بررسی بیان ژن‌های NAC6 و NAC10 بر روی گیاه تراریخت و غیر تراریخت برنج

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 کارشناسی ارشد گروه بیوتکنولوژی دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهرکرد

2 گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهرکرد، ایران

3 گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهرکرد

چکیده

پروتئین‌های متصل شونده به عناصر پاسخ دهنده به تنش خشکی از اهمیت ویژه ای در بالا بردن مقاومت گیاه به تنش خشکی برخوردارند. در این تحقیق با هدف تعیین تفاوت بیان فاکتورهای رونویسی در بافت های مختلف، بیان ژن‌های کد کننده عوامل رونویسی NAC10 و NAC6 در برنج تحت تنش خشکی در بافت‌های برگ و بساک مورد بررسی قرار گرفتند. بذور گیاه تراریخته برنج و غیر تراریخته رقم Nipponbare کشت شدند و از بافت‌های برگ و بساک در مرحله میکروسپور جوان در زمانهای مختلف پس از قطع آبیاری، نمونه برداری صورت گرفت. آنالیز پروموتر انجام شد و دو فاکتورهای رونویسی از خانواده NAC انتخاب شدند. مقایسه بیان داده‌های ژن های سنتز کننده فاکتورهای رونویسی به وسیله Real-time PCR از طریق روش دلتا دلتا سی تی انجام گرفت. نتایج حاصل از این بررسی نشان داد که ژنهای NAC10 و NAC6 در برنج، هر دو در بافت‌های بساک و برگ بیان می‌شوند و بیان این ژن‌ها تحت تنش خشکی بطور معنی داری افزایش یافته است که بیشترین مقدار بیان هر دو فاکتور رونویسی مربوط به بافت بساک بوده است، بیشترین مقدار بیانی NAC10 مربوط به بساک گیاه غیر تراریخت در حدود 70 برابر حالت کنترل بود و بیشترین مقدار بیانی NAC6 مربوط به بساک گیاه تراریخت به مقدار 60 برابر حالت کنترل و در هر دو مورد بیشترین بیان در زمان 24 ساعت پس از شروع تنش رخ داده است. این نتایج حاکی از نقش مهم این فاکتور‌ها در بافت بساک گیاه برنج در هنگام مواجه شدن با تنش خشکی می باشد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Evaluation of NAC10 and NAC6 gene expression on Transgenic and Non-Transgenic Rice

نویسندگان [English]

  • kobra arab 1
  • Rudabeh Ravash 2
  • Behrouz shiran 3

1 Department of Biotechnology, Faculty of Agriculture, Shahrekord University, Shahrekod, Iran

2 Department of Plant Breeding and Biotechnology, Faculty of Agriculture, Shahrekord University, Iran

3 Department of Plant Breeding and Biotechnology, Faculty of Agriculture, Shahrekord University, Shahrekod, Iran

چکیده [English]

The proteins that bind to the elements that respond to drought stress, have particular important in rising plant resistance to drought. In this study with the aim of evaluate different expression of TFs in different tissue, the expression of genes encoding NAC10 and NAC6 transcription factors in rice under drought stress in leaf and anther tissues were estimated. In this study, transgenic and non-transgenic rice seeds of Nipponbare variety were cultivated. Leaf and anther tissues on young microspore stage were sampled at several times after Stop irrigation. Promoter analysis for finding transcription binding sites has done by two web sites and two TF from NAC family were selected. RNA extraction was maintained at -80 ° C, RNA quality and quantity were evaluated. Expression comparison of genes encoding these transcription factors were performed by real-time PCR with Delta-Delta CT method. The results of this study showed that NAC10 and NAC6 are expressed in both anther and leaf tissues. Under drought stress, the highest expression of both transcription factors was in anther tissue after 24h stress, the highest expression of NAC10 was in non-transgenic plants, about 70 times more than control and the highest expression of NAC6 was in transgenic plant about 60 times more than control condition. These results indicate the important role of these factors in anther tissue of rice, response to drought stress.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Promoter analysis
  • Drought
  • Transcription factors
  • Gene expression

بررسی بیان ژنهای NAC6 و NAC10 تحت تنش خشکی در بافتهای برگ و بساک برنج تراریخت و غیر تراریخت رقم Nipponbare

کبری عرب1، رودابه راوش2* و بهروز شیران2

1 ایران، شهرکرد، دانشگاه شهرکرد، دانشکده کشاورزی، گروه بیوتکنولوژی

2 ایران، شهرکرد، دانشگاه شهرکرد، دانشکده کشاورزی، گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی

تاریخ دریافت: 04/09/1398          تاریخ پذیرش: 17/03/1399

چکیده

پروتئینهای متصل شونده به عناصر پاسخ دهنده به تنش خشکی از اهمیت ویژه ای در بالا بردن مقاومت گیاه به تنش خشکی برخوردارند. در این تحقیق با هدف تعیین تفاوت بیان فاکتورهای رونویسی در بافتهای مختلف، بیان ژنهای کد کننده عوامل رونویسی NAC10 و NAC6 در برنج تحت تنش خشکی در بافتهای برگ و بساک مورد بررسی قرار گرفتند. بذور گیاه تراریخته برنج و غیر تراریخته رقم Nipponbare کشت شدند و از بافتهای برگ و بساک در مرحله میکروسپور جوان در زمانهای مختلف پس از قطع آبیاری، نمونه برداری صورت گرفت. آنالیز پروموتر انجام شد و دو فاکتورهای رونویسی از خانواده NAC انتخاب شدند. نتایج حاصل از real-time PCR نشان داد که ژنهای NAC10 و NAC6 در برنج، هر دو در بافتهای بساک و برگ بیان می­شوند و بیان این ژنها تحت تنش خشکی به طور معنی داری افزایش یافته است که بیشترین مقدار بیان هر دو فاکتور رونویسی مربوط به بافت بساک بوده است، بیشترین مقدار بیانی NAC10 مربوط به بساک گیاه غیر تراریخت در حدود 70 برابر حالت کنترل بود و بیشترین مقدار بیانی NAC6 مربوط به بساک گیاه تراریخت به مقدار 60 برابر حالت کنترل و در هر دو مورد بیشترین بیان در زمان 24 ساعت پس از شروع تنش رخ داده است. این نتایج حاکی از نقش مهم این فاکتور­ها در بافت بساک گیاه برنج در هنگام مواجه شدن با تنش خشکی می­باشد.

