نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 کروه بیوتکنولوژی، دانشگاه تحصیلات تکمیلی و فناوری پیشرفته کرمان

2 گروه بیوتکنولوژی، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته

3 گروه علوم دامی، دانشگاه محقق اردبیلی

چکیده

استرس گرمایی یکی از مهمترین مشکلاتی است که تاثیر منفی بر روی مصرف غذا، نرخ رشد، شبکه عصبی، عملکرد سیستم ایمنی و همچنین نرخ مرگ و میردارد. در شرایط استرس گرمایی، سنتز اکثر پروتئین‌ها به تاخیر می‌افتد اما پروتئین‌های استرس گرمایی(HSP) به طورسریع سنتز می شوند و نقش مهمی در زنده مانی سلول‌ها دارند. از مهمترین آنها، HSP70 می باشد که ساختار کریستالوگرافی آن در زنبورعسل گزارش نشده و مدلسازی آن می تواند زمینه تشخیص مکانیسم عمل آن در مقابل تنش‌های محیطی را در زنبورعسل فراهم نموده و هزینه های مربوط به تنشهای محیطی را کم کند. همچنین HSP40 یک تنظیم کننده مکانیسم عمل HSP70 است. لذا، در این تحقیق مدلسازی کامل هر دو پروتئین صورت گرفت و در ادامه میانکنش پروتئین HSP70وHSP40 با استفاده از نرم افزارهای مدلسازی در دو وضعیت مطالعه شد. 1- مطالعه داکینگ دو پروتئین به صورت کور، که ساختار کامل هر دو پروتئین در داکینگ مورد استفاده قرار گرفت و نتایج آن نشان داد اتصال بین دو پروتئین در دو ناحیه اتفاق می افتد;HSP70 از ناحیه اسید آمینه های 430-400 و 640-620 به ترتیب با اسیدآمینه های 350-330 و 175-165 در HSP40 متصل می شود. 2- بر اساس مطالعات گذشته، داکینگ تنها در بخش محتمل برای اتصال صورت گرفت، برهمکنش بین ناحیهJdomainاز HSP40 با کل پروتئین HSP70 ، که نشان داد اسید آمینه های 41-28 از دمین J در HSP40 با یک شیار اسیدی از دمین ATPase درHSP70، میانکنش دارند. نتایج حاصل میتواند به فهم بهتر عملکرد دو پروتئین و طراحی داروهای ضداسترس کمک نماید.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Modeling of heat stress protein 70 (HSP70) of honey bee by homology modeling and molecular simulation method and interaction to HSP40

نویسندگان [English]

  • elham rezvannejad 1
  • safa lotfi 2
  • azadeh boustan 3

1 department of biotechnology, graduate university of advanced technology

2 department of biotechnology, graduate university of advanced technology

3 department of animal science, university of mohaghegh ardabili

چکیده [English]

Heat stress is one of the most significant problems which has negative effect on feed intake, growth rate, neural network, immune function and mortality. In heat stress, the synthesis of proteins delayed but the heat stress proteins quickly are synthesized. They have important role in survival cell in stress conditions. Hsp70 is one of most important hsps, Because of crystallographic structure of this protein is not determined in honey bee, modeling of honey bee hsp70 can identify the mechanism of action of this protein against environmental stresses and help to reduce costs associated with environmental stresses. HSP40 is as a regulator of the mechanism of HSP70. So, in the present study, 3d structure of two proteins and interaction of HSP70 and HSP40 was studied using simulation methods in two states: 1- To investigate the interaction between the two proteins in blind (whole 3d structure of proteins were used),this results show interaction between these proteins mainly is restricted to two regions. HSP70 is bound to the HSP40 from the amino acid region of 400-430 and 620-640, with the amino acid region of 330-350 and 165-175, respectively. 2- According to previous studies, docking is only possible in likely regions of the proteins. So, the interaction between Jdomain of HSP40 to HSP70 was investigated, in which the amino acids 28-41 of Jdomain are interacting to an acid groove in the ATPase domain of HSP70. The results could help to better understand the function of two proteins and to design new anti stress drugs.

کلیدواژه‌ها [English]

  • HSP70 protein
  • HSP40 protein
  • Honeybee
  • heat stress
  • Interaction

مدل سازی پروتئین استرس گرمایی70 (HSP70) زنبورعسل به روش همولوژی مدلینگ و شبیه سازی ملکولی و اتصال آن به HSP40

الهام رضوان نژاد1*، صفا لطفی1 و آزاده بوستان2

1 ایران، کرمان، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، پژوهشگاه علوم وتکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، گروه بیوتکنولوژی

2 ایران، اردبیل، دانشگاه محقق اردبیلی دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی مغان، گروه علوم دامی

تاریخ دریافت: 21/9/97                                تاریخ پذیرش: 11/2/98

چکیده

استرس گرمایی یکی از مهمترین مشکلاتی است که تاثیر منفی بر روی مصرف غذا، نرخ رشد، شبکه عصبی، عملکرد سیستم ایمنی و همچنین نرخ مرگ و میردارد. در شرایط استرس گرمایی، سنتز اکثر پروتئین­ها به تاخیر می­افتد اما پروتئین­های استرس گرمایی(HSP) به طورسریع سنتز می شوند و نقش مهمی در زنده مانی سلول­ها دارند. از مهمترین آنها، HSP70 می باشد که ساختار کریستالوگرافی آن در زنبورعسل گزارش نشده و مدلسازی آن می تواند زمینه تشخیص مکانیسم عمل آن در مقابل تنش­های محیطی را در زنبورعسل فراهم نموده و هزینه های مربوط به تنشهای محیطی را کم کند. همچنین HSP40 یک تنظیم کننده مکانیسم عمل HSP70 است. لذا، در این تحقیق مدلسازی کامل هر دو پروتئین صورت گرفت و در ادامه میانکنش پروتئین HSP70وHSP40  با استفاده از نرم افزارهای مدلسازی در دو وضعیت مطالعه شد. 1- مطالعه داکینگ دو پروتئین به صورت کور، که ساختار کامل هر دو پروتئین در داکینگ مورد استفاده قرار گرفت و نتایج آن نشان داد اتصال بین دو پروتئین در دو ناحیه اتفاق می افتد;HSP70 از ناحیه اسید آمینه های 430-400 و 640-620 به ترتیب با اسیدآمینه های 350-330 و 175-165 در HSP40 متصل می شود. 2- بر اساس مطالعات گذشته، داکینگ تنها در بخش محتمل برای اتصال صورت گرفت، برهمکنش بین ناحیهJdomain از HSP40 با کل پروتئین HSP70 ، که نشان داد اسید آمینه های 41-28 از دمین J در HSP40 با یک شیار اسیدی از دمین ATPase درHSP70، میانکنش دارند. نتایج حاصل میتواند به فهم بهتر عملکرد دو پروتئین و طراحی داروهای ضداسترس کمک نماید.

