می شوند. (27). از ابتدای این قرن ، تاکنون سه شیوع بیماری زونوتیک (بیماری هایی که از حیوانات به انسان منتقل می شوند)  از نوع بتا کروناویروس وجود داشته است. در اواخر سال 2019 ، یک کرونا ویروس جدید با نام SARS-CoV-2 در بیماران مبتلا به ذات الریه شدید یافت شده است. ویروس ها از بیماران جدا و توالی یابی شدند. تجزیه و تحلیل فیلوژنتیک آنها نشان داد که این ویروس دارای ارتباط فیلوژنی با نسل B کروناویروس نوع بتا است و دارای ارتباط نزدیک فیلوژنی با SARS  (RaTG13) است که در سال 2013، در چین کشف شد (12، 32). کرونا ویروس جدید 2019 (nCov2019) که اخیرا با عنوان کووید 19 (COVID-19) از آن یاد می شود به عنوان یک عامل بیماریزا در چین با بروز علائم اولیه مانند تب، بیماری شدید تنفسی و پنومونیا ظاهر شد (37).

ویروس SARS-CoV-2 حاوی چهار پروتئین ساختاری به نام های Spike (تاج) ، Envelope (پاکت) ، Membrane (غشاء) و پروتئین Nucleocapsid (نوکلئوکپسید) می باشد. گلیکوپروتئین سطحی (پروتئین S)، یک پروتئین مهم اتصالی برای همجوشی ویروس و غشای سلولی از طریق آنزیم تبدیل کننده آنژیوتانسین 2 گیرنده سلولی (ACE2) است و پروتئین مهم دیگر ، پروتئاز اصلی (Mpro/ 3CLpro) می باشد که یک آنزیم کلیدی برای تکثیر کرونا ویروس است (17، 33).

پروتئاز اصلی کروناویروس (Mpro / 3CLpro) مانند پروتئازهای گیاهی پاپایین (Papain-like proteinase) ، برای پردازش پلی پروتئین هایی که از RNA ویروسی ترجمه میشوند ضروری است. بنابر این مهارفعالیت این آنزیم مانع از تکثیر ویروس می شود. از آنجا که هیچ پروتئاز انسانی با ویژگی هضم مشابه شناخته نشده است ، بعید نیست مهار کننده های پروتئاز اصلی ویروس برای بدن انسان سمی باشند (42). از نظر ساختاری ، پروتئاز اصلی کروناویروس حاوی یک زنجیره A به طول 306 اسید آمینه و از دسته پروتئین  های غیرساختاری ویروس می باشد .گلیکوپروتئین S از نظر ساختاری دارای سه زنجیره A،B وC به طول 1281 aa و دارای دو زیر واحد S1 و S2 می باشد که به ترتیب وظیفه اتصال و همجوشی با غشا را برعهده دارند که بخش C ترمینال زیر واحد S2 مسئول همجوشی ویروس با سلول است (31، 38). از این رو، پروتئاز Mpro و پروتئین S می توانند اهدافی ایده آل برای طراحی و توسعه دارو جهت مهار این ویروس باشند.

دانشمندان در همه حوزه های مرتبط از جمله دانشمندان علوم پایه، علوم پزشکی، داروسازان، متخصصین بیوتکنولوژی و ژنتیک در حال بررسی ابعاد مختلف درمان جهت تولید واکسن یا دارویی موثر برای این ویروس در جهان می باشند. تا کنون از برخی داروها به صورت داروهای ترکیبی برای مهار بیماری کووید 19 در جهان استفاده شده است اما محققان همچنان در پی یافتن واکسن یا دارویی ویژه برای درمان این بیماری هستند چراکه داروهای تجویز شده به تنهایی عملکرد موثری در مهار کامل بیماری نداشته و یا همراه با اثرات جانبی فراوان بر سلولها و بافت های بدن می باشند. گیاهان یکی از منابع ترکیبات فعال دارویی هستند که کاربرد گسترده ای در درمان بیماری های ناشی از میکروب ها دارند (10، 25، 35). بسیاری از ترکیبات گیاهی فعال زیستی گزارش شده، دارای فعالیتهای ضد قارچ ، ضد باکتری و ضد ویروسی هستند (7، 26، 29). گیاهان و محصولات مشتق شده گیاهی نسبت به روش های معمول درمانی مزایایی همچون ساده بودن، ایمنی بیشتر، سمیت کمتر، هزینه کمتر، سرعت عمل بالاتر و سازگاری با محیط زیست را دارا می باشند (13). جستجو برای یافتن کاندیداهای بالقوه از میان ترکیبات گیاهی که بتوانند بدون عوارض جانبی یا با عوارض جانبی کمتر ویروس را مهار کنند در بیماری های ویروسی مشابه مانند ایدز، هپاتیت C و HSV انجام شده است (34). از میان ترکیبات متنوع گیاهی، ترکیبات فنولی و ترپنوئیدی با داشتن خواص متعدد دارویی همچون ضد سرطان، ضد اکسیدان، ضد التهاب، ضد ویروس، ضد باکتری و حفاظت کننده سیستم ایمنی و کبد، مورد توجه محققان قرار گرفته اند و در مطالعات قبلی، پتانسیل مهار تکثیر ویروس ها و عفونت زایی آنها مشاهده شده است (16، 30).

امروزه به منظور کاهش هزینه و زمان در تولید دارو، توجه زیادی به پیش مطالعات در طراحی دارو به روش های بیوانفورماتیکی معطوف شده است. در این روش، بکارگیری ابزارهای بیوانفورماتیکی و روش های محاسباتی که با ضریب اطمینان بالا اثربخشی ترکیبات دارویی و نیز سمیت احتمالی آنها را پیش بینی میکنند طی سال های اخیر بسیار مورد توجه قرار گرفته اند (24). داکینگ مولکولی، شبیه سازی، تعیین نقطه هدف و بررسی های پایداری شیمیایی، از مهم ترین روش های بیوانفورماتیکی استفاده شده در طراحی دارو هستند. در این میان، داکینگ مولکولی از جایگاه ویژه ای برخوردار است. در این تکنیک می توان با در نظر گرفتن حالت های مختلف مولکول های مورد نظر در فضای سه بعدی و پیش بینی چگونگی تعامل پروتئین گیرنده با ترکیبات فعال زیستی (لیگاند) ، نحوه میان کنش آن ها را بررسی کرد و عوامل موثر در برهم کنش پایدارتر و مهم از لحاظ شناخت دارو را تعیین نمود (9).

این تحقیق با توجه به گزارش های تایید شده قبلی در خصوص پتانسیل ترکیبات فعال زیستی و برخی از ترکیبات گیاهی (phitochemical) در پیشگیری و درمان عفونت های ویروسیِ چندین ترکیب فعال زیستی شناخته شده مانند ترکیبات فنولی و ترپنوئیدی گیاهی به عنوان کاندیدهای دارویی موثر برای غلبه بر کووید 19 با استفاده از داکینگ مولکولی بررسی شده است.

مواد و روشها

جمع آوری داده: این پژوهش به شیوه توصیفی-تحلیلی انجام شد. در گام نخست از میان ترکیبات موثر گیاهان دارویی دو گروه ترکیبات فنولی و ترپنوئیدی که دارای خاصیت ضد ویروسی بودند انتخاب شدند و در گام بعدی از میان 100 ترکیب فنولی و ترپنوئیدی، 22 ترکیب فنولی و 8 ترکیب ترپنوئیدی که بر اساس مقالات پیشین، خاصیت ضد ویروسی آنها بر روی بیماری هایی مانند آنفولانزا، HIV ، HPV و سرطان های مختلف مانند سرطان کبد اثبات شده بود، به عنوان لیگاند انتخاب شدند که فرمول ترکیبات و کد دسترسی به آنها در PubChem در جدول 1 آورده شده است. ساختار سه بعدی لیگاندهای مذکور از پایگاه داده های شیمیایی به آدرس (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov) دریافت شد و برای ساختارهایی که ساختار سه بعدی آن ها در سایت مذکور وجود نداشت، از روی ساختار دو بعدی موجود در سایت، با کمک نرم افزار Chem Draw Ultra 7.0 ساختار سه بعدی آن ترکیبات نیز تهیه شد. ساختار سه بعدی پروتئاز Mpro و Spike گلیکوپروتئین SARS-CoV-2 نیز از پایگاه داده های پروتئین به آدرس (http://www.rcsb.org) به ترتیب با شماره دسترسی 6LU7 و 6VXX دریافت شد.