واژه های کلیدی: آنالیز پروموتر، تنش خشکی، فاکتور­های رونویسی، بیان ژن

* نویسنده مسئول، تلفن: 03832324401 ، پست الکترونیکی: r.ravash@sku.ac.ir

مقدمه

 

تنشهای محیطی می توانند باعث القای مکانیسمهایی درون گیاه شوند که باعث آسیب به غشای سلولی، آسیب به مولکولهای DNA و پروتئین و کم شدن عملکرد گیاه می شود (2). بررسی عوامل تنظیمی در پاسخ به تنشها حائز اهمیت می باشد. کنترل شروع رونویسی یک مکانیسم محوری است برای تعیین اینکه آیا یک ژن بیان می­شود یا خیر و چه مقدار mRNA و در نتیجه، پروتئین تولید می­شود. پروموتر یک توالی است که رونویسی یک ژن را آغاز و تنظیم می­کند. جایگاههای اتصال پروتئین در پروموتر، نماینده عناصر بسیار مهم هستند و پروتئینهای مسئول فاکتور­های رونویسی نامیده می­شوند. فاکتور­های رونویسی NAC یکی از بزرگترین خانواده­های فاکتور­های مختص گیاهان می­باشند (23) که در مقاومت به شوری نقش دارند. آنها در پایین دست مسیر­های سیگنالینگ اکسین و اتیلن علاوه بر مسیر ABA عمل می­کنند(11). مشابه این پروتئینها پروتئینهای هسته­ای DELLA هستند که در پاسخ به تنشهای محیطی ازجمله تنظیمات رشد، هنگام روبرو شدن با تنش شوری دخالت دارند (3). فاکتور­های رونویسی NAC (NAM, ATAF, CUC) یک خانواده ژنی مختص گیاه می­باشند که نقش تعداد کمی از اعضای این خانواده در رشد و توسعه گیاه و همچنین تحمل گیاه به تنش شناسایی شده است. فاکتور­های رونویسی NAC شامل یک خانواده بزرگ پروتئینی هستند. پروتئینهای این خانواده دارای یک N-ترمینال متصل به DNA بسیار محافظت شده و یک دمین متغییر C-ترمینال می­باشند (7 و 8). پروتئینهای NAC درگیاهان زمینهای وسیع هستند و تاکنون هیچ هومولوگی در سایر یوکاریوتها مشاهده نشده است (24). گزارشات اولیه فاکتور­های رونویسی NAC مربوط به دخالت آنها در جنبه­های مختلف رشد گیاهان بوده است. چندین مثال از این عوامل رونویسی در پتونیا (گل اطلسی)(27)، NAM و CUC1-2 در آرابیدوپسیس (4) نقش کنترل شکل‌گیری سلولهای مریستمی را بر عهده دارند. گزارش شده است که تعدادی از عوامل رونویسی NAC در تنظیم پیری، تقسیم سلولی و شکل‌گیری چوب در گیاهان نقش بسیار مهم و ضروری را ایفاء می­کنند (15، 20 و 30). پروتئینهای NAM، ATAF و CUC در پاسخ گیاه به پاتوژنها، عفونتهای ویروسی و پاسخ به محرک­های ویروسی شرکت دارند (17). علاوه بر این پروتئینهای این ژنها می­توانند در اتصال با عنصر cis شامل موتیف CATGTG باشند (29). به نظر می­رسد که چندین ژن ازخانواده NAC در القای هورمون نقش دارند (13). ژن SNAC1 نیز از این خانواده در برنج در تحمل به تنش و پاسخ به تنش نیز شناسایی شده است (14). از دیگر ژنهای این خانوادهOsNAC6  است که یکی از اعضای زیرخانواده ATAF می­باشد (16). این ژن هنگام تنش زیستی و تیمار جاسمونیک اسید القاء می‌شود، بیان بالای این ژن در برنج، باعث افزایش مقاومت گیاه در برابر تنش می­شود (22). آنالیز تک هیبریدی مخمر وجود 12 پروتئین NAC که نماینده ترکیبات موتیف مختلف می­باشد تأیید کرد که می­تواند به جایگاه اتصال DNA متصل شود. مناطق پروموتر در ژنهای خانواده NAC القاء کننده آلومینیوم، در آنالیز پروموتر نشان داد که این مناطق شامل عناصر فعال cis هستند که مسئول پاسخ به اکسینها، سیتوکینینها، جیبرلینها، آبسیزیک اسید و اتیلن هستند. اطلاعات به دست آمده از این تحقیقات برای طراحی استراتژی استفاده از آلومینیوم به عنوان یک محرک زیستی رشد برای برنج و دیگر گیاهان بسیار مفید خواهد بود (21). تعداد کمی از اعضای خانواده NAC در گیاهان ثابت کرده‌اند نقش مهمی در تنظیم رشد و توسعه گیاهان دارند(9). بیان سه ژن خانواده NAC در آرابیدوپسیس، ANACO19، ANACO55 و ANACO72 در اثر تنش خشکی، شوری بالا و ABA القاء می­شوند و این سه ژن بیان معنی‌داری را در تحمل به خشکی نشان می­دهند (29). درک مکانیزم پیچیده‌ای از خشکی و شوری برای تولید کشاورزی مهم است. در گیاه آرابیدوپسیس شناسایی عناصر تنظیمی ناحیه پروموتر نشان داده پروموتر ژنهای این ناحیه دارای گروههای مختلف عملکردی از جمله پاسخ به نور، پاسخ به تنشهای زیستی و غیر زیستی، پاسخ به فیتوهورمون، کنترل شبانه روزی و توسعه سلولی هستند. در همه ژنهای مورد بررسی عناصر تنظیمی TATA box و CAAT-box به عنوان عنصر رایج در ناحیه مرکزی پروموتر شناسایی شد. فاکتورهای رونویسی پروتئینهایی هستند که در اندامهای مختلف و در مراحل مختلف رشد در گیاهان وحیوانات وجود دارند. این پروتئینها با اتصال به عناصر تنظیمی cis در پروموتر در ژنهای هدف، سطوح بیان ژن را تنظیم می­کنند، تا مراحل مختلف بیولوژیکی از قبیل رشد، تقسیم سلولی و پاسخ به تنشهای محیطی را کنترل کنند (10). در برنج، 20 ژن القاء کننده تنش در خانواده NAC شناسایی شدند که در مناطق پروموتر عناصر فعال cis در پاسخ به اسید آبسیزیک شناسایی شدند (25).

