مطالعه برهمکنش رنگ خوراکی قرمز آلورا با پپسین توسط طیف سنجی فلورسانس
فاطمه السادات محسنی شهری*
ایران، بندرعباس، دانشگاه آزاد اسلامی واحد بندر عباس، گروه شیمی
تاریخ دریافت: 23/3/1398    تاریخ پذیرش: 4/6/1398
چکیده
دراین مقاله برهمکنش پپسین با رنگ خوراک قرمز آلورا با استفاده از روش طیف سنجی فلورسانس در شرایط شبه فیزیولوژیک مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد رنگ قرمز آلورا می تواند فلورسانس ذاتی پپسین را کاهش دهد، ثابت سرعت خاموشی (kq) نشان می دهد که مکانیسم خاموشی ازنوع پایا (استاتیک) است .ثابت اتصال ظاهری Ka))، تعداد جایگاه اتصال n) ) در دماهای مختلف مورد ارزیابی قرار گرفتند. نتایج نشان می دهند با افزایش دما ثابت اتصال رنگ قرمز آلورا به پپسین کاهش می یابد. آنتالپی (H°Δ) و آنتروپی (S°Δ) برهمکنش بین  رنگ قرمز آلورا و پپسین به ترتیب 584/45- (kJ mol-1) و 052/49- (J K-1 mol-1) محاسبه گردید که نشان دهنده نقش مهم پیوند های هیدروژنی و بر همکنشهای واندروالسی در این اتصال می باشد، علامت منفی مربوط به تغییرات انرژی آزاد (G°Δ) بیانگر تمایل اتصال رنگ به پروتئین است. طیف سنجی فلورسانس همزمان نشان داد که محیط اطراف باقی مانده های تریپتوفان و تیروزین در فرآیند اتصال تغییرقابل توجهی نداشته است.  بر اساس داده های تجربی، اتصال بین رنگ قرمز آلورا و پروتئین می تواند فعالیت پپسین را مهار کند. 
واژه های کلیدی: پپسین، رنگ قرمز آلورا، طیف سنجی فلورسانس، فعالیت آنزیم
* نویسنده مسئول، تلفن 07633665500 ، پست الکترونیکی: f.mohseni@iauba.ac.ir
مقدمه
 
رنگهای غذایی به طور گسترده ای در صنایع غذایی مورد استفاده قرار می گیرند تا مواد غذایی را با هدف جذب مصرف کنندگان بهبود بخشد. در مقایسه با رنگهای طبیعی، رنگهای مصنوعی به دلیل پایداری بالای آنها در برابرنور، اکسیژن ، pH، یکنواختی رنگ، آلودگی میکروبیولوژیکی کم و هزینه های نسبتا پایین تولید کاربرد بیشتری دارند (9). با این حال، برخی از رنگهای مصنوعی برای بدن انسان مضر هستند، به ویژه اگر آنها بیش از حد مصرف شوند (15). بنابراین، مانند بسیاری از مواد افزودنی خوراکی دیگر، کنترل دزهای رنگ در صنایع غذایی بسیار مهم است.
قرمز آلورا (Allura red) (ساختار نشان داده شده در شکل1)  رنگ محلول در آب، متعلق به خانواده منوآزو از رنگدانه غذایی مصنوعی است که دارای مقاومت بسیار بالایی است ودر بسیاری از محصولات غذایی مانند پوشش آب نبات، بستنی،لواشک، نوشیدنیها و شیرینی استفاده می شود.
 
