نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه مهندسی علوم زیستی، دانشکده علوم و فنون نوین، دانگاه تهران، تهران، ایران

2 گروه مهندسی علوم زیستی، دانشکده علوم و فنون نوین، دانشگاه تهران، تهران، ایران

چکیده

فاکتور رشد عصبی(NGF) عضوی شناخته شده از خانواده ی پروتئین های نوروتروفین است که در درمان بیماری هایی مانند مولتی پل اسکلروزیس و آلزایمر بکار گرفته می شود. تولید پروتئین نوترکیب در E. coli دارای معایب خاصی است که شکل گیری اینکلوژن بادی و عدم شکل گیری پیوندهای دی سولفیدی درسیتوپلاسم در درجه اول قرار دارند .بنابراین ما به منظور هدایت β-NGF نوترکیب تولید شده به سمت پری پلاسم، استفاده از پپتید نشانه ی اصلاح شده آنزیم آلفا آمیلاز باسیلوس لیکنی فورمیس بومی ایران را به عنوان یک رویکرد مؤثر برای تولید β-NGF با تا خوردگی صحیح، مورد هدف قرار دادیم. به همین منظور ژن β- NGF انسانی به همراه توالی پپتید نشانه مذکور در وکتور pET21a(+)کلون شدند و سپس وکتور نوترکیب به سویه های BL21(DE3) و BL21(DE3)plysS انتقال داده شد. بیان پروتئین درسویه های دارای وکتور نوترکیب و سویه ی کنترل مثبت حاوی وکتور pET39b(+) دارای پپتید نشانه DsbA با استفاده از IPTG ، 1 میلی مولار القا گردید. بیان سیتوپلاسمی وپری پلاسمی β-NGF با تکنیک های SDS-PAGE و سنجش دات بلات تأیید شد. در نهایت، پروتئین های پری پلاسمی بیان شده با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی تخلیص وصحت تخلیص با روش SDS-PAGE و وسترن بلات تأیید شد. نتایج نشان می دهد که در تولید ترشحی و هدایت پروتئین β-NGF به فضای پری پلاسمی توالی پپتید نشانه ی اصلاح شده ی آنزیم آلفا آمیلاز باسیلوس لیکنی فورمیس بومی ایران نسبت به پپتید نشانه DsbA عملکرد بهتری داشته و سویه ی BL21(DE3)plysS میزبان مناسبتری می باشد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Cloning and secretory expression of human β-NGF using the modified signal peptide of the Iranian native bacillus licheniformis alpha amylase

نویسندگان [English]

  • Samaneh Qobadi Nasr 1
  • Zahra Hajihassan 2
  • Naser Ansari-Pour 2

1 Department of Life Science Engineering, Faculty of New Sciences and Technologies, University of Tehran, Tehran, Iran

2 Department of Life Science Engineering, Faculty of New Sciences and Technologies, University of Tehran, Tehran, Iran

چکیده [English]

Nerve growth factor (NGF) is a well-characterized member of the neurotrophin protein family, which has been shown to play a pivotal role in treating diseases such as multiple sclerosis and Alzheimer’s disease. Production of recombinant proteins in E. coli has particular disadvantages, which are primarily inclusion body formation and lack of disulfide bond formation in the cytoplasm. We therefore aimed to use the modified signal peptide of the Iranian native Bacillus licheniformis alpha-amylase to target the expressed recombinant β-NGF to the periplasm as an effective strategy to produce correctly-folded β-NGF.
For this purpose, the human β-NGF gene with the signal sequence of the Iranian native Bacillus licheniformis alpha-amylase was cloned into a pET21a (+) vector and then the recombinant vector was transformed to BL21 (DE3) and BL21 (DE3) plysS strains. Protein expression was induced by 1mM IPTG in strains with the recombinant vector and the positive control strain containing the pET39b (+) vector with the DsbA signal peptide. Cytoplasmic and periplasmic expression of β-NGF was confirmed by SDS-PAGE and dot-blot assays. Finally, the expressed periplasmic proteins were purified using affinity chromatography and this purification was confirmed by using SDS-PAGE and Western blot assays.
The results show the modified signal peptide of the Iranian native Bacillus licheniformis alpha-amylase is more effective for the secretory expression and directing β-NGF to the periplasmic space than the DsbA signal peptide. Also, these results indicate that the BL21 (DE3) plysS strain is an appropriate host for periplasmic expression of β-NGF.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Nerve growth factor
  • Recombinant protein
  • signal sequence
  • periplasmic expression

کلون سازی و بیان ترشحی فاکتور رشد بتا-NGF انسانی با استفاده از پپتیدنشانهیاصلاحشدهی آنزیمآلفاآمیلازباسیلوسلیکنیفورمیسبومی ایران

سمانه قبادی نصر، زهرا حاجی حسن* و ناصر انصاری پور*

ایران، تهران،دانشگاه تهران،دانشکده علوم و فنون نوین،گروه مهندسی علوم زیستی

تاریخ دریافت: 27/8/96           تاریخ پذیرش: 16/11/96

چکیده

فاکتور رشد عصبی(NGF) عضوی شناخته شده از خانواده ی پروتئین های نوروتروفین است که در درمان بیماری هایی مانند مولتی پل اسکلروزیس و آلزایمر بکار گرفته می شود. تولید پروتئین نوترکیب در E. coli دارای معایب خاصی است که شکل گیری اینکلوژن بادی و عدم شکل گیری پیوندهای دی سولفیدی درسیتوپلاسم در درجه اول قرار دارند .بنابراین ما بمنظور هدایت β-NGF نوترکیب تولید شده به سمت پری پلاسم، استفاده از پپتید نشانه ی اصلاح شده آنزیم آلفا آمیلاز باسیلوسلیکنیفورمیس بومی ایران را به عنوان یک رویکرد مؤثر برای تولید β-NGF با تا خوردگی صحیح، مورد هدف قرار دادیم. به همین منظور ژن β-NGF انسانی بهمراه توالی پپتید نشانه مذکور در وکتور pET21a(+)کلون شدند و سپس وکتور نوترکیب به سویه های BL21(DE3)  و BL21(DE3)plysS انتقال داده شد. بیان پروتئین درسویه های دارای وکتور نوترکیب و سویه ی کنترل مثبت حاوی وکتور pET39b(+) دارای پپتید نشانه DsbA با استفاده از IPTG ، 1 میلی مولار  القا گردید. بیان سیتوپلاسمی وپری پلاسمی β-NGF با تکنیک های SDS-PAGE و سنجش دات بلات تأیید شد. در نهایت، پروتئین های پری پلاسمی بیان شده با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی تخلیص وصحت تخلیص با روش SDS-PAGE  و وسترن بلات تأیید شد. نتایج نشان می دهد که در تولید ترشحی و هدایت ‌پروتئین β-NGF به فضای پری پلاسمی توالی پپتید نشانه ی اصلاح شدۀ آنزیم آلفا آمیلازباسیلوسلیکنیفورمیسبومی ایران  نسبت به پپتید نشانه DsbA عملکرد بهتری داشته و سویه ی BL21(DE3)plysS میزبان مناسبتری می باشد.

