اصلاح خصوصیات سطح در سیستم میکروفلوییدیک به منظور شناساییmiR-21  و

miR-486 در سرطان ریه

الهام کشاورز باحقیقت¹، عبداله اله وردی^1*، مسلم صدقی¹، علیرضا نادری سهی²، فاطمه کوه کن² و حسین
نادری منش^1*

¹ ایران، تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم زیستی، گروه نانوبیوتکنولوژی/بیوفیزیک

² ایران، تهران، مرکز تحقیقات فن آوری بن یاخته

تاریخ دریافت: 27/3/1398            تاریخ پذیرش: 12/5/1398

چکیده

میکرو RNA های گردشی به عنوان بیومارکرهایی جدید جهت تشخیص و حتی پیش­آگاهی سرطان مطرح شده­اند. استفاده از این مولکولها علاوه بر تشخیص زودهنگام و به ­موقع پیش از متاستاز، به دلیل امکان دستیابی غیرتهاجمی ، موجب کاهش آسیبهای وارد شده به بیمار خواهند­ شد. در این مطالعه، بیوسنسوری جهت جداسازی  و شناسایی میکروRNAهای گردشی خون در بستر میکروفلوئیدیک طراحی شده است. انتخاب  بر پایه تحقیقات گذشته مبنی بر دخالت دو میکروRNA  (miR-21 وmiR-486)  در ایجاد و گسترش سرطان ریه و همچنین استفاده به عنوان بیومارکر تشخیصی، انجام شده است. در این سیستم بر روی چیپ میکروفلوئیدیک، با استفاده از کاوشگر گیرنده (DNA تک رشته) که به وسیله لینکر GPTMS بر روی سطح PDMS تثبیت شده، جداسازی میکروRNA انجام شد. با اتصال میکروRNA به این پروب، پروب دوم که DNA بیوتینه مکمل بخش بالایی میکروRNA است به آن متصل شده و  ساختار ساندویچی ایجاد می­کند.  در نهایت میکروRNA به دام افتاده میان دو کاوشگر به وسیله استرپتاویدین متصل به FITC تشخیص داده شد.

واژه های کلیدی: میکروRNA، سرطان ریه، تشخیص سرطان، میکروفلوئیدیک

* نویسنده مسئول، تلفن: 02182884749 ، پست الکترونیکی: naderman@modares.ac.ir و a-allahverdi@modares.ac.ir

مقدمه

سرطان ریه دومین سرطان شایع در مردان و زنان است و با اختلاف زیاد اصلی­ترین علت مرگ‌و‌میر ناشی از سرطان در جهان، با حدود یک میلیون فوت در سال است(5).  علت اصلی مرگ و میر بالا در این سرطان، عدم وجود نشانه های  بالینی در مراحل اولیه سرطان ریه می باشد. این امر موجب تشخیص دیرهنگام بیماری شده و سرطان ریه را تبدیل به کشنده ترین سرطان در جهان کرده است(16). عبارت Lung Cancer در مورد تومورهایی به کار می­رود که از اپیتلیوم مجاری تنفسی (برونش، برونشیول­ها، و آلوئول_­ها) نشأت گرفته. بنابراین لغت کارسینوم در مورد بدخیمی ناشی از بافت پوششی به کار می رود. روشهای تشخیص این سرطان غالباً بر پایه روشهای تصویربرداری و در ادامه انجام بیوپسی و برونکوسکوپی است. این روشها عبارتند از: رادیوگرافی قفسه سینه، CT اسکن و PET اسکن، برونکوسکوپی، بافت برداری اسپیراسیون و پرتونگاری با استفاده از تشدید میدان میغناطیسی(MRI).

با توجه به اینکه هم اکنون این  سرطان ریه در مراحل پیشرفته تشخیص داده می شود، متاسفانه بیش از ۷۵ درصد از سرطانهای ریه هنگامی تشخیص داده میشوند که تومور در محل پیشرفت کرده یا متاستاز داده و در این شرایط کمتر از ۱۵ درصد افراد بیمار تا ۵ سال بعد زنده خواهند ماند. درحالی که بیمارانی که زودتر تشخیص داده ­شوند شانس درمان و زنده مانی بسیار بهتر است. به عبارت دیگر در صورت تشخیص در مراحل اولیه بیماری، بیش از ۵۰ درصد افزایش بقای عمر تا ۵ سال وجود دارد. بنابراین نیاز مبرمی جهت تشخیص سرطان در مراحل اولیه مخصوصاً پیش از متاستاز وجود دارد.  این مسئله موجب توجه بیشتر به یک روش غربالگری کارآمد در تشخیص سرطان در مراحل اولیه ، خصوصاً برای گروههای با ریسک بالا مانند افراد سیگاری، می‌شود.