واژه های کلیدی: پروتئین HSP70، پروتئین HSP40، استرس گرمایی، زنبورعسل، برهمکنش

* نویسنده مسئول، تلفن: 03433776610 ، پست الکترونیکی: e.rezvannejad@kgut.ac.ir

مقدمه

 

پروتئین­های استرس گرمایی (HSPs= Heat-shock proteins)، نوعی از پروتئین­های سلولی هستند که در شرایط نرمال محیطی در درون سلول وجود داشته اما سطح بیان آنها زمانی که سلول در شرایط استرس یا شوک قرار می گیرد افزایش می یابد(26). دلیل نامیدن این نوع پروتئین­ها به پروتئین های استرس گرمایی از آنجا ناشی می شود که این پروتئین ها برای نگهداری هومئوستازی در سلول ضروری بوده و به زنده مانی سلول در زمان استرس کمک می کنند(13، 29 و 30). مطالعات مختلفی که بر روی موجودات متفاوت و الگوی بیان این پروتئین­ها تحت شرایط استرس انجام شده است، نشان می­دهد که پاسخ به استرس گرمایی محدود به برخی از موجودات نبوده و گستره وسیعی از حیات از E.coli تا Homo sapiensرا در بر گرفته است(28). همچنین ثابت شده است که علاوه بر شرایط استرس گرمایی،فاکتورهای متعدد محیطی و فیزیکی نیز در افزیش HSP­های سلول نقش دارند(33).

از جمله استرس­های خارجی برای موجودات می­توان به تغییر دما، شرایط اسمزی، مواد شیمیایی، فلزات سنگین،کاهش اکسیژن، تشعشعات رایواکتیو و همچنین به عفونت، تشکیل تومور، تقسیم و تمایز سلولی به عنوان استرس های داخلی اشاره نمود (9 و 13). علاوه بر این،شرایط آب و هوایی و وضعیت ژئوگرافی نیز نقش مهمی در میزان بیان پروتئین های استرس گرمایی در یک موجود زنده بازی می کنند(12).

پروتئین های استرس گرمایی در اندازه هایی از 27 تا110 کیلو دالتون وجود دارند و بر اساس وزن ملکولی و عملکردشان به پنج گروه تقسیم می شوند (25). این پروتئین ها شاملHSP ; با وزن ملکولی پایین، HSP60، HSP70، HSP90 وHSP با وزن ملکولی بالا هستند (17).گروه پروتئین های استرس گرمایی با وزن ملکولی پایین، یک خانواده بزرگ از چاپرونها (chaperon) هستند و دارای یک زنجیره ثابت در انتهای کربوکسیل خود می­باشند که از 90 اسیدآمینه تشکیل شده و بعنوان زنجیره α-کریستال نامگذاری شده است(3). این دسته از HSPها، در هر دو گروه سلولهای پروکاریوت و یوکاریوت دارای وزن ملکولی 15 تا42 کیلودالتون هستند(31).

ایران کشوری متنوع از نظر ارتفاع، بارش و اقلیم می باشد و لذا تغیررات دمایی در آن بسیار زیاد می باشد (1). استرس گرمایی یکی از مشکلات ناشی از شرایط محیطی است که زنبورعسل را تحت تاثیر قرار می دهد و می تواند خسارتهایی رادر هر سال به زنبورداران وارد نماید. استرس گرمایی بر روی میزان خروج زنبور از کندو تاثیر منفی گذاشته و در نتیجه بر میزان جمع آوری شهد و گرده، شبکه عصبی، عملکرد سیستم ایمنی و همچنین نرخ مرگ و میر آنها تاثیر منفی دارد. بنابراین استرس گرمایی تهدیدی جدی در صنعت زنبورداری بویژه در مناطق گرم جهان محسوب می شود. زمانی که موجودات زنده در شرایط استرس گرمایی قرار می گیرند، سنتز اکثر پروتئینها به تاخیر می افتد اما پروتئین های استرس گرمایی به طورسریع سنتز می شوند.

با توجه به اهمیت پروتئین HSP70در محافظت از سلول در برابر استرسهای محیطی و نظر به اینکه تا کنون ساختار سه بعدی کریستالوگرافی این پروتئین در زنبورعسل مشخص نشده است، تعیین ساختار سه بعدی آن از اهمیت ویژه­ای برخوردار است. وظیفه اصلی پروتئین HSP40 تنظیم عمل HSP70 در سلولهاست. چند روش برای این تنظیم مورد شناسایی قرار گرفته است و شامل اتصال پلی پپتیدهای مختلف به واسطه HSP40 به HSP70 و همچنین تاثیر بر روی فعالیت ATP آزی درHSP70  می باشد، به هرحال جفت شدن HSP40 به HSP70 به هر طریقی بر روی عملHSP70 تاثیر می گذارد (4; 5). مطالعات کریستالوگرافی در برخی موجودات از جمله انسان و پروکاریوت ها در مورد محل اتصال نشان داده اند که اتصال HSP70به HSP40 از دو ناحیه صورت می گیرد اولین محل که در تنظیم فعالیت ATPآزی HSP70 موثر است، اتصال دمینJ در HSP40 ( حاوی حدود 75 اسید آمینه ) به دمین ATP در HSP70  می باشد (4; 5). دومین محل اتصال در انتهای Cهر دو چاپرون اتفاق می افتد که در زمان اتصال پروتئین های هدف به HSP70 برقرار می شود (4; 5; 14). از آنجا که تا کنون در زنبورعسل هیچ مطالعه ای در مورد ساختار HSP70 و نحوه برهمکنش آن با HSP40 در زمان استرس های مختلف به ویژه استرس گرمایی صورت نگرفته است، لذا تحقیق حاضر به منظور مدل­سازی ساختار سه بعدی پروتئین HSP70 در گونه Apis.Meliferaبرای شناسایی دمین­های ساختاری و جایگاه­های ویژه آن انجام گرفته و با توجه به اینکه HSP40 یک تنظیم کننده مکانیسم عمل HSP70 محسوب می شود تعیین مکانیسم عمل آن بر روی HSP70 و نحوه برهمکنش آنها مورد بررسی قرار می گیرد. انتظار می­رود با این اطلاعات زمینه شناسایی جایگاههای اتصال با یون­ها جهت مهار و یا افزایش فعالیت این چاپرون را در آینده فراهم نماید.