واژه های کلیدی : فاکتور رشد عصبی، پروتئین نوترکیب، توالی نشانه، بیان پری پلاسمی.

* نویسندگان مسئول، تلفن: 09128333563 و 09121238180 ، پست الکترونیکی: hajihasan@ut.ac.ir و n.ansaripour@ut.ac.ir

مقدمه

 

فاکتور رشد عصبی(NGF= Nerve Growth Factor) به عنوان عضوی از خانواده نوروتروفینها (Neurotrophins)، حدود نیم قرن پیش کشف شد و اولین بار به دلیل نقش حیاتی اش در بقا، رشد و تمایز نورونهای سیستم عصبی مرکزی و محیطی مورد توجه قرار گرفت و ساختار سه بعدی آن برای اولین بار با استفاده از کریستالوگرافی اشعه ایکس منتشر شد(21و23). کمپلکس پروتئینی NGF از زیر واحدهای آلفا، بتا و گاما (α2β2γ2) تشکیل شده است که زیر واحد بتا مسئول فعالیت بیولوژیک  NGF است(31) .ژن  β-NGF بر روی بازوی کوتاه کروموزوم شماره یک انسانی واقع شده است. هومودایمر 26 کیلودالتونی β-NGF متشکل از دو زیرواحد بتای 120 آمینواسیدی یکسان است که با پیوندهای هیدروفوبی و غیرکووالانسی به هم متصل شده اند و ساختار چهارم دارای عملکرد را تشکیل میدهند. هر منومر β-NGF دارای صفحات بتای ناهمسو (Anti-Parallel β Sheet) که دور هم پیچیده شده اند و چهار لوپ می باشد . لوپهای L1 ، L2 و L4 در یک انتهای مولکول و لوپ L3 در انتهای دیگر آن واقع شده اند. صفحه های بتا توسط موتیف گره ی سیستئینی (Cysteine Knot) موجود در نزدیکی لوپ L3 با برقراری سه پیوند دی سولفیدی به هم متصل شده اند (7و12و16و31).

اندکی پس از کشف NGF در اواسط قرن بیستم، پتانسیل دارویی NGF برای درمان بیماری های تخریب سیستم عصبی مرکزی و نوروپاتی محیطی (Neuropathy) روشن شد. آزمایشات نشان دهنده ی کاربردهای بالینی این پروتئین در درمان بیماران مبتلا به آلزایمر، پارکینسون، دیابت و بیماری های مربوط به قرنیه ی چشم است. یکی از کاربردهای بالینیNGF  مربوط به فعالیت این پروتئین به عنوان یک تنظیم کننده ی سیستم ایمنی است. بر اساس این ویژگی، این پروتئین در درمان بیماری های خود ایمنی مانند مالتی پل اسکلروزیس (Multiple Sclerosis) و بیماری های التهابی مزمن می تواند مؤثر باشد(4).

با توجه به عملکرد فاکتورهای رشد متعلق به خانواده­ی نوروتروفین­ها مثل NGF بر روی تکثیر، تمایز، بقا و مرگ سلول­های عصبی و با توجه به این مسئله که ­بدست ­آوردن مقادیر زیاد این پروتئین از منابع طبیعی­اش کار مشکل، زمان­بر و پرهزینه­ای است، توجه­ محققان به سمت تولید نوترکیب NGF جلب شده است. از آنجائیکه تولید پروتئینهای نوترکیب بصورت سیتوپلاسمی در میزبانهایی مانند E. coliمنجر به تولید اینکلوژن بادی ( Inclusion body) می شود و تولید پروتئین در فضای پری پلاسمی میتواند به تاخوردگی صحیح پروتئین نوترکیب و تشکیل پیوند های دی سولفیدی در باکتری کمک کند(8). در بررسی حاضر تولید پروتئین  β-NGF به روش ترشحی برای نخستین بار با استفاده از یک پپتید نشانه نوین مورد بررسی قرار گرفت. در این تحقیق cDNA زیر واحد بتای پروتئین NGF  از بانک اطلاعاتی NCBI استخراج شده و توالی آن بمنظور بیان در باکتری  E. coli با استفاده از رویکردهای بیوانفورماتیکی بهینه سازی شد. سپس با طراحی پرایمرهای مناسب و انجام واکنشPCR جایگاه های برشی مورد نظر در دو طرف ژن قرار داده شد. قطعه تکثیر شده توسط آنزیمهای محدودالأثر بریده شده و به هراه توالی پپتید نشانه آنزیم آلفا آمیلاز باکتری باسیلوسلیکنیفورمیس بومی ایران در وکتور pET21a(+) کلون گردید و سپس میزان بیان در دو سویه BL21(DE3) و BL21(DE3)plysS  مورد بررسی قرار گرفت.

مواد روشها

مواد مورد استفاده: محیط های کشت از شرکت مرک آلمان، آنتی بیوتیک و IPTG از شرکت سیگما، کلیه ی آنزیم ها از شرکت فرمنتاز (Fermentase)، Master Mix از شرکت آمپلیکون (Apliqon) مارکرDNA از شرکت  SMO BIO  و مارکر پروتئینی از شرکت سیناکلون خریداری شدند.