در این تحقیق میزان بیان ژنهای مرتبط با فاکتور­های رونویسیNAC10 وNAC6  در تنش خشکی در دو گیاه غیر تراریخت و تراریخت، با هدف بررسی تأثیر پروموتر خارجی دارای جایگاه مرتبط با این عناصر تنظیمی، مورد اندازه­گیری واقع شدند.

مواد و روشها

کشت گیاه و اعمال تنش: در این تحقیق بذور گیاه تراریخته برنج، رقم Nipponbare که در آنها ناحیه پروموتری ژن S-like RNase قبل از ژن GUS قرار گرفته است از مؤسسه CSIRO دریافت شدند (1) و همراه با برنج غیر تراریخته رقم Nipponbare در دو تکرار، در دو شرایط کنترل و تنش خشکی در گلدانهای پلاستیکی در اتاقک کشت ایزوله در دمای 32 درجه سانتی گراد و رطوبت 70 درصد در 14ساعت روشنایی و 10ساعت تاریکی در تشتهای پر آب کشت داده شدند. جهت ایجاد تنش در مرحله میکروسپور جوان گیاه برنج، قطع آبیاری صورت گرفت و نمونه برداری از اندامهای برگ و بساک این گیاه انجام شد. نمونه­ها فورا در ازت مایع قرار گرفتند و به فریزر 80- درجه سانتی گراد منتقل شدند. بساکها زیر دستگاه بینوکولار جدا شدند و سریعاً داخل ازت منتقل شدند و به فریزر 80- درجه سانتی گراد انتقال داده شدند.

همزمان با نمونه برداری گیاهان، چندین گلدان جهت تنش به مدت 24 ساعت، 48 ساعت، 72 ساعت و 7 روز بیرون از تشتهای آب قرار گرفت، و مقدار RWC آنها اندازه گیری شد و با RWC گیاه کنترل مقایسه شد تا تغییر در محتوی نسبی آب برگ در زمانهای تنش مشخص شود. برای اندازه گیری مقدار RWC به اندازه 10 سانتیمتر از برگ انتهایی، نمونه برداری شد وزن اولیه آن اندازه گیری شد و نمونه برگ درون لوله­های آزمایشی قرار گرفتند و با آب مقطر اشباع شدند و به مدت 24 ساعت در یخچال 4+ درجه سانتی گراد قرار گرفت. بعد از 24 ساعت، وزن تر آنها اندازه گیری شد و به مدت 24 ساعت در آون گذاشته شد تا وزن خشک گیاه به دست آید و در نهایت میزان RWC با فرمول زیر تخمین زده شد (26).

RWC=  وزن خشک – وزن تر/وزن خشک – وزن اولیه

مطالعات بیوانفورماتیکی: «آنالیز ناحیه پرموتری»: آنالیز ناحیه پرموتری با شماره دسترسی NC_029264.1 که به گیاهان تراریخت انتقال یافته بود، برای یافتن فاکتورهای رونویسی مرتبط با آن توسط سایتهای plantRegMap (http://plantregmap.cbi.pku.edu.cn/) و همچنین (https://www.genomatix.de/matinspector) MatInspector  صورت گرفت.

طراحی پرایمر برای ژن: برای طراحی پرایمر برای Real Time PCR (RT-PCR) ابتدا با وارد کردن نام ژن، توالی mRNA با فرمت FASTA از سایت (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) NCBI دریافت شد. توالی دریافتی در سایت Primer 3 وارد گردید و یکسری خصوصیات از قبیل مقدار GC مابین 40 تا 60، طول پرایمر بین 20 تا 23 همچنین اندازه محصول نهایی بین 120 تا 220 جفت باز مشخص گردید و جهت بررسی منحصر به فرد بودن محصول در RT-PCR، این پرایمر­ها وارد سایت Primer blast گردید و در این سایت گونه Oryza sativa و دیتابیس mRNA refseq انتخاب شد، تا تکثیر یک ناحیه واحدکه نشان دهنده گرفتن یک باند در PCR بود، تأیید گردد. (جدول 1)

 

جدول 1- مشخصات پرایمر­های استفاده شده در RT-PCR

دمای اتصال (°C)

 

5' - 3'توالی آغازگر

 

نام آغازگر

 

 

56

 

ACCCCATTCAACTGGTTCGA

 

NAC10 F

 

1

 

 

 

CCTGCTTAGCCCACTAGGAAAC

 

NAC10 R

 

55

 

GTGAATCGTCTTCCCACTGATG

 

NAC6 F

 

2

 

 

 

TTCAACCCCACTGAAGAGAACT

 

NAC6 R

 

58

 

ATCCTTGTATGCTAGCGGTCGA

 

Actin1 F

 

3

 

 

 

ATCCAACCGGAGGATAGCATG

 

Actin1 R

 

               

 

 

استخراج RNA: RNA یک مولکول ناپایدار با نیمه عمر بسیار کوتاه وقابل استخراج از سلول و بافت می­باشد. برای جداسازی RNA نیاز به مراقبت و احتیاط فراوانی می­باشد چرا که مستعد تخریب شدن است. به منظور استخراج RNA کل، از محلول RNXTM-plus (شرکت سیناژن) استفاده شد. بدین منظور 100 میلی‌گرم بافتهای مختلف گیاه (برگ و بساک) در ازت مایع سابیده شد و پودر به دست آمده در یک میلی‌لیتر ماده RNXTM-plus همگن شد. سپس با افزودن کلروفورم فاز آبی که حاوی RNA کل بود از فاز آلی جداسازی و با استفاده از ایزوپروپانول رسوب داده شد و با اتانول شستشو داده شد و پلیت حاصله در آب DEPC حل گردید. برای خالص سازی RNA از کیت DNase (شرکت سیناژن) از بین بردن آلودگی از RNA استخراج شده، استفاده شد.

کمیت RNA استخراج شده با روش اسپکتروفوتومتر با استفاده از دستگاه بیوفتومتر ساخت شرکت اپندرف آلمان مشخص شد. به منظور تعیین کیفیت RNA استخراج شده، از الکتروفورز نمونه­ها روی ژل آگارز 2/1 درصد در بافر 1X MOPS استفاده شد.