مواد و روشها

جستجوی پایگاه اطلاعاتی PDB : به منظور بررسی میانکنش بین دو پروتئین HSP70 و HSP40 ابتدا وجود ساختار کریستالی آنها به روش آزمایشگاهی در زنبورعسل بررسی شد. به دلیل موجود نبودن ساختار سوم مبتنی بر داده های آزمایشگاهی در پایگاه اطلاعاتیPDB(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)، ساختار سوم این پروتئین­ها با استفاده از یک روش مبتنی بر هومولوژی مدلینگ تعیین شد.

به این منظور، در ابتدا توالی اسید آمینه آنها تهیه شد. که توالی پروتئینی HSP70 زنبورعسل(با کد شناسایی NP_001153522.1و با نام heat shock protein cognate 4 [Apismellifera وهمچنین توالی پروتئینی HSP40 زنبورعسل(با کد شناسایی XP_016767139.1 و با نام dnaJ homolog subfamily A member 1 [Apismellifera])از پایگاه داده بیوتکنولوژی (NCBI) به فرمت fasta تهیه شدند.

آنالیز توالی و تهیه مدل: توالی های تهیه شده از طریق ابزار  Blastدر پایگاه داده  (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) NCBIآنالیز شد و از این طریق توالی های مناسب با شباهت قابل قبول و همچنین E-Value پایین بدست آمد.با توجه به اینکه پروتئینHSP70 Apismelliferaحدود 658 اسید آمینه و HSP40 Apismelliferaحدود 399 اسید آمینه دارد اما هیچ پروتئینی در سایر گونه ها که درصد شباهت بالای توالی با دو پروتئین HSP مورد نظر داشته باشد و همچنین به طور کامل تعیین ساختار شده باشد، شناسایی نشد، در نتیجه مدل­سازی پروتئین HSP40, HSP70  در Apismellifera بدون پیشنهاد اولیه الگو برای مدل­کردن انجام شد.

مدل­سازی با استفاده از سرور I-TASSER : مدل­سازی به روش همولوژی مدلینگ و به کمک پایگاه­های اطلاعاتی I-TASSER (https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/) انجام شد. ساختار ایجاد شده بایستی حداقل انرژی را در وضعیت تمام اتمهای خود داشته باشد. I-TASSER عنوان سرور شماره یک را برای پیش بینی ساختار پروتئین در آزمایش های CASP7، CASP8، CASP9، CASP10 و CASP11 (CASP: Critical Assessment of Techniques for Protein Structure Prediction) اختصاص داده است. این سرور همچنین در آزمایش CASP9 بعنوان بهترین سرور برای پیش بینی عملکرد پروتئین شناخته شده است (27; 36; 38). در پایگاه اطلاعاتی  I-TASSER ابتدا یک هم ترازی صورت می­گیرد. این هم ترازی به کمک آنالیز توالی اولیه دربرنامه­های MUSTER، FFAS-3D، SPARKS-X، HHSEARCH2 ،HHSEARCHI،Neff-PPAS ،HHSEARCH ، pGenTHREADER، wdPPAS وcdPPAS انجام می­شود. خروجی این ده برنامه بصورت ده توالی هم تراز شده از ده پروتئین تعیین ساختار شده با توالی اولیه می­باشد که پایگاه اطلاعاتی I-TASSER از این ده ساختار استفاده نموده و بر اساس نتایج هم ترازی در این ده برنامه، پنج مدل پیش­بینی می­کند. ارزیابی کیفیت ساختاری این مدل­ها براساس پارامترهایC-score می­باشد. مدل­سازی ساختار در I-TASSER براساس ارزیابی کیفی موضعی ساختار( structurelocal quality) و بتا فاکتور(B-factor) نرمال شده، می­باشد. کیفیت موضعی ساختار مدل­سازی شده به Z-score و بتا فاکتور (B-factor) نرمال شده بستگی دارد. به میزان انحراف فاصله بین یک رزیدو در مدل و ساختار طبیعی Z-score گفته می­شود. ارزیابی مدل­های ساخته شده بر اساسTM-score، RMSD وC-score می­باشد که بر اساس هم­ترازی الگو و تقارب پارامترهای ساختاری محاسبه می­گردد. بهترین مدل از بین این پنج مدل بر اساس این پارامترها انتخاب شد(2).

به منظور ارزیابی و مطالعه ساختاری مدل ساخته شده از نرم افزارPymol استفاده شد.

پیش بینی بنیان های درگیر در میانکنش دو پروتئین با استفاده از CPORT: با توجه به اینکه در این تحقیق از وب سرورHADDOCK برای بررسی میانکنش HSP70 و HSP40 استفاده گردید، بنیان های فعال که به طور مستقیم در میانکنش نقش دارند و بنیان های غیرفعال که بنیان های فعال را احاطه می نمایند با استفاده ازسرور (7) CPORT(Consensus Prediction Of interface Residues in Transient complexes) که از لینک http://milou.science.uu.nl/services/CPORT/  قابل دسترسی است مشخص گردیدند. CPORT در واقع مجموعه ای از شش وب سرور پیش بینی کننده interface می باشد (7). interface در واقع بنیان هایی از یک پروتئین است که به طور مستقیم و یا غیرمستقیم در میانکنش با سایر مولکول های زیستی نظیر پروتئین ها نقش دارد.

