نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 گروه زیست شناسی ، دانشکده علوم، موسسه غیرانتفاعی نوردانش میمه
2 گروه زیست فناوری مولکولی گیاهی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران
3 استادیار گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، موسسه آموزش عالی نور دانش، میمه
4 دانشکده علوم و صنایع غذایی، دانشگاه شیراز
5 پژوهشگر دانشگاه صنعتی مالک اشتر
6 دانشکده دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد کازرون
چکیده
کینوا (Chenopodium quinoa Willd) به عنوان محصولی با ارزش، دارای مقاومت طبیعی به شرایط خشکی، گزینه مناسبی برای بهبود امنیت و کیفیت غذایی، مقاوم به استرس و از خانواده تاج خروسیان بوده که از هفت هزار سال پیش در مناطق آند کشت گردیده است. دانههای کینوا منابع غنی از پلیفنلها بوده که قادرند، اجزای سلولی را در برابر آسیب اکسیداتیو محافظت نموده و خطر بروز انواع بیماریهای وابسته به تنش اکسیداتیو را کاهش دهند. در این مطالعه، پارامترهای سلولی و بیوشیمیایی واریتههای کینوای کشتشده در شرایط اقلیمی میمه اصفهان شامل محتوای فنل کل، اسیدآمینه آزاد کل، فعالیت سوپراکسید دیسموتاز، پروتئین محلول کل، SDS-PAGE پروتئین محلول و مشاهدات کروموزومی سنجیده شد. میکروسکوپ نوری ابزار مناسبی برای مطالعه کروموزومهای کینوا نبود. از 5 واریته کینوا، محتوای فنل کل به طرز معنیداری در Q29 (62/2±90/12 میکروگرم گالیکاسید بر میلیگرم دانه)، بیشتر بود. آنالیز واریانس محتوای اسید-آمینه کل، تفاوتهای معنیداری بین واریتهها نشان داد (p
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Evaluation of molecular and biochemical properties in quinoa varieties
نویسندگان [English]
1 Biology Dept, Noor Danesh Institude of Higher Education, Meimeh Isfahan, I.R. of Iran
2 Department Of Plant Molecular Biotechnology ,National Institute for Genetic Engineering and Biotechnology,(NIGEB), Tehran, Iran
3 Assistant Professor of NourDaneh Institute of Higher Education, Meimeh
4 Food Science & Technology Dept., Shiraz University, Shiraz, I.R. of Iran
5 Researcher of Malek Ashtar University of Technology
6 Faculty of Veterinary Medicine, Kazerun Branch, Islamic Azad University, Kazerun, I.R. of Iran
چکیده [English]
As a high value crop with natural tolerance for drought conditions, Quinoa (Chenopodium quinoa Willd) is an excellent candidate for improving food safety and food quality. It's an Amaranthacean, stress-tolerant plant cultivated along the Andes for the last 7000 years. Quinoa seeds represent potential rich sources of polyphenol compounds; they may protect cell constituents against oxidative damage and therefore limit the risk of various degenerative diseases associated to oxidative stress. In this study cellular and biochemical parameters include of total phenolic content, total free amino acids, superoxide dismutase activity, leaf total soluble protein, soluble protein SDS-PAGE and chromosomal observation in quinoa varieties cultivated in climate condition of meimeh Isfahan were investigated. Optical microscope was not a good tool for studying quinoa chromosomes. The total phenol content amongst the five quinoa varieties was significantly higher in Q29 (12.90±2.62 μg GA/mg seed). Analysis of variance of total content of free amino acids revealed significant (p
کلیدواژهها [English]
بررسی ویژگیهای مولکولی و بیوشیمیایی واریته های کینوا (Chenopodium quinoa)
اعظم راسخی کازرونی1، محمد رضا زمانی2، فاطمه حیدریان نائینی1*، اسما راسخی کازرونی3 ، علیرضا منصوریان4 و سعید سلامی5
1 ایران، اصفهان، میمه، مؤسسه آموزش عالی نور دانش میمه، گروه زیستشناسی
2 ایران، تهران، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیستفناوری، گروه زیستفناوری مولکولی گیاهی
3 ایران، شیراز، دانشگاه شیراز، بخش علوم و صنایع غذایی
4 ایران، اصفهان، دانشگاه صنعتی مالک اشتر
5 ایران، کازرون، دانشگاه آزاد اسلامی واحد کازرون، دانشکده دامپزشکی
تاریخ دریافت: 27/11/1397 تاریخ پذیرش: 09/06/1398
چکیده
کینوا (Chenopodium quinoa Willd) به عنوان محصولی با ارزش، دارای مقاومت طبیعی به شرایط خشکی، گزینه مناسبی برای بهبود امنیت و کیفیت غذایی، مقاوم به استرس و از خانواده تاج خروسیان بوده که از هفت هزار سال پیش در مناطق آند کشت گردیده است. دانههای کینوا منابع غنی از پلیفنلها بوده که قادرند، اجزای سلولی را در برابر آسیب اکسیداتیو محافظت نموده و خطر بروز انواع بیماریهای وابسته به تنش اکسیداتیو را کاهش دهند. در این مطالعه، پارامترهای سلولی و بیوشیمیایی واریتههای کینوای کشتشده در شرایط اقلیمی میمه اصفهان شامل محتوای فنل کل، اسیدآمینه آزاد کل، فعالیت سوپراکسید دیسموتاز، پروتئین محلول کل، SDS-PAGE پروتئین محلول و مشاهدات کروموزومی سنجیده شد. میکروسکوپ نوری ابزار مناسبی برای مطالعه کروموزومهای کینوا نبود. از 5 واریته کینوا، محتوای فنل کل به طرز معنیداری در Q29 (62/2±90/12 میکروگرم گالیکاسید بر میلیگرم دانه)، بیشتر بود. آنالیز واریانس محتوای اسیدآمینه کل، تفاوتهای معنیداری بین واریتهها نشان داد (p<0.05). فعالیت سوپراکسید دیسموتاز (001/0±144/0 واحد آنزیمی بر میلیگرم پروتئین محلول برگ تازه) و اسیدآمینه آزاد کل (72/2±44/31 میلیگرم گلیسین بر گرم برگ تازه) در Q18 کمتر از سایرین بود. واریتههای Q18 (31/0±62/2 میلیگرم بر گرم برگ تازه)، Q29 (19/0±36/2 میلیگرم بر گرم برگ تازه) و Q22 (85/0±20/2 میلیگرم بر گرم برگ تازه) به ترتیب دارای بیشترین میزان پروتئین محلول کل بودند. هر 5 واریته، دارای باندهای پروتئینی با وزن مولکولی تقریبی 35، 55، 60 و 170 کیلودالتون، بودند که باند 170 کیلودالتونی برای نخستین بار در کینوا رؤیت شد.