سنتز cDNA: سنتز رشته اول cDNA با استفاده از کیت YTA (یکتا تجهیز آزما) صورت گرفت. بعد از اتمام چرخه، cDNA حاصل با 20 میکرولیتر آب دوبار تقطیر اتوکلاو شده به حجم رسانده شد و در فریزر 80- درجه سانتی‌گراد قرار گرفت. برای مشخص شدن بهترین دما برای اتصال آغازگر، گرادیانت PCR گذاشته شد. بازه دمایی از 54 تا 62 درجه سانتی گراد برای نمونه­ها در نظر گرفته شد و برنامه PCR اجرا شد. پس از تعیین بهترین دمای اتصال، PCR برای هر پرایمر برای گرفتن تک باند بر روی ژل انجام پذیرفت.

بررسی بیان ژن با استفاده از روش RT-PCR: میزان بیان ژنهای سنتز کننده فاکتور­های رونویسی با روش PCR کمّی مطالعه شد. PCR در زمان واقعی با دستگاه Rotor gene-Q با استفاده از مخلوط واکنش Takara حاوی SYBR® Green و با استفاده از پرایمرهای اختصاصی طراحی شده طبق دستورالعمل کیت در پژوهشکده زیست فناوری صورت گرفت. این واکنش برای هر نمونه در 2 تکرار تکنیکی انجام شد و از ژن خانه‌دار اکتین به عنوان کنترل داخلی استفاده گردید.

برنامه واکنش شامل: 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه و سپس طی 40 سیکل با 95 درجه سانتی‌گراد برای 5 ثانیه ،60 درجه سانتی‌گراد برای 30 ثانیه بود. الگویابی منحنی ذوب از 62 درجه سانتی‌گراد تا 95 درجه سانتی‌گراد در پایان واکنش برای هر PCR جهت تشخیص اختصاصی بودن واکنش صورت گرفت.

مقایسه­های بیان داده­های Real-time PCR با میزان رونویسی هر ژن خانه دار از طریق روش دلتا دلتا سی تی انجام گرفت (12).

نتایج و بحث

آنالیز ناحیه پروموتری: آنالیز ناحیه پروموتری انتقال یافته به گیاه تراریخت با شماره دسترسی NC_029264.1 ، شماری از فاکتورهای رونویسی که در تنشهای مختلف زیستی و غیر زیستی نقش مهمی را ایفاء می­کردند نشان داد. از جمله این فاکتور­های رونویسی، تعدادی TF (Transcription Factor) از خانواده NAC بودند که در این ناحیه پروموتری شناسایی شدند (جدول 2 و 3).

آنالیز ناحیه پروموتری در سایت plantRegMap اعضای مختلف عضو خانواده NAC را نشان داد که نتایج در جدول 2 آورده شده است.

آنالیز پروموتر مورد نظر در سایت MatInspecter نیز TF هایی از خانواده های مختلف مشخص کرد که لیست TFهای مرتبط با خانواده NAC در جدول 3 نشان داده شده است (جدول 3).

 

 

جدول 2- پیش بینی جایگاه اتصال فاکتورهای رونویسی خانواد NAC بر روی پروموتر مورد نظر

p-value

توالی*

رشته

محل

نام

7.08E-06

GATAAATTATTTTTCACGCAA

+

1006-1026

NAC070

1.21E-05

TTGCGTGAAAAATAATTTATC

-

1006-1026

NAC101

1.27E-05

GATAAATTATTTTTCACGCAA

+

1006-1026

NAC033

2.22E-05

TTGCGTGAAAAATAATTTATC

-

1006-1026

NAC020

4.46E-05

AGACAAGGAACT

-

967-978

NAC030

4.66E-05

TAAATTATTTTTCACGCAA

+

1008-1026

NAC083

4.73E-05

TACGTATGTAGGACG

+

208-222

NAC010

6.17E-05

TTGCGTGAAAAATAATTTATC

-

1006-1026

NAC046

6.54E-05

CGTCCTACATACGTA

-

208-222

NAC076

6.56E-05

TTGCGTGAAAAATAATTTA

-

1008-1026

NAC083

7.25E-05

ATTTGCGTGAAAAATAATTTA

-

1008-1028

NAC070

8.54E-05

CTACGTATGTAGGACGGG

+

207-224

NAC094

8.97E-05

CGACGTCGGGCCCAATTCGC

-

36-55

NAC042

9.03E-05

CGTCCTACATACGTA

-

208-222

NAC007

9.97E-05

TAAATTATTTTTCACGCAA

+

1008-1026

NAC87

*آنالیز شده با استفاده از پایگاه داده plantRegMap (http://plantregmap.cbi.pku.edu.cn/)

 

 

ماتریسهای سنگین از کتابخانه MatInspecter در حال حاضر با MatDefine به وجود آمده اند، که ابزاری برای تعیین اتوماتیک و ارزیابی ماتریسهای سنگین حاصل از مجموعه ای از جایگاههای اتصال فاکتور­های رونویسی می­باشد. MatDefine الگوریتمهای اصلی را در چندین جهات گسترش می­دهد: 1- اول یک توالی کوتاه مرکزی به شدت محافظت شده در توالیهای ورودی معمولی، تعریف شده است. 2- بعد از آن هم ترازی جایگاههای اتصال در ابتدای موقعیت توالی مرکزی مشخص شده محکم شده. 3- طول ماتریس سنگین به صورت اتوماتیکی از دوطرف توسط برش دادن بخشهای کمتر محافظت شده مشخص می­شود.4- تمام توالیهای به دست آمده برخلاف نتایج ماتریس، دوباره چک می­شوند و توالیهایی با شباهتهای ماتریسی کمتر از 8/0 پذیرفته نمی­شوند. 5- این فرآیند تا زمانی که ماتریس، همه توالیهای باقیمانده را تشخص دهد ادامه دارد. اگر کمتر از 5 توالی باقی بماند، ماتریسی تولید نمی­شود.6- ماتریس نهایی با کل ماتریسهای موجود در کتابخانه مقایسه می­شود تا مشخص شود که آیا ماتریس جدید به یک جایگاه اتصال موجود در حال حاضر، شباهتی دارد یا نه. بدین منظور همه جایگاههای اتصال برای تولید ماتریس استفاده می­شود. جهت انطباقهای جایگاه اتصال فاکتور­های رونویسی با کل ماتریسهای کتابخانه، جستجو انجام می­گیرد. تعدادی از جایگاههای اتصال تشخیص داده شده توسط خانواده ماتریس مشابه، به عنوان یک معیار برای اندازه­گیری میزان شباهت به ماتریسهای موجود استفاده می­شود و برای کاربر به عنوان منبع اطلاعاتی نقش ایفاء می­کند (5).