بررسی میانکنش HSP40 وHSP70 با استفاده از HADDOCK : به منظور بررسی میانکنشHSP40 و HSP70 از وب سرورHADDOCK 2.2 (35)استفاده گردید. HADDOCK یک وب سرور داکینگ پروتئین-پروتئین است که از لینک http://milou.science.uu.nl/services/HADDOCK2.2/ قابل دسترسی می­باشد. این وب سرور به طور گسترده به منظور بررسی میانکنش های پروتئین-پروتئین مورد استفاده قرار می گیرد. از ویژگی­های وب سرور HADDOCK این است که باید قبل از ران کردن فرایند داکینگ، بنیان های فعال دو پروتئین داک شونده مشخص و در جایگاه های مورد نظر وارد شوند، سپس نرم­افزار، بنیان­های غیرفعال را بر اساس بنیان­های فعال وارد شده مشخص می نماید. همین موضوع موجب می­شود که این نرم افزار نسبت به نرم افزارهایی که بدون در نظر گرفتن این بنیان ها و به صورت کاملا کور(blind) داکینگ پروتئین ها را انجام می­دهند از قابلیت اعتماد بسیار بالاتری برخوردار باشد. در واقع روش­های داکینگ پروتئین ها را می توان به دو دسته روش های "abinitio" (از آغاز) و داده-محور تقسیم نمود. داکینگ داده-محور به این معناست که اطلاعات آزمایشگاهی به طور مستقیم طی فرایند داکینگ استفاده می­شوند بنابراین نتایجی که از این روش ها به دست می آیند با نتایج به دست آمده در آزمایشگاه مطابقت دارد. HADDOCK در واقع یک روش داکینگ داده-محور است که پراستنادترین وب سرور داکینگ پروتئین-پروتئین در سطح جهان محسوب می شود (8 و10).

لذا به منظور انجام فرایند داکینگ با استفاده از این وب سرور، علاوه بر فایل های PDB مربوط به هر پروتئین، بایستی بنیان های فعال هر دو پروتئین نیز در جایگاه­های مورد نظر وارد شوند، سپسوب سرورHADDOCK به صورت اتوماتیک بنیان های غیرفعال را با توجه به بنیان های فعال وارد می نماید.

در تحقیق حاضر با توجه به اینکه داده های آزمایشگاهی به دست آمده تا به امروز محل دقیق میانکنشHSP70 و HSP40 را در زنبورعسل تعیین ننموده اند  و در عین حال مطالعات آزمایشگاهی گذشته در برخی دیگر از موجودات یوکاریوت و پروکاریوت محل میانکنشHSP70 و HSP40 را، از ناحیه J domain نشان داده اند(14; 21; 34) ، لذا در تحقیق حاضر به منظور داک نمودن این دو پروتئین، دو وضعیت برهمکنش اجرا شد؛ در حالت نخست، تمام بنیان­های فعال به دست آمده برای هردو پروتئین در همه محل های مربوطه وارد شدند. اما در حالت دوم،به منظور داک نمودن این دو پروتئین، برای پروتئینHSP40 فقط بنیان­های فعال به دست آمده در ناحیه J domain وارد شدند در حالی که برایHSP70  همه بنیان های فعال در نظر گرفته شدند.

در نهایت نتایج به دست آمده از وب سرورHADDOCK با استفاده ازنرم افزارLigPlot+ورژن 1.4.5 (19) و وب­سرور PIC= Protein Interactions Calculator (http://pic.mbu.iisc.ernet.in/) مورد بررسی قرار گرفت و بنیان های آمینواسیدی میانکنش­کننده و نوع پیوندها مشخص گردید.

نتایج

در تحقیق حاضر، میانکنش HSP70 و HSP40 با استفاده از نرم افزارهای مدلسازی مورد بررسی قرار گرفته است. نتایج حاصل می تواند علاوه بر افزایش سطح اطلاعات در مورد چگونگی میانکنش این دو پروتئین، اطلاعات پایه ای و ارزشمندی را برای طراحی داروهای ضد تنش و تحریک روند مقابله با استرس در درون سلولها، فراهم نماید. نتایج به دست آمده از این تحقیق در ذیل ارائه شده است.

نتایج به دست آمده از سرور I-TASSER : مدل­سازی ساختار در I-TASSER براساس ارزیابی کیفی موضعی ساختار و بتا فاکتور نرمال شده، می­باشد. در پایگاه اطلاعاتی I-TASSER به کمک آنالیز توالی اولیه در ده برنامه پایه­ای این پایگاه ابتدا یک هم ترازی صورت می‍گیرد. سپس I-TASSER به کمک خروجی این ده برنامه و ده ساختار ایجاد شده، چند مدل پیش­بینی می­کند.

مدل سازی HSP70 و HSP40 : ساختار مدل­سازی شده HSP70 زنبورعسل در I-TASSER از 658 رزیدو تشکیل شده و تقریبا تمامی ساختار را پوشش می­دهد. در مدل ارائه شده درصد ساختارهای ثانویه پیش­بینی شده بصورت شکل1 می­باشد.همچنین ساختار مدل­سازی شده HSP40 زنبورعسل که از 399 رزیدو تشکیل شده و تقریبا تمامی ساختار را پوشش می­دهد بصورت شکل2 می­باشد. پیش­بینی I-TASSER در مورد ساختارهای ثانویه آلفا هلیکس در شکل 1و 5 بصورت H قرمز رنگ، در مورد صفحات بتا بصورت S آبی رنگ و نواحی راندوم کویل بصورت C نمایش داده شده است.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 1- پیش بینی ساختار دوم پروتئین HSP70 توسط سرور I-TASSER

 

شکل 2- پیش بینی ساختار دوم پروتئین HSP40 توسط سرور I-TASSER

 

 

شکل های 3 و 4 به ترتیب پیش بینی I-TASSER را در مورد میزان دسترسی بنیان های آمینواسیدی HSP70 و HSP40 نسبت به حلال نشان می دهد. همانطور که به خوبی در شکل مشخص است این پارامتر بین صفر تا 9 متغیر است به طوری که عدد صفر نشان دهنده بنیان هایی است که به طور کامل در ساختار پروتئین مخفی شده و به حلال دسترسی ندارند در حالی که 9 نمایانگر بنیان هایی است که کاملا در سطح پروتئین قرار گرفته و در معرض حلال قرار دارند.

 

 

شکل 3- پیش بینی میزان دسترسی بنیان های آمینواسیدی HSP70 به حلال

 

شکل 4- پیش بینی میزان دسترسی بنیان های آمینواسیدی HSP40 به حلال

 

شکل های 5 و 6 به ترتیب پیش بینی B-factor نرمال شده را برای HSP70 و HSP40توسط I-TASSER نشان می دهد. درواقع، B-factor نشان­دهنده میزان تحرک گرمایی ذاتی بنیان ها و یا اتم ها در پروتئین است. رزیدوهایی با بتا فاکتور بالاتر از 2 از پایداری کمتری در آزمایشات ساختاری برخوردارند.همانطور که مشاهده می­شود تعداد اندکی از رزیدوها دارای بتا فاکتور بالاتر از 2 بوده و درصد بالایی از رزیدوها بتا فاکتور آنها در این مدل منفی بوده و این ضریب اطمینان بالایی برای مدل ساخته شده فراهم می­کند.