واژههای کلیدی: سوپر اکسیددیسموتاز، Chenopodium quinoa، کروموزوم، SDS-PAGE، اسیدآمینه آزاد
* نویسنده مسئول، تلفن: 09133040284، پست الکترونیکی: mansoorian271@yahoo.com
مقدمه
کینوا (Chenopodium quinoa Willd) به عنوان محصولی با ارزش، دارای مقاومت طبیعی به شرایط خشکی، گزینه مناسبی برای بهبود امنیت و کیفیت غذایی، مقاوم به استرس و از خانواده تاج خروسیان بوده که از هفت هزار سال پیش در مناطق آند کشت گردیده است. دانههای کینوا منابع غنی از پلیفنلها بوده که قادرند، اجزای سلولی را در برابر آسیب اکسیداتیو محافظت نموده و خطر بروز انواع بیماریهای وابسته به تنش اکسیداتیو مانند سرطان، بیماری قلبی- عروقی و پوکی استخوان را کاهش دهند. با وجود معضل کمآبی در کشور، با توجه به مزایای تغذیهای این گیاه، مقاومت آن به خشکی و همچنین کمسابقه بودن کشت آن در ایران (5، 8، 19، 31، 48 و 61)، انجام بررسیهای بیوشیمیایی، سلولی و مولکولی واریتههای مختلف آن با هدف پیبردن به مکانیسمهای مقاومت گیاه و نیز گزینش واریتههای مناسب با توجه به اهداف مختلف، ضروری است.
مواد و روشها
مواد مورد استفاده: مواد شیمیایی شرکتهای Merck و Sigma-Aldrich مورد استفاده قرار گرفتند.
بذرهای 5 واریته کینوا (Q29، Q22، Q18، Titicaca، RedCarina) از مؤسسه بذر و نهال کرج تهیه شد. در مزرعه نور دانش میمه از اواخر اردیبهشت 96 تا اوایل شهریور 96 کشت گردید و آبیاری هر نه روز یک بار انجام شد. برای کینوا آبیاری هر سه روز یک مرتبه آبیاری مناسب و آبیاری هر نه روز یک بار تنش شدید آبی محسوب میگردد (17). پس از برداشت، برگها بلافاصله درون کیسههای پلاستیکی جمعآوری سپس در فریزر با دمای 20- درجه سانتیگراد تا زمان استفاده، نگهداری شد.
اندازهگیری پلیفنل کل: دانهها ابتدا پودر شده و از الک با اندازه مش 60 عبور داده شدند. 125/0 گرم از نمونههای پودر شده با 5 میلیلیتر از حلال استخراج (ترکیبی از متانول، هیدروکلریک اسید 16/0 مولار و آب به ترتیب به نسبتهای 8: 1: 1)، مخلوط شدند. مخلوط حاصل به مدت 2 ساعت در تاریکی نگهداری شده؛ آنگاه با سرعت 200 دور در دقیقه در دمای محیط و در تاریکی توسط شیکر بهم زده، سپس به مدت 5 دقیقه در دمای محیط، با سرعت g 10000 سانتریفیوژ و مایع رویی به تیوب دیگری منتقل شد. رسوب حاصل مجدداً عصارهگیری شد. این مرحله نیز همانند مرحله قبل انجام شد با این تفاوت که عصارهگیری توسط 5 میلیلیتر استون 70 درصد صورت گرفت. پس از ترکیب نمودن عصاره حاصل از مرحله اول (عصاره متانولی) با عصاره حاصل از مرحله دوم (عصاره استونی)، عصاره نهایی تا زمان اندازهگیری پلیفنل کل در تاریکی و در فریزر 20- درجه سانتیگراد نگهداری شد (26 و 48). میزان پلیفنل کل بر اساس روش فولین- سیوکالته چنانچه سلمانیان و همکاران (1393) بیان نمودهاند، اندازهگیری شد (9). اساس کار در این روش، احیای معرف فولین توسط ترکیبات فنلی در محیط قلیایی و ایجاد کمپلکس آبی رنگ است که حداکثر جذب را در طول موج 760 نانومتر نشان میدهد. به طور خلاصه در این روش، 20 میکرولیتر از محلول عصاره درون لوله آزمایش با 160/1 میلی لیتر آب مقطر و 100 میکرولیتر معرف فولین سیوکالته مخلوط شدند. بعد از گذشت 1 تا 8 دقیقه، 300 میکرولیتر محلول بیکربنات سدیم (20 درصد وزنی- حجمی) به محتوای لوله آزمایش افزوده شد. لولههای آزمایش بعد از تکان دادن، درون حمام آب با دمای 40 درجه سانتیگراد قرار گرفته و پس از گذشت 30 دقیقه، جذب آنها با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 760 نانومتر خوانده شد. میزان پلیفنل کل با استفاده از منحنی استاندارد گالیک اسید بر حسب میکروگرم گالیک اسید بر میلیگرم دانه بیان گردید (9).