با توجه به نتایج به دست آمده از آنالیز پروموتر، نتایج پیش بینی در دو سایت موردنظر مقایسه شدند، NAC87، NAC30 به طور مشترک در هر دو سایت، برای این ناحیه پروموتری پیش بینی شدند. از بین TF های متفاوت از خانواده NAC که نقش آنها در پاسخ به خشکی، قبلا گزارش شده بود (7)، فاکتور NAC10 از نتایج جدول 2 و فاکتور NAC6 که در چند محل در جدول 3 پیش بینی شده بود، انتخاب شدند.

پس از قطع آبیاری در گیاهان، RWC در روزهای مختلف اندازه گیری شد و میزان آن در هر زمان انتخابی برای نمونه گیری به میزان 10-20 درصد نسبت به زمان قبل کاهش داشت.

 

 

جدول 3- پیش بینی جایگاه اتصال فاکتورهای رونویسی خانواد NAC بر روی پروموتر مورد نظر

 

امتیازدهی

 

توالی*

رشته

تا

 

از

توضیحات

نام ماتریس

 

0.757

 

atttataggccggccTACGtatgtagg

(+)

219

 

193

Wheat NAC-domain DNA binding factor (DNA binding site II)

P$NACF

 

0.785

 

tatgcccgtcctacatACGTaggccgg

(-)

228

 

202

Wheat NAC-domain DNA binding factor (DNA binding site I)

P$NACF

 

0.942

 

caatttaacaatattgcCAAGttttgaca

(+)

335

 

307

NAC domain containing protein 103

P$NACD

 

1

 

ctctagtaaatataTAAGaaatc

(-)

359

 

337

NAC WITH TRANSMEMBRANE MOTIF 1-LIKE 6 (NTL6/NTM1)

P$NTMF

 

1

 

TGTGttg

(-)

571

 

565

Heterodimer of NAC-domain transcription factors GmNAC30 and GmNAC81

P$PCDR

 

0.943

 

aactttgtgaaagtAAAGaat

(-)

626

 

606

Secondary wall NAC binding elements

P$SWNS

 

0.765

 

agtttaCTTTtagctcattttatttgt

(-)

689

 

663

NAC domain containing protein 87

P$NACF

 

0.996

 

aaacaaaaagcatgagaCAAGgaactact

(-)

992

 

964

NAC domain containing protein 16

P$NACD

 

0.98

 

tttttgtttttcttgaGGAAaag

(+)

1006

 

984

NAC WITH TRANSMEMBRANE MOTIF 1-LIKE 8 (NTL8/NTM1-like 8)

P$NTMF

 

0.99

 

atcttttcctCAAGaaaaaca

(-)

1008

 

988

NAC domain containing protein 71

P$SWNS

 

0.774

 

aatttatcttttcctCAAGaaaaacaa

(-)

1013

 

987

NAC domain containing protein 92 (NAC6)

P$NACF

 

0.995

 

ataatttatcttttcctCAAGaaaaacaa

(-)

1015

 

987

NAC domain containing protein 16

P$NACD

 

0.777

 

gtttttCTTGaggaaaagataaattat

(+)

1015

 

989

NAC domain containing protein 87

P$NACF

 

0.831

 

aaagataaattatttttCACGcaaataaa

(+)

1031

 

1003

NAC domain containing protein 38

P$NACD

 

1

 

agataaattatttttcACGCaaataaa

(+)

1031

 

1005

Arabidopsis NAC domain containing protein 92 (ATNAC6)

P$NACF

 

0.754

 

gctagacatcgcatgCATGaaagttca

(+)

1111

 

1085

NAC domain containing protein 92 (NAC6)

P$NACF

 

0.98

 

cttccatgtccagaGAAGaaaag

(+)

1239

 

1217

NAC with transmembrane motif 1-like 8 (NTL8/NTM1-like 8)

P$NTMF

 

0.752

 

aatgttttatgagtgGACGgtgccttt

(-)

1262

 

1236

Wheat NAC-domain DNA binding factor (DNA binding site II)

P$NACF

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

* آنالیز شده توسط پایگاه داده MatInspector (https://www.genomatix.de/matinspector)

 

تکثیر اختصاصی ژنهای مسئول فاکتورهای رونویسی NAC10 و NAC6 و ژن Actin (به عنوان ژن خانه دار) با استفاده از cDNA و به وسیله PCR کمّی مورد بررسی قرار گرفت. بررسی نمودار ذوب در RT-PCR صورت گرفت و تکثیر اختصاصی محصول با حضور یک قله در نمودار برای هریک از پرایمرها تأیید گردید.

بررسی میزان بیان ژن مسئول فاکتور رونویسی NAC6 در بافت برگ و بساک: داده­های حاصل از آنالیز RT-PCR میزان بیان فاکتور رونویسی  NAC6در بافت برگ (شکل A1) و بساک (شکل B1) در گیاهان تراریخت (transgene) و غیر تراریخت (np) را نشان داد.

آنالیز داده­ها نشان داد که بیان ژن مسئول فاکتور رونویسی NAC6 در شرایط تنش در بافت برگ، در همه زمانها نسبت به شرایط کنترل، هم در گیاه برنج تراریخته و هم در گیاه غیر تراریخته افزایش بیان نشان داده است.