تاکنون تعدادی مولکول مانند آنتی ژن سرطان جنینی (Carcinoembryonic antigen)، سایتوکراتین 19 (Cytokeratin 19)، آنزیم انولاز ویژه عصب (Neuron-specific enolase) با هدف استفاده به عنوان بیومارکر مورد مطالعه قرار گرفتهاند(5 و 7). این بیومارکرها اگرچه در سرم مبتلایان به سرطان ریه بالا میروند، اما حساسیت و ویژگی لازم را ندارند و برای تشخیص افراد بدون علائم، قابل اعتماد نیستند؛ همچنین تولید گسترده آنها بسیار هزینه بر بوده و مقرون به صرفه نمیباشد.

بسیاری از میکرو RNA ها در گستره وسیعی از فرآیندهای بیولوژیکی و پاتولوژیکی شامل تکامل،تکثیر سلولی، متابولیسم، تمایز، انتقال پیام و پاسخ به استرس نقش دارند(2 و 4) و از زمان کشف اولین میکرو RNA  در نماتود C.elegans ، بیش از ۳۰۰۰۰ میکرو RNA بالغ در ۲۰۶ گونه شناسایی شدهاند (3).

بسیاری از ژنها، نقاط هدف برای تنظیم شدن به وسیله میکرو RNA را دارند. یک میکرو RNA توانایی تنظیم بیان چندین ژن را دارد که موجب افزایش پیچیدگی این شبکه تنظیمی می شود. در انسان بیش از ۸۰۰ میکرو RNA شناخته شدهاست که بسیاری از آنها در مراحل خاص تکامل یا در مسیرهای مخصوص هر بافت بیان میشوند(8)، تخمین زده میشود که  میکرو RNA ها حدود ۳۰ درصد از ژنوم کد کننده پروتئین در انسان را تنظیم کند(2).

در بسیاری از مسیرهای تومورزاییهای انسانی تغییر بیان میکرو RNA وجود دارد. بنابراین احتمال داده میشود، میکرو RNA ها به عنوان دسته جدیدی از ژنهای انکوژن یا تومورساپرسور نقش مهمی داشته باشند (10). سطح بیان میکرو RNA های انکوژن که انکومیر نامیده میشوند، در سرطانهای مختلف افزایش مییابد. این میکرو RNA ها غالباً با مهار ژنهای تومورساپرسور و/ یا ژنهایی که تمایز سلولها یا آپوپتوز را کنترل میکنند، موجب پیشرفت تومور میشوند. با وجود این میکرو RNAهای زیادی هم میتوانند تومورساپرسور درنظرگرفته شوند زیرا بیان آنها در سلولهای بدخیم کاهش مییابد. این میکرو RNAها میتوانند با مهار منفی انکوژنها و/ یا ژنهایی که تمایز سلولی یا آپوپتوز را مهار میکنند، عملکردشان را انجام دهند(2 و 8). بنابراین، این میکرو RNAها می توانند بیومارکر خوبی برای تشخیص سرطان در ابتدایی ترین مراحل تشخیص باشد. به طور مثال، حسین پور فیضی و همکاران  افزایش بیان miR16  را در سرطان سینه با استفاده از PCR اندازه گیری کردند و تأیید کردند در بیماران سرطانی ( حتی در ابتدای سرطان که با هیچ روش دیگری قابل اثبات نیست ) افزایش بیان miR16 نسبت به افراد سالم کاملاً مشهود است(6). همچنین این گروه دریافتند افزایش میزان بیان miR 4270 در مواردی از  سرطان سینه که به سایر بافتها تهاجم می کند، الزامی است (1).