اندازهگیری محتوای اسیدهای آمینه آزاد: 5/0 گرم از بافت تازه برگ با 5 میلیلیتر اتانول 10 درصد ساییده و حجم آن با آب مقطر به 100 میلیلیتر رسانده شد. پس از صاف نمودن هموژن حاصل توسط کاغذ صافی، برای تعیین میزان اسیدهای آمینه آزاد، 1/0 میلیلیتر از عصاره صاف شده برداشته و به آن 1 میلیلیتر بافر استیک اسید- استات سدیم، 3 میلیلیتر معرف نینهیدرین و 1/0 میلیلیتر، آسکوربیک اسید 3 درصد اضافه شد. محلول فوق به مدت 15 دقیقه در بن ماری 100 درجه سانتیگراد قرار گرفت. پس از سرد شدن، حجم محلول فوق با اتانول 60 درصد به 20 میلیلیتر رسانده و جذب توسط اسپکتروفتومتر در طول موج 470 نانومتر قرائت شد. میزان اسیدهای آمینه آزاد با استفاده از منحنی استاندارد گلیسین بر حسب میکروگرم گلیسین بر گرم برگ تازه، بیان گردید (12 و 63).
اندازهگیری پروتئین محلول کل: 1 گرم از بافت برگ تازه در حضور بافر استخراج (پتاسیم فسفات 50 میلیمولار با 7pH=) له شد. برای عصارهگیری، مخلوط حاصل به لولههای سانتریفیوژ منتقل و به مدت 10 دقیقه با سرعت g38990 در دمای 4 درجه سانتیگراد، سانتریفیوژ شد. پروتئین محلول کل مطابق روش بردفورد (1979) اندازهگیری شد. سپس 10 میکرولیتر از محلول رویی سانتریفیوژ شده را با 200 میکرولیتر معرف رنگی بردفورد و 790 میکرولیتر آب مقطر ترکیب و جذب در طول موج 595 نانومتر خوانده شد. میزان پروتئین محلول کل با استفاده از منحنی استاندارد آلبومین سرم گاوی بر حسب میلیگرم بر گرم برگ تازه بیان شد (10 و 25).
اندازهگیری فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز: 1 گرم از نمونه برگ در 2 میلیلیتر فسفات بافر در هاون ساییده و به مدت 10 دقیقه با سرعتg 38990 در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد. 100 میکرولیتر از محلول رویی به عنوان عصاره آنزیمی مورد استفاده قرار گرفت. سنجش فعالیت آنزیم به کمک سنجش توانایی آن در جلوگیری از احیاء نوری نیتروبلوتترازولیوم (NBT) در طول موج 560 نانومتر انجام گرفت. برای این منظور ابتدا محلول بافر فسفات 50 میلیمولار با 8/7pH= تهیه شد. به منظور تهیه محلول واکنش، ترکیبات EDTA 1/0 میلیمولار، NBT 75 میکرومولار، متیونین 13 میلیمولار و ریبوفلاوین 2 میکرومولار، به ترتیب به یکدیگر اضافه و محلول حاصل در تاریکی نگه داشته شد. از هر نمونه عصاره، 100 میکرولیتر در هر ویال ریخته و 900 میکرولیتر از محلول واکنش به آن اضافه گردید؛ با قرار گرفتن نمونه تحت روشنایی لامپ 40 وات، بلافاصله واکنش آغاز شد. پس از 10دقیقه جذب نمونه در طول موج 560 نانومتر خوانده شد. برای سنجش فعالیت آنزیم، نیاز به شاهد روشنایی است. شاهد روشنایی شامل 100 میکرولیتر بافر فسفات (فاقد آنزیم) و 900 میکرولیتر محلول واکنش بود. همچنین از ترکیب واکنشی کامل دیگری به عنوان نمونه بلانک استفاده شد که حاوی عصاره آنزیمی بود و از ابتدا در تاریکی مطلق قرار گرفت. به این ترتیب میزان فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز در نمونهها در مقایسه با شاهد روشنایی سنجیده شد. به دلیل عدم وجود آنزیم در شاهد روشنایی، احیاء NBT در حضور نور به طور صد درصد انجام گرفته و تمام NBT موجود در محلول واکنش به فورمازون تبدیل میشود. میزان جذب این شاهد در طول موج 560 نانومتر نشاندهنده صد در صد احیای نوری NBT است و نیمی از آن، معادل یک واحد آنزیمی میباشد. بنابراین یک واحد آنزیمی سوپراکسید دیسموتاز، مقدار آنزیمی است که موجب 50 درصد ممانعت از احیای نوری NBT میگردد. اختلاف جذب نمونهها و شاهد روشنایی در طول موج 560 نانومتر، نشاندهنده مهار احیاء نوری NBT در حضور آنزیم سوپراکسید دیسموتاز موجود در نمونه میباشد. با استفاده از این اختلاف جذب، واحد آنزیمی نمونهها محاسبه شده و فعالیت ویژه آنزیم بر حسب واحد آنزیم در مقدار پروتئین کل (بر حسب میلیگرم) در 100 میکرولیتر عصاره بیان گردید (1، 2 و 29). درصد ممانعتکنندگی از احیای NBT در هر نمونه از طریق رابطه 1 محاسبه شد که Z بیانگر تعداد واحد آنزیمی بر حسب میکرولیتر و Y بیانگر میزان ممانعتکنندگی بر حسب درصد میباشد (رابطه 2). عدد 100 در واقع حجم عصاره آنزیمی است.