به منظور بررسی برهمکنش لیگاند و رسپتور (گیرنده) در پایدارترین حالت از لحاظ انرژی و ساختار، پیش از بررسی نهایی، همه ساختارهای مولکولی از نظر انرژی برهمکنش اپتیمایز شد، سپس ساختاری که دارای کمترین انرژی است، انتخاب و جهت مطالعات داکینگ توسط برنامه iGEMDOCKv2.1 آنالیز شد. در پروتئین رسپتور،  محل اسید آمینه ها به عنوان جایگاه فعال ، جاییکه لیگاندها به آن متصل می شوند با استفاده از یک پایگاه پروتئین به آدرس (https://www.uniprot.org) مشخص شد. در مورد پروتئاز (Mpro) از کل ساختار به عنوان رسپتور استفاده شد اما به جهت بزرگ بودن پروتئین S و جهت بررسی رقابت میان آنالوگ های گیاهی هدف، با پروتئین S  ، برای اتصال به گیرنده سلولی انسان، تنها از بخش های دومین اتصالی پروتئین S ، براى پیدا کردن بهترین جهت گیرى یک لیگاند در یک کمپلکس با حداقل انرژى استفاده شد. بخش های دومین اتصالی این پروتئین،  شامل ناحیه دومین اتصالی به رسپتور (RBD) از اسید آمینه 319-541 و ناحیه اتصال رسپتور به گیرنده (ACE2) در سطح سلولی انسان از اسید آمینه 437-508 به عنوان دومین های قابل بررسی جدا شدند.

 

جدول 1- ترکیبات فنولی و ترپنوئیدی گیاهی کاندید شده جهت بررسی بیوانفورماتیکی مهارکننده های آنزیم Mpro و پروتئین S ویروس  SARS-CoV-2 بر اساس پایگاه داده های شیمیایی PubChem

ردیف

نوع ترکیب

نام ترکیب

کد دسترسی در pubchem

فرمول مولکولی

1

ترکیبات فنولی

Anethole

637563

C10H12O

2

Apigenin

5280443

C15H10O5

3

Caffeic acid

689043

C9H8O4

4

EGCG

65064

C22H18O11

5

Eugenol

3314

C10H12O2

6

Glabridin

124052

C20H20O4

7

Liquiritigenin

114829

C15H12O4

8

Menthol

1254

C10H20O

9

Rosmarinic acid

5281792

C18H16O8

10

Isoimperatorin

68081

C16H14O4

11

Osthole

10228

C15H16O3

12

oxypeucedanin hydrate

17536

C16H16O6

13

psoralen

6199

C11H6O3

14

Quercetin

5280343

C15H10O7

15

Silibinin

31553

C25H22O10

16

Thymol

6989

C10H14O

17

Gingerol

442793

C17H26O4

18

Carvacrol

10364

C10H14O

19

Proanthocyanidin

108065

C31H28O12

20

Procyanidin B2

122738

C30H26O12

21

Anthocyanin

131751682

C57H59O35+

22

Chlorogenic acid

1794427

C16H18O9

1

ترکیبات ترپنوئیدی

Safficinolide

85152699

C20H24O5

2

Oleanolic acid

10494

C30H48O3

3

Ursolic acid

64945

C30H48O3

4

glycyrrhizic acid

14982

C42H62O16

5

Withanolide

53477765

C28H38O6

6

Saikosaponin B2

21637642

C42H68O13

7

Withaferin A

265237

C28H38O6

8

Polyphyllin I

11018329

C44H70O16

 


پیش بینی خصوصیات فیزیکوشیمیایی لیگاندهای مورد بررسی: بطول کلی ، دارا بودن خصوصیات فیزیکوشیمیایی مطلوب در کنار اثربخشی دارویی از جمله شاخص های مهم جهت ارزیابی یک مولکول به عنوان یک کاندید دارویی مناسب است. لذا در پژوهش حاضر، خصوصیات فیزیکوشیمیایی شامل حلالیت در آب، مساحت قسمت های قطبی مولکول (TPSA)، پخش و نفوذ (LogD) و قابلیت مهار  سیتوکرومی که در طراحی  پیش دارو بصورت خوراکی یا تزریق وریدی یا جذب پوستی نقش دارند با استفاده از سرور SWISSADME به آدرس http://www.swissadme.ch بر اساس قانون لیپینسکی پیش بینی شد. سرور مذکور یک نرم افزار آنلاین است که با دریافت اطلاعات مولکول شیمیایی در قالب فایل Mol یا Smile امکان پیش بینی خصوصیات فیزیکوشیمیایی را فراهم می آورد. جهت مقایسه شاخص های عملکرد ترکیبات فنولی و ترپنوئیدی  گیاهی  و دستیابی به نتایج قابل اطمینان برهمکنش مولکولی ، 10 داروی بکار رفته در درمان بیماری کووید 19 به شرح جدول 2 براساس کد دسترسی در pubchem در مهار پروتئاز اصلی (Mpro) و پروتئین S ویروس مورد مطالعه  قرار گرفت. فرمول مولکولی و کد دسترسی به این داروها از پایگاه داده ای DrugBank به آدرس (www.drugbank.ca) و پایگاه Pubchem به آدرس (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov) دریافت شد و مورد استفاده قرار گرفت.

 

جدول 2- بررسی داروهای مورد مطالعه بر اساس پایگاه داده های شیمیایی PubChem

ردیف

نام دارو

کد دسترسی در pubchem

فرمول مولکولی

1

chloroquine

2719

C18H26ClN3

2

Hydroxychloroquine

3652

C18H26ClN3O

3

Favipiravir

492405

C5H4FN3O2

4

Remdesivir

121304016

C27H35N6O8P

5

Ribavirin

37542

C8H12N4O5

6

Oseltamivir

65028

C16H28N2O4

7

Prednisolone

5755

C21H28O5

8

Azithramycine

55185

C38H72N2O12

9

Ritonavir

392622

C37H48N6O5S2

10

Lopinavir

92727

C37H48N4O5

 


داکینگ مولکولی: به منظور ارزیابی ترکیبات فنولی و ترپنوئیدی مورد بررسی در مهار آنزیم Mpro و پروتئین S ویروس SARS-CoV-2 از روش داکینگ مولکولی با استفاده از نرم افزار iGEMDOCKv2.1 استفاده شد. پارامترهای استفاده شده جهت انجام داکینگ مولکولی در این نرم افزار برای تمامی ترکیبات مورد بررسی ثابت و بصورت نوع داکینگ استاندارد، قطر ناحیه بر همکنش 200 آنگسترم، تعداد دفعات برهمکنش 70 و بررسی میان کنش های هیدروژنی، الکترواستاتیکی و واندروالسی در کل جایگاه فعال آنزیم بود و نتایج حاصل با هم مقایسه شد.

 

نتایج

بررسی انرژی اتصال و خصوصیات فیریکوشیمیایی داروهای مورد مطالعه به عنوان کنترل مثبت: نتایج حاصل از بررسی داروهای بکار رفته به عنوان کنترل مثبت در ردیف های 4، 8 و 10 در جدول شماره 3، حاکی از برهمکنش مستحکم 4 مورد از آن ها به نام های رمدیسیویر (Remdesivir) ، ریباویرین (Ribavirin) ، لوپیناویر (lopinavir) ، ریتوناویر (Ritonavir) به ترتیب با انرژی مهاری منفی تر 38/96- ، 38/97- ، 57/102- ، 72/109- با جایگاه فعال آنزیم پروتئاز Mpro بود. داروهای رمدیسیویر (Remdesivir) ، لوپیناویر (lopinavir)  و ریتوناویر (Ritonavir)  به ترتیب با انرژی های مهاری 82/92- ، 14/98- ، 19/98- کیلوژول و انرژی مهاری 06/116- ، 01/119- و 48/105- کیلوژول اثر بازدارندگی قوی تری به جهت دارا بودن انرژی مهاری منفی­تر ، به ترتیب روی دومینهای ACE2 و RBD پروتئین  S  نشان دادند. طبق نمودار شماره 1، داروهای  لوپیناویر (lopinavir) ، ریتوناویر (Ritonavir)  و رمدیسیویر (Remdesivir)  که به عنوان اولین کاندید امید بخش در درمان ویروس کرونا یاد می شود، با داشتن انرژی برهمکنش منفی تر ، تاثیر مهاری قوی تری روی پروتئین  S نسبت به پروتئاز Mproدارند. بر اساس جدول شماره 3،  طبق ردیف های 4، 6، 7، 8 و 10 تاثیر داروها  در مهار ویروس قبل از ورود به سلول با اثر بازدارندگی روی پروتئین S و طبق ریف های 4، 5 ، 8 و 10 تاثیر داروها بعد از ورود ویروس به داخل سلول در مرحله همانندسازی و تکثیر ویروس با اثر بازدارندگی روی پروتئاز Mpro ، نشان داده شده است.