میکرفلوئیدیک هم به عنوان دانش مطالعه رفتار مایعات درون میکروکانالها و هم تکنولوژی کوچک سازی کانالها و تونلها در حد میکرو جهت جریان یافتن مایعات مورد توجه قرار میگیرد (13).  میکروفلوئیدیک با حجم بسیار کم مایعات، در حدود میکرولیتر در ارتباط است. رفتار هیدرومکانیکی سیالات در محدوده میکرومتر با رفتار آنها در حجم بالا متفاوت است. این ویژگی خاص،کلیدی برای آزمایشهای علمی و نوآوریهاست. برای رسیدن به میکروفلوئیدیک باید در نهایت یکی از ابعاد کانال در محدوده یک تا دهها میکرومتر باشد. از مزایای میکروفلویدیک می توان به مصرف کمتر نمونه و مواد، افزایش انتقال گرمایی، افزایش سرعت جداسازی، انجام موازی و همزمان تستها، قابلیت حمل و نقل و افزایش کارآیی جداسازی اشاره کرد(11-12).

هدف از این مطالعه طراحی بیوسنسوری جهت تشخیص زودهنگام سرطان ریه است و برای این کار از ثبیت میکروRNA بر روی سطح استفاده گردید. وجود میکروRNAهای گردشی در خون یکی دیگر از مزیتهای استفاده از این مولکولهاست که در این تحقیق از آنها استفاده شد زیرا تنها با استفاده از چند قطره سرم خون امکان تشخیص به صورت غیر تهاجمی وجود دارد. همچنین در این طراحی از سیستم میکروفلوئیدیک استفاده گردید تا علاوه بر مصرف کمتر نمونه و مواد بتوان سرعت انجام تست را افزایش داد (15).

مواد و روشها

انتخاب میکرو RNA های مناسب و سفارش توالیها: طبق گزارشات در سرطان ریه مقدار بیان بعضی میکرو RNA ها در سرم خون افراد بیمار افزایش می­یابد که قابل بررسی و اندازه­گیری است. پس از بررسیها، در نهایتmiR 21  و miR 486-5p انتخاب شدند(9 و 14).

جهت انتخاب توالی این میکرو RNA ها از سایت miRBase استفاده شد. توالی این دو میکرو RNA در جدول 1 ذکر شده است.

جدول 1- توالی ریبونوکلوتیدی miR 21 و miR 486-5p

پس از انتخاب توالی میکرو RNA ها از سایت، توالیهای کاوشگرها به صورت مکمل با میکرو RNA ها مطابق جدول 2 طراحی شدند، و به شرکت تکاپوزیست سفارش داده شدند.

جدول 2- Error! No text of specified style in document.توالی اولیگونوکلئوتیدها

آماده سازی اولیگونوکلئوتیدها: اولیگونوکلئوتیدها به صورت لیوفیلیزه  تحویل شد و هنگام استفاده در آب مقطر حل شدند. پس از افزودن مقدار مشخصی آب (که در دستورالعمل شرکت قید شده بود)، غلظت ۱۰۰ پیکومول بر ماکرولیتر از هریک از این اولیگونوکلئوتیدها به دست آمد. برای میکرو RNAها از آب DEPC استفاده شد.

طراحی و ساخت تراشه سیلیکونی: طراحی و ترسیم نقشه تراشه ها با استفاده از نرم افزار Adobe Illustrator انجام شد. این تراشه به  منظور به دام انداختن میکرو RNA موجود در مایع رویی سلولهای کشت داده شده سرطانی طراحی شده است. ساخت تراشه­های سیلیکونی ( الگو ) مورد استفاده در این تحقیق توسط شرکت فنون ریز تراشه میزان انجام شد.

تهیه الاستومر PDMS و کپی برداری از تراشه سیلیکونی: PDMS از ترکیب PDMS پایه و ماده پلیمریزهکننده تشکیل می­شود. این پلیمر به دلیل شفافیت، خنثی بودن الکتریکی و شیمیایی، عدم واکنش با ترکیبات سلولی و بافرها، نفوذپذیری به گازها و عدم سمیت برای ترکیبات سلولی، به طور وسیع در میکروفلوییدیک به کار می­رود. جهت تهیه این الاستومر، PDMS پایه و ماده پلیمریزه کننده به نسبت وزنی ۱۰:۱ کاملاً با یکدیگر مخلوط شده،   مستر سیلیکونی چیپ در ظرفی قرار داده شد و مخلوط PDMS پایه و ماده پلیمریزه کننده بر روی آن ریخته شد و ظرف در دسیکاتور قرار گرفت و به مدت حداقل ۴ ساعت در انکوباتور در دمای ۶5 درجه حرارت داده شد تا پلیمر بسته شده و سفت شود.