(رابطه1) جذب نمونه = Z
Y= میزان ممانعتکنندگی بر حسب درصد
Z= تعداد واحدآنزیمی برحسب میکرولیتر
(رابطه2) =Y
ODsample= جذب نمونه دارای عصاره آنزیمی
ODcontrol= جذب نمونه فاقد عصاره آنزیمی
مشاهده کروموزومها: مراحل جوانهزنی بذرها، پیش تیمار، تثبیت، هیدرولیز و رنگآمیزی به منظور تهیه لام به شرح زیر انجام شد. برای استفاده از مریستم انتهای ریشه، تعدادی بذر روی کاغذ صافی مرطوب در پتری دیش قرار داده شد. بدون ضدعفونی کردن بذرها پیش از ریشهزایی، بدون هیچ مشکلی ریشهزایی رخ داد. پتری دیشها به مدت 48 ساعت در انکوباتور با دمای 26 درجه سانتیگراد قرار داده شدند. وقتی طول ریشهها به 1 سانتیمتر رسید عمل قطع ریشه انجام شد (4، 15 و 16). ریشهها به محلول حاوی 8- هیدروکسی کینولین 002/0 مولار و دیمتیلسولفوکسید 03/0 درصد منتقل شده و به مدت 3 الی 5 ساعت در تاریکی در یخچال نگهداری شدند. در این مرحله ریشهها در محلول کارنوی I (اتانول- استیکاسید (1:3)) در یخچال به مدت 24 ساعت نگهداری شد. سپس ریشهها به الکل 70 درصد انتقال داده شد و تا زمان استفاده از آنها، در یخچال نگهداری شدند. قبل از رنگآمیزی، ریشهها 2 بار به مدت 5 دقیقه توسط آب مقطر شستشو داده شده، سپس توسط سیترات بافر 01/0 مولار به مدت 30 دقیقه تیمار شد. ریشهها به مدت 4 ساعت در پکتیناز 1 درصد و سلولاز (50 میلیگرم سلولاز و 1 میلیلیتر پکتیناز رقیق شده در 10 میلیلیتر سیترات بافر 01/0 مولار با 8/4-5/4pH=) و در دمای 37 درجه سانتیگراد گرمخانهگذاری شد، سپس به مدت 11 دقیقه در هیدروکلریکاسید 1 نرمال در دمای 60 درجه سانتیگراد هیدرولیز شدند. رنگآمیزی به روش فولژن یعنی قرار گرفتن ریشهها در محلول استوکارمن 1 درصد به مدت 1ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد صورت گرفت. سپس ریشهها روی لام قرار گرفت و پس از افزودن استیکاسید 45درصد، عمل اسکواش انجام شد (32).
بررسی پروتئینها به روش SDS-PAGE: برای استخراج پروتئینهای محلول، قطعات برگ با کمک ازت مایع کاملاً به صورت پودر درآمدند. سپس بافت نرم شده به لولههای سانتریفیوژ منتقل و به نسبت 1 گرم بافت برگ به 3 میلی لیتر بافر استخراج با 7 pH= (Tris-HCl 50 میلی مولار، PMSF 1 میلی مولار، EDTA 2 میلی مولار و مرکاپتواتانول 1 میلی مولار) به لولهها افزوده گردید. سپس لولههای حاوی محلول به مدت 3 الی 4 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد قرار داده شد و پس از آن به مدت 25 دقیقه با سرعت g 33965 در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ گردید. پس از آن محلول رویی جمعآوری و توسط استون سرد (1 حجم نمونه به 3 حجم استون) رسوب داده و در دمای 20- درجه سانتیگراد فریزر به مدت 20 دقیقه نگهداری شد. پس از آن مجدداً به مدت 15 دقیقه با g 33965 در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ گردید. در این مرحله محلول رویی به آرامی خالی گردید و رسوب حاصله در دمای اتاق کاملاً خشک و پس از آن به این رسوب مقدار کمی از بافر استخراج (حدوداً 300 میکرولیتر) افزوده شده، با دقت رسوب موجود حل گردید و مجدداً به مدت 5 دقیقه با g 33965 در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ گردید و برای بررسی پروتئینها به روش SDS-PAGE استفاده شد (37). به منظور انجام SDS-PAGE از دستگاه الکتروفورز عمودی (شرکت پایا پژوهش پارس، ایران) استفاده شد. ژل آکریلآمید 5/12 درصد در شرایط احیایی بر اساس روش Laemmli ساخته شده و باندهای پروتئینی با رنگآمیزی کوماسی بریلیانت بلو R250 ظاهر شدند (7 و 38).
تجزیه و تحلیل دادهها: پژوهش حاضر بر اساس یک طرح کاملاً تصادفی با 3 تکرار برای هر آنالیز انجام شد. نتایج به صورت میانگین± تغییرات انحراف استاندارد بیان شدند و برای تحلیل دادهها از آنالیز ANOVA و آزمون دانکن با نرمافزار SPSS نسخه 16 استفاده شد.