 

 

شکل 5- پیشبینیB-factor نرمال شده توسطI-TASSER برای بنیان های پروتئین HSP70

 

شکل 6- پیش بینیB-factorنرمالشده توسطI-TASSER برای بنیان های پروتئین HSP40

 

 

ارزیابی کیفیت ساختاری این مدل­ها براساس پارامترهایC-score،TM-score  وRMSD می­باشد. درصد این پارامترهای برای بهترین مدل ساخته شده از HSP70 بصورت زیر می­باشد.

C-score=0.37

Estimated TM-score = 0.76±0.10

Estimated RMSD = 7.1±4.2Å

همچنین درصد این پارامترهای برای بهترین مدل ساخته شده برای HSP40 بصورت زیر می­باشد.

C-score=1.89

Estimated TM-score = 0.49±0.15

Estimated RMSD = 11.3±4.6Å

در مجموع پنج مدل از پروتئین HSP70و HSP40توسط I-TASSERR ساخته شد که بر اساس C-score بهترین مدل انتخاب گردید. در واقع درجه قابل اطمینان بودن یک مدل به صورت کمی توسط C-scoreاندازه گیری می­شود و بنابراین مدلی با بالاترین میزان C-score بهترین مدل شناخته می شود. مقادیر C-score بین 5- تا 2 متغیر است. از بین پنج مدل ساخته شده برای HSP70توسط I-TASSER مدل یک بیشترین میزان C-score  (37/0) را دارا بود و بنابراین بهترین مدل در نظر گرفته شد. همچنین برای HSP40 نیز مدل یک بیشترین میزان C-score  (89/1) را دارا بود و بهترین مدل شناخته شد.

در شکل های 7 و 8 بهترین مدل ایجاد شده توسط سرور I-TASSER از پروتئین HSP70 و HSP40 نمایش داده شده است.

 

 

شکل7-بهترین مدل ساخته شده از HSP70 زنبورعسل توسط سرورI-TASSER، دمین های ATP ( N-terminal یاNucleotide binding domain)در رنگ قرمز و C-terminalدر رنگ سبز بر اساس اطلاعات HSP70 انسانی

 

شکل 8- بهترین مدل ساخته شده از HSP40 زنبورعسل توسط سرورI-TASSER، j دمین ( N-terminal)در رنگ قرمز


تعیین بنیان های فعال و غیرفعال B-باکس توسط CPORT

قبل از بررسی میانکنش پروتئین های HSP70 و HSP40، بنیان های فعال و غیرفعال هر دو پروتئین با استفاده از CPORT شناسایی شدند. همانطور که در اشاره شد بنیان های فعال متشکل از کلیه بنیان هایی است که به طور مستقیم در میانکنش این پروتئین ها با مولکول های دیگر (پروتئین ها، DNA و....) نقش دارند در حالی که بنیان های غیرفعال در واقع بنیان­هایی هستند که بنیان های فعال را احاطه­ می نمایند. شکل 9 بنیان های فعال و غیرفعال به دست آمده برای این دو پروتئین را نمایش می دهد.

 

 

شکل 9- بنیان های فعال و غیرفعال پروتئینهای HSP70 و HSP40 پیش­بینی شده با استفاده از سرور CPORT


نتایج به دست آمده از HADDOC

همانطور که قبلا اشاره شد HADDOCK یک وب سرور داکینگ پروتئین- پروتئین است. خروجی HADDOCK که در واقع کمپلکس دو پروتئین داک شده به فرمت PDB می باشد، که بر اساس آن کمپلکسHSP70-HSP40 به صورت کلی و همچنین کمپلکس Jdomain در HSP40 با HSP70 که در اکثر مطالعات کریستالوگرافی به این اتصال اشاره شده است (18و 23) مدلسازی شدند.

ارزیابی کیفیت کمپلکس ها و انتخاب بهترین آنها بر اساس میزان Z-score وHADDOCK-score  از بین کلاستر های شبیه سازی شده انجام شد، که میزان این پارامترها برای بهترین داکینگ از کمپلکسHSP70-HSP40  به بصورت زیر می­باشد.

Z-score=-1.9

HADDOCK-score=-205.9 +/- 13.9

و برای کمپلکسHSP70-Jdomain HSP40  به بصورت زیر می­باشد.

Z-score=-1.8

HADDOCK-score=-251.4 +/- 9.7

در شکل 10 نتایج حاصل از داکینگ هر دو حالت نمایش داده شده اند.

در نهایت فایل هایPDB به دست آمده از HADDOCK با استفاده از نرم افزار LigPlot و وب سرور PIC مورد مطالعه قرار گرفت و اسیدآمینه های درگیر در میانکنش این دو پروتئین و انواع پیوندهای موجود مشخص گردیدند (شکل11).

نتایج بررسی اتصال Jdomain در  HSP40 با HSP70نشان داد که اسید آمینه های 28-41 که در انتهای هلیکس 3 و هلیکس 4 درJ domain  از HSP40 و 34HPD36 motif می باشند در تداخل دخیل هستند.همچنین یک شیار اسیدی شامل اسید آمینه های  QTFTTYADNQPGVLI و ATAGGVMTدر دمینATPase از HSP70 که در محدوده اسیدآمینه های 400 تا 430 قرار گرفته اند، در میانکنش نقش دارند.

همچنین در حالت بررسی اتصال به صورت کور بینHSP40 با HSP70،HSP70  از دوناحیه اسید آمینه های 400 تا 430 و 620 تا 640  به ترتیب با ناحیه اسیدآمینه های330 تا 350و 165تا 175 در HSP40متصل می شود.