سویه ی باکتریایی و وکتور: سویه ی باکتریاییGold10 جهت تکثیر وکتور نوترکیب، از طرف گروه بیوشیمی بالینی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی اهدا شد. سویه های بیانی BL21(DE3) و BL21(DE3)pLysS ، وکتورpET21a(+) به عنوان وکتور بیانی و وکتور pET39b(+)  حاوی کل ژن Dsb A و توالی پپتید نشانه آن به عنوان کنترل مثبت، از شرکت نواژن (Novagene) آمریکا خریداری شدند.

پپتید نشانه: در این بررسی از پپتید نشانه آنزیم آلفا آمیلاز باکتری باسیلوس لیکنی فورمیس بومی ایران (Accession No.AY842512) که در آن یک اسید آمینه متیونین بین اسید آمینه های شماره 13 و 14 آن وارد شده، استفاده گردید(1). توالی پپتید نشانه بهمراه توالی مربوط به β-NGF cDNA توسط شرکت شاین جین (ShineGene) کشور چین سنتز شد.

کلونینگ ژن و تأیید آن: پرایمرهای استفاده شده در این تحقیق پس از طراحی با استفاده از نرم افزار Primer3Plus، توسط شرکت ماکروژن (Macrogene) کره سنتز شدند. توالی پرایمرها به صورت زیر می باشد:

5’- ATCCTACCATGGCCTCTTCCAGCCATCCGATTTTC-3’

5’- ATCCTAGAATTCGGCACGACGGACGGCTTTA-3’

بمنظور تخلیص پروتئین با استفاده از ستون IMAC جایگاه های برشی به گونه ای انتخاب شدند که در انتهای پروتئین β-NGF یک توالی 6 اسید آمینه ای از هیستیدین قرار گیرد(2).پرایمرها دارای توالی مکان برشی برای آنزیم های EcoRI و NcoI  می باشند. قطعه مورد نظر طی واکنش PCR با مقادیر(جدول 1) و برنامه دمایی(جدول 2) زیر تکثیر گردید:

جدول 1- ترکیب مواد در هر واکنش PCR به حجم 10 میکرولیتر

حجم(میکرولیتر)

ترکیب

5

PCR Master mix

2/0

پرایمر فوروارد

2/0

پرایمر ریورس

1

DNA

6/3

آب استریل

10

حجم نهایی

 

جدول 2- برنامه دمایی واکنش PCR

تعداد چرخه

دما(درجه سانتی گراد)

زمان(ثانیه)

نام مرحله

1

95

300

Pre-denaturation

32

95

30

Denaturation

32

60

40

Annealing

32

72

40

Extension

1

72

420

Final extension

 

پس از برش دو انتهای قطعه و نیز جایگاه برشی موجود در وکتور pET21a(+) توسط دو آنزیم EcoRIو NcoI، اتصال قطعه ژنی β-NGF و وکتور به کمک آنزیم DNA T4 Ligase  صورت پذیرفت.

بمنظور تأیید صحت کلونینگ از روش های کلونی PCR، هضم دو آنزیمی و توالی یابی (با استفاده از پرایمر T7 terminator که توسط شرکت ماکروژن انجام شد) استفاده شد.

ترانسفورماسیون: انتقال وکتور نوترکیب به میزبان کلونینگ Gold10 و میزبان های بیانیBL21(DE3) و BL21(DE3)pLysS با روش شوک اسمزی در حضور کلسیوم کلراید صورت پذیرفت و سپس باکتری های نوترکیب بر روی پلیت LB آگارحاوی آنتی بیوتیک آمپی سیلین (غلظت mg/ml100) در 37 درجه سانتی گراد کشت داده شده و انکوبه شدند(28).

بیان پروتئین: میزان 1% از کشت شبانه هر دو سویه ی  BL21(DE3)وBL21(DE3)pLysS  دارای وکتور pET21a(+)::β-NGF به طور جداگانه در محیط کشت LB مایع حاوی آنتی بیوتیک آمپی سیلین (غلظت mg/ml100) کشت داده شد. رشد باکتری ها تا زمان رسیدن به OD 7/0-5/0 در طول موج 600 نانومتر ادامه یافت. بیان پروتئین با اضافه کردن غلظت 1  میلی مولار IPTG در دمای 30 درجه سانتی گراد و انکوباسیون به مدت 4 ساعت انجام شد. سپس باکتری ها به مدت 15 دقیقه در g 5000 و دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شدند. در ادامه بمنظور استخراج پروتئین های پری پلاسمی و سیتوپلاسمی، رسوب سلولی در بافر سرد 40 میلی گرم بر میلی لیتر  TES(سوکروز 5/0 مولار، Tris-HCl 03/0 مولار و EDTA 1 میلی مولار) با pH 8 به مدت 10 دقیقه در دمای محیط مخلوط شد. در مرحله بعد سوسپانسیون حاصله به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد با دور g10000 سانتریفوژ شد. پس از دور ریختن مایع رویی، به رسوب MgSO4 5 میلی مولار سرد اضافه و به مدت 10 دقیقه انکوبه شد. سپس مجدداً سانتریفیوژ با دور g 10000 به مدت 15 دقیقه انجام شد و مایع رویی جدا و از رسوب سلولی برای استخراج سیتوپلاسمی با استفاده از اوره 8 مولار استفاده شد. به محلول رویی 12% حجم نهایی TCA 100% اضافه شد و به مدت 20 دقیقه بر روی یخ مخلوط گردید. در مرحله ی بعد پس از انجام سانتریفیوژ مایع رویی دور ریخته شد و رسوب حاصل که حاوی پروتئین های پری پلاسمی بود در دمای منفی 20 درجه سانتی گراد نگهداری شد.

بررسی بیان پروتئین نوترکیب با استفاده روش SDS-PAGE : برای الکتروفورز پروتئین ها در شرایط دناتوره کننده (در حضور SDS)، از روش لاملی استفاده گردید. بدین منظور از ژل SDS-PAGE 12 درصد استفاده گردید، بدین ترتیب که در هر یک از چاهک های ژل مقدار مساوی از پروتئین های سیتوپلاسمی و پری پلاسمی استخراج شده بارگذاری شدند. پس از پایان الکتروفورز با استفاده از کوماسی بلو R250 رنگ آمیزی انجام شد(19).