نتایج و بحث
از نظر میزان پلیفنل کل دانه، واریته Q29 (62/2±90/12 میکروگرم گالیک اسید بر میلیگرم دانه) در مقایسه با سایر واریتهها دارای بیشترین مقدار بود که این اختلاف از نظر آماری کاملاً معنیدار شد (p<0.05). میزان پلیفنل کل در واریته Q29 تقریبا 4 برابر پلیفنل کل دانه در واریته Titicaca (39/0±28/3 میکروگرم گالیک اسید بر میلیگرم دانه) بود (شکل 1). ژنوتیپهای مختلف هر محصول کشاورزی خاص از نظر ظرفیت آنتیاکسیدانی و میزان ترکیبات فنلی با یکدیگر متفاوت هستند (64، 65 و 66). بین محتوای پلیفنل کل و فعالیت آنتیاکسیدانی رابطهای خطی برقرار است و با افزایش محتوای پلیفنل کل، فعالیت آنتیاکسیدانی در دانهها افزایش مییابد (34، 39، 40 و 67). وجود این ارتباط قوی بین محتوای پلیفنل کل و فعالیت آنتیاکسیدانی، حاکی از آن است که محتوای پلیفنل کل، شاخص پیشبینیکننده مناسبی برای ارزیابی فعالیت آنتیاکسیدانی دانهها در شرایط آزمایشگاهی میباشد. دانههای کینوا به واسطه وجود ترکیبات فنلی، دارای خاصیت آنتیاکسیدانی میباشند که خطر ابتلا به آن دسته از بیماریها را که با افزایش رادیکالهای آزاد ارتباط مستقیم دارند، کاهش میدهد (48). بنابراین واریته Q29 از این نظر به سایر واریتهها ترجیح داده میشود.
شکل1- مقایسه پلیفنل کل در واریتههای کینوا. حروف a و b بیانگر تفاوتهای معنیدار بین واریتههاست (p<0.05).
بیشترین میزان اسیدهای آمینه آزاد برگ متعلق به واریته Titicaca و کمترین میزان، متعلق به واریته Q18 بود که این اختلاف از نظر آماری نیز معنیداری بود (p<0.05). پس از واریته Titicaca (25/1±68/42 میلیگرم گلیسین بر گرم برگ تازه)، میزان اسیدهای آمینه آزاد برگ به ترتیب در واریتههای Q29 (27/1±41/39 میلیگرم گلیسین بر گرم برگ تازه)، RedCarina (74/2±33/38 میلیگرم گلیسین بر گرم برگ تازه)، Q22 (24/9±07/35 میلیگرم گلیسین بر گرم برگ تازه) و Q18 (72/2±44/31 میلیگرم گلیسین بر گرم برگ تازه) بیشتر بود (شکل 2). واریتههای Q29، RedCarina و Q22 از نظر آماری تفاوت معنیداری با یکدیگر نداشتند. بین این سه واریته با واریته Titicaca و نیز بین این سه واریته با واریته Q18 تفاوت معنیداری مشاهده نشد؛ هرچند که واریتههای Titicaca و Q18، خود در دو سطح آماری مختلف قرار داشتند. در زمان کمبود آب، پتانسیل نگهداری آب برای رشد پیوسته و یکنواخت گیاه، ضروری است و این امر از طریق سازوکارهای تنظیم اسمزی ناشی از تجمع مواد محلول سازگار در سیستم امکانپذیر میباشد (56). برخی گیاهان از قبیل هالوفیتها در پاسخ به کمبود آب، اسمولیتهای رقابتی مانند اسیدهای آمینه آزاد و قندهای الکلی را به مقادیر زیاد در سلولهای خود تجمع میسازند. اثبات شده است که اسمولیتهای رقابتی با واکنشهای بیوشیمیایی معمول هیچگونه تداخلی ندارند و تنها به عنوان اسمولیتهای محافظتی در حین تنش اسمزی عمل میکنند (17). در شرایط تنش خشکی، میزان فتوسنتز به دلیل بسته شدن روزنهها کاهش مییابد. با پیشرفت خشکی، به دلیل تغییرات بیوشیمیایی در کلروپلاست، تثبیت گاز دیاکسید کربن کاهش بیشتری پیدا کرده و در چنین شرایطی کاهش تثبیت گاز دیاکسید کربن موجب احیای شدید زنجیره انتقال الکترون فتوسنتزی و نشت الکترون به مولکول اکسیژن و در نتیجه تشکیل انواع اکسیژن فعال (ROS) میگردد. در غلظتهای زیاد، اکسیژنهای فعال از طریق تخریب اکسیداتیو لیپیدها، پروتئینها و اسیدهای نوکلئیک به سازوکارهای طبیعی سلول آسیب میرسانند (24، 27، 49 و 53). تحقیقات نشان دادهاند که در آن دسته از ژنوتیپهای کینوا که نسبت به خشکی و تنش کمآبی مقاومند، مقدار اسیدهای آمینه آزاد برگ در مقایسه با ژنوتیپهای حساس به خشکی و کمآبی، بیشتر است. همچنین، در تمام ژنوتیپها میزان اسیدآمینه آزاد گلیسین در برگ در شرایط کمآبی بیش از شرایط معمولی است (17).
شکل2- مقایسه میزان اسیدآمینه آزاد در واریتههای کینوا. حروف a و b بیانگر تفاوتهای معنیدار بین واریتههاست (p<0.05).