PDMS پس از بسته شدن، به آرامی از مستر جدا گردید و بخشهای اضافی برش داده شد. طرح میکروکانالها بر روی PDMS باقی ماند. به وسیله یک سوزن تیز (شکافنده)  منافذی روی ورودیها و خروجیهای کانال ایجاد گردید. سپس PDMS به همراه یک لامل به مدت ۴۵ ثانیه درون دستگاه Plasma etching  Harrick قرار گرفت و در نهایت PDMS به لامل چسبانده و ۲ دقیقه بر روی هیتر در دمای 95-100 قرار گرفت تا کاملاً به یکدیگر متصل شوند.

اتصال لینکر به سطح PDMS: لینکر GPTMS، جهت اتصال به سطح در متانول به نسبت حجمی ۲ درصد ، (2% v/v) حل گردید.. پس از آماده سازی محلول لینکر، چیپ ساخته شده از PDMS، به مدت ۴۵ ثانیه درون دستگاه Plasma etching system  قرار گرفت تا سطح آن اکسید شده و گروه عاملی سیلان ایجاد شود. سپس محلول لینکر GPTMS  رقیق شده با متانول به میزان ۱۵۰ ماکرولیتر از داخل کانالهای چیپ عبور داده شد و ۴-۵ ساعت در دمای ۵۰ درجه قرار داده شد، سپس با پمپ گاز (نیتروژن) خالی و کاملاً خشک گردید.

اتصال کاوشگر گیرنده ( capture probe ) به لینکر: ابتدا ۹۰ ماکرولیترآب به۱۰ ماکرولیتر از محلول  DNA با غلظت ۱۰۰ پیکومول بر ماکرولیتر اضافه کرده و محلول ۱۰ پیکومول بر ماکرولیتر DNA آماده شد. در این مرحله با نانو درآپ میزان DNA تک رشته اندازه­گیری شد.

سپس  به ­۱۰۰ماکرولیتر، از محلول اولیگونوکلئوتید ۵ پیکومول بر ماکرولیتر ، ۲۵ ماکرولیتر محلول  DTT  1/0 نرمال، اضافه گردید. بعد از اینکه ۲۰-۳۰ دقیقه در دمای محیط قرار گرفت تا DTT عمل نموده و پیوند S=S شکسته شود، سپس۲۰۰ماکرولیتر اتیل­استات به این محلول اضافه و ۹۰ ثانیه ورتکس شد، سپس ۱۰ دقیقه زمان داده شد تا DTT توسط اتیل­استات به بالا کشیده شود. محلول دو فاز تشکیل می­دهد فاز رویی اتیل­استات حاوی DTT می­باشد که جدا و دور ریخته شد و فاز زیرینDNA  محلول در آب است. این کار سه بار تکرار گردید تا DTT کاملاً جدا شود. پس از جدا شدن بخش انتهایی اولیگونوکلئوتید و آزاد شدن گروه SH،  محلول باید سریعاً استفاده شود. در این مرحله نیز میزان DNA با نانو دراپ اندازه­گیری ­شد.

اتصال کاوشگر گیرنده به لینکر: جهت اتصال بهتر گروه SH به گروه اپوکسی، pH محلول باید نسبتاً قلیایی و در حدود 5/8  باشد. برای افزایش pH، از تری­اتیل­آمین استفاده شد.  به این محلول حاوی کاوشگر گیرنده، ۱۰۰ ماکرولیتر از TEA  اضافه گردید تا pH محلول به ۸ برسد.

در کانال میکروفلویدیک پوشانده شده با لینکر،۱۰۰ ماکرولیتر DNA فعال شده وارد گردید و یک شب در انکوباتور با دمای ۳۶ درجه قرار گرفت. پس از این چیپ میکروفلویدیک را از انکوباتور خارج کرده و جذب نوری مایع  درون میکروکانال با نانو دراپ اندازه­گیری شد.