بررسی بیان پروتئین نوترکیب با استفاده از روش دات بلات: ابتدا مقادیر مساوی از پروتئین های های سیتوپلاسمی و پری پلاسمی استخراج شده روی کاغذ نیتروسلولز قرار داده شد. سپس بمنظور بلاک کردن نقاط غیر اختصاصی، کاغذ در پلیت حاوی بافر بلوکه کننده  TBST(شامل Tris-HCl 50 میلی مولار، NaCl 150 میلی مولار و 5% Tween20) حاوی 5% شیر خشک به مدت 1 ساعت قرار داده شد. پس از مدت زمان مذکور سه مرحله شست و شو با بافر TBST انجام شد. در مرحله ی بعد کاغذ در محلول حاوی آنتی بادی مونوکلونال ضد His-tag متصل به آنزیم HRP با رقت 1:1000  قرار داده شد. در انتها کاغذ با سوبسترای رنگی DAB (شرکت بایوبیسیک (Biobasic) کانادا) در حضور پر اکسید هیدروژن به عنوان سوبسترای آنزیم در محیط تاریک انکوبه شد.

بررسی میزان بیان پروتئین با نرم افزار IMAGE J : بمنظور بررسی و مقایسه دقیق سطح پروتئین بیان شده در نمونه های مختلف، تصویر حاصل از دات بلات با استفاده از نرم افزار IMAGE J  نسخه ی 1.50i (از  NIHبه آدرس https://imagej.nih.gov/ij/) آنالیز و مورد بررسی قرار گرفت.

تخلیص پروتئین: تخلیص پروتئین β-NGFبیان شده بصورت پری پلاسمی توسط سویه یBL21(DE3)pLysS  با استفاده از ستون IMAC انجام شد(3).

بررسی پروتئین تخلیص شده با استفاده از روش وسترن بلات: بمنظورانجام وسترن بلات، پس از الکتروفورز پروتئین ها توسط ژل SDS-PAGE، پروتئین های تفکیک شده به کمک بافر انتقال (گلایسین 192 میلی مولار، تریس 25 میلی مولار و 15% متانول) توسط جریان ثابت 200 میلی آمپر به مدت 4 ساعت در 4 درجه سانتی گراد بر روی کاغذ نیتروسلولز منتقل گردیدند. پس از پایان مدت زمان انتقال، مراحل بلوکه کردن، شست و شو و افزودن آنتی بادی و سوبسترا مطابق با روش دات بلات انجام شد(10).

نتایج

کلونینگ ژن β-NGFدر وکتور pET21a(+) : پس از کلونینگ ژن  β-NGFبه درون وکتور pET21a(+)و انتقال وکتور نوترکیب به باکتری های مستعد، بمنظور تشخیص کلونی های حاوی وکتور نوترکیب، کلونی های رشد کرده بر روی پلیت حاوی آنتی بیوتیک آمپی سیلین مورد بررسی قرار گرفتند. تست های غربالگری شامل کلونی PCR (شکل 1)، هضم دو آنزیمی توسط آنزیم های EcoRIو NcoI(شکل 2) و توالی یابی با استفاده از پرایمر T7 terminator(شکل 3) نشان دهنده کلون شدن ژن مورد نظر در وکتور pET21a(+) بود. در شکل 1 مشاهده ی قطعه ی  bp374  بر روی ژل آگارز نشان دهنده ی حضور این قطعه در کلونی های بررسی شده است. شکل 2 نشان می‍دهد پس از استفاده از آنزیم های EcoRIو NcoIو انجام واکنش هضم دو آنزیمی قطعه ای هم اندازه با ژن مورد نظر ما از وکتور جدا  شده است. در نهایت در شکل 3 در کروماتوگرام حاصل از توالی یابی وکتور نوترکیب مشاهده می گردد که قطعه ی ژنی مربوط به ژن  β-NGF بدون تغییر در تعداد یا نوع نوکلئوتید در وکتور نوترکیب حضور دارد.

 

شکل1-تصویر ژل الکتروفورز محصول کلونی PCR  بر روی ژل آگارز ۱ درصد. باند مربوط به ژن β-NGF در تصویر با فلش نشان داده شده است.M نشان دهنده مارکر وزن مولکولی 100bp+3k می باشد.

 

شکل2- تصویر ژل الکتروفورز محصول واکنش هضم دو آنزیمی بر روی ژل آگارز 1 درصد. باند مربوط به ژن β-NGF که پس از واکنش هضم دو آنزیمی از وکتور جدا شده است در ناحیه ی 374 جفت باز قابل مشاهده است. M نشان دهنده مارکر مولکولی 100bp+3k می‍باشد.

بررسی بیان پروتئین β-NGF در دو سویه ی BL21(DE3)وBL21(DE3)pLysSبا استفاده از ژل SDS-PAGE و روش دات بلاتو آنالیز کمی با استفاده از نرم افزار IMAGE J : پس از بیان پروتئین با استفاده از روش گفته شده در قسمت روش کار، مقادیر مساوی از پروتئین های استخراج شده پری پلاسمی و سیتوپلاسمی مربوط به هر دو سویه ی BL21(DE3) و BL21(DE3)pLysS بر روی ژل SDS-PAGE الکتروفورز شدند. با توجه به اینکه پروتئین مذکور دارای وزن مولکولی 14 کیلو دالتون می باشد همانطور که در شکل 4 قابل مشاهده است در این محدوده وزن مولکولی تفاوت خاصی بین سویه های دارای وکتور نوترکیب و سویه کنترل بدون وکتور قابل مشاهده نیست.

بمنظور بررسی اختصاصی تر بیان از روش دات بلات استفاده گردید. میزان مساوی از نمونه های سیتوپلاسمی و پری پلاسمی کنترل مثبت (سویه ی BL21(DE3) دارای وکتور pET39b(+)حامل ژن β-NGF انسانی و دارای توالی نشانه Dsb A)، کنترل منفی (BL21(DE3) بدون وکتور) و سویه های BL21(DE3) و BL21(DE3)pLysS حامل وکتور نوترکیب pET21a(+)::β-NGF روی کاغذ نیتروسلولز قرار داده شد که نتایج آن در شکل 5 قابل مشاهده است. همانطور که در تصویر قابل مشاهده است بیان پری پلاسمی در سویه های BL21(DE3) و BL21(DE3)pLysS دارای وکتور نوترکیب که پپتید نشانه مورد نظر را نیز در کنار پروتئین های خود بیان می کنند، نسبت به نمونه ی کنترل مثبت افزایش یافته است. با توجه به تصویر مشاهده می شود که بیان پری پلاسمی در سویه ی BL21(DE3)pLysS بیشتر از سویه ی ((DE3)BL21 است.