شکل 1- ساختار مولکولی قرمز آلورا
تحقیقات پیشین نشان می دهد که رنگ قرمز آلورا در موش صحرایی توسط میکرو فلور روده تجزیه شده و باعث تولید سم ، عوامل سرطان زا و موتاژنیک می شود(4 و 20). یافته ها نشان می دهدکه رنگ قرمز آلورا می تواند سبب آسیب DNA در روده بزرگ موش شود (18). همچنین نشان داده شده است که رنگ قرمز آلورا می تواند موجب تغییرات فیزیولوژیک، آسیب به بافت و تغییرات ساختاری جدی کبد و کلیه در موش شود (6 و 7). با توجه به خطرات سلامتی بالقوه، رنگ قرمز آلورا برای مصرف کودکان در اروپا توصیه نمی شود.
 پپسین آنزیم پروتئولیتیک اصلی در اسید معده است. پپسین به عنوان یکی از پروتئازهای گوارشی توسط سلولهای اصلی معده آزاد می شود. وزن مولکولی پپسین 35500 دالتون است و دارای یک زنجیره آنزیمی پلی پپتیدی حاوی 327 باقی مانده آمینواسیدی است (2،19 و 25). پپسین دارای  5 باقی مانده تریپتوفان(Trp39، Trp141، Trp181، Trp190 و(Trp300 و 13 باقی مانده تیروزین (Tyr) و 13 باقی مانده فنیل آلانین Phe)) است (25 و 26). پنج باقی مانده تریپتوفان می تواند به عنوان فلوئوروفورهای ذاتی برای فراهم کردن اطلاعاتی در زمینه برهمکنش لیگاند- پپسین و تغییرات کنفورماسیونی ناشی از اتصال به لیگاند استفاده شود(13). اتصال مولکولهای کوچک با پپسین موجب تغییرات سازوکار و فعالیت آن می شود(7). وانگ و همکارانش برهمکنش متقابل رنگ قرمز آلورا  با سرم آلبومین انسانی را مورد مطالعه قرار دادند (21). نتایج نشان داد که بین رنگ قرمز آلورا و سرم آلبومین برهمکنش وجود دارد. با این حال، رنگ قرمز آلورا قبل از این که وارد پلاسمای خون شود و با سرم آلبومین و پروتئینهای دیگر ارتباط برقرار کند،  ابتدا وارد سیستم گوارش شده و به طور مستقیم به برخی از آنزیمهای گوارشی متصل می شود. درزمینه اتصال رنگ قرمز آلورا  به پپسین اطلاعات کمی وجود دارد و نیاز است در این زمینه مطالعاتی انجام شود.
در این تحقیق، مکانیسم مولکولی برهمکنش رنگ قرمز آلورا با پپسین با استفاده ازروش طیف سنجی فلورسانس مطالعه شده است. با استفاده از معادله اشترن-ولمر، سازوکار خاموشی فلورسانس پپسین با رنگ قرمز آلورا ارزیابی شده و همچنین پارامترهای ترمودینامیکی و فعالیت آنزیم پپسین در حضور رنگ خوراکی مورد بررسی قرار گرفته است.
مواد و روشها
پپسین خوکی با درجه خلوص بالای 90 درصد و رنگ قرمز آلورا از شرکت معتبر سیگما-آلدریچ خریداری شدند.  برای ثابت نگه داشتن   pHمحلول پپسین و هموگلوبین گاوی (شرایط فیزیولوژیک،  pH=2) از محلول بافرسدیم سیترات-اسید سیتریک (2/0 مولار، حاوی  NaCl  1/0 مولار) استفاده شد. کلیه محلولها با بافر سدیم سیترات-اسید سیتریک تا حجم مورد نظر رقیق شدند. کلیه مواد شیمیایی دارای خلوص تجزیه ای بودند و بدون خالص سازی استفاده شدند. تمام محلولهای تهیه شده تا زمان استفاده در یخچال ( دمای 4 درجه سانتی گراد) و تاریکی نگهداری شدند.
کلیه طیفهای فلورسانس پپسین در غیاب و حضور قرمز آلورا توسط یک دستگاه فلورومتر  FP-6200 ((Jasco مجهز به سل کوارتز 0/1 سانتیمتر ثبت شدند. طول موج تهییجی 280 نانومتر انتخاب شد و طیف نشری در محدوده طول موج 300 تا 500 نانومتر دردماهای 298، 305 و 310 کلوین ثبت شدند. غلظت اولیه پپسین μM  0/40 بود و غلظت قرمز آلورا بین 0/0 تا 0/12 میکرومولار با گرادیان رشد0/2 میکرومولار تغییر کرد و پس از انکوبه شدن به مدت 3 دقیقه در دمای مورد نظرطیف فلورسانس ذاتی پروتئین در طول موج تهییجی ثبت شد. طیفهای فلورسانس همزمان (Δλ = 15، Δλ = 60 نانومتر) با طول موج 250 تا 350 نانومتر در دمای اتاق ثبت شدند. غلظت پپسین وقرمز آلورا در آزمایشهای فلورسانس مشابه بود. برای حذف اثر فیلتر داخلی، نیاز است مقدار شدت فلورسانس نمونه ها برای جذب آنها در طول موجهای تهییجی و نشری با استفاده از معادله زیرتصحیح شوند:
 