تأیید اتصال کاوشگر گیرنده به لینکر: جهت تأیید اتصال کاوشگر گیرنده به لینکر توسط DNase ، ابتدا حدود ۱۷ نانوگرم از کاوشگر گیرنده بر روی سطح PDMS تثبیت شد. در چیپ، کنترل مراحل بدون افزودن لینکر انجام شد. پس از انکوباسیون و تثبیت و شستشوی کامل چیپ، از DNase جهت تعیین میزان DNA درون میکروکانال استفاده شد.

در هر چیپ 5/0 ماکرولیتر آنزیم DNase، ۴ماکرولیتر بافر مخصوص  و ۳۵ ماکرولیتر آب دوبار تقطیر اضافه شد و ۳۰ دقیقه در دمای محیط، جهت انجام واکنش زمان داده شد. سپس پساب از چیپ خارج و جهت بررسی توسط نانودراپ جمع آوری شد.

اتصال میکرو RNA و کاوشگر آشکارساز به کاوشگر گیرنده: چیپ حاوی کاوشگر گیرنده به آرامی با بافر SSC شست­و­شو داده شد، سپس با افزودن۹۰ ماکرولیتر آبDEPC  به ۱۰ ماکرولیتر از محلول میکرو RNA با غلظت۱۰۰پیکومول بر ماکرولیتر، محلول۱۰ پیکومول بر ماکرولیتر میکرو RNA آماده شد.  به ۱۰ ماکرولیتر کاوشگرآشکارسازی با غلظت ۱۰۰ پیکومول بر ماکرولیتر، ۹۰ ماکرولیتر بافر هیبریداسیون اضافه شد و آزمایش طبق مراحل زیر انجام شد.

آزمایش سیستم با  miR-486: پس از ساختن چیپ از PDMS و فعال سازی با لینکر، کاوشگر گیرنده به هر چیپ حدود 2/4 پیکومول بر ماکرولیتر اضافه شد. کاوشگر آشکارسازی، میکرو RNA ، RNase inhibitor ‌و بافر هیبریداسیون مطابق جدول 3 مخلوط شده و در چیپ مورد مطالعه تزریق شد. سپس حدود ۳۰ دقیقه در دمای اتاق قرار گرفتند تا هیبریداسیون انجام گیرد

جدول 3- میزان هریک از مواد استفاده شده در تست اول miR-486

آزمایش دوم: چیپ ساخته شده از PDMS،  طبق روش قبل آماده شد. میزان کاوشگر گیرنده اضافه شده به هر چیپ حدود ۲.۲ پیکومول بر ماکرولیتر ابود. سایر مواد مطابق جدول4 مخلوط شده و در چیپ مورد مطالعه  تزریق شدند. سپس حدود ۳۰ دقیقه در دمای اتاق قرار گرفتند تا هیبریداسیون انجام گیرد.

جدول 4 - میزان هریک از مواد استفاده شده در تست دوم miR-486

آزمایش سیستم با miR-21: جهت تست miR-21 مطابق جدول 5 مواد با یکدیگر مخلوط شده و به چیپ مورد نظر تززیق شدند. میزان کاوشگر گیرنده اضافه شده به هر چیپ حدود ۳ پیکومول بر ماکرولیتر است.

جدول 5- میزان هریک از مواد استفاده شده در تست miR-21

بررسی سیستم به وسیله استرپتاویدین متصل به FITC: پس از پایان زمان هیبریداسیون، چیپها دو مرتبه با بافر SSC حاوی Tween 20 و SDS و یک مرتبه با بافر SSC شست و شو داده شدند. ۵/۰ ماکرولیتر استرپتاویدین متصل به FITC به ۸۲ ماکرولیتر بافر PBS اضافه و  ۱۶4 مرتبه رقیق شد. پس از رقیق سازی در دمای۲۰- نگهداری شد. به هر چیپ ۱۰ ماکرولیتر از این محلول اضافه شد. چیپها ۲۰ دقیقه در دمای اتاق قرار داده شدند تا واکنش انجام گیرد و سپس دو مرتبه با بافر SSC حاوی Tween 20 و SDS و یک مرتبه با بافر SSC شست و شو داده شدند. در نهایت به وسیله میکروسکوپ فلورسانس الیمپوس IX-81 و دستگاه  Cytationمشاهده و بررسی شدند.