 

 

شکل 10- کمپلکسHSP70-HSP40 به دست آمده از وب سرور HADDOCKA: اتصالHSP70به HSP40 از محل JdomainB: اتصالHSP70 به HSP40 بر اساس تمامی بنیان های فعال (HSP70 با رنگ سبز وhsp40 بارنگ آبی)

 

شکل11- اسیدآمینه های درگیر در میانکنش دو پروتئین HSP70 ,HSP40 و انواع پیوندهای آنها با استفاده از وب سرور PIC. A: میانکنش HSP70 با HSP40 از محل Jdomain. B: میانکنشHSP70  باHSP40 بر اساس تمامی بنیان های فعال ( بنیان هایHSP70 با رنگ قرمز وHSP40 بارنگ آبی)


بحث

به منظور بررسی میان­کنش دو پروتئین با استفاده از روش های محاسباتی قبل از هرچیز نیازمند ساختار سه بعدی دو پروتئین هستیم. در مورد هیچکدام از دو پروتئین مورد مطالعه در زنبورعسل داده های آزمایشگاهی تعیین ساختار وجود نداشت و به همین دلیل از ساختارهای به دست آمده به روش داکینگ بدین منظور استفاده گردید.

اعضای خانواده Hsp40 به سه نوعI،II و III طبقه بندی می شوند.تمام انواع پروتئین Hsp40 حاوی دامنه J می باشند که حدود 70 اسید آمینه را دارا می باشد.در پروتئین Hsp40 نوع I و II، دامنه J در N-terminus است.در اعضای خانواده Hsp40 نوعIII، می توان آن را در هر موقعیت درون پروتئین یافت.همچنین در این دو نوع پروتئین بین دو دامنه J و   terminalCیک ناحیه غنی ازFG/وجود دارد. دامنه J از Hsp40 می تواند با دامنه ATPase  از Hsp70 اتصال ایجاد کند و سپس فعالیت هایATPآزیHsp70را تحریک کند. علاوه بر این در زمان اتصال پروتئین های بدون ساختار توسط HSP40 به HSP70 اتصال دیگری بین انتهای C terminal ازHSP70  به ابتدای C terminal از HSP40  صورت می پذیرد (21).

ساختار پیش بینی شده برای دامنه J از HSP40 زنبورعسل نشان دهنده مطابقت با مطالعات کریستالوگرافی در HSP40 گاوی، Ecoli و مخمر است که نشان داده اند دامنه J آن دارای چهار زنجیره الفا هلیکس و تعدادی اسیدآمینه های حفاظت شده در بین آنها می باشد (6; 15; 24).

پروتئین HSP70 شامل یک دامنه ATPase N-terminal((45 kDa، یک دامنه اتصال سوبسترا (18kDa) که خود آن به زیر دمین صفحات β  (bSBD)و یک کلاهک آلفا هلیکسی(αSBD) تقسیم می شود و انتهای کربوکسیل C-terminal  (10 kDa) می باشد (16).

مطالعات گذشته نشان می دهد که چاپرونهای HSP40 هیدرولیز ATP را با HSP70 تحریک می کنند و پروتئین HSP40  و HSP70 در تمام موجودات از انسان گرفته تا باکتری  اشرشیاکلی نواحی حفاظت شده بسیاری دارد (37).

مطالعات ساختار شناسی نشان داده است کهDnaJ درE. coli  میزان هیدرولیز ATP توسط HSP70 را بیشتر از 1000 بار تحریک می کنند (18;20). علاوه بر این، فعالیت چاپرونیDnaJ نیاز به توانایی ارتباط باDnaK از طریق دامنه J خود دارد (18; 23) و همچنین از طریق دامنه C خود با سوبستراها اتصال می یابد.DnaJبا شیوه های سریع و مداوم با سوبستراها ارتباط دارد (23).

همانطور که در بخش های قبلی متن اشاره شد وب­سرور I-TASSER بر اساس روش هومولوژی مدلینگ ساختار پروتئین ها را تعیین می نماید و در مقایسه با سایر وب­سرورها و نرم افزارهای تعیین ساختار پروتئین از اعتبار بسیار بالایی برخوردار است. ساختار دمین C-ترمینال HSP70 زنبورعسل که در I-TASSER مدل­سازی شده دارای بخش کلاهک آلفا هلیکسی می­باشد. مشابه دمین N-ترمینال، الگوی ساختاری این بخش نیز شباهت بالایی باHSP70 انسانی داشته و از الگوی ساختاری مشابهی برخوردار است و پنج آلفا هلیکسی که در HSP70 انسانی گزارش شده در اینجا نیز قابل مشاهده است. همچنین، زیر دمین صفحات بتا (bSBD) نیز دارای الگویی مشابه است. این مدل نشان می­دهد که موقعیت قرارگیری این دو زیر دمین نسبت به همدیگر تا حدودی در دو HSP انسانی و زنبورعسل متفاوت است و نسبت به قرارگیری آنها در HSP انسانی از هم دور شده­اند. عمده دلیل آن به خاطر لوپی است که این دو زیردمین را به هم وصل می­کند. با توجه به سخت بودن مدل­سازی ساختارهای ثانویه لوپ­ها در پروتئین­ها که می­توانند حالت­های مختلفی را بپذیرند موقعیت قرارگیری این دو زیر دمین در ساختار مدل­سازی شده می­تواند نسبت به هم متفاوت باشد. از طرفی هلیکس A و B در اینجا به هم چسبیده­اند که علت آن وجود یک لوپ بسیار کوچک است که آن را به عنوان بخشی از آلفا هلیکس شناسایی نموده است (11; 23).

همانطور که در بخش روش تحقیق اشاره شد بنیان های فعال و غیرفعال پروتئین HSP70 و HSP40 با استفاده از وب سرور CPORT شناسایی شدند و در مرحله بعد از آن ها برای انجام داکینگ پروتئین-پروتئین استفاده گردید.با توجه به نتایج مطالعات گذشته بدست آمده از داده های آزمایشگاهی نقاط اتصال درHSP70 از دو ناحیه می باشد و شامل ناحیه N terminal و C terminal است (21; 32; 37). HSP40 جهت اتصال به HSP70 به صورت دایمر عمل میکند و بعد از اتصال ناحیه C terminal  آن به پروتئین های هدف و سپس برقراری اتصال بین پروتئین های بدون ساختار با HSP70، از ناحیه Jdomain خود به ناحیه ATPas از HSP70 متصل می شود تا فعالیت آن را تحریک کند و تاخوردگی پروتئین مورد نظر اتفاق بیوفتد(14).