 

 

شکل 3-تصویر کروماتوگرام حاصل از توالی یابی وکتور نوترکیب pET21a(+)::β-NGFدارای پپتید نشانه ی اصلاح شده ی آنزیم آلفا آمیلاز باسیلوسلیکنیفورمیس بومی ایران با استفاده از پرایمر T7 terminator. توالی مربوط به قطعه ی ژن β-NGFدر تصویر مشخص شده است.

در ادامه بمنظور آنالیز کمی و بررسی دقیق تر، نتایج حاصل از دات بلات با استفاده از نرم افزارIMAGE J  مورد بررسی قرار گرفت که نتایج آن در جدول 3 قابل مشاهده است. همانطور که انتظار می رفت آنالیز کمی هم نشان می دهد که بیان پری پلاسمی در سویه هایBL21(DE3)pLysS و BL21(DE3) حامل وکتور نوترکیب pET21a(+)::β-NGFدارای پپتید نشانه ی اصلاح شده ی آنزیم آلفا آمیلاز باسیلوسلیکنیفورمیس بومی ایران بیشتر از نمونه ی کنترل مثبت می باشد. همچنین می توان مشاهده نمود که میزان بیان پری پلاسمی در سویه ی BL21(DE3)pLysS بیشتر از سویه BL21(DE3) است.

 

شکل 4- طرح الکتروفورزی محتوای پروتئینی پری پلاسمی و سیتو پلاسمی بر روی ژل SDS-PAGE 12درصد رنگ آمیزی شده با کوماسی بلو.

 بترتیب M: مارکر وزن مولکولی(10-250KDa)، شماره1: بیان سیتوپلاسمی سویه ی BL21(DE3)دارای وکتور نوترکیب، شماره2: بیان سیتوپلاسمی سویه ی BL21(DE3)pLysS دارای وکتور نوترکیب، شماره3: بیان پری پلاسمی سویه ی BL21(DE3) دارای وکتور نوترکیب، شماره4: بیان پری پلاسمی سویه ی BL21(DE3)pLysS دارای وکتور نوترکیب.

 

 

 

شکل5- طرح دات بلات محتوای پروتئینی پری پلاسمی و سیتوپلاسمی استخراج شده. بترتیب1- بیان سیتو پلاسمی کنترل مثبت، 2- بیان سیتوپلاسمی BL21(DE3)حاوی وکتور نوترکیب، 3- بیان سیتوپلاسمی سویه ی BL21(DE3)pLysS حاوی وکتور نوترکیب، 4- بیان سیتوپلاسمی سویه ی BL21(DE3) بدون وکتور، 5- بیان پری پلاسمی کنترل مثبت ، 6- بیان پری پلاسمی سویه ی BL21(DE3)حاوی وکتور نوترکیب، 7- بیان پری پلاسمی سویه ی BL21(DE3)pLysS حاوی وکتور نوترکیب، 8- بیان پری پلاسمی سویه ی BL21(DE3) بدون وکتور.

 

جدول 3- داده های کمی حاصل از آنالیز نتایج دات بلات با استفاده از نرم افزار IMAGE J

نمونه

درصد تولید پروتئین(%)

بیان سیتوپلاسمی کنترل مثبت

756/48

بیان سیتوپلاسمی سویه BL21(DE3)

حامل وکتور نوترکیب

943/33

بیان سیتوپلاسمی سویه BL21(DE3)pLysS حامل وکتور نوترکیب

301/17

بیان پری پلاسمی کنترل مثبت

557/15

بیان پری پلاسمی سویهBL21(DE3) حامل وکتور نوترکیب

525/38

بیان پری پلاسمی سویه BL21(DE3)pLysS حامل وکتور نوترکیب

918/45

 

تخلیص پروتئینβ-NGFبیان شده بصورت پری پلاسمی توسط سویه ی BL21(DE3)pLysS و بررسی صحت آن با استفاده از ژل SDS-PAGE و روش وسترن بلات : پس از اینکه مشاهده گردید بیان پری پلاسمی در سویه ی BL21(DE3)pLysS بیشتر از سویه BL21(DE3) و نمونه کنترل مثبت است، پروتئینβ-NGF بیان شده بصورت پری پلاسمی توسط این سویه با استفاده از ستون کروماتوگرافی تمایلی Ni+2-NTA (IMAC) تخلیص شد. سپس پروتئین مورد نظر بر روی ژل SDS-PAGE الکتروفورز شد و همانطور که در شکل 6 (A) قابل مشاهده است تک باند مربوط به پروتئین β-NGF در ناحیه ی 14 کیلو دالتون قابل مشاهده می باشد که نشان دهنده تخلیص موفقیت آمیز پروتئین مورد نظر است.

بمنظور اطمینان بیشتر از صحت تخلیص پروتئین از روش وسترن بلات استفاده گردید. همانطور که در شکل 6 (B) دیده میشود تک باند مربوط به پروتئین β-NGF در ناحیه ی مورد نظر قابل مشاهده است و میان کنش آن با آنتی بادی ضد His-tag نشان دهنده صحت ساختار پروتئین NGF خالص شده است.

بحث

نوروتروفین ها که شامل فاکتور رشد عصبی، فاکتور نوتروفیک مشتق شده از مغز (BDNF) ، NT-3 و NT-4 می باشند به طور گسترده ای در سیستم عصبی بیان می شوند و به خوبی شناخته شده اند. نوروتروفین ها برای رشد و حفاظت سیستم عصبی مرکزی و محیطی ضروری می‍باشند(22). فاکتور رشد عصبیNGF ، اولین عضو شناخته شده ی خانواده ی نوروتروفین ها است که در بقا و رشد نورون های حسی و همچنین در حفظ و نگهداری نورون های سیستم عصبی مرکزی نقش دارد(24).

 

شکل6- طرح الکتروفورزی بر روی ژلSDS-PAGE 12درصد (A) وسترن بلات (B) پروتئین β-NGF تخلیص شده با استفاده از ستون IMAC استخراج شده از سویه ی BL21 (DE3) pLysS.M  مارکر وزن مولکولی (10-250KDa) می باشد.