نتایج و بحث

طراحی و ساخت تراشه میکروفلویدیک: این طرح بر اساس   داده های شبیه سازی توسط نرم افزار Comsol  رسم گردید ( شکل 1). در این طرح، اصل سادگی جهت جلوگیری از مشکلات در مراحل ساخت حفظ شده است، به طور مثال یک ورودی و یک خروجی دارد.   جهت افزایش سطح و کاهش سرعت جریان و افزایش احتمال تثبیت  میکرو RNA اشکال ذوزنقه ایی تعبیه شد تا جریان داخل این اشکال کند شده و شانس اتصال میکرو RNA به سطح افزایش یابد.

اتصال لینکر GPTMS به PDMS: PDMS الاستومری با

فرمول شیمیایی ، (C2H6OSi) است که به عنوان ماده ساختاری برای ساخت کانالهای میکروفلوئیدیکی در فرآیند casting استفاده می­شود. واکنش ایجاد اتصالات عرضی درPDMS پایه به کمک ماده پلیمریزه کننده و دمای ۶۵ درجه انجام می­شود که طی آن PDMS به صورت یک ماده کشسان و یکپارچه متبلور می­شود.

شکل 1- طرح چیپ مورد استفاده در این کار اساس این طرح سادگی و افزایش سطح جهت کاهش سرعت جریان بود. بر اساس خصوصیات مکانیکی سیال، چون سرعت جریان در وسط کانال سریع است، شانس اتصال لینکر به سطح کمتر است. لذا اشکال ذوزنقه ایی تعبیه شد تا سرعت جریان در کناره ها به کمترین مقدار برسد و شانس اتصال افزایش یابد.

در حالت طبیعی، سطح PDMS به علت گروه هیدروفوب CH₃ تمایلی به اتصال به لینکر ندارد. اکسیداسیون سطح PDMS در فرآیند پلاسما برخی از گروههای متیل را حذف نموده و موجب ایجاد انتهای سیلانول(SiOH) بر سطح آن شده و در حقیقت ستون PDMS حاوی گروههای هیدروکسیل می­شود. سطح اکسید شده PDMS وارد تماس متقابل با شیشه شده و یک اتصال محکم و غیر قابل برگشت با آن ایجاد می­کند. همچنین این تغییر PDMS را قابل اتصال با لینکر هایی از جنس سیلان نظیر GPTMS می کند.

از لینکر GPTMS جهت اصلاح سطح PDMS و ایجاد گروه اپوکسی بر روی آن استفاده شد. مطابق شکل 2، GPTMS سیلانی حاوی گروه تری متوکسی است که با پیوند کوالانسی طی واکنش چند مرحله­ای به سیلانول موجود بر سطح PDMS متصل می­شود.

انجام این واکنش گروه اپوکسی مورد نیاز جهت واکنش با اولیگونوکلئوتید تیوله را فراهم می­کند.(شکل 3).

شکل 2- لینکر GPTMS این لینکر با داشتن گروه اپوکسی و C=O ماده مناسبی جهت اتصال نوکلیک اسید به سطوحی نظیر PDMS می باشد. ماده مذکور از دم Si- C=O به گروه –OH در سطح PDMS پیوند کوالانسی برقرار می کند و از طریق اپوکسی به انواع اولیگونوکلئوتید پیوند تشکیل می دهد.

شکل3- اتصال لینکر  GPTMSبه PDMS.  پلاسما ( که خود از برانگیخته شدن اکسیژن با امواج الکترومغناطیس بوجود می آید) باعث اکسیداسیون گروههای -CH3 در سطح PDMS شده و بوجود امدن گروه –OH می گردد. که آن را قادر می سازد با گروههای Si- C=O  موجود در شیشه پیوند تشکیل دهد.

اتصال کاوشگر گیرنده به لینکر: پس از اتصال لینکر GPTMS به سطح PDMS، حال باید DNA تک رشته تیوله به وسیله گروه SH- با پیوند تیواتری به گروه اپوکسی فعال لینکر متصل ­شود(شکل۴). این واکنش در pH قلیایی انجام پذیر است، جهت افزایش pH محیط از تری اتیل آمین استفاده شد.