Lu and Cyr (1998) بر اساس داه های آزمایشگاهی در پروکاریوتها نشان دادند که ترکیبی از دامنه J، ناحیه انگشت روی (Zn) و پایانه های کاربوکسیل محافظت شده برای Ydj1 برای همکاری با Hsp70 و تسهیل تاشوندگی پروتئین لازم است (22). همچنین Tsai و همکاران (1996) نشان دادند که اتصال HSP40 به HSP70 برای تحریک فعالیت ATPase آن از ناحیه هلیکس های 2و3 دامنه J و اسیدآمینه های حفاظت شده  بین این دو هلیکس می باشد (34) که کاملا منطبق بر نتایج بدست آمده از محل برهمکنش در تحقیق حاضر می باشد.

نتایج بدست امده از بررسی برهمکنش بین HSP70 و HSP40 در حالت کور می تواند به این دلیل باشد که در بررسی انجام شده پروتئینهای بدون ساختار در مطالعه سه بعدی وجود ندارند، لذا دو چاپرون از محل هایی که بایستی به اینگونه پروتئین ها متصل شوند به یکدیگر متصل می شوند (اتصال در ناحیه اسید آمینه های 400 تا 430 از HSP70 با اسیدآمینه های 330 تا 350 در HSP40 ) و علاوه بر این اتصال در انتهای C terminal از HSP70  با ابتدای  C terminal از  HSP40 (ناحیه اسید آمینه های 620 تا 640 از HSP70 به ناحیه اسیدآمینه های 165تا 175 در HSP40) که در زمان انتقال پروتئین های بدون ساختار توسط HSP40 به HSP70 به صورت کریستالو گرافی در مطالعات مختلف نشان داده شده است در مطالعه حاضر نیز قابل مشاهده است.

نتایج به دست آمده از این تحقیق اولین مرحله در شناسایی ساختار پروتئینی چاپرون های HSP70و HSP40 زنبورعسل می­باشد. این نتایج شباهت ساختاری مناسب بین HSP70 و HSP40 زنبورعسل و HSP70 و HSP40 انسان را نشان می دهد. از این رو می­توان پیش بینی نمود که رفتار و عملکرد HSP70 ,HSP40 زنبورعسل می­تواند مشابه با HSP40,HSP70 انسانی باشد و میان کنش­هایی که HSP70 ,HSP40 انسانی با سایر پروتئین­های سلولی برقرار می­کند در زنبورعسل نیز وجود دارد. با توجه به مطالعات کم در زمینه HSP70 وHSP40 زنبورعسل از داده­های مربوط به حوزه  HSP40 و  HSP70 انسانی می­توان در بسیاری از فرضیات و عملکردهای زنبورعسل در زمان تنش ها استفاده نمود و در مرحله اول از این اطلاعات بصورت اولین احتمال استفاده نمود. داده­های این پژوهش به عنوان نمونه می توانند در زمینه داروهای طراحی شده که در عملکرد با HSP70 و HSP40 انسانی می­باشند و استفاده از همان داروها در حوزه زنبورعسل بسیار کمک کننده باشند.  این داده­ها می­توانند به فهم چگونگی نحوه میان کنش HSP70 زنبورعسل با HSP40 کمک کرده و زمینه ساز روشن شدن نحوه فعالیت آن در درون سلول­های زنبورعسل در شرایط استرس باشد.

تقدیر و تشکر

این مقاله مستخرج از طرح شماره 407/95/ص/7 پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته کرمان می باشد که بدین وسیله نویسندگان از آن دانشگاه تشکر می نمایند.

1-    زهری، ص.، اصغری، ع.  دادخواه، م. (1392). تنوع جمعیتهای زنبور عسل بر اساس نشانگرهای مورفولوژیکی و ریزماهواره (microsatellite) در استان اردبیل. پژوهش های سلولی و مولکولی، 26(4)، 462-471

2-    لطفی، ص. مرتضوی، م. و ریاحی مدوار. ع. (1397). تعیین ساختار سوم پروتئین HMGB4 انسانی با استفاده از دو روش مبتنی بر هومولوژی مدلینگ. پژوهش های سلولی و مولکولی, 31(4), 612-623

 

3- Basha, E., Friedrich, K. L., & Vierling, E. (2006). The N-terminal arm of small heat shock proteins is important for both chaperone activity and substrate specificity. J Biol Chem, 281(52), 39943-39952. doi: 10.1074/jbc.M607677200

4- Bukau, B., Weissman, J., & Horwich, A. (2006). Molecular chaperones and protein quality control. Cell, 125(3), 443-451. doi: 10.1016/j.cell.2006.04.014

5- Chou, C. C., Forouhar, F., Yeh, Y. H., Shr, H. L., Wang, C., & Hsiao, C. D. (2003). Crystal structure of the C-terminal 10-kDa subdomain of Hsc70. J Biol Chem, 278(32), 30311-30316. doi: 10.1074/jbc.M304563200

6- Cupp-Vickery, J. R., & Vickery, L. E. (2000). Crystal structure of Hsc20, a J-type Co-chaperone from Escherichia coli. J Mol Biol, 304(5), 835-845. doi: 10.1006/jmbi.2000.4252

7- de Vries, S. J., and Bonvin, A. M. . (2011). CPORT: a consensus interface predictor and its performance in prediction-driven docking with HADDOCK. PloS one, 6, e17695.

8- de Vries, S. J., Melquiond, A. S., Kastritis, P. L., Karaca, E., Bordogna, A., van Dijk, M., . . . Bonvin, A. M. (2010). Strengths and weaknesses of data-driven docking in critical assessment of prediction of interactions. Proteins, 78(15), 3242-3249. doi: 10.1002/prot.22814

9- Diamant, S., Eliahu, N., Rosenthal, D., & Goloubinoff, P. (2001). Chemical Chaperones Regulate Molecular Chaperones in Vitro and in Cells under Combined Salt and Heat Stresses. Journal of Biological Chemistry, 276(43), 39586-39591. doi: 10.1074/jbc.M103081200

10- Dominguez, C., Boelens, R., & Bonvin, A. M. J. J. (2003). HADDOCK:  A Protein−Protein Docking Approach Based on Biochemical or Biophysical Information. Journal of the American Chemical Society, 125(7), 1731-1737. doi: 10.1021/ja026939x

11- Fan, C. Y., Lee, S., & Cyr, D. M. (2003). Mechanisms for regulation of Hsp70 function by Hsp40. Cell Stress Chaperones, 8(4), 309-316.

