شناسایی و مقدار سنجی نسبی تغییرات پروتئوم مبتنی بر اشک متاٌثر از بیماری قوز قرنیه

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 بیوشیمی،علوم زیستی،تربیت مدرس،تهران،ایران

2 دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله(عج)، تهران، ایران

3 گروه بیوتکنولوژی پزشکی، انستیتو پاستور ایران، تهران، ایران

4 گروه بیوشیمی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران

چکیده

قوز قرنیه حالتی نامتقارن از نازک شدن قرنیه است که بطور معمول در سنین نوجوانی بروز کرده و میزان شیوع آن حدود