شکل 1- تغییر بیان ژن NAC6 در زمانهای مختلف تنش خشکی در بافت برگ (A) و بافت بساک (B) گیاه تراریخت و غیر تراریخت

این در حالی است که بیان این فاکتور رونویسی در بافت برگ گیاه ترایخت، در زمانهای 24 ساعت و یک هفته پس از شروع تنش، بیشتر از میزان بیان در نمونه غیر تراریخته بوده است. در مقابل میزان بیان ژن NAC6  در بافت بساک در گیاه تراریخته در 24 ساعت اول روبرو شدن گیاه با تنش خشکی افزایش بیان 61 برابر داشته است. پس از آن، بیشترین بیان مربوط به نمونه بساک 48 ساعت تنش تراریخته بوده است. میزان بیان این فاکتور رونویسی در گیاه غیر تراریخت نیز در زمانهای24 ساعت و 48 ساعت پس از تنش افزایش معنی داری داشته است ولی در مقایسه بین دو گیاه، افزایش بیان این فاکتور در گیاهی که پرومورتر در آن وارد شده بود در زمان 24 ساعت حدود 8 برابر و در زمان 48 ساعت حدود 3 برابر بیشتر از گیاه غیر تراریخت بوده است. در مقایسه بافت برگ و بساک، افزایش بیان این فاکتور در دو بافت و در هر دو نمونه تراریخته و غیر تراریخته مشاهده شده است ولی در بافت بساک میزان بیان بالاتر از بیان دربرگ بوده است. در مطالعات قبلی که با رنگ آمیزی هیستوشیمیایی، روی میزان فعالیت این پروموتر در بافتهای مختلف ریشه، برگ و بساک، صورت گرفته است، بیشترین فعالیت پروموتر و رنگ پذیری در بافت بساک مشاهده شده است (1)، که با نتایج این تحقیق، مطابقت دارد. لی و همکاران (2017) با انجام تحقیقی بر روی ریشه­های گیاه برنج تحت تنش خشکی میزان بیان یکی از اعضای فاکتور رونویسی NAC6 به نام OsNAC6 را مورد بررسی قرار دادند، بررسی داده­ها نشان داد که میزان بیان این فاکتور­ها در ریشه­ها در هنگام تنش خشکی به خصوص در برنج گونه تراریخته افزایش نشان می­دهد (18). چانگ و همکاران (2018) با انجام تحقیقی بر روی بافت ریشه برنج تراریخته میزان بیان ژنهای فاکتور­های رونویسی OsNAC5، OsNAC6، OsNAC9 و OsNAC10 را مورد بررسی قرار دادند نتایج نشان داد که میزان بیان این فاکتور­های رونویسی در ریشه گیاه برنج تراریخته هنگام مواجه شدن گیاه با تنش خشکی افزایش یافته است (6). لیئو و همکاران (2018) با تحقیقی بر روی گیاه دارویی Scutellaria baicalensis به نقش مهم فاکتور­های رونویسی NAC در متابولیتهای ثانویه پی بردند و با آنالیز داده­های RT-PCR نشان دادند که میزان بیان فاکتور ژن NAC6 در ریشه­ها و برگهای این گیاه افزایش بیان داشته است (19).

در مجموع، در این تحقیق علاوه بر تأیید پاسخ این فاکتور رونویسی به شرایط تنش آبی در بافت برگ و بساک، بیان بالاتر این فاکتور در گیاه تراریخت نشان داد که حضور بیشتر پروموتر انتقال یافته در گیاه تراریخت، مرتبط با بیان بالاتر فاکتور رونویسی ای شد که جایگاه اتصال آن روی پروموتر پیش بینی شده بود.

بررسی بیان ژن مسئول فاکتور رونویسی NAC10: با آنالیز داده­های RT-PCR میزان بیان ژن NAC10 در بافت برگ (شکل A2) و بساک (شکل B2)دو بافت برگ و بساک مشخص گردید.

شکل 2- تغییر بیان ژن NAC10 در زمانهای مختلف تنش خشکی در بافت برگ (A) و بافت بساک (B) گیاه تراریخت و غیر تراریخت

آنالیز داده­های RT-PCR نشان داد که بیان ژن NAC10 در بافت برگ در گیاه غیر تراریخته در همه زمانهای تنش پاسخ افزایشی داشته است و بیشترین بیان را در 72 ساعت (حدود 14 برابر شرایط کنترل) و پس از آن در 24 ساعت (حدود 7 برابر شرایط کنترل) داشته است. بررسی بیان در برگ گیاه تراریخته نیز، پاسخ افزایش در حالت تنش نسبت به کنترل را نشان داد. در مقایسه برگ گیاهان تراریخته و غیر تراریخته، میزان بیان در 24 ساعت و 48 ساعت در برگ گیاهان تراریخته بیشتر از غیر تراریخته بوده است. در 72 ساعت میزان بیان در برگ غیر تراریخته بالاتر از برگ تراریخته بوده است.

بیان قابل توجهی از این فاکتور در نمونه­های بساک تراریخته دیده نشد، این در حالی بود که میزان بیان این فاکتور در بافت بساک نمونه غیر تراریخته در 24 ساعت اول که گیاه با تنش خشکی مواجه شده بود، به میزان زیادی در حدود 70 برابر شرایط کنترل، بالا رفته بود، که نشان دهنده نقش زیاد این فاکتور رونویسی در بافت بساک هنگام مواجه به شرایط خشکی می باشد. نکته قابل توجه اینکه میزان بیان این فاکتور در بافت بساک به ترتیب بعد از 48 ساعت تنش و 72ساعت تنش و در نهایت در 7 روز تنش به کمترین میزان خود رسیده است. طبق تحقیقاتی که در این زمینه انجام گرفته شده است میزان بیان فاکتور­های رونویسی در 24 ساعت اول مواجه شدن گیاه با تنش زیستی به بیشترین مقدار خود می­رسند و بیان بالایی جهت مقاوم شدن گیاه در برابر تنش از خود نشان می­دهند و با ادامه پیدا کردن تنش میزان بیان کمتر و کمتر می­شود تا به جاییکه دیگر بیانی نخواهند داشت. در بافت بساک در گیاه تراریخت، بیان بسیار پایین این فاکتور در زمانهای 48 و 72 ساعت پس از تنش، مشاهده شده است. گزارشات مختلفی از نقش فاکتورهای رونویس خانواده NAC در خشکی وجود دارد به عنوان مثال هانگ و همکاران با انجام تحقیقی بر روی گیاه تراریخته برنج به بررسی بیان ژن ONAC022 از خانواده NAC پرداختند آنالیز داده­ها نشان داد که میزان بیان این ژن در گیاه تراریخته برنج هنگام مواجه شدن این گیاه با تنش شوری و تنش خشکی افزایش بیان داشته است، آنها نشان دادند که فاکتور­های رونویسی NAC در مقاوم کردن گیاه نسبت به تنش شوری و خشکی نقش به سزایی دارند (12). همچنین تیرومالایی کومار و همکاران با تحقیق بر روی گیاه گوجه فرنگی نشان دادند که فاکتور­های رونویسی NAC در مقاومت گیاه نسبت به خشکی نقش به سزایی دارند (28). تران و همکاران بر روی گیاه آرابیدوپسیس نقش فاکتور­های رونویسی را مورد بررسی قرار دادند و نشان دادند که این فاکتور­ها بیان بالایی در هنگام مواجه شدن گیاه با تنش شوری و خشکی از خود نشان دادند (29).