در این معادلهF  و Fc به ترتیب شدت نشر فلورسانس اندازه گیری شده و تصحیح شده می باشند.  Aexو Aem جذب لیگاند (خاموش گر) در طول موج تهییجی و نشری می باشند (10).
فعالیت آنزیم با استفاده از روش دقیق آنسون با برخی اصلاحات بررسی شد. پپسین (0/20 میکرومولار) با غلظتهای مختلفی از رنگ قرمز آلورا) 7/0و 6/0 ، 5/0، 4/0، 3/0، 2/0، 1/0، 05/0، 0/0 میلی مولار) در بافر سیترات سدیم  (0/2 ( pH= و در دمایK310 به مدت 20 دقیقه مخلوط شد و سپس 0/2 میلی لیتر از محلول هموگلوبین گاوی 5 درصد اضافه شد. پس ازگذشت 20 دقیقه برای خاتمه واکنش 2 میلی لیتر تری کلرواستیک اسید (10 درصد وزنی) اضافه شد. مخلوط به مدت 5 تا 10 دقیقه نگهداری شد و سپس به مدت 15 دقیقه با سرعت 5000 دور در دقیقه سانتریفوژ شد. در نهایت به 1 میلی لیتر از محلول صاف شده،  1 میلی لیتر  NaOH (0/4 مولار) و 1 میلی لیتر رقیق کننده فنول اضافه شد و سپس این مخلوط در دمایK  310 به مدت 15 دقیقه انکوبه شد )3 (.
نتایج و بحث
خاموشی فلورسانس پپسین: به منظور بررسی نوع برهمکنش رنگ قرمز آلورا با پپسین اندازه گیریهای فلورسانس انجام شد. فلورسانس ذاتی پپسین معمولاً مربوط به حضور باقی مانده های تریپتوفان ( (Trp) و تیروزین   (Tyr)است. هنگامی که طول موج تهییجی 280 نانومتر است، تنها باقی مانده تریپتوفان برانگیخته می شود. خاموشی فلورسانس کاهش بهره کوانتومی فلورسانس فلوروفور ناشی از انواع مختلف برهمکنشهای مولکولی مانند واکنشهای حالت بر انگیخته ، تشکیل کمپلکس حالت پایه، انتقال انرژی و خاموشی در نتیجه برخورد است )8، 17، 28 و 29(. نمودار شدت فلورسانس در مقابل طول موج نشری در طول موج تهییج 280 نانومتررسم شده است (شکل a2). همان طور که مشاهده می شود با افزایش غلظت قرمز آلورا شدت نشر پروتئین کاهش می یابد و خاموشی فلورسانس اتفاق می افتد. همچنین در اثر اتصال رنگ قرمز آلورا به پروتئین طول موج ماکزیمم به سمت طول موجهای کمتر یعنی به سمت ناحیه آبی منتقل می شود. این انتقال زمانی رخ می دهد که باقیمانده های تیروزین و تریپتوفان از محیط آبدوست به محیط آبگریز انتقال یابند و این نشان دهنده کاهش قطبش پذیری محیط اطراف کروموفور است )22(.
همچنین می توان نتیجه گرفت با اتصال رنگ قرمز آلورا به پپسین فلوروفورهای این پروتئین به سمت داخل پروتئین رفته و محیط شان آبگریز تر شده است. برای تعیین سازوکار اتصال بین پپسین و قرمز آلورا، داده های شدت فلوئورسانس با استفاده از معادله اشترن- ولمر تحلیل شدند(1 و 11):
 
در این معادله F0 و F به ترتیب شدت فلورسانس پروتئین در غیاب و حضور خاموش کننده ،Kq ثابت سرعت خاموشی پروتئین، KSV ثابت اشترن‌ـ ولمر، 0τ طول عمر فلورسانس پروتئین در غیاب خاموش کننده (10-8 s= 0τ  ( (27) و [Q] غلظت خاموش کننده است. بدیهی است که:
 

 
   
شکل 2- ((a اثر افزایش غلظت رنگ قرمز آلورا بر طیف نشری پپسین در طول موج تهییجی 280 نانومتر و دمای 298 کلوین، جهت پیکان عمودی افزایش غلظت وجهت پیکان افقی انتقال آبی را نشان می دهد (b) نمودار اشترن-ولمر کمپکس پپسین-قرمز آلوار در دماهای مختلف c)) نمودار  در مقابل log[Q]برای برهمکنش رنگ قرمز آلورا با پپسین در دماهای مختلف.
 