از پروتئین NGFدر درمان بیماری هایی مانند آلزایمر، پارکینسون و بیماری های خود ایمن مانند مالتی پل اسکلروزیس استفاده می شود. از دیگر فعالیت های این پروتئین می توان به درمان بیماری های مربوط به قرنیه ی چشم اشاره کرد(5و15و20).

با توجه به کاربردهای فروانی که در رابطه با NGF مطرح شد این پروتئین مود توجه قرار گرفته است. غدد بزاقی موش نر به عنوان منبع طبیعی فاکتور رشد عصبی، مخلوط هتروژنی از دایمرهای نسبتا تخریب شده است و به همین دلیل برای اهداف درمانی مناسب نمی باشد. به علاوه ایمنی زایی، دشواری، گرانی و زمان بر بودن تخلیص این پروتئین از دیگر مشکلات استفاده از منابع طبیعی محسوب می شود؛ به همین دلیل تولید نوترکیب آن حائز اهمیت است.

 در سال 1989 بمنظور مطالعه ی نقش NGF در بهبود بیماری های تخریب عصبی انسانی، اگزون چهار ژن NGFانسانی در سلول های COS به صورت نوترکیب بیان شد(9). پس از آن در سال 1990 ژن NGF انسانی در سلول های CHO بیان و سپس فعالیت بیولوژیکی آن بر روی تمایز سلول های PC12 به سلول های عصبی نسبت به فعالیت NGF موش سنجیده شد(17). علاوه بر این در همین سال به کمک وکتور باکلو ویروس این پروتئین به صورت Pre-Pro-β-NGF در سلول های حشرات بیان و سپس تاثیر آن در درمان بیماری آلزایمر تایید شد(6). در سال 1992 تحقیقات بیشتری بر روی بیان نوترکیب این پروتئین انجام شد به طوریکه بر روی بیان rhNGF به صورت اینکلوژن بادی در CHO و E. coliچندین بررسی صورت گرفت( 11و14و29). در سال 1993 با روش کشت غیر مداوم خوراک دهی شده (Fed-Batch Culture) تراکم سلول های حشره در کشت سوسپانسیون افزایش داده شد و متعاقب آن میزان تولید hNGF افزایش یافت(25). در ادامه ی تحقیقات انجام شده در سال 1993،NGF انسان و موش در مخمر ساکارومایسزسرویزیه بیان و با استفاده از توالی راهنمای فاکتور آلفا به سوپرناتانت محیط کشت ترشح شدند. سپس تاثیر این پروتئین های نوترکیب تولید شده بر روی گیرنده های NGF مربوط به سلول های PC12 موش مورد بررسی قرار گرفت(26). در سال 1997 بیان hNGF با استفاده از وکتور pET11c در E. coliا فزایش داده شد(32). در سال 2001 نشان داده شد که بیان بالای پروتئین های DsbCD که وظیفه ی کاتالیز و ایزومریزاسیون پیوندهای دی سولفیدی را دارند، به طور قابل توجهی تولید rhNGF را در فضای اکسید کننده ی پری پلاسم بهبود می بخشد. بدین منظور از دو نوع وکتور بیانی سازگار با هم که یکی دارای ژن Dsb و دیگری حامل ژن NGF بهمراه پپتید نشانه OmpT بود استفاده شد و پس از بیان تاثیر پروتئین تولید شده بر روی سلول های PC12 موش مورد بررسی قرار گرفت. همچنین در همین سال یک گروه تحقیقاتی بمنظور افزایش بازده و سرعت دوباره تا خوردن اینکلوژن بادی ها جهت تشکیل صحیح پیوندهای دی سولفیدی، rh-pro-NGF را در سیتوپلاسم E.coliبیان کردند(17و27). از آنجائیکه دمای پایین برای بیان و ترشح محصول به فضای پری پلاسمی میزبان، سبب تسهیل تاخوردگی صحیح پروتئینهای سخت مانند rhNGF با سه پیوند دی سولفیدی میشود ایلینا ویننتینی و همکارانش در سال 2006 با استفاده از میزبان سرما دوست Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125، rhNGF را در دمای چهار درجه سانتی گراد بیان کردند(30). در نهایت در سال 2010 rhNGF در سلولهای بنیادی مزانشیمی مغز استخوان خرگوش (rMSCs) بیان و مشاهد گردید که فعالیت بیولوژیکی این پروتئین روی سلولهای PC12  و سلولهای عصبی جنین جوجه مانند rhNGF تجاری، کامل بود(13).

از آنجاییکه پیوندهای دی سولفیدی در محیط احیا کننده ی سیتوپلاسم E. coliتشکیل نمی شوند، سنتز پروتئین هایی نظیر β-NGF  که دارای سه پیوند دی سولفیدی در ساختمان خود هستند منجر به شکل گیری اینکلوژن بادی وتشکیل رسوبات درون سلولی می شود. در چنین وضعیتی پروتئین های تولید شده پس از بیان می بایست رناتوره شوند که این فرآیند بسیار زمان بر است و بازده پایینی دارد. به دلیل این مشکلات هدایت پروتئین به سمت فضای پری پلاسمی می تواند یک رویکرد مفید باشد. از سوی دیگر در بیشتر موارد، هدایت پروتئین به سمت فضای پری پلاسمی یا محیط کشت فرآیندهای پایین دستی و تاخوردگی پروتئین را تسهیل می کند، پایداری پروتئین در شرایط  زنده (in vivo) را افزایش می دهد و منجر می شود که طی یک فرآیند مقرون به صرفه پروتئین های فعال و محلول تولید گردد. علاوه بر این بیان ترشحی سبب می شود پپتید هایی با N-ترمینال صحیح ایجاد گردد و از اضافه شدن متیونین به پروتئین هایی که فرم بالغ آنها با متیونین شروع نمی شود جلوگیری می کند. بنابراین در این تحقیق برای هدایت پروتئین β-NGF به سمت پری پلاسم از پپتید نشانه ی اصلاح شده ی آنزیم آلفا آمیلاز باسیلوس لیکنیفورمیس بومی ایران استفاده شد.