 

جدول 3- انرژی اتصال داروهای استاندارد مورد مطالعه حاصل از داکینگ با استفاده از نرم افزار iGEMDOCKv2.1

داروهای استاندارد در درمان کووید-19  (به عنوان کنترل مثبت)

ردیف

نام دارو

کد دسترسی در pubchem

میزان انرژی (E) برای اتصال به پروتئین

 6LU7

میزان انرژی (E) برای اتصال به

6vxx-ACE2

میزان انرژی (E) برای اتصال به

6vxx-RBD

1

chloroquine

2719

57/78-

92/68-

39/77-

2

Hydroxychloroquine

3652

75/64-

82/69-

50/89-

3

Favipiravir

492405

93/78-

16/64-

80/74-

4

Remdesivir

121304016

38/96-

82/92-

06/116-

5

Ribavirin

37542

38/97-

67/75-

54/85-

6

Oseltamivir

65028

28/68-

99/68-

02/94-

7

Prednisolone

5755

29/78-

92/85-

91/96-

8

lopinavir

92727

57/102-

14/98-

01/119-

9

Azithramycine

55185

43/88-

43/75-

29/85-

10

Ritonavir

392622

72/109-

19/98-

48/105-

 

 

شکل 1- مقایسه مقدار اتصال انرژی ) ΔG (-kcal / mol پروتئین S و Mpro با داروهای استاندارد بکار رفته، با روش داکینگ مولکولی با استفاده از نرم افزار iGEMDOCKv2.1

 

بر اساس شکل شماره 1، از میان داروهای شیمیایی کاندید شده 3 داروی رمدیسیویر (Remdesivir) ، ریتوناویر (Ritonavir) و لوپیناویر (lopinavir) با بیشترین برهمکنش مولکولی (ΔG بالای 100کیلوکالری بر مول)  و بهترین جهت گیری به عنوان لیگاند، داخل کمپلکس پروتئینی ویروس به عنوان رسپتور ، برای درمان کووید 19 می باشند.

در جدول شماره 4 نیز خصوصیات فیزیکوشیمیایی، میزان TPSA، حلالیت و تاثیر داروها بر سیتوکروم های حیاتی بدن و جذب گوارشی داروها نشان داده شده است.

 

جدول شماره 4- بررسی خصوصیات فیزیکوشیمیایی داروهای استاندارد مورد مطالعه بر اساس قانون لیپینسکی

نام دارو

Logp

logD

ph=7

LogS

TPSA

جذب گوارشی

BBB permeant

مهارکننده سیتوکروم

CYP1A2

مهارکننده سیتوکروم

CYP2C19

مهارکننده سیتوکروم

CYP2C9

مهارکننده سیتوکروم

CYP3A4

مهارکننده سیتوکروم

CYP2D6

Azithramycine

02/4

99/1-

55/6-

08/180

کم

خیر

خیر

خیر

خیر

خیر

خیر

chloroquine

63/4

4/0

55/4-

16/28

بالا

بله

بله

خیر

خیر

بله

بله

Hydroxychloroquine

58/3

23/0-

91/3-

39/48

بالا

بله

بله

خیر

خیر

خیر

بله

Favipiravir

56/0-

81/0-

80/0-

84/88

بالا

خیر

خیر

خیر

خیر

خیر

خیر

Remdesivir

91/1

-

12/4-

36/213

کم

خیر

خیر

خیر

خیر

بله

خیر

Ribavirin

85/1-

77/2-

21/0-

72/143

کم

خیر

خیر

خیر

خیر

خیر

خیر

Oseltamivir

10/1

03/1-

88/1-

65/90

بالا

خیر

خیر

خیر

خیر

خیر

خیر

Prednisolone

62/1

27/1

96/2-

83/94

بالا

خیر

خیر

خیر

خیر

خیر

خیر

Ritonavir

05/6

77/2-

99/6-

26/202

کم

خیر

خیر

خیر

خیر

بله

خیر

Lopinavir

92/5

22/5

64/6-

120

بالا

خیر

خیر

بله

خیر

بله

خیر

 

 

بر اساس قانون لیپینسکی و تعریف قانون 5 ، پیش بینی قابل جذب بودن ترکیبات از راه خوراکی بر اساس وزن مولکولی، فاکتور چربی دوستی و تعداد اتم های دهنده و پذیرنده پیوند هیدروژنی ارائه می شود.  Logp میزان لیپوفیلوسیتی ماده را نشان می دهد که می بایست بین 1 الی 5 باشد (23). پس هر اندازه میزان آن از 5 بزرگتر باشد میزان چربی دوستی ماده بیشتر و جذب گوارشی آن کمتر خواهد بود. Logs نیز میزان حلالیت ماده را نشان می دهد که میزان آن بالای صفر، نشان دهنده حلالیت بالا و میزان کمتر از 10- ، نشان دهنده نامحلول بودن ماده مورد نظر است. فاکتور مهم دیگری که نقش مستقیمی در نفوذپذیری ترکیبات زیست فعال دارد مساحت قسمت های قطبی مولکول (TPSA) می باشد (23). بر اساس مطالعات انجام شده، نفوذپذیری ترکیبات با افزایش جرم ماده و کاهش PSA بیشتر می شود. ترکیباتی که PSA بزرگتر از 140 آنگستروم دارند فاقد نفوذپذیری مناسب می باشند. سیتوکروم ها از آنزیم های مهم در بدن هستند که بطور عمده در کبد و روده یافت می شوند و مولکول های کوچک آلی خارجی مانند سموم یا داروها را اکسید می کنند تا بتوانند از بدن خارج شوند. بنابر این بررسی این سیتوکروم ها در جذب و اثر بخشی دارو بسیار موثر است و چنانچه ترکیب کاندید شده ، مهار کننده این سیتوکروم ها نباشد، می توان عنوان کرد که دارو قابلیت جذب گوارشی خوبی دارد و بصورت خوراکی قابل مصرف می باشد. در نهایت برای اثر بخشی یک دارو به صورت خوراکی، تزریق وریدی یا جذب پوستی باید برآیندی از فاکتورهای ذکر شده را در نظر گرفت. بر اساس جدول شماره 4، علیرغم بالا بودن انرژی اتصال داروهای رمدیسیویر (Remdesivir) ، ریتوناویر (Ritonavir) و ریباویرین (Ribavirin) ، این داروها دارای محلولیت نسبی، نفوذپذیری نامناسب و جذب گوارشی کم می باشند و باید به صورت تزریق وریدی استفاده شوند. اما داروهای کلروکین (chloroquine) ، هیدروکسی کلروکین (Hydroxychloroquine) و فاویپیراویر (Favipiravir) با داشتن انرژی اتصال پایین، دارای نفوذپذیری مناسب و جذب گوارشی بالا می باشند و قابلیت مصرف خوراکی دارند.

 

جدول شماره 5- بررسی خصوصیات فیزیکوشیمیایی ترکیبات فنولی و ترپنوئیدی بر اساس قانون لیپینسکی