میزان پروتئین محلول کل در واریتههای Q18، Q29 و Q22 بیشتر از دو واریته Titicaca و RedCarina بود. با توجه به نتایج آنالیز آماری (شکل 3)، واریتههای Q18 (31/0±62/2 میلیگرم بر گرم برگ تازه)، Q29 (19/0±36/2 میلیگرم بر گرم برگ تازه) و Q22 (85/0±20/2 میلیگرم بر گرم برگ تازه) که به ترتیب دارای بیشترین میزان پروتئین محلول کل بودند، همگی در یک سطح قرار گرفتند (p<0.05). بین واریتههای Titicaca (56/0±90/0 میلیگرم بر گرم برگ تازه) و RedCarina (09/0±43/0 میلیگرم بر گرم برگ تازه) نیز تفاوت معنیداری مشاهده نشد. در مطالعاتی که به منظور بررسی پاسخهای بیوشیمیایی و فیزیولوژیک گیاهان به تنش انجام میشود، مقدار پروتئین کل یکی از شاخصهای بیوشیمیایی محسوب میگردد. زیتون نیز یکی از گونههای متحمل به خشکی است اما پژوهشها نشان داده که ارقام مختلف زیتون، تحمل متفاوتی نسبت به کمبود آب نشان میدهند. در شرایط تنش، پروتئین محلول کل در تمام ارقام کاهش مییابد اما تفاوت معنیداری بین ارقام وجود ندارد (3). در بررسی اثرات تنش خشکی و ژنوتیپ بر عملکرد دانه نخود در شرایط مزرعه در مرحله زایشی، تنش خشکی، میزان پروتئین محلول برگ را از 5/17 به 5 میلی گرم بر گرم وزن تر کاهش داد، اما در مجموع رابطهای بین میزان پروتئین محلول برگ و مقاومت به خشکی مشاهده نشد (11). تنش آبی سطوح پروتئینی گیاهان را تحت تأثیر قرار داده و نتایج ضد و نقیضی را به همراه داشته است به طوری که برخی کاهش و گروهی افزایش در سطوح پروتئینی را تحت تنش آبی گزارش کردهاند (50 و 57).
شکل3- مقایسه میزان پروتئین محلول کل در واریتههای کینوا. حروف a و b بیانگر تفاوتهای معنیدار بین واریتههاست (p<0.05).
فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز در واریته RedCarina (118/0±747/0 واحد آنزیمی بر میلیگرم پروتئین محلول برگ تازه) بیش از سایر واریتهها بود که البته این اختلاف معنیدار بود (p<0.05). پس از واریته RedCarina، واریته Titicaca (004/0±417/0 واحد آنزیمی بر میلیگرم پروتئین محلول برگ تازه) از نظر فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز بیشترین میزان را داشت (شکل 4). واریتههای Q22 (013/0±163/0 واحد آنزیمی بر میلیگرم پروتئین محلول برگ تازه)، Q29 (001/0±158/0 واحد آنزیمی بر میلیگرم پروتئین محلول برگ تازه) و Q18 (001/0±144/0 واحد آنزیمی بر میلیگرم پروتئین محلول برگ تازه) نیز از نظر آماری در یک سطح قرار گرفتند. وجود رابطه معکوس بین میزان پروتئین محلول کل و میزان فعالیت سوپراکسید دیسموتاز میتواند به علت اثر تنش بر میزان تولید ترکیبات اکسیداتیو و کاهش میزان پروتئین در نتیجه اثر این ترکیبات بر تجزیه پروتئین و نیاز به حضور بیشتر سوپراکسید دیسموتاز جهت رفع اثر این اکسیدانها باشد. این مطلب توسط سی و سه مرده و همکاران (1393) نیز بیان شده است (11). سوپراکسید دیسموتاز یک آنتیاکسیدان قوی است که اولین ماده تولید شده از احیای یک ظرفیتی اکسیژن، یعنی رادیکال سوپراکسید را از بین میبرد و به اکسیژن و پراکسید هیدروژن تبدیل میکند و در نتیجه باعث پایداری غشاء و سلولهای گیاهی در شرایط خشکی میشود، بنابراین سوپراکسید دیسموتاز به عنوان دفاع اولیه در مقابل رادیکالهای آزاد و اکسیژن در نظر گرفته میشود (18). توحیدی مقدم و همکاران (2009)، گزارش کردند که در طی بروز تنش خشکی بر میزان فعالیت سوپراکسید دیسموتاز، افزوده میشود (60). افزایش فعالیت سوپراکسید دیسموتاز که آنزیمی ضداکسنده است تحت تنش خشکی موجب افزایش مقاومت گیاه در مقابل تنش خشکی شده و از کاهش رشد و عملکرد گیاه جلوگیری مینماید (6). محققان بیان نمودهاند که در پاسخ به تنش خشکی، فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز، افزایش مییابد که میزان آن در شرایط تنش شدید بیش از تنش ملایم است (52). در گیاهان، افزایش سطح آنزیمهای آنتیاکسیدان و فعالیت ویژه آنزیم سوپراکسید دیسموتاز، یکی از سازوکارهای دفاعی گیاه برای مقابله با استرس دمای پایین و یخزدگی است (41). Clare و همکاران (1984) نشان دادند که در گیاه مقاوم به سرمای Chlorella Ellipsoidea، مقدار سوپراکسید دیسموتاز در استرس سرمایی بالا میرود (28). در پژوهشی دیگر در باب برگهای جو که یک دوره دمای زیر صفر را گذرانده بودند، آنزیم سوپراکسید دیسموتاز در اثر استرس یخزدگی افزایش یافت. در واقع افزایش فعالیت سوپراکسید دیسموتاز در فضای بین سلولی در برگ جو از مهمترین سازوکارهای افزایش تحمل یخزدگی در این گیاه است (45). در برگ چای، سازوکارهای آنزیمی و افزایش فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی میتواند تا حد زیادی خطرها و آسیبهای ناشی از کاهش دما را مرتفع سازد. در برگ چای آنزیم سوپراکسید دیسموتاز در اثر کاهش دما فعالیت خود را با هدف خنثی کردن و به حداقل رسانیدن آسیبهای اکسیداتیو افزایش میدهد (9). افزایش رادیکالهای آزاد مثل سوپراکسید، نتیجه مواجهه گیاه با تنشهای محیطی مانند خشکی است. در این راستا، واکنش بعدی گیاه، سنتز و فعالیت بیشتر آنزیم سوپراکسید دیسموتاز در جهت خنثیسازی هر چه بیشتر آنیون مخرب سوپراکسید میباشد. فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز در سلولها در پاسخ به تنشهای مختلف محیطی و تنشهای غیرزیستی مانند شدت نور بالا، شوری و خشکی افزایش پیدا میکند. نتایج تحقیقات مؤید این است که همبستگی مثبت و بسیار بالایی بین تحمل تنشهای اکسیداتیو، که به دلیل تنشهای محیطی ایجاد میشود و افزایش غلظت آنزیمهای آنتیاکسیدانی وجود دارد (1، 20، 42 و 51). حبیبی و همکاران (2004)، در بررسی نحوه فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدان در شرایط مزرعه در 5 رقم آفتابگردان، نشان دادند که در اثر تنش خشکی، فعالیت سوپراکسید دیسموتاز افزایش مییابد (35). در تحقیق مشابهی که توسط شرما و دوبی (2005)، روی نشاهای برنج انجام شد نیز مشخص گردید که فعالیت سوپراکسید دیسموتاز در اثر تنش خشکی افزایش مییابد (54). افزایش فعالیت سوپراکسیددیسموتاز در اثر تنش به وسیله محققین دیگر نیز گزارش شده است. ملازم و بشیرزاده (1396) در بررسی فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدان در ارقام ذرت (Zea mays L.) نشان دادند که تحت تنش شوری فعالیت سوپراکسید دیسموتاز افزایش مییابد (13). همان طور که نتایج مربوط به اندازهگیری اسیدهای آمینه آزاد نشان داده است میزان اسیدآمینه آزاد در برگ واریته Q18 کمتر از سایر واریتههاست، با توجه به کمتر بودن میزان فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز در این واریته میتوان استنباط نمود که احتمالاً این واریته در مقایسه با سایر واریتهها توان کمتری در مقابله با شرایط خشکی و کمآبی و سرما دارد.
شکل4- مقایسه واریتههای کینوا از نظر میزان فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز. حروف a، b و c تفاوتهای معنیدار بین واریتهها را نشان میدهد(p<0.05).
شکل 5 سلولهای مریستم نوک ریشه را در مرحله متافاز تقسیم میتوز نشان میدهد. در هر 5 واریته مورد مطالعه، کروموزومها از نظر اندازه بسیار کوچک و فاقد بازوی مشخص بوده که تشخیص محل سانترومر را غیر ممکن میسازد. در مرحله متافاز میتوز با از بین رفتن غشای هسته، رنگپذیری کروموزومها میسر شد. در سلولهایی که در مرحله متافاز تقسیم میتوز بودند، اغلب کروموزومها به شکل نقاطی در وسط سلول حضور داشتند. با توجه به ماهیت ظاهری منحصر به فرد کروموزومها در گونه گیاهی مورد مطالعه، امکان شمارش دقیق کروموزومها در مرحله متافاز تقسیم میتوز با استفاده از میکروسکوپ نوری حتی در بزرگنمایی 1000× نیز در هیچ یک از واریتهها فراهم نشد. اطلاعات اندکی در مورد سیتوژنتیک کینوا وجود دارد (64). فراتر از این مطلب که تمام واریتههای Chenopodium quinoa، دارای36n=2 میباشند، اطلاعات چندانی در دسترس نمیباشد (21، 23، 36 و 62). در مطالعات محققین دیگر نیز گزارش شده است که اندازههای کروموزومها در این گونه بسیار کوچک بوده و کروموزومها اساسا فاقد پارامترهای افتراقی میباشند؛ لذا انجام کاریوتایپ به شکل متداول برای آنها امکانپذیر نیست. در تصاویری که این محققان توسط میکروسکوپ انرژی اتمی (AFM) از کروموزومهای کینوا تهیه نمودند تنها قادر به مشاهده و شمارش 32 کروموزوم از 36 کروموزوم شدند. آنها بیان نمودند که این کروموزومها کوچکتر از اندازه طبیعی کروموزومهای سایر گونهها میباشند. تصاویر حاصل از AFM حاکی از آن بود که ضخامت کروموزومهای کینوا، یکنواخت نبوده و بین 160 تا 310 نانومتر متغیر است. مطابق گزارش آنها طول کروموزومهای کینوا بین 600 نانومتر تا 1/3 میکرومتر بود (64). زیر گونه Barandales کینوا نیز دارای کروموزومهایی به طول 17/1 تا 96/1 میکرومتر میباشد (47).
شکل5- تصویر کروموزومها با بزرگنمایی 1000× میکروسکوپ نوری در مرحله متافاز میتوز. الف- واریته Q18 ب- واریته Q22 ج- واریته Red Carina د- واریته Q29 ه- واریته Titicaca.
با توجه به الگوی الکتروفورزی SDS-PAGE پروتئینهای محلول برگ (شکل 6) به طور کلی در برگ گیاه کینوا، در هر 5 واریته، باندهای پروتئینی با وزن مولکولی تقریبی 35، 55، 60 و 170 کیلودالتون، مشاهده شد که احتمالاً پروتئینهای اختصاصی کینوا میباشند.