در بررسی پیش بینی جایگاههای اتصال فاکتورهای رونویسی اعضای مختلف خانواده NAC در دو سایت مختلف پیش بینی شدند. آنالیز توالی cis در برنج توسط محققان دیگری نیز صورت گرفته است و 140 مورد فاکتور رونویسی NAC یا ژنهای NAC-like (ONAC) را نشان داده است. تجزیه و تحلیل فیلوژنتیک خانواده NAC نشان داده که این خانواده به 5 گروه با نقشهای متفاوت تقسیم می­شوند(9). بر مبنای مقایسه میزان بیان ژن NAC10 در شرایط افزایش حضور پروموتر انتقال یافته در گیاهان تراریخت در مقابل گیاه غیر تراریخت، و عدم هماهنگی میزان بیان بین پروموتر و TF کاندید، احتمالاً پیش بینی سایت plantRegMap مبنی بر قرار گرفتن این TF بر روی این پروموتر صحیح نمی باشد، ولی پاسخ افزایشی بسیار بالای این TF نسبت به شرایط خشکی، در گیاهان غیر تراریخت تأیید شد. با بررسی کلی پیش بینی جایگاههای اتصال فاکتورهای رونویسی در سایت MatInspector خانواده های مختلف TF پیش بینی شد، و در ادامه در این تحقیق خانواده NAC مورد بررسی آزمایشگاهی قرار گرفت و در بین اعضای این خانواده NAC6 که چندین جایگاه بر روی پروموتر برای آن پیش بینی شده بود، انتخاب شد. نتایج حاصل از بررسی کمّی، هماهنگی میزان بیان این فاکتور با افزایش میزان پروموتر مرتبط با آن را نشان داد. سایت Genomatix و قسمت MatInspector در این سایت (http://www.genomatix.de/matinspector .html)، برای آنالیز پروموتر و بررسی جایگاههای تنظیمی و عوامل رونویسی بر روی آن، پیشنهاد می شود. MatInspecter توسط کارتاریوس و همکاران ارائه شده که جایگاه اتصال فاکتور­های رونویسی و خانواده ماتریس را در توالیهای نوکلئوتیدی شناسایی می­کند. تعدادی از برنامه­ها بر اساس MatInspecter اجازه آنالیز عمیق پروموتر و طراحی جایگاههای توالیهای تنظیمی را می­دهد(5).

کیم و همکاران (2004) با آزمایشی نشان دادند تمام عناصر مهم تنظیمی cis مورد نیاز برای نسخه برداری گرده خاص در بالادست بین نوکلئوتید­های 158 و273 قرار گرفته­اند (17)، این منطقه شامل چهار عنصر فرضی وابسته به القای جیبرلین (جعبه پیریمیدینCCTTTT  وTTTTTTCC ) و بیان بافت اختصاصی گرده خاص (AGAA وGTGA ) می­باشد. در تحقیق حاضر نیز، چهارعنصر AGAA در جایگاه اتصال فاکتور رونویسی NAC6 (جدول 3) مشاهده شد که می تواند به بیان بالای پروموتر مدنظر این تحقیق در بساک گیاه مرتبط باشد

بسیاری از ژنهای NAC در پاسخ به شوری و خشکی در گیاهان دخالت دارند، در تحقیق حاضر بیان بالای این فاکتورهای رونویسی در بساک تحت تنش خشکی نشان دهنده فعالیت بافت-اختصاصی این ژنها تحت شرایط تنش بود. همچنین با حضور پروموتر -که جایگاه فاکتور رونویسی NAC6 بر روی آن واقع بود- در گیاه تراریخت، بیان ژن NAC6، حدود 6 برابر بیشتر از گیاه غیر تراریخت شد که به تأثیر ورود پروموتر بر سنتز ژنهای مسئول فاکتورهای رونویسی مرتبط با آن جایگاه اشاره می کند.

1- راوش، ر، شیران، ب، ابراهیمی، ا، هوشمند، س، دلفروس، ر، 1396، بررسـی پـرومـوتـر ژن S-Like RNase  در بـرنـج
تراریخت، مجله بیوتکنولوژی کشاورزی، 9 (4)، 65-80
 