نام ترکیب

Logp

logD

PH=7

LogS

TPSA

جذب گوارشی

BBB permeant

مهارکننده سیتوکروم

CYP1A2

مهارکننده سیتوکروم

CYP2C19

مهارکننده سیتوکروم

CYP2C9

مهارکننده سیتوکروم

CYP3A4

مهارکننده سیتوکروم

CYP2D6

Glycyrrhizic acid

80/2

99/5-

24/6-

04/267

کم

خیر

خیر

خیر

خیر

خیر

خیر

Oleanolic acid

49/7

36/4

32/7-

53/57

کم

خیر

خیر

خیر

خیر

خیر

خیر

Safficinolide

31/3

36/4

04/4-

67/80

بالا

خیر

خیر

خیر

بله

بله

خیر

Ursolic acid

34/7

35/4

23/7-

53/57

کم

خیر

خیر

خیر

خیر

خیر

خیر

Withanolide

12/3

78/3

59/4-

36/96

بالا

خیر

خیر

خیر

خیر

خیر

خیر

Polyphyllin I

45/1

25/1

53/5-

68/235

کم

خیر

خیر

خیر

خیر

خیر

خیر

Withaferin A

83/3

58/3

97/4-

36/96

بالا

خیر

خیر

خیر

خیر

خیر

خیر

Saikosaponin B2

53/2

87/0

81/5-

99/218

کم

خیر

خیر

خیر

خیر

خیر

خیر

Anethol

30/3

94/2

11/3-

23/9

بالا

بله

بله

خیر

خیر

خیر

خیر

Apigenin

02/3

13/2

94/3-

90/90

بالا

خیر

بله

خیر

خیر

بله

بله

Caffeic acid

15/1

71/1-

89/1-

76/77

بالا

خیر

خیر

خیر

خیر

خیر

خیر

EGCG

17/1

03/3

56/3-

37/197

کم

خیر

خیر

خیر

خیر

خیر

خیر

Eugenol

27/2

61/2

46/2-

46/29

بالا

بله

بله

خیر

خیر

خیر

خیر

Glabridin

89/3

09/4

61/4-

92/58

بالا

بله

بله

بله

بله

بله

بله

Liquiritigenin

30/2

42/2

28/3-

76/66

بالا

بله

بله

خیر

خیر

خیر

خیر

Menthol

40/3

66/2

88/2-

23/20

بالا

بله

خیر

خیر

خیر

خیر

خیر

Rosmarinic acid

36/2

37/0-

44/3-

52/144

کم

خیر

خیر

خیر

خیر

خیر

خیر

Isoimperatorin

43/3

15/3

96/3-

58/52

بالا

بله

بله

بله

بله

خیر

خیر

Osthole

81/3

35/3

97/3-

44/39

بالا

بله

بله

بله

بله

خیر

خیر

oxypeucedanin hydrate

25/1

16/1

69/2-

04/93

بالا

خیر

بله

خیر

خیر

خیر

خیر

psoralen

67/1

94/1

73/2-

35/43

بالا

بله

بله

خیر

خیر

خیر

خیر

Quercetin

54/1

41/1

16/3-

36/131

بالا

خیر

بله

خیر

خیر

بله

بله

Silibinin

90/1

56/2

14/4-

14/155

کم

خیر

خیر

خیر

خیر

بله

خیر

Thymol

30/3

43/3

19/3-

23/20

بالا

بله

بله

خیر

خیر

خیر

خیر

Gingerol

76/2

62/3

96/2-

76/66

بالا

بله

بله

خیر

خیر

خیر

بله

Carvacrol

49/3

43/3

31/3-

23/20

بالا

بله

بله

خیر

خیر

خیر

خیر

Proanthocyanidin

69/2

25/3

36/5-

76/209

کم

خیر

خیر

خیر

خیر

بله

خیر

Anthocyanin

11/3-

8-

90/4-

07/568

کم

خیر

خیر

خیر

خیر

خیر

خیر

Procyanidin B2

37/2

11/3

14/5-

76/220

کم

خیر

خیر

خیر

خیر

بله

خیر

Chlorogenic acid

42/0-

56/3-

62/1-

75/164

کم

خیر

خیر

خیر

خیر

خیر

خیر

 


بررسی خصوصیات فیزیکوشیمیایی ترکیبات فنولی و ترپنوئیدی گیاهی: بر اساس جدول شماره 5، مشاهده شد که از میان ترکیبات ترپنوئیدی، گلیسریزیک اسید (glycyrrhizic acid)، اولئالونیک اسید (Oleanolic acid)، اورسولیک اسید (Ursolic acid)، پولیفیلین I (Polyphyllin I)، سیکوساپونین B2 (Saikosaponin B2) و از میان ترکیبات فنولی EGCG ، رزماریک اسید (Rosmarinic acid)، سیلیبینین (Silibinin)، پروآنتوسیانیدین (Proanthocyanidin)، آنتوسیانین (Anthocyanin)، پروسیانیدین B2 (Procyanidin B2) و کلروژنیک اسید (Chlorogenic acid) با داشتن محلولیت نسبی، نفوذپذیری نامناسب و جذب گوارشی کم ، قابلیت مصرف خوراکی نداشته و می بایست مانند داروهای رمدیسیویر (Remdesivir) ، ریتوناویر (Ritonavir) و ریباویرین (Ribavirin) در جدول شماره 4 به صورت تزریق وریدی استفاده شوند اما دیگر ترکیبات بررسی شده در جدول با داشتن نفوذپذیری مناسب و جذب گوارشی بالا ، قابلیت مصرف خوراکی دارند.

داکینگ مولکولی: نتایج بدست آمده از داکینگ مولکولی میان ترکیبات گیاهی با پروتئاز Mpro و دومین های ACE2 و RBD پروتئین S در جدول 6 و7 و شکل های 2و3 آورده شده است. بر اساس جدول 6 ، از میان 22 ترکیب فنولی کاندید شده ، اثر مهاری ترکیب های آپی ژنین (Apigenin) ، رزماریک اسید (Rosmarinic acid) ، EGCG ، آنتوسیانین (Anthocyanin) ، کوئرستین (Quercetin) ، کلروژنیک اسید (Chlorogenic acid) ، پروسیانیدین B2 (Procyanidin B2) ، سیلیبینین (Silibinin)، پروآنتوسیانیدین (Proanthocyanidin) به ترتیب با انرژی های مهاری 28/102- ، 58/103- ، 69/103- ، 11/107- ، 17/110- ، 47/110- ، 73/114- ، 83/122- ، 71/128- کیلوژول نسبت به داروهای استاندارد بکار رفته مانند هیدروکسی کلروکین (Hydroxychloroquine) ، اوسلتامیویر (Oseltamivir) ، پردنیزولون (Prednisolone) ، کلروکین (chloroquine)  ، فاویپیراویر (Favipiravir)  ، آزیترومایسین (Azithramycine) ، رمدیسیویر (Remdesivir) و ریباویرین (Ribavirin) به ترتیب با انرژی های مهاری 75/64- ، 28/68- ، 29/78- ، 57/78- ، 93/78- ، 43/88- ، 38/96- و 38/97- کیلوژول روی پروتئاز Mpro قوی تر است. در ادامه مشخص گردید از میان ترکیبات فنولی آپی ژنین (Apigenin) ، رزماریک اسید (Rosmarinic acid)  ، EGCG ، آنتوسیانین (Anthocyanin) ، کوئرستین (Quercetin) به ترتیب با انرژی های مهاری 28/102- ، 58/103- ، 69/103- ، 11/107- ، 17/110- کیلوژول ، اثری مشابه داروهای استاندارد لوپیناویر (lopinavir) و ریتوناویر (Ritonavir) با انرژی مهاری 57/102- و 72/109-کیلوژول در مهار ویروس دارند. از طرفی مشخص شد ترکیبات سیلیبینین (Silibinin) و پروآنتوسیانیدین (Proanthocyanidin) با انرژی های مهاری 83/122- و 71/128-  کیلوژول ، اثر بازدارندگی قوی تری نسبت به داروهای استاندارد لوپیناویر (lopinavir) و ریتوناویر (Ritonavir) با انرژی مهاری 57/102- و 72/109- کیلوژول و حتی آزیترومایسین (Azithramycine) و رمدیسیویر (Remdesivir) با انرژی مهاری 43/88- و 38/96- کیلوژول دارند.

در مقایسه ای دیگر، از میان 22 ترکیب فنولی کاندید شده، ترکیب های کوئرستین (Quercetin)  ، رزماریک اسید (Rosmarinic acid)  ، EGCG ، آنتوسیانین (Anthocyanin)  ، پروسیانیدین B2 (Procyanidin B2) ، پروآنتوسیانیدین (Proanthocyanidin)  به ترتیب با انرژی های 30/93- ، 09/97- ، 92/104- ، 10/107- ، 50/112- و 04/114-کیلوژول نسبت به داروهای استاندارد به کار رفته مانند رمدیسیویر (Remdesivir)، لوپیناویر (lopinavir)  و ریتوناویر (Ritonavir) به ترتیب با انرژی های معادل 82/92- ، 14/98- و 19/98- کیلوژول دارای اثر مهاری قوی تر روی دومین ACE2  پروتئین S  می باشد. همچنین ترکیب های EGCG ، سیلیبینین (Silibinin) ، پروآنتوسیانیدین (Proanthocyanidin) ، کلروژنیک اسید (Chlorogenic acid) ، آنتوسیانین (Anthocyanin) ، رزماریک اسید (Rosmarinic acid)، پروسیانیدین B2 (Procyanidin B2) به ترتیب با انرژی های مهاری 38/113- ، 24/116- ، 118/120- ، 98/120- ، 60/122- ، 76/128- ، 59/138- کیلوژول نسبت به داروهای استاندارد به کار رفته مانند رمدیسیویر (Remdesivir)، لوپیناویر (lopinavir)  و ریتوناویر (Ritonavir) به ترتیب با انرژی های معادل 82/92- ، 14/98- و 19/98- کیلوژول دارای اثر مهاری قوی تر روی دومین RBD پروتئین S  می باشد.

در مقایسه اثر مهاری ترکیبات فنولی روی هر دو پروتئین مورد بررسی ویروس، اثر بازدارندگی قوی تر آنها روی دومین RBD پروتئین S با میانگین انرژی مهاری 15/91- کیلوژول بیشتر از پروتئاز Mpro با میانگین انرژی مهاری 09/82- و دومین ACE2 پروتئین S با میانگین انرژی مهاری 36/81- کیلوژول مشاهده شد بنابر این می توان گفت اثر مهاری ترکیبات فنولی روی پروتئین S بیشتر از پروتئاز Mpro می باشد.