شکل 4- اتصال کاوشگر گیرنده به لینکر اولیگومر (DNA تک رشته بعنوان کاوشگر گیرنده) از طریق گروه اپوکسی به لینکر پیوند تشکیل میدهد.

کاوشگر گیرنده، یک توالی محافظت کننده در انتهای تیوله خود دارد که موجب می­شود اتمهای گوگرد در پیوند S=S به فرم اکسید خود قرار گیرد. لازم است پیش از اتصال به لینکر اولیگونوکلئوتید احیاء شده و این توالی جدا شود تا امکان واکنش تیول و اپوکسی فراهم گردد. برای این کار از

DTT استفاده شد.

DTT عامل احیا کننده است. در حالت اکسید یک حلقه ۶ عضوی با پیوند دی سولفید داخلی دارد. احیای یک پیوند دی سولفید معمولی به وسیله دو واکنش تبادل تیول دی­سولفید متوالی انجام می­شود (شکل 5).  DTT، DNA تیوله را احیاء نموده و توالی محافظت کننده را جدا می­کند. اتم گوگرد انتهایی DNA تیوله، خصوصاً در حضور اکسیژن تمایل به تشکیل دایمر در محلول را دارد.DTT با محلول DNA مخلوط شده و واکنش می­دهد و سپس به وسیله فیلتراسیون حذف می­شود.

شکل 5- نحوه جداشدن توالی محافظت کننده از کاوشگر گیرنده . توالی محافظت کننده که از طریق پیوند دی سولفیدی به کاوشگر گیرنده (capture prob ) متصل است توسط DTT احیاء شده و از آن جدا می شود.

جهت آشکارسازی سیستم از واکنش بیوتین-استرپتاویدین استفاده شد. تمایل واکنش گری استرپتاویدین به بیوتین یکی از قوی­ترین واکنشهای غیر کوالان شناخته شده است. هر مونومر استرپتاویدین می­تواند به یک مولکول بیوتین متصل شود و درنتیجه این پروتئین حداکثر به چهار مولکول بیوتین متصل می­شود (شکل6). علاوه بر قدرت پیوند، این اتصال بسیار اختصاصی بوده و با سرعت بالا انجام می­گیرد. همچنین در برابر تغییرات دما و pH و حضور حلالهای آلی و عوامل دناتوره کننده بسیار مقاوم است.

شکل 6- اتصال بیوتین و استرپتاویدین. هر مولکول بیوتین به یک مولکول استراپتاویدین متصل می شود. پیوند غیر کوالانسی بوده و استراپتاویدین را می توان با رنگ کنژوگه کرد تا بتوان آن را مشاهده نمود.

علت استفاده از سیستم بیوتین-استرپتاودین در این کار،افزایش تعداد مولکولهای FITC است. FITC از مشتقات فلورسئین است که کاربردهای زیادی خصوصاً در فلوسایتومتری دارد. مولکول اصلی آن فلورسئین است که یک گروه فعال ایزوتیوسیانات جایگزین اتم هیدروژن در یکی از حلقه­های آن شده است. طول موج برانگیختگی و انتشار این مولکول در ۴۹۵ و ۵۱۹ نانومتر بوده و رنگ سبز می­دهد.

هر استرپتاویدین به چندین FITC متصل است که با افزایش فلورسانس کارآیی سیستم را افزایش می­دهد (شکل 7).

شکل 7- اتصال استرپتاویدینFITC- به کاوشگر آشکارسازی. استراپتاویدین را می توان به چندین مولکول FITC  متصل کرد تا کارآیی سیستم افزایش یابد. به عبارت دیگر وجود یک مولکول میکرو RNA با چندین مولکول FITC  متصل شده به استراپتاویدین مشاهده می شود.

پس از افزودن استرپتاویدین و اتصال آن به بیوتین، سیستم با بافر SSC حاویTween 20  و SDS شستشو داده می­شود تا از حذف پیوندهای غیر اختصاصی و مولکولهای استرپتاویدین متصل شده به PDMS ‌اطمینان حاصل شود.