ثابت سرعت خاموشی، (L mol-1 s-1) Kq را می‌توان بر اساس معادله (2) به دست آورد. عموماً خاموشی دینامیک و استاتیک را می‌توان توسط ثابت خاموشی Kq از  یکدیگر تشخیص داد، به طوری که حداکثر ثابت خاموشی دینامیک‌ خاموش کننده‌های مختلف همراه بیومولکول  L mol-1 s-11010×2  است(24). نمودار اشترن-ولمر فلورسانس پپسین که توسط قرمز آلورا خاموش شده در شکل b1 نشان داده شده و نتایج در جدول 1 گزارش شده است.
 
جدول1- ثابت های اشترن-ولمر برای برهمکنش پپسین با رنگ قرمز آلورا در دماهای مختلف
T (K)    Ksv (L mol-1)    Kq (L  mol−1 s−1)      R*
298    104×07/9    1012×07/9    987/0
305    104×84/8    1012×84/8    997/0
310    104×10/7    1012×10/7    991/0
*:ضریب همبستگی
 
با افزایش دما،  Ksv کاهش می یابد، مقدار Kq بیشتر از   L mol-1 s-11010×2 است، بنابراین خاموشی فلورسانس پپسین در حضور رنگ قرمز آلورا به واسطه تشکیل کمپلکس پپسین-قرمز آلورا می باشد. برای محاسبه ثابت اتصال قرمز آلورا به پپسین و تعداد جایگاههای اتصال از معادله 3 استفاده شد.
 
در این معادله  F0 وF به ترتیب شدتهای فلورسانس پروتئین در غیاب و حضور خاموش کننده، Ka ثابت اتصال، n تعداد جایگاههای اتصال و [Q]غلظت خاموش کننده می‌باشد. شیب نمودار  در مقابل    تعداد جایگاههای اتصال و عرض از مبدأ لگاریتم ثابت  اتصال را می دهد(8). نتایج در جدول2 گزارش شده است.
 
جدول2- ثابت اتصال(Ka ) و پارامترهای ترمودینامیکی برای برهمکنش پپسین و قرمز آلورا 
T (K)    Ka (L mol-1)    n    R*    ΔH° (kJ mol-1)    ΔG° (kJ mol-1)    ΔS° (J mol-1 K-1)   
298    105×620/2    095/1     995/0    584/45-     910/30-    052/49-   
305    105×858/1    045/1    996/0        765/30-    
310    105×272/1    992/0    989/0        292/30-    
*: ضریب همبستگی
 
از نتایج جدول 2 می توان دریافت که Ka برای اتصال قرمز آلورا به پپسین با افزایش دما کاهش می یابد، که نشان می دهد کمپلکس تشکیل شده ناپایدار است و در دماهای بالاتر تجزیه می شود (23). علاوه بر این مقادیر n نشان می دهد یک دسته جایگاه اتصال مستقل در پپسین برای رنگ وجود دارد. اساساً چهار نوع برهمکنش غیر کووالانسی در اتصال لیگاند به بیومولکول وجود دارد: پیوند هیدروژنی ، نیروهای واندروالاسی، نیروهای الکترواستاتیک و برهمکنشهای هیدروفوب)23.( علامت و مقدار پارامترهای ترمودینامیکی مانند تغییر انرژی آزاد (ΔG°)، تغییر آنتالپی (ΔH°)  و تغییر آنتروپی (ΔS°)  واکنش برای تعیین نوع برهمکنش اهمیت دارند. اگر ΔH° با تغییر دما خیلی تغییر نکند، مقدار ΔH° و ΔS° را می توان با استفاده از معادله وانت هوف به صورت زیر محاسبه کرد:
 