جدول6- پیش بینی برهمکنش بین لیگاندهای فنولی، پروتئاز Mpro و دومین های RBD و ACE2 پروتئین S ویروس SARS-CoV-2 با روش داکینگ مولکولی با استفاده از نرم افزار iGEMDOCKv2.1

ردیف

ترکیبات فنولی

کد دسترسی در Pubchem

میزان انرژی (E) برای اتصال به پروتئین 6LU7

میزان انرژی (E) برای اتصال به 6vxx-ACE2

میزان انرژی (E)

برای اتصال به

 6vxx-RBD

1

Anethole

637563

78/68-

66/51-

26/61-

2

Apigenin

5280443

28/102-

35/82-

37/90-

3

Caffeic acid

689043

47/76-

95/58-

65/75-

4

EGCG

65064

69/103-

92/104-

38/113-

5

Eugenol

3314

33/63-

09/60-

34/63-

6

Glabridin

124052

18/84-

88/83-

06/85-

7

Liquiritigenin

114829

98/84-

87/86-

46/87-

8

Menthol

1254

85/62-

16/53-

27/58-

9

Rosmarinic acid

5281792

58/103-

09/97-

76/128-

10

Isoimperatorin

68081

48/74-

65/72-

60/85-

11

Osthole

10228

57/72-

47/69-

19/74-

12

oxypeucedanin hydrate

17536

01/80-

26/84-

78/86-

13

Psoralen

6199

7/88-

37/71-

35/71-

14

Quercetin

5280343

17/110-

30/93-

86/90-

15

Silibinin

31553

83/122-

107-

24/116-

16

Thymol

6989

92/54-

68/54-

45/60-

17

Gingerol

442793

54/88-

15/73-

70/93-

18

Carvacrol

10364

79/56-

57/60-

38/59-

19

Proanthocyanidin

108065

71/128-

04/114-

18/120-

20

Procyanidin B2

122738

73/114-

50/112-

59/138-

21

Chlorogenic acid

1794427

47/110-

89/90-

98/120-

22

Anthocyanin

131751682

11/107-

10/107-

60/122-

 

بر اساس جدول شماره 7 ، از میان 8 ترکیب ترپنوئیدی کاندید شده، اثر بازدارندگی ترکیب های سیکوساپونین B2 (Saikosaponin B2) ، گلیسریزیک اسید (glycyrrhizic acid)، ویتافرین A (Withaferin A) ، ویتانولید (Withanolide) و پولیفیلین I (Polyphyllin I) به ترتیب با انرژی های معادل 05/97- ،72/97- ، 35/98- ، 07/101- و 49/107- کیلوژول نسبت به داروهای استاندارد هیدروکسی کلروکین (Hydroxychloroquine)، اوسلتامیویر (Oseltamivir) ، پردنیزولون (Prednisolone) ، کلروکین (chloroquine) ، فاویپیراویر (Favipiravir) ، آزیترومایسین (Azithramycine) ، رمدیسیویر (Remdesivir) ، ریباویرین (Ribavirin) و لوپیناویر (lopinavir) به ترتیب با انرژی های معادل 75/64- ، 28/68- ، 29/78- ، 57/78- ، 93/78- ، 43/88- ، 38/96- ، 38/97- و 52/102- کیلوژول روی پروتئاز Mpro قوی تر می باشد.

 

 

شکل2- مقایسه مقدار اتصال انرژی ) ΔG (-kcal / mol پروتئین S و Mpro با چند نامزد ترکیبات فنولی مهارکننده با روش داکینگ مولکولی با استفاده از نرم افزار iGEMDOCKv2.1

جدول7- پیش بینی برهمکنش بین لیگاندهای ترپنوئیدی و پروتئاز Mpro و دومین های RBD و ACE2 پروتئین S ویروس

 SARS-CoV-2 با روش داکینگ مولکولی با استفاده از نرم افزار iGEMDOCKv2.1

ردیف

ترکیبات ترپنوئیدی

کد دسترسی در Pubchem

میزان انرژی (E) برای اتصال به پروتئین 6LU7

میزان انرژی (E) برای اتصال به 6vxx-ACE2

میزان انرژی (E)

برای اتصال به

 6vxx-RBD

1

Safficinolide

85152699

22/87-

53/78-

17/92-

2

Oleanolic acid

10494

65/83-

83/76-

07/92-

3

Ursolic acid

64945

91/78-

03/78-

48/97-

4

glycyrrhizic acid

14982

72/97-

51/97-

22/101-

5

Withanolide

53477765

07/101-

22/96-

57/96-

6

Saikosaponin B2

21637642

05/97-

99/97-

32/95-

7

Withaferin A

265237

35/98-

22/105-

34/107-

8

Polyphyllin I

11018329

49/107-

75/104-

102-

 

 

در میان ترکیبات کاندید شده ترپنوئیدی، ترکیبهای گلیسریزیک اسید (glycyrrhizic acid) ، سیکوساپونین B2 (Saikosaponin B2)، پولیفیلین I (Polyphyllin I) و ویتافرین A (Withaferin A) به ترتیب با انرژی های معادل 51/97- ، 99/97- ، 75/104- و 22/105- کیلوژول قوی ترین اثر بازدارندگی را روی دومین ACE2 پروتئین S ویروس نسبت به داروهای استاندارد هیدروکسی کلروکین (Hydroxychloroquine)، اوسلتامیویر (Oseltamivir) ، پردنیزولون (Prednisolone) ، کلروکین (chloroquine) ، فاویپیراویر (Favipiravir) ، آزیترومایسین (Azithramycine) ، رمدیسیویر (Remdesivir) ، ریباویرین (Ribavirin) و لوپیناویر (lopinavir) به ترتیب با انرژی های معادل 75/64- ، 28/68- ، 29/78- ، 57/78- ، 93/78- ، 43/88- ، 38/96- ، 38/97- و 52/102- کیلوژول و همین ترکیبات ذکر شده ترپنوئیدی با انرژی های معادل 22/101- ، 32/95- ، 102- و 34/107- کیلوژول قوی ترین اثر بازدارندگی را روی دومین RBD پروتئین S ویروس نسبت به داروهای استاندارد ذکر شده دارند. در مقایسه اثر مهاری ترکیبات ترپنوئیدی روی هر دو پروتئین مورد بررسی ویروس، اثر بازدارندگی قوی تر آنها روی دومین RBD پروتئین S با میانگین انرژی مهاری 02/98- کیلوژول بیشتر از پروتئاز Mpro با میانگین انرژی مهاری 95/93- و دومین ACE2 پروتئین S با میانگین انرژی مهاری 88/91- کیلوژول مشاهده شد بنابر این می توان گفت اثر مهاری ترکیبات فنولی روی پروتئین S بیشتر از پروتئاز Mpro می باشد.


 

شکل 3- مقایسه مقدار اتصال انرژی ) ΔG (-kcal / mol پروتئین S و Mpro  با چند ترکیب ترپنوئیدی مهارکننده، با روش داکینگ مولکولی با استفاده از نرم افزار iGEMDOCKv2.1

 

طبق شکل شماره 4 ، از نظر مقایسه میان ترکیبات فنولی و ترپنوئیدی در مواجه با ویروس و مهار آن، نسبت به داروهای استاندارد به کار رفته، ترکیبات فنولی عملکرد بهتری نسبت به ترکیبات ترپنوئیدی از خود نشان می دهند و اثر بازدارندگی تعدادی از ترکیبات فنولی بسیار نزدیک به داروهای استاندارد بکار رفته در آزمایش های بالینی است.

 

 

شکل 4- مقایسه ترکیبات ترپنوئیدی و فنولی مهارکننده ویروس SARS-CoV-2  نسبت به داروهای استاندارد بکار رفته با روش داکینگ مولکولی با استفاده از نرم افزار iGEMDOCKv2.1

 

در نهایت، نتایج نشان داد که هر دو ترکیب فنولی و ترپنوئیدی در مقایسه با داروهای استاندارد به کار رفته، قدرت مهار مناسبی برای پروتئاز Mpro و پروتئین S مذکور دارد.