در بررسی نتایج حاصل از تست دات بلات مربوط به پروئین های بیان شده ی سیتو پلاسمی و پری پلاسمی مشاهده گردید که بیان پری پلاسمی در سویه های BL21(DE3) و pLysS حامل وکتور نوترکیب دارای پپتید نشانه ی اصلاح شده ی آنزیم آلفا آمیلاز باسیلوسلیکنیفورمیس بومی ایران بیشتر از سویه ی کنترل مثبت حاوی پپتید نشانه و کل ناحیه ی کد کننده ی ژن DsbA  است اما بیان سیتوپلاسمی به طور قابل توجهی کاهش یافته است. بخشی از این کاهش در بیان سیتوپلاسمی با توجه به افزایش بیان پری پلاسمی قابل توجیح است. از سوی دیگر باتوجه به لکه های ایجاد شده بیان پری پلاسمی در سویه ی pLysS بیشتر از سویه ی BL21(DE3) است که احتمالا یکی از دلایل این تفاوت سمیت پروتئین تولیدی برای باکتری میزبان  می باشد چرا که در سویه ی BL21(DE3)  درحالت بدون القا  بیان نشتی وجود دارد. بمنظور بررسی کمی میزان پروتئین بیان شده در سویه های مختلف، داده های حاصل از تست دات بلات با استفاده از نرم افزارIMAGE J مورد بررسی قرار گرفت. آنالیزها نشان می داد که بیان پروتئین با استفاده از سویه های حامل وکتور نوترکیب دارای پپتید نشانه ی اصلاح شده ی  آنزیم آلفا آمیلاز باسیلوسلیکنیفورمیس بومی ایران به میزان قابل توجهی بیشتر از نمونه ی کنترل مثبت می باشد. همچنین داده های کمی نشان می داد که بیان پری پلاسمی در سویه BL21(DE3)plysS  حاوی وکتور نوترکیب دارای پپتید نشانه ی اصلاح شده ی آنزیم آلفا آمیلاز باسیلوسلیکنیفورمیس بومی ایران بیشتر از سویه ی BL21(DE3) دارای همین وکتور است. در مرحله ی بعد نمونه های پری پلاسمی سویه یpLysS  با استفاده از ستون IMAC تخلیص شدند و پس از دیالیز بر روی ژل SDS-PAGE الکتروفورز شدند و باند مربوط به پروتئین مورد نظر در ناحیه ی 17 کیلودالتون مشاهده گردید. در ادامه بمنظور تایید نهایی از روش وسترن بلات استفاده شد و باند مورد نظر مشاهده گردید.

در مجموع با توجه به داده های به دست آمده می توان نتیجه گرفت که استفاده از پپتید نشانه ی اصلاح شده ی آنزیم آلفا آمیلاز باسیلوسلیکنیفورمیس بومی ایران بیان پری پلاسمی را نسبت به سویه ی کنترل مثبت حاوی پپتید نشانه و کل ناحیه ی کد کننده ی ژن Dsb A  به میزان بیشتری افزایش می دهد و به عبارتی پپتید نشانه بهتری برای بیان پری پلاسمی پروتئین β-NGF می باشد. همچنین با توجه به بررسی های مقایسه ای که انجام شد می توان نتیجه گرفت سویه یBL21(DE3)plysS  نسبت به سویه BL21(DE3)  میزبان بهتری برای بیان پروتئین β-NGF با استفاده از پپتید نشانه ی مذکور است.

همانطور که در نتایج مربوط به دات بلات دیده می شود کل پروتئین تولید شده به پری پلاسم هدایت نشده است. درواقع باید توجه داشت که ترشح پروتئین در E. coliیک فرآیند پیچیده است و تلاش برای ترشح پروتئین های نوترکیب می تواند با چندین مشکل مواجه باشد. مهم ترین این مشکلات انتقال ناقص در عرض غشا داخلی، ظرفیت ناکافی ماشین انتقال پروتئین و تخریب پروتئولیتیک است. چندین فاکتور ترشح یک پروتئین نوترکیب در E. coliرا تحت تاثیر قرار می دهند.  ترکیب آمینو اسیدی پپتید نشانه و پروتئین هدف یکی از فاکتورهای تاثیر گذار است. برای دست یابی به بیان بالای پروتئین های هترولوگوس یک سرعت بهینه ی ترجمه وجود دارد. ترشح ممکن است در سرعت های بالاتر به شدت کاهش یابد که این تاثیر احتمالا نتیجه ای از ظرفیت ترشحی محدود ماشین انتقالی مربوط به E. coliاست. زمانیکه این ظرفیت پر می شود احتمالا باقی مانده ی پروتئین های نوترکیب به فرم اینکلوژن بادی تجمع می یابد. بنابراین یک راه حل برای بهینه سازی سطح بیان ایجاد توازن در قدرت پروموتر و تعداد کپی های ژن است. در هر حال در بررسی های انجام شده بمنظور ترشح پروتئین ها با استفاده از پپتیدهای نشانه نباید انتظار داشت که پروتئین هدف 100 درصد به پری پلاسم منتقل شود.

تشکر و قدردانی

تحقیق حاضر با حمایت مالی دانشگاه تهران تحت شماره گرنت 01/06/30096 به دکتر ناصر انصاری پور انجام شده است. نویسندگان از ستاد توسعه علوم و فناوری های سلول‌ بنیادی به خاطر حمایت مالی که تحت شماره طرح 25802/11 به دکتر زهرا حاجی حسن انجام ‌شده است تشکر می کنند.

1-حاجی حسن، ز.، حسینی، س.، زمردی پور، ع.1395. بهینه سازی رمزه و مقایسه ی بیان فاکتور رشد اکتیوین A در میزبان های  باکتریایی BL21(DE3)،BL21(DE3)pLysS و BL21(DE3)Rosettagami. مجله زیست فناوری دانشگاه تربیت مدرس.(2)7، 71-61.

2-شجاع،ز.،رجبی معماری،ح.،رعایایی اردکانی، م.1394. جداسازی، همسانه سازی و بیان ژن زیرواحد آلفا فیکوسیانین در سیستم  بیانی اشرشیا کلی.مجله پژوهش های سلولی و مولکولی(مجله زیست شناسی ایران).(3)28، 359-352.