که T دمای آزمایش بر حسب کلوین است، Ka ثابت اتصال است که از معادله (3) به دست می آید و R ثابت گاز است. از شیب و عرض از مبدأ منحنی Ka  lnدر مقابل 1/T، به ترتیب تغییر آنتالپی(ΔH°)  و تغییر آنتروپی  (ΔS°) به دست آمد. انرژی آزاد گیبس، ΔG°، نیز با استفاده از معادله ترمودینامیکی زیر محاسبه شد (12):
 
مقادیر پارامترهای ترمودینامیکی در جدول 2 ارائه شده است. از جدول 2 می توان نتیجه گرفت که علامت منفی برای ΔG° در محدوده دمایی مورد بررسی بدین معنی است که فرآیند اتصال پپسین به قرمز آلورا به صورت خود به خودی است. بر طبق قوانین خلاصه شده توسط راس و سوبرامانیان (1981)، هنگامی که ΔH° و ΔS° مثبت هستند، برهمکنشهای هیدروفوبی نقش اصلی را در واکنش اتصال ایفاء می کند ومقدار منفی ΔH° و ΔS° نشان دهنده حضور نیروهای واندروالس و پیوند هیدروژنی در تشکیل کمپلکس هستند. علاوه بر این، برهمکنش الکترواستاتیک با ΔS° مثبت و ΔH° منفی مشخص می شود که ΔH° معمولاً بسیار کوچک و تقریباً برابر با صفر است. نتایج نشان می دهند که پیوند هیدروژنی و نیروهای واندروالسی نقش مهمی را در  تشکیل کمپلکس رنگ قرمز آلورا با پپسین ایفاء می کنند(16).
طیف سنجی فلورسانس همزمان: طیف سنجی فلورسانس همزمان اطلاعاتی در زمینه باقی مانده های تیروزین و تریپتوفان پپسین فراهم می کند. زمانی که فاصله بین طول موج تهییج و طول موج نشری 15  Δλ= نانومتر است طیف اطلاعاتی را درزمینه باقی مانده های Tyr ارائه می دهد و زمانی که 60   Δλ= نانومتر است طیف اطلاعات مربوط به باقی مانده  Trp را نشان می دهد، تغییر در موقعیت حداکثر طول موج نشری، تغییر در قطبیت محیط اطراف باقی مانده های Tyr یا Trp را نشان می دهد (11).  شکل 3، تغییرات طیف فلورسانس همزمان برای پپسین را نشان می دهد.
 
  
شکل 3-((a طیف فلورسانس همزمان برهمکنش بین پپسین و رنگ قرمز آلورا در  Δλ = 60 نانومتر و(b) Δλ = 15 نانومتر در دمای اتاق (برای Δλ = 60 نانومترطول موج تهییج 220 نانومتر و برای Δλ = 15 نانومترطول موج تهییج 225 نانومتر تنظیم گردید)
 
نتایج نشان می دهند شدت فلورسانس برای هر دو باقی مانده تریپتوفان و تیروزین به تدریج همراه با افزایش رنگ قرمز آلورا کاهش می یابد که نشان دهنده تشکیل کمپلکس و برهمکنش رنگ قرمز آلورا با باقی ماندة تیروزین و تریپتوفان در پپسین است، همچنین با افزایش غلظت رنگ تغییری در موقعیت λmax مشاهده نگردید، که حاکی از نبود تغییر قابل توجه در محیط اطراف فلوروفور است.
انتقال انرژی بین پپسین و رنگ قرمز آلورا: با توجه به نظریه انتقال انرژی غیر تابشی فورسترکارایی انتقال انرژی بین دهنده و پذیرنده، E، می تواند توسط معادله زیر تعیین شود(5) :
 
که r فاصله لیگاند تا باقیمانده تریپتوفان پروتئین است. R0 فاصله بحرانی است هنگامی که بازده انتقال آنها 50 درصد می باشد و می تواند از معادله زیر تعیین شود:
 
K2 فاکتور جهت گیری فضایی مربوط به هندسه دهنده و پذیرنده دو قطبی برای جهت گیری تصادفی در یک محلول است. n ضریب شکست محیط است، Φ بهره کوانتومی فلورسانس دهنده در غیاب پذیرنده است و J انتگرال همپوشانی بین طیف نشری فلورسانس دهنده و طیف جذبی پذیرنده است. مقدار J را می توان با استفاده از معادله زیر به دست آورد:
 