بحث و نتیجه گیری

با توجه به پاندمی کرونا ویروس در جهان و تلاش دانشمندان برای کشف دارو و واکسنی موثر بر علیه بیماری کووید 19، هم چنان هیچ واکسن یا دارویی برای آن تایید نشده است. از این رو دانشمندان در حوزه های مختلف علوم پایه، پزشکی، ژنتیک، بیوتکنولوژی و شیمی و داروسازی در حال بررسی بر روی مواد موثر دارویی جهت مهار این ویروس کشنده می باشند. اخیرا پس از اعلام سازمان بهداشت جهانی در خصوص پاندمی بودن بیماری، متخصصین در جهان ژنوم ویروس را توالی یابی نموده و تحقیقات ژنتیکی بر روی ژنوم این ویروس آغاز شد (39). از آنجا که پروتئین S در سطح ویروس، بطور مؤثر با ACE2 در سطوح سلول های انسانی اتصال برقرار می کند انتقال ویروس SARS-Cov-2 به راحتی انجام می پذیرد. از طرفی پروتئاز Mpro نیز برای پردازش پلی پروتئین هایی که از RNA ویروس ترجمه میشوند ضروری است و مهارفعالیت این آنزیم مانع از تکثیر ویروس می شود. بنابر این پروتئاز  Mpro و پروتئین  S اهداف ایده آلی برای طراحان  دارو علیه این ویروس هستند. علیرغم تلاش های جهانی برای دست آوردن واکسن یا دارویی ویژه برای درمان بیماری کووید 19 ، تاکنون از میان داروهای ضد ویروسی قدیمی داروی  Remdesivir امیدوار کننده ترین داروی شیمیایی COVID-19 اعلام شده است که البته با عوارض جانبی بسیاری نیز همراه است، اگرچه FDA استفاده از کلروکین و هیدروکسی کلروکین را نیز تصویب کرده است (43).

کشف اثرات درمانی یک ترکیب شیمیایی، تازه آغاز راهی است که ممکن است تحقیق، توسعه و اجرای آن سالیان سال به طول بیانجامد. در حقیقت زمان بر بودن، پر هزینه بودن و عدم دسترسی آسان به مواد اولیه دارویی جهت سنتز و داشتن عوارض جانبی متعدد داروهای شیمیایی از معایب داروهای شیمیایی می باشد. یکی از راهکارهای نوین درمانی ، غیر از طراحی و سنتز شیمیایی داروها، جستجوی مواد موثره دارویی در بین ترکیبات طبیعی به منظور دست یابی به داروهایی با کمترین اثرات جانبی و صرف هزینه و زمان کوتاهتر است.

در پژوهش حاضر، اثربخشی ترکیبات فعال گیاهان دارویی مانند ترکیبات فنولی و ترپنوئیدی که خصوصیت ضد ویروسی آنها قبلا در مقالات مختلف تایید شده است (3، 6، 8، 18، 19، 20) در مهارپروتئاز اصلی (Mpro/ 3CLpro) و گلیکوپروتئین سطحی (پروتئین S) ویروس با استفاده از داکینگ مولکولی مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج نشان داد که این ترکیبات میتوانند به طور موثری از ورود ویروس به سلول و یا از تکثیر و همانندسازی آن بعد از ورود به سلول جلوگیری نمایند (27). ترکیبات فنلی که نسبت به ترپنوئید ها حلالیت بیشتری در آب دارند شامل گروه کثیری از متابولیتهای ثانویه هستند که بسیاری از ترکیبات حلقوی مثل ترکیبات فنلی، فلاون ها، فلاونوئیدها، تانن ها، لیگنین ها و حتی اسیدهای آمینه حلقوی مانند تریپتوفان، تیروزین و پرولین را شامل می‌شوند. به طور کلی فنل ها مجموعه‌ای از پلیمرهای محلول(تاننها) و منومرها (اسیدهای فنلی و فلاونوئیدها) هستند (1).

ترکیبات فعال زیستی مشتق از گیاهان دارویی با داشتن اثرات دارویی چندگانه و مکمل می توانند علاوه بر تاثیر روی همانندسازی ویروس، روی پروتئین های ساختاری ویروس نیز اثر بگذارند. بنابر این ترکیبات فیتوشیمیایی فعال می توانند به عنوان ساختارهای نوین دارویی برای مقابله با گستره بزرگی از مولکولهای هدف مورد استفاده قرار گیرند. از طرفی هزینه تولید و توسعه این ترکیبات بسیار پایین تر از داروهای مرسوم بوده و اثر بخشی بالا و عوارض جانبی اندک از دیگر ویژگی های منحصر به فرد آنهاست (27).

در این مطالعه، ارزیابی تشابه دارویی موثر در مهار ویروس با مهار کننده های گیاهی از نظر خصوصیات فیزیکو شیمیایی،  توسط قانون لیپینسکی با استفاده از ابزار آنلاین SWISSADME ارزیابی شد. این ارزیابی به عنوان یک پایه و اساس، کمک می کند تا میزان موفقیت یا عدم موفقیت یک ترکیب دارویی یا بیولوژیکی خاص را به عنوان یک دارو با احتمال زیاد پیش بینی کرد (3). با در نظر گرفتن خصوصیات فیزیکوشیمیایی ترکیبات فنولی و ترپنوئیدی بررسی شده در جدول شماره 5 می توان حلالیت، نفوذپذیری و جذب گوارشی مواد را جهت پتانسیل دارویی آنها پیش بینی کرد. بر اساس نتایج مشاهده شده در این تحقیق که با هدف پیش بینی مهار پروتئین S  و پروتئاز Mpro توسط ترکیبات فعال گیاهی انجام شد. نتایج نشان داد که اثر بازدارندگی ترکیبات گیاهی از برخی داروهای استاندارد بکار گرفته شده مانند کلرکین، هیدروکسی کلرکین، فاویپیراویر، پردنیزولون ، اسلتامیویر ، ریباویرین ، رمیدیسویر و آزیترومایسین و ریتوناویر دارند (جدول 3 و 6). از میان ترکیبات کاندید شده برای مهار پروتئاز (Mpro/ 3CLpro) و پروتئین S ترکیباتی مانند پروسیانیدین B2 (Procyanidin B2)، کلروژنیک اسید (Chlorogenic acid)، سیلیبینین (Silibinin) ، پروآنتوسیانیدین (Proanthocyanidin)، کوئرستین (Quercetin)، رزماریک اسید (Rosmarinic acid)، EGCG، آنتوسیانین (Anthocyanin) ، گلیسریزیک اسید (glycyrrhizic acid) ، سیکوساپونین B2 (Saikosaponin B2) ، ویتافرین A (Withaferin A)، پولیفیلین I (Polyphyllin I) با استفاده از داکینگ مولکولی نشان دادند که می توانند کاندید بالقوه ای برای بر همکنش مستحکم با جایگاه فعال آنزیم و پروتئین سطحی ویروس باشند (جدول 6 و 7). با بررسی خصوصیات  فیزیکوشیمیایی ترکیبات گیاهی کاندید شده در جدول شماره 5، برخی ترکیبات مانند کوئرستین (Quercetin)، سافی سینولید (Safficinolide) ، ویتانولید (Withanolide) ، کافئیک اسید (Caffeic acid) ، آپی ژنین (Apigenin)  ، لیکوئریتیژنین (Liquiritigenin) در صورت مصرف خوراکی برای انسان جذب گوارشی خوبی نشان می دهند. بررسی جذب گوارشی و میزان حلالیت ترکیبات برای طراحی یک دارو از اهمیت ویژه ای برخوردار است زیرا اگر فراهمی زیستی خوراکی (oral bioavailability) در خصوص یک ترکیب پایین باشد ممکن است طی آزمایش های بالینی بخوبی عمل نکند.(21).  Pei-Win Cheng و همکاران در پژوهشی نشان دادند ترکیب سیکوساپونین B2 (Saikosaponin B2) از مشتقات ترپنوئیدی دارای اثر بازدارندگی مناسب در اتصال و نفوذ ویروس می باشد. این نتایج نشان داد که سیکوساپونین B2 (Saikosaponin B2)  دارای فعالیت ضد ویروسی قوی است و نحوه عملکرد آن احتمالاً شامل مداخله در مراحل اولیه تکثیر ویروس ، از جمله جذب و نفوذ ویروس است. Trina Tallei و همکاران اثر EGCG را در مهار پروتئین S و پروتئاز Mproدر مهار مناسب ویروس نشان دادند (36). در پژوهشی Yong-Ming Yan  تاثیر کلروژنیک اسید (Chlorogenic acid) ، گلیسریزیک اسید (glycyrrhizic acid) ، سیکوساپونین B2 (Saikosaponin B2)، پولیفیلین I (Polyphyllin I) ، رزماریک اسید (Rosmarinic acid) را  بر اساس داکینگ مولکولی و کارآزمایی بالینی در مهار خوب ویروس از طریق تاثیر روی گیرنده ACE2 و پروتئاز اصلی ویروس نشان دادند (41). Peterson با داکینگ مولکولی تاثیر مثبت سیلیبینین (Silibinin) ، EGCG را بخوبی بر روی پروتئاز Mpro  نشان داده است (22). در تحقیقی مشابه Jo و همکاران اتصال مستحکم  EGCG را در اتصال به پروتئاز اصلی ویروس و مهار آن نشان داد (14). بر اساس مطالعات آزمایشگاهی نشان داده شد ترکیبات گلیسریزیک اسید (glycyrrhizic acid) ، گلیسیریزین (glycyrrhizin) و گلابریدین (glabridin) در عصاره  شیرین بیان حاوی اثرات ضد HIV ، HCV ، HSV ،H5N1 و اثر مهاری روی کروناویروس دارد (40). در تحقیق Hayashi و همکاران خاصیت ضد ویروسی آنتوسیانین بر روی آنفولانزای A و  B نشان داده شد (11). بر اساس مطالعات Khwaza و همکاران، خاصیت ضد ویروسی اولئالونیک اسید (Oleanolic acid) که از مواد موثر گیاه رزماری است روی ویروس هرپس، هپاتیت B و C ، آنفولانزا و HIV اثبات شد (15). اثر ضد ویروسی ترکیب اوژنول (eugenol) در گیاه میخک بر روی  HSV و هپاتیت C در تحقیق Batiha و همکاران گزارش شد (4). ترکیب کافئیک اسید (caffeic acid) در گیاهانی مانند سیر، رزماری، ریحان یا پونه کوهی دارای خاصیت ضد HIV می باشد (5). بر اساس تحقیقات Bekut و همکاران خاصیت ضد ویروسی سافی سینولید (Safficinolide) بر روی VSV که از گروه ویروس های زنوبیوتیک می باشند نشان داده شد. بر اساس تحقیقات Polyak و همکاران ترکیب سیلیبینین (Silibinin) در گیاه خار مریم دارای خاصیت ضد ویروس هپاتیت C می باشد (5). همچنین بر اساس تحقیقات دادخواه و همکاران، سیلیبینین که جز اصلی سیلیمارین می باشد با تعدیل پارامتر های دخیل در استرس اکسیداتیو از جمله گلوتاتیون، پراکسیداسیون لیپیدها و آنزیم میلوپراکسیداز، از آسیب اکسیداتیو بافتی به خصوص کبد و ریه در بیماری عفونی سپسیس جلوگیری می کنند (2).