استفاده  از  تراشه  میکروفلویدیک  به  منظور  تثبیت  و

شناسایی miR 21  و miR 486 : پس از تثبیت کاوشگر گیرنده به لینکر GPTMS ( شکل 4)، انتهای 3̕ کاوشگر با انتهای 3̕ miRNA  مکمل می باشد و در صورتی که در سیستم میکرو RNA وجود داشته باشد به آن متصل می‍شود. پس از این مرحله از DTT به عنوان عامل احیاء کننده استفاده شد تا باعث احیای گروه دی سولفید S₌S  گردد. سپس جهت آشکار سازی از استرپتاویدین متصل به FITC  استفاده شد و با  میکرسکوپ فلورسانس به صورت لایه یا نقاط سبز رنگ دیده شد ( شکل 8).

استفاده از سامانه میکروفلویدیک باعث افزایش سرعت و کاهش مصرف مواد شده و همچنین می توان تعداد کمتری میکرو RNA را نیز مشاهده کرد. این امر در اوایل سرطان که میزان میکرو RNA انتشار یافته بسیار کم است بسیار اهمیت دارد.

شکل 8-الف حضور FITC درون کانالهای تراشه.(بزرگنمایی 10X)

شکل 8-ب حضور FITC درون کانالهای تراشه.(بزرگنمایی 20X) وجود لکه های سبز رنگ بر روی سطح PDMS نشان از تثبیت موفقیت آمیز میکرو RNA دارد. بعد از هر مرحله شستشو وجود دارد و چنانچه ماده ایی متصل نشده باشد با شستشو از بین می رود. لذا کارآیی اصلاح سطح تأیید و سیستم آماده استفاده از مایعات بیولوژیکی نظیر پلاسمای افراد را دارد.

نتیجه گیری

روشهای موجود تشخیص سرطان غالباً شامل بیوپسی بافت

سرطانی و تکنیکهای بر پایه پردازش تصاویر است.  پژوهش جهت یافتن نشانگرهای غیر تهاجمی در مایعات بدن  به منظور تشخیص تومور، یکی از زمینه­های  تحقیقاتی رو به رشد در تحقیقات سرطان است. یکی از این نشانگرهای موجود میکرو RNA می باشد. هدف از این مطالعه اصلاح خصوصیات سطح جهت تثبیت،  جداسازی و آشکارسازی میکرو RNA ها بود. نتایج نشان می­دهد که اصلاح خصوصیات سطح به خوبی و موفقیت آمیز انجام شد تا بتواند  میکرو RNA ها توسط این سیستم به خوبی جداسازی  شوند. شمای کلی مراحل این تحقیق  در شکل 9 نشان داده شده است.  در ابتدا لینکر GPTMS بر سطح PDMS تثبیت شد. حضور این لینکر جهت اتصال کاوشگر گیرنده بهPDMS  الزامی است. سپس کاوشگرگیرنده به آن اضافه گردید. این تک رشته DNA در یازده نوکلئوتید ابتدایی در سمت ´۳ خود با  یازده نوکلئوتید ابتدایی ´۳ میکرو RNA ، مکمل است. بنابراین با ورود میکرو RNA به سیستم، بین این دو رشته اتصالات عرضی برقرار شد. به دلیل عدم امکان نشاندار کردن میکرو RNA از یک کاوشگر جهت آشکارسازی استفاده گردید. این کاوشگر گیرنده نیز مکمل قسمتی از میکرو RNA است و در صورت حضور به آن متصل می­شود. در این هنگام میکرو RNA بین دو کاوشگر به صورت ساندویچی تثبیت شد. کاوشگر آشکارسازی در انتهای ´۳ حاوی مولکول بیوتین است. جهت آشکارسازی نهایی از استرپتاویدین متصل به FITC  استفاده شد. با اتصال استرپتاویدین به بیوتین موجود در کاوشگر آشکارسازی سیستم قابل رؤیت گردید.

شکل 9- شمای کلی مراحل انجام کار

تشکر و قدردانی

بدین وسیله مؤلفین از صندوق حمایت از پژوهشگران
(INSF) به خاطر گرنت شماره 96006759 و دانشگاه تربیت مدرس به خاطر گرنت هسته پژوهشی IG-39708  تشکر می کنند.