2- Abnosi, MH, Amirjani, M, Mahdiyeh, M, Moradipoor, H, 2015, Biochemical and Cellular Response of Catharanthus roseus Callus Cells to Cadmium Toxicity, Journal of Genetic Resources, 1 (2): 101-114.
3- Achard, P, Gong, F, Cheminant, S, Alioua, M, Hedden, P, Genschik, P, 2008, The cold-inducible CBF1 factor–dependent signaling pathway modulates the accumulation of the growth-repressing DELLA proteins via its effect on gibberellin metabolism, The Plant Cell, 20, 2117-2129
4- Aida, M, Ishida, T, Fukaki, H, Fujisawa, H, Tasaka, M, 1997, Genes involved in organ separation in Arabidopsis: an analysis of the cup-shaped cotyledon mutant, The Plant Cell, 9, 841-857
5- Cartharius, K, Frech, K, Grote, K, Klocke, B, Haltmeier, M, Klingenhoff, A, Frisch, M, Bayerlein, M, Werner, T, 2005, MatInspector and beyond: promoter analysis based on transcription factor binding sites, Bioinformatics, 21, 2933-2942
6- Chung, PJ, Jung, H, Do Choi, Y, Kim, J-K, 2018, Genome-wide analyses of direct target genes of four rice NAC-domain transcription factors involved in drought tolerance, BMC genomics, 19, 40
7- Duval, M, Hsieh, T-F, Kim, SY, Thomas, TL, 2002, Molecular characterization of AtNAM: a member of the Arabidopsis NAC domain superfamily, Plant molecular biology, 50, 237-248
8- Ernst, HA, Olsen, AN, Skriver, K, Larsen, S, Leggio, LL, 2004, Structure of the conserved domain of ANAC, a member of the NAC family of transcription factors, EMBO reports, 5, 297-303
9- Fang, Y, You, J, Xie, K, Xie, W, Xiong, L, 2008, Systematic sequence analysis and identification of tissue-specific or stress-responsive genes of NAC transcription factor family in rice, Molecular Genetics and Genomics, 280, 547-563
10- Gao, G, Zhong, Y, Guo, A, Zhu, Q, Tang, W, Zheng, W, Gu, X, Wei, L, Luo, J, 2006, DRTF: a database of rice transcription factors, Bioinformatics, 22, 1286-1287
11- He, XJ, Mu, RL, Cao, WH, Zhang, ZG, Zhang, JS, Chen, SY, 2005, AtNAC2, a transcription factor downstream of ethylene and auxin signaling pathways, is involved in salt stress response and lateral root development, The Plant Journal, 44, 903-916
12- Hong, Y, Zhang, H, Huang, L, Li, D, Song, F, 2016, Overexpression of a stress-responsive NAC transcription factor gene ONAC022 improves drought and salt tolerance in rice, Frontiers in plant science, 7, 4
13- Hoth, S, Morgante, M, Sanchez, J-P, Hanafey, MK, Tingey, SV, Chua, N-H, 2002, Genome-wide gene expression profiling in Arabidopsis thaliana reveals new targets of abscisic acid and largely impaired gene regulation in the abi1-1 mutant, Journal of cell science, 115, 4891-4900
14- Hu, H, Dai, M, Yao, J, Xiao, B, Li, X, Zhang, Q, Xiong, L, 2006, Overexpressing a NAM, ATAF, and CUC (NAC) transcription factor enhances drought resistance and salt tolerance in rice, Proceedings of the National Academy of Sciences, 103, 12987-12992
15- Ishida, T, Aida, M, Takada, S, Tasaka, M, 2000, Involvement of CUP-SHAPED COTYLEDON genes in gynoecium and ovule development in Arabidopsis thaliana, Plant and Cell Physiology, 41, 60-67
16- Kikuchi, K, Ueguchi-Tanaka, M, Yoshida, K, Nagato, Y, Matsusoka, M, Hirano, H-Y, 2000 Molecular analysis of the NAC gene family in rice, Molecular and General Genetics MGG, 262, 1047-1051
17- Kim, YJ, Lee, SH, Park, KY, 2004, A leader intron and 115-bp promoter region necessary for expression of the carnation S-adenosylmethionine decarboxylase gene in the pollen of transgenic tobacco, FEBS letters, 578, 229-235
18- Lee, DK, Chung, PJ, Jeong, JS, Jang, G, Bang, SW, Jung, H, Kim, YS, Ha, SH, Choi, YD, Kim, JK, 2017, The rice Os NAC 6 transcription factor orchestrates multiple molecular mechanisms involving root structural adaptions and nicotianamine biosynthesis for drought tolerance, Plant biotechnology journal, 15, 754-764
19- Liu, J, Chen, T-Y, Yuan, Y, Zhou, J-H, Zhao, Y-Y, Huang, L-Q, 2018, Bioinformatics and expression analysis of NAC transcription factor genes in Scutellaria baicalensis World, Journal of Traditional Chinese Medicine, 4, 37
20- Mitsuda, N, Iwase, A, Yamamoto, H, Yoshida, M, Seki, M, Shinozaki, K, Ohme-Takagi, M, 2007, NAC transcription factors, NST1 and NST3, are key regulators of the formation of secondary walls in woody tissues of Arabidopsis, The Plant Cell, 19, 270-280
21- Moreno-Alvarado, M, García-Morales, S, Trejo-Téllez, LI, Hidalgo-Contreras, JV, Gómez-Merino, FC, 2017, Aluminum enhances growth and sugar concentration, alters macronutrient status and regulates the expression of NAC transcription factors in rice, Frontiers in plant science, 8, 73
22- Nakashima, K, Ito, Y, Yamaguchi-Shinozaki, K, 2009, Transcriptional regulatory networks in response to abiotic stresses in Arabidopsis and grasses, Plant physiology, 149, 88-95
23- Olsen, AN, Ernst, HA, Leggio, LL, Skriver, K, 2005, NAC transcription factors: structurally distinct, functionally diverse, Trends in plant science, 10, 79-87
24- Riechmann, JL, 2002, Transcriptional regulation, a genomic overview The Arabidopsis Book, American Society of Plant Biologists, 1
25- Shinozaki, K, Yamaguchi-Shinozaki, K, 2000, Molecular responses to dehydration and low temperature: differences and cross-talk between two stress signaling pathways, Current opinion in plant biology, 3, 217-223
26- Siddique, M., Hamid, A. and Islam, M. (2000). Drought stress effects on water relations of wheat. Botanical Bulletin of Academia Sinica, 41.
27- Souer, E, van Houwelingen, A, Kloos, D, Mol, J, Koes, R, 1996, The no apical meristem gene of Petunia is required for pattern formation in embryos and flowers and is expressed at meristem and primordia boundaries, Cell, 85, 159-170
28- Thirumalaikumar, VP, Devkar, V, Mehterov, N, Ali, S, Ozgur, R, Turkan, I, Mueller‐Roeber, B, Balazadeh, S, 2018, NAC transcription factor JUNGBRUNNEN 1 enhances drought tolerance in tomato, Plant biotechnology journal, 16, 354-366
29- Tran, L-SP, Nakashima, K, Sakuma, Y, Simpson, SD, Fujita, Y, Maruyama, K, Fujita, M, Seki, M, Shinozaki, K, Yamaguchi-Shinozaki, K, 2004, Isolation and functional analysis of Arabidopsis stress-inducible NAC transcription factors that bind to a drought-responsive cis-element in the early responsive to dehydration stress 1 promoter, The Plant Cell, 16, 2481-2498
30- Zhang, JZ, 2003, Overexpression analysis of plant transcription factors, Current opinion in plant biology, 6, 430-440
دوره 35، شماره 1
اردیبهشت 1401
صفحه 29-43
  • تاریخ دریافت: 04 آذر 1398
  • تاریخ بازنگری: 01 خرداد 1399
  • تاریخ پذیرش: 17 خرداد 1399