به دلیل تعداد زیاد ترکیبات طبیعی موجود در گیاهان دارویی، ارزیابی و اثربخشی آنها با محدودیت های بسیاری مواجه شده است. برای شناسایی سریعتر داروی مناسب برای کووید 19، استفاده از ابزارهای بیوانفورماتیکی جهت بررسی و غربالگری مواد موثره گیاهی، پیش بینی مکانیسم اثر و سمیت احتمالی آنها به عنوان یک راهکار موثر و جدید می تواند بسیار حائز اهمیت باشد.

بر اساس نتایج بدست آمده از مطالعه حاضر می توان نتیجه گرفت که از میان ترکیبات ترپنوئیدی، 4 ترکیب فیتوشیمیایی گلیسریزیک اسید (glycyrrhizic acid)، سیکوساپونین B2 (Saikosaponin B2)، پولیفیلین I (Polyphyllin I) و ویتافرین A (Withaferin A) در مقایسه با ترکیبات دارویی مرجع و مورد تایید FDA مانند کلرکین ، هیدروکسی کلرکین، فاویپیراویر و ریباویرین ، با داشتن انرژی اتصال قویتر ، حلالیت ، نفوذپذیری و جذب گوارشی اندک بهترین آنالوگ گیاهی ضد ویروس و کاندید مناسب برای مهار پروتئین Mpro و S ویروس بصورت تزریق وریدی می باشند البته ویتافرین A (Withaferin A) دارای حلالیت و نفوذ پذیری مناسبی بوده و می تواند با داشتن جذب گوارشی بالا بصورت خوراکی استفاده شود. همچنین از میان ترکیبات فنولی بررسی شده ، 7 ترکیب EGCG ، رزماریک اسید (Rosmarinic acid) ، سیلیبینین (Silibinin) ، کلروژنیک اسید (Chlorogenic acid) ، پروآنتوسیانیدین (Proanthocyanidin) ، پروسیانیدین B2 (Procyanidin B2) و آنتوسیانین (Anthocyanin)  به ترتیب در گیاهانی مانند چای سبز، رزماری، خارمریم، پیچ امین الدوله ، گل نسترن ، انگور و بلوبری با داشتن انرژی اتصال قوی در مقایسه با  ترکیبات دارویی مرجع مانند کلرکین ، هیدروکسی کلرکین، فاویپیراویر و ریباویرین ، آزیترومایسین و رمیدیسویر ، با نفوذپذیری و حلالیت متوسط و جذب گوارشی پایین ،کاندیدهای فیتوشیمیایی بسیار مناسبی برای مهار گلیکوپروتئین S و پروتئاز اصلی ویروس (Mpro) بصورت تزریق وریدی می باشند.  در مجموع، با توجه به میزان بیماریزایی شدید ویروس SARS-CoV-2  و عدم دسترسی به آزمایشگاه های مجهز سطح 4 Biosafety در کشور، بنظر می رسد آزمایش های مبتنی بر بررسی های بیوانفورماتیکی و پیش بینی ترکیبات زیست فعال گیاهی با پتانسیل بالای فعالیت ضد ویروسی می تواند نقطه شروعی برای کاندید نمودن بالقوه ترکیبات فعال زیستی (لیگاند) به عنوان دارویی جدید باشد. نتایج حاصل از این پژوهش به عنوان یک غربالگری مقدماتی برای کاندید نمودن ترکیبات نامزد بالقوه دارویی و انجام آزمایش های in vitro و in vivo در مدل های حیوانی و انسانی می تواند بسیار کمک کننده باشد.

1- بیضایی، س، صفی پورافشار،ا ، سعید نعمت پور، ف. ۱۳۹۴.تولید ترکیبات فنلی درکشت ریشه‌های مویین گیاه تربچه (Raphanus sativus L).مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی(مجله زیست شناسی ایران). ۲۸ (۳) : ۳۲۷-۳۳۵.
2- دادخواه، ا، فاطمی، ف، محمدی ملایری، م، رسولی، آ، کاروین آشتیانی، م. ۱۳۹۷. تاثیر اسانس نعنا بر روی استرس اکسیداتیو و بیان ژن COX-2 در پیشگیری از سپسیس. مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی(مجله زیست شناسی ایران). ۳۱ (۴):۴۸۴-۴۹۹.
 