12- Feder, M. E. (1999). Organismal, Ecological, and Evolutionary Aspects of Heat-Shock Proteins and the Stress Response: Established Conclusions and Unresolved Issues. American Zoologist, 39(6), 857-864.

13- Feder, M. E., & Hofmann, G. E. (1999). Heat-shock proteins, molecular chaperones, and the stress response: evolutionary and ecological physiology. Annu Rev Physiol, 61, 243-282. doi: 10.1146/annurev.physiol.61.1.243

14- Gebauer, M., Zeiner, M., & Gehring, U. (1997). Proteins interacting with the molecular chaperone hsp70/hsc70: physical associations and effects on refolding activity. FEBS Letters, 417(1), 109-113. doi: https://doi.org/10.1016/S0014-5793(97)01267-2

15- Hennessy, F., Nicoll, W. S., Zimmermann, R., Cheetham, M. E., & Blatch, G. L. (2005). Not all J domains are created equal: implications for the specificity of Hsp40-Hsp70 interactions. Protein Sci, 14(7), 1697-1709. doi: 10.1110/ps.051406805

16- Jiang, J., Maes, E. G., Taylor, A. B., Wang, L., Hinck, A. P., Lafer, E. M., & Sousa, R. (2007). Structural basis of J cochaperone binding and regulation of Hsp70. Mol Cell, 28(3), 422-433. doi: 10.1016/j.molcel.2007.08.022

17- Joe, M. K., Park, S. M., Lee, Y. S., Hwang, D. S., & Hong, C. B. (2000). High temperature stress resistance of Escherichia coli induced by a tobacco class I low molecular weight heat-shock protein. Mol Cells, 10(5), 519-524.

18- Karzai, A. W., & McMacken, R. (1996). A bipartite signaling mechanism involved in DnaJ-mediated activation of the Escherichia coli DnaK protein. J Biol Chem, 271(19), 11236-11246.

19- Laskowski, R. A., & Swindells, M. B. (2011). LigPlot+: multiple ligand-protein interaction diagrams for drug discovery. J Chem Inf Model, 51(10), 2778-2786. doi: 10.1021/ci200227u

20- Laufen, T., Mayer, M. P., Beisel, C., Klostermeier, D., Mogk, A., Reinstein, J., & Bukau, B. (1999). Mechanism of regulation of Hsp70 chaperones by DnaJ cochaperones. Proceedings of the National Academy of Sciences, 96(10), 5452-5457. doi: 10.1073/pnas.96.10.5452

21- Li, J., Qian, X., & Sha, B. (2009). Heat shock protein 40: structural studies and their functional implications. Protein Pept Lett, 16(6), 606-612.

22- Lu, Z., & Cyr, D. M. (1998). The conserved carboxyl terminus and zinc finger-like domain of the co-chaperone Ydj1 assist Hsp70 in protein folding. J Biol Chem, 273(10), 5970-5978.

23- Mayer, M. P., & Bukau, B. (2005). Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism. Cell Mol Life Sci, 62(6), 670-684. doi: 10.1007/s00018-004-4464-6

24- Mokranjac, D., Bourenkov, G., Hell, K., Neupert, W., & Groll, M. (2006). Structure and function of Tim14 and Tim16, the J and J-like components of the mitochondrial protein import motor. Embo j, 25(19), 4675-4685. doi: 10.1038/sj.emboj.7601334

25- Moseley, P. L. (1997). Heat shock proteins and heat adaptation of the whole organism. J Appl Physiol (1985), 83(5), 1413-1417.

26- Robert, J. (2003). Evolution of heat shock protein and immunity. Dev Comp Immunol, 27(6-7), 449-464.

27- Roy, A., Kucukural, A., & Zhang, Y. (2010). I-TASSER: a unified platform for automated protein structure and function prediction. Nat Protoc, 5(4), 725-738. doi: 10.1038/nprot.2010.5

28- Schlesinger, M. J. (1986). Heat shock proteins: the search for functions. J Cell Biol, 103(2), 321-325.

29- Sikora, A., & Grzesiuk, E. (2007). Heat shock response in gastrointestinal tract. J Physiol Pharmacol, 58 Suppl 3, 43-62.

30- Sørensen, J. G., Kristensen, T. N., & Loeschcke, V. (2003). The evolutionary and ecological role of heat shock proteins. Ecology Letters, 6(11), 1025-1037. doi: 10.1046/j.1461-0248.2003.00528.x

31- Sun, W., Van Montagu, M., & Verbruggen, N. (2002). Small heat shock proteins and stress tolerance in plants. Biochim Biophys Acta, 1577(1), 1-9.

32- Suzuki, H., Noguchi, S., Arakawa, H., Tokida, T., Hashimoto, M., & Satow, Y. (2010). Peptide-binding sites as revealed by the crystal structures of the human Hsp40 Hdj1 C-terminal domain in complex with the octapeptide from human Hsp70. Biochemistry, 49(39), 8577-8584. doi: 10.1021/bi100876n

33- Tomanek, L. (2002). The Heat-Shock Response: Its Variation, Regulation and Ecological Importance in Intertidal Gastropods (genus Tegula). Integr Comp Biol, 42(4), 797-807. doi: 10.1093/icb/42.4.797

34- Tsai, J., & Douglas, M. G. (1996). A conserved HPD sequence of the J-domain is necessary for YDJ1 stimulation of Hsp70 ATPase activity at a site distinct from substrate binding. J Biol Chem, 271(16), 9347-9354.

35- van Zundert, G. C., Rodrigues, J. P., Trellet, M., Schmitz, C., Kastritis, P. L., Karaca, E., Melquiond, A. S., van Dijk, M., de Vries, S. J., and Bonvin, A. M. . (2016). The HADDOCK2.2 Web Server: User-Friendly Integrative Modeling of Biomolecular Complexes. Journal of molecular biology, 428, 720-725.

36- Yang, J., Yan, R., Roy, A., Xu, D., Poisson, J., & Zhang, Y. (2015). The I-TASSER Suite: protein structure and function prediction. Nat Methods, 12(1), 7-8. doi: 10.1038/nmeth.3213

37- Young, J. C. (2010). Mechanisms of the Hsp70 chaperone system. Biochem Cell Biol, 88(2), 291-300. doi: 10.1139/o09-175

38- Zhang, Y. (2008). I-TASSER server for protein 3D structure prediction. BMC Bioinformatics, 9(1), 40. doi: 10.1186/1471-2105-9-40