که F(λ) شدت فلورسانس دهنده در طول موج λ است و ((λ ε ضریب جذب مولی پذیرنده در طول موجλ است. مقدار انتگرال همپوشانی با استفاده از رابطه (8) و نرم افزار اکسل 2016 محاسبه شد و مقدار آن cm3 L moL-1 15-10×346/8  به دست آمد. همپوشانی طیف جذبی مرئی- فرابنفش رنگ قرمز آلورا با طیف نشری فلورسانس پپسین در شکل4 نشان داده شده است. تحت شرایط آزمایش برای پپسین , K2 =   36/1 =n  و15/ 0=Φ می باشد(27).
 
شکل4 – همپوشانی طیف فلورسانس پپسین با طیف جذبی رنگ قرمز آلورا. mol L-1 6- 10×0/2= (رنگ قرمز آلورا C (= (پپسین) C
(قرمز :طیف جذبی پذیرنده انرژی، آبی:طیف نشری دهنده انرژی)
بر اساس معادلات 8- 6 فاصله بین باقیمانده تریپتوفان پپسین (دهنده) و رنگ قرمز آلورا (پذیرنده)  47/3 نانومتر محاسبه شد که چون در محدوده 8-2 نانومتر و 0.5R0 < r < 1.5R0  می باشد، نشان می دهد انتقال انرژی از پپسین به رنگ قرمز آلورا رخ داده است (14).
فعالیت پپسین در حضور رنگ قرمز آلورا: به منظور نشان دادن اینکه آیا رنگ قرمز آلورا پس از ورود به بدن انسان از طریق غذا یا دارو می تواند فعالیت پپسین را تحت تأثیر قرار دهد، اثر رنگ آلورا بر فعالیت پپسین در محیط آزمایشگاهی طبق روش ذکر شده بررسی شد.
با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر، جذب در 660 نانومتر (OD660) اندازه گیری شد و فعالیت پپسین با استفاده از رابطه زیر محاسبه شد(3):
 = (%) نرخ بازدارندگی آنزیم
همان طور که در شکل5 نشان داده شده است، فعالیت آنزیم در حضور رنگ قرمز آلورا با غلظتهای مختلف تغییر می کند. با افزایش غلظت رنگ، میزان بازدارندگی افزایش می یابد و فعالیت پپسین کاهش می یابد. 
 
شکل5- اثر رنگ قرمز آلورا بر فعالیت پپسین در دمای 310 کلوین و μM0/20 =(پپسینC(
میزان مهارکنندگی رنگ قرمز آلورا در غلظت 50/0میلی مولار برابر 4/34 درصد می باشد. این نتایج نشان می دهد هنگامی که رنگ قرمز آلورا وارد معده می شود می تواند فعالیت پپسین را مهار کند.
به طور کلی نتایج نشان می دهد که رنگ قرمز آلورا می تواند به طورخود به خود به پپسین متصل شود و فلورسانس ذاتی پروتئین را از طریق مکانیسم استاتیک خاموش کند. پارامترهای ترمودینامیکی نشان می دهد که پیوندهای هیدروژنی و نیروهای وان در والسی نقش مهمی در برهمکنش رنگ قرمز آلورا با پپسین ایفاء می کنند. طیف سنجی فلورسانس همزمان نشان داد که محیط اطراف باقی مانده های تریپتوفان و تیروزین در فرآیند اتصال تغییرقابل توجهی نمی کند. علاوه بر این، رنگ قرمز آلورا باعث مهار فعالیت پپسین شد. نتایج حاصل از این تحقیق می تواند اطلاعات ارزشمندی در مورد برهمکنش رنگ قرمز آلورا با پروتئازهای گوارشی فراهم کندکه در ارزیابی اثرات سمی رنگهای آزو مفید است.
در پژوهشهای آتی می توان با انجام محاسبات دینامیک مولکولی نتایج حاصل از این تحقیق را تفسیر و همچنین تغییرات ساختاری پپسین ناشی از اتصال رنگ قرمز آلورا را بررسی نمود.
تشکر و قدردانی
این تحقیق با حمایت مالی دانشگاه آزاد اسلامی واحد بندر عباس انجام شده است. بنابراین نویسنده مراتب سپاس خود را از آن دانشگاه محترم اعلام می دارد.