3-Balkrishna, A. Pokhrel, S. Singh, J. Varshney, A. 2020. Withanone from Withania somnifera May Inhibit Novel Coronavirus (COVID-19) Entry by Disrupting Interactions between ViralS-Protein Receptor Binding Domain and Host ACE2 Receptor.virology: 1-26.
4-Benet, LZ. Hosey, CM. Ursu, O. Oprea, TI. 2016. The Rule of 5 and drug ability. Advanced Drug Delivery Reviews. BDDCS: 101: 89–98.
5-Batiha, GES. Alkazmi, LM. Wasef, LG.Beshbishy, AM. Nadwa, EH. Rashwan, EK. 2020. Traditional Uses, Bioactive Chemical Constituents, and Pharmacological and Toxicological Activities of Glycyrrhiza glabra L. (Fabaceae). Biomolecules:10 (3) 352.     
6-Bekuta, M. Brki, S. Kladara, N. Dragovi, G. Gavari, N. Bozina, B. 2018.Potential of selected Lamiaceae plants in anti(retro)viral therapy. Pharmacological Research: 133 : 301–314.
7-Cheng, PW. Ng, LT. Chiang, LC. Lin, CC. 2006. Antiviral effects of saikosaponins on human coronavirus 229E in vitro. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology:33: 612–616.
8-Costa, L. Vilas Boas, P. Campos, ML. Berlanda, RLA. Neves, NC. Franco, OL.  2019. Antiviral peptides as promising therapeutic drugs. Cellular and Molecular Life Sciences: 76:3525–3542.
9-Ding, Y. Cao, Z. Cao, L. Ding, G. Wang, Z. Xiao, W. 2017.Antiviral activity of chlorogenic acid against influenza A (H1N1/ H3N2) virus and its inhibition of neuraminidase. Scientific Reports: 7:45723.
10-Earlia, N. Suhendra, R. Amin, M. Prakoeswa, CRS. Idroes, R. 2019. GC/MS analysis of fatty acids on Pliek U oil and its pharmacological study by molecular docking to filaggrin as drug candidate in atopic dermatitis treatment. The Scientific World Journal: Article ID 8605743,7 pp.
11-Estevam, EC. Griffin, S. Nasim, J. Zieliński, D. Aszyk, J. Osowicka, M. Jacob, C. 2015.Inspired by nature: The use of plant-derived substrate/enzyme combinations to generate antimicrobial activity in situ. Natural Product Communications: 10: 1733–1738.
12-Hayashi, K. Mori, M. Matsutani, Y.  Suzutan, T.  Ogasawara, M.  Yoshida, I. Hosokawa, Keizo. Tsukui, A. Azuma, M. 2003. Anti Influenza Virus Activity of a Red-Fleshed Potato Anthocyanin. Food Science and Technology Research: 9(3):242-244.
13-Huang, C. Wang, Y. Li, X. Ren, L. Zhao, J. Hu, Y. Zhang, L. Fan, G. Xu, J. Gu, X. Cheng, Z. Yu, T. Xia, J. Wei, Y. Wu, W. Xie, X. Yin, W. Li, H. Liu, M. Xiao, Y. Gao, H. Guo, L. Xie, J. Wang, G. et al. 2020. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. Lancet: 395(10223):497-506.
14-Jacob, JR. Korba, BE. You, JE. Tennant, BC. Kim, YH. 2004. Korean medicinal plant extracts exhibit antiviral potency against viral hepatitis. Alterna Complement Med: 10(6):1019-26.
15-Jo, S. Kim, S. Shin, DH. Kim, MS. 2020. Inhibition of SARS-CoV 3CL protease by flavonoids. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry: 35(1): 145–151.
16-Khwaza, V. Oyedeji, O. Aderibigbe, BA. 2018.Antiviral Activities of Oleanolic Acid and Its Analogues. Molecules: 23,2300.
17-Khaerunnisa, S. Kurniawan, H. Awaluddin, R. Suhartati, S. Soetjipto, S.2020. Potential Inhibitor of COVID-19 Main Protease (Mpro) From Several Medicinal Plant Compounds by Molecular Docking Study. Preprints: 2020030226:1-14.
18-Liu, X. Wang, XJ. 2020. Potential inhibitors for 2019-nCoV coronavirus M protease from clinically approved medicines. J Genet Genomics: 47(2): 119–121.
19-Lin, WY. Yu, YJ. Jinn, TR. 2019.Evaluation of the virucidal effects of rosmarinic acid against enterovirus 71 infection via in vitro and in vivo study. Virology Journal: 16:94.
20-Liu, CH. Jassey, A. Hsuand, HY. Lin, LT. 2019. Antiviral Activities of Silymarin and Derivatives. Molecules: 24, 1552.
21-Lee, WP. Lan, KL. Liao, SX. Huang, YH. Hou, MC. Lan, KH. 2019. Antiviral effect of saikosaponin B2 in combination with daclatasvir on NS5A resistance-associated substitutions of hepatitis C virus. Chinese Medical Association: 82(5): 368-374.
22-Lin, L. Wong, H. 2017. Predicting Oral Drug Absorption: Mini review on physiologically-based pharmacokinetic models. Pharmaceutics: 9(4): 41.   
23-Leif, EP. 2020. COVID-19 and Flavonoids: In Silico Molecular Dynamics Docking to the Active Catalytic Site of SARS-CoV and SARS-CoV-2 Main Protease. DOI: 10.13140/RG.2.2.22294. 50246.
24-Benet, LZ. Hosey, CM. Ursu, O. Oprea, TI. 2017. BDDCS, the Rule of 5 and Drugability.Adv Drug Deliv Rev.1; 101: 89–98.
25-Mustafa, S. Balkhy, H. Gabere, M. 2019.Peptide-Protein Interaction Studies of Antimicrobial Peptides Targeting Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus Spike Protein: An In Silico Approach. Advances in Bioinformatics. Article ID 6815105, 16 pages.
26-Nuraskin, CA. Marlina, M. Idroes, RM. Soraya, C. jufri, D. 2020. Identification of secondary metabolite of laban leaf extract (Vitex pinnata L.) from geothermal areas and nongeothermal of agam mountains in Aceh Besar, Aceh province, Indonesia. Rasayan Journal of Chemistry: 13(1): 18–23.
27-Nuraskin, CA. Idroes, RM. Soraya, C. jufri, D. 2019. Activities inhibition methanol extract laban leaf (Vitex pinnata) on growth of bacteria S. mutans Atcc 31987. IOP Conference Series: Materials Science and Engineering: 523(1).
28-Naika, HR. Lingaraju, K. Chandramohan, V. Krishna, V. 2015.Evaluation of Phytoconstituents and Molecular Docking Against NS3 Protease of Hepatitis C Virus. J Pharmaceu Sci Pharmacol: 2: 96-103.
29-Ou, X . Liu, Y. Lei, X. Li, P. Mi, D. Ren, L. Guo, L. Guo, R. Chen, T. Hu, J. Xiang, Z. Mu, Z. Chen, X. Chen, J. Hu, K. Jin, Q. Wang, J  & Qian Z. 2020. Characterization of spike glycoprotein of SARS-CoV-2 on virus entry and its immune cross-reactivity with SARS-CoV. Nature communications: 11:1620.
30-Pratiwi, SUT. Lagendijk, EL. deWeert, S. Idroes, R. Hertiani, T. Hondel, CV. 2015. Effect of Cinnamomum burmannii Nees ex Bl. and Massoia aromatica Becc. essential oils on planktonic growth and biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in vitro. International Journal of Applied Research in Natural Products: 8(2): 1–13.
31-Qamar, MT. Alqahtani, SM. Alamri, MA. Chen, LL. 2020. Structural basis of SARS-CoV-2 3CLpro and anti-COVID-19 drug discovery from medicinal plants. Journal of Pharmaceutical Analysis.
32-Qian, Z. Ou, X. Góes, LG. Osborne, C. Castano, A. Holmes, KV. Dominguez, SR. 2015. Identification of the receptor-binding domain of the spike glycoprotein of human betacoronavirus HKU1. Journal of Virology: 89(17):8816-8827.
33-Ren, L. Wang, YM. Wu, ZQ. Xiang, ZC. Guo, L. Xu, T. Jiang, YZ. Xiong, Y. Li, YJ. Li, XW. Li, H. Fan, GH. Gu, XY. Xiao, Y. Hong, GH. Xu, JY. Yang, F. Wang, XM. Wu, C. Chen, L. Liu, YW. Liu, B. Yang, J. Wang, XR. Dong, J. Li, L. et al.  2020. Identification of a  novel coronavirus causing severe pneumonia in human: a descriptive study. Chin Med J (Engl): 133(9):1015-1024.
34-Song, W. Gui, M. Wang, X. Xiang, Y. 2018. Cryo-EM structure of the SARS coronavirus spike glycoprotein in complex with its host cell receptor ACE2. PLOS Pathogens: 14(8), e1007236.
35-Shakeran, Z. Nosrati, M. Shakeran, Z. 2018. In silico screening of hepatitis C virus NS3/4A protease inhibitor(s) from Cornus officinalis and Syzygium aromaticum. Razi Journal of Medical Sciences: 25(167).
36-Tallei, TE. Tumilaar, SG. Niode, NJ. Wali, F.  Kepel, BJ. Idroes, R. Effend, Y. 2019. The potential of five therapeutic medicinal herbs for dental treatment : A review. IOP Conference Series: Materials Science and Engineering: 523(1), 12009.
37-Tallei, TE. Tumilaar, SG. Niode, NJ. Wali, F. Kepel, BJ. Idroes, Ri. Effendi, Y. 2020. Potential of Plant Bioactive Compounds as SARS-CoV-2 Main Protease (Mpro) and Spike (S) Glycoprotein Inhibitors: A Molecular Docking Study. Preprints, 2020040102.
38-Wrapp, D. Wang, N. Corbett, KS. Goldsmith, JA. Hsieh, CL. Abiona, O. Graham, BS. Mclellan JS. 2020. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation.Science: 367: 1260–1263.
39-Wang, N. Shi, X. Jiang, L. Zhang, S. Wang, D. Tong, P. Guo, D.Fu, L. Cui, Y. Arledge, KC. Chen, YH. Zhang, L. Wang, X. 2013.Structure of MERS-CoV spike receptor-binding domain complexed with human receptor DPP4. Cell Res: 23, 986–993.
40-Wu, C. Liu, Y. Yang,Y. Zhang, P. Zhong, W. Wang, Y. Wang, Q.  Xu, Y. Li, X.  Zheng, M, Chen, L. Li, H. 2020. Analysis of Therapeutic Targets for SARS-CoV-2 and Discovery of Potential Drugs by Computational Methods. Acta Pharmaceutica Sinica B.
41-Wang, L. Yang, R. Yuan, B. Liun, Y. Liu, C. 2015.The antiviral and antimicrobia lactivities of licorice ,awidely-used Chinese herb. Acta PharmaceuticaSinicaB: 5(4):310–315.
42-Yan, Y. Shen, X. Cao, Y. Zhang, J. Wang, Y. Cheng, Y. 2020.Discovery of Anti-2019-nCoV Agents from 38 Chinese Patent Drugs toward Respiratory Diseases via Docking Screening. Preprints, 2020020254.
43-Zhang, L. Lin, D.Sun, X. Curth, U. Drosten, C. Sauerhering, L. Rox, K. Hilgenfeld, R. 2020. Crystal structure of SARS-CoV-2 main protease provides a basis for design of improved a-ketoamide inhibitors. Science: 368: 409–412.