شکل 6- الگوی الکتروفورزی SDS-PAGE پروتئینهای محلول برگ واریتههای مختلف کینوا. چاهک 1: واریته Q22، چاهک 2: واریته Titicaca، چاهک 3: واریته Q29، چاهک 4: واریته Q18، چاهک 5: واریته RedCarina و چاهک 6: نشانگر وزن مولکولی
پروتئین ذخیرهای غالب در کینوا، گلوبولینهای S11 و S7 هستند. گلوبولینها بر اساس ضریب سدیمنتاسیون به دو گروه S 12-11 و S 8-7 تقسیم میشوند. اخیراً گلوبولین S 11 کینوا به نام کنوپودین نامگذاری شده است. کنوپودین دارای دو زیر واحد، یکی زیر واحد پلیپپتید اسیدی، با وزن مولکولی 39-32 کیلودالتون و یک پلیپپتید بازی با وزن مولکولی 23-22 کیلودالتون میباشد (59). در تحقیق Toapanta و همکاران (2016)، پروتئینهایی با وزن مولکولی 36-33 کیلودالتون در تمام pH های مورد آزمایش، با میزان بیان زیاد قابل مشاهده بود که در واقع همان پلیپپتید اسیدی S 11 میباشند (59). محققان دیگری نیز پروتئینهای با وزن مولکولی 36-20 کیلودالتون را مشاهده نموده و این پروتئینها را کنوپودین معرفی نمودند (14). در تحقیق دیگری، در تمام pH های مورد آزمایش، پروتئینی با وزن مولکولی 33 کیلودالتون با میزان بیان زیاد یافت شده بود؛ آنها با توجه به یافتههای Abugoch و همکاران (2008) (14)، پروتئینهای با وزن مولکولی 33-31 کیلودالتون را کنوپودین دانستند (30). پروتئینی با وزن مولکولی 55 کیلودالتون در تمام pH های مورد آزمایش توسط Elsohaimy و همکاران (2015) (30)، مشاهده شده بود که با توجه به یافتههای سایر محققان (14) دریافتند که این پروتئین، گلوبولین میباشد. پروتئینهایی با وزن مولکولی 60 کیلودالتون نیز در تمام pH های مورد آزمایش Toapanta و همکاران (2016) (59)، یافت شده بودند که آنها با توجه به یافتههای Abugoch و همکاران (2008) (14)، دریافتند که این پروتئینها متعلق به S 7 گلوبولین میباشد.Elsohaimy و همکاران (2015) (30)، در هیچ یک از pH های مورد مطالعه خود پروتئین با وزن مولکولی 85 کیلودالتون را مشاهده نکردند.Toapanta و همکاران (2016) (59)، نیز در هیچ یک از pHهای مورد آزمایش خود در حضور 2- بتامرکاپتواتانول، پروتئینهای با وزن مولکولی بالا به عنوان مثال، 130 کیلودالتونی را مشاهده نکردند. در تحقیقی که توسط Omar و همکاران (2014) (46)، انجام شد در مقایسه پروتئینهای 5 ژنوتیپ مختلف کینوا به نامهای Kvlsra3، Kvlsra2، Regolano، Q37 و Q52 به روش SDS-PAGE، باندهای پروتئینی مختلفی مشاهده شدند. در واریته Kvlsra2 یک باند منحصر به فرد با وزن مولکولی 103 کیلودالتون، در واریته Q37 باندهای منحصر به فردی با وزنهای مولکولی 100، 80، 74، 69، 63 و 52 کیلودالتون و در واریته Regolano، دو باند منحصر به فرد با وزنهای مولکولی 92 و 87 کیلودالتون مشاهده شدند. در هیچ یک از مطالعات انجام شده روی گیاه کینوا، باند پروتئینی با وزن مولکولی 170 کیلودالتون گزارش نشده است. در ایالات پارانای برزیل، پتانسیل بالایی برای تولید محصولات کشاورزی به خصوص تولید محصولاتی از قبیل ذرت و لوبیای سویا وجود دارد. کشت کینوا میتواند در فصل آیش با توجه به مدیریت چرخش کشت، به عنوان یک کشت جایگزین مناسب با هدف تولید محصول دانهای در این مزارع به کار رود. با توجه به زودرس بودن کینوا، این کشت میتواند به صورت متناوب با ذرت یا لوبیای سویا جایگزین شود (22). پروتئینهای سویا مخلوطی از پروتئینهای گلوبولی از جمله کانگلیسینین (با وزن مولکولی 170-140 کیلودالتون دارای سه زیر واحد گلیکوزیله شده) و گلیسینین (با وزن مولکولی 375-340 کیلودالتون) میباشد. گلوبولین S 7 و گلوبولین S 11 به ترتیب 37 و 31 درصد از پروتئینهای سویا را تشکیل میدهند. بتاکانگلیسینین در واقع پروتئین گلوبولین S 7 است که در لوبیای سویا یافت شده است (43). در سایر منابع وزن مولکولی بتاکانگلیسینین 180-140 کیلودالتون گزارش شده است (44، 55 و58). این پروتئین در داروسازی و پزشکی به عنوان نشانگر تشخیص واکنشهای مقاوم آلرژیک نسبت به سویا، قابلیت استفاده دارد. این پروتئین در مقایسه با گلیسینین، مقاومت حرارتی کمتری داشته و در دماهای 80-70 درجه سانتی گراد، دناتوره میشود (43). پروتئینهای لوبیای سویا توسط حرارت، تشکیل ژل میدهند. این خصوصیت برای استفاده از پروتئینها در سیستمهای غذایی بسیار مهم است. ژل تشکیلشده از گلوبولین S 11 دارای کدورت بوده اما ژل تشکیل شده از گلوبولین S 7 دارای کدورت کمتری است (33). با توجه به مطالب بالا این احتمال وجود دارد که باند پروتئینی 170 کیلودالتونی یافت شده در الگوی الکتروفورزی پروتئینهای محلول کینوا، بتاکانگلیسینین باشد.