3-مرتضوی،م.،امین زاده،س.،قنبری،ع.،فرخی،ن.،کارخانه،ع.،جواهری صفا،ز.1396.تولید باکتریایی پروتین نوترکیب کیتیناز از باکتری ترموفیل Paenibacillus sp A01. مجله پژوهش های سلولی و مولکولی(مجله زیست شناسی ایران).(2)30، 359-352.

 

4- Aloe, L., Rocco, M.L., Bianchi, P., Manni, L., 2012. Nerve growth factor: from the early discoveries to the potential clinical use. Journal of translational medicine 10, 239.

5 - Althaus, H.H., 2004. Remyelination in multiple sclerosis: a new role for neurotrophins? Progress in brain research 146, 415-432.

6 - Barnett, J., Baecker, P., Routledge-Ward, C., Bursztyn-Pettegrew, H., Chow, J., Nguyen, B., Bach, C., Chan, H., Tuszynski, M.H., Yoshida, K., 1990. Human β nerve growth factor obtained from a baculovirus expression system has potent in vitro and in vivo neurotrophic activity. Experimental neurology 110, 11-24.

7 - Bax, B., Ferguson, G., Blaber, M., Sternberg, M.J., Walls, P.H., 1993. Prediction of the three‐dimensional structures of the nerve growth factor and epidermal growth factor binding proteins (kallikreins) and an hypothetical structure of the high molecular weight complex of epidermal growth factor with its binding protein. Protein Science 2, 1229-1241.

8 - Brondyk, W.H., 2009. Selecting an appropriate method for expressing a recombinant protein, Methods in enzymology. Elsevier, pp. 131-147.

9 - Bruce, G., Heinrich, G., 1989. Production and characterization of biologically active recombinant human nerve growth factor. Neurobiology of aging 10, 89-94.

10 - Demaio, A., 1996. Protein blotting and immunoblotting using nitrocellulose membranes. Protein blotting. Oxford University Press, Oxford, 11-32.

11 - Dicou, E., 1992. Expression of recombinant human nerve growth factor in Escherichia coli. Neurochemistry international 20, 129-134.

12 - Fahnestock, M., 1991. Structure and biosynthesis of nerve growth factor, Neuronal Growth Factors. Springer, pp. 1-26.

13 - Fan, B.-S., Lou, J.-Y., 2010. Recombinant expression of human nerve growth factor beta in rabbit bone marrow mesenchymal stem cells. Molecular biology reports 37, 4083-4090.

14 - Fujimori, K., Fukuzono, S., Kotomura, N., Kuno, N., Shimizu, N., 1992. Overproduction of biologically-active human nerve growth factor in Escherichia coli. Bioscience, biotechnology, and biochemistry 56, 1985-1990.

15 - Heese, K., Low, J.W., Inoue, N., 2006. Nerve growth factor, neural stem cells and Alzheimer’s disease. Neurosignals 15, 1-12.

16 - Ibáñez, C.F., 1998. Emerging themes in structural biology of neurotrophic factors. Trends in neurosciences 21, 438-444.

17 - Iwane, M., Kitamura, Y., Kaisho, Y., Yoshimura, K., Shintani, A., Sasada, R., Nakagawa, S., Kawahara, K., Nakahama, K., Kakinuma, A., 1990. Production, purification and characterization of biologically active recombinant human nerve growth factor. Biochemical and biophysical research communications 171, 116-122.

18 - Kurokawa, Y., Yanagi, H., Yura, T., 2001. Overproduction of bacterial protein disulfide isomerase (DsbC) and its modulator (DsbD) markedly enhances periplasmic production of human nerve growth factor in Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry 276, 14393-14399.

19 - Laemmli, U.K., 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. nature 227, 680.

20 - Lambiase, A., Sacchetti, M., Bonini, S., 2012. Nerve growth factor therapy for corneal disease. Current opinion in ophthalmology 23, 296-302.

21 - Levi-Montalcini, R., 1987. The nerve growth factor 35 years later. Science 237, 1154-1162.

22 - Ma, W., Wang, C., Su, Y., Tian, Y., Zhu, H., 2015. Expression of nerve growth factor and its receptor, tyrosine kinase receptor A, in rooster testes. Animal reproduction science 161, 40-46.

23 - McDonald, N.Q., Lapatto, R., Rust, J.M., Gunning, J., Wlodawer, A., Blundell, T.L., 1991. New protein fold revealed by a 2.3-Å resolution crystal structure of nerve growth factor. Nature 354, 411.

24 - Meakin, S.O., Shooter, E.M., 1992. The nerve growth factor family of receptors. Trends in neurosciences 15, 323-331.

25 - Nguyen, B., Jarnagin, K., Williams, S., Chan, H., Barnett, J., 1993. Fed-batch culture of insect cells: a method to increase the yield of recombinant human nerve growth factor (rhNGF) in the baculovirus expression system. Journal of biotechnology 31, 205-217.

26 - Nishizawa, M., Ozawa, F., Higashizaki, T., Hirai, K., Hishinuma, F., 1993. Biologically active human and mouse nerve growth factors secreted by the yeast Saccharomyces cerevisiae. Applied microbiology and biotechnology 38, 624-630.

27 - Rattenholl, A., Lilie, H., Grossmann, A., Stern, A., Schwarz, E., Rudolph, R., 2001. The pro‐sequence facilitates folding of human nerve growth factor from Escherichia coli inclusion bodies. The FEBS Journal 268, 3296-3303.

28 - Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., 1989. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold spring harbor laboratory press.

29 - Schmelzer, C.H., Burton, L.E., Chan, W.P., Martin, E., Gorman, C., Canova‐Davis, E., Ling, V.T., Sliwkowski, M.B., McCray, G., Briggs, J.A., 1992. Biochemical characterization of recombinant human nerve growth factor. Journal of neurochemistry 59, 1675-1683.

30 - Vigentini, I., Merico, A., Tutino, M.L., Compagno, C., Marino, G., 2006. Optimization of recombinant human nerve growth factor production in the psychrophilic Pseudoalteromonas haloplanktis. Journal of biotechnology 127, 141-150.

31- Wiesmann, C., De Vos, A., 2001. Nerve growth factor: structure and function. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS 58, 748-759.

32 - Zhang, J., Zhang, L., Zhang, X., Chai, J., Li, C., 1997. The high expression of human beta-nerve growth factor in E. coli. Wei sheng wu xue bao= Acta microbiologica Sinica 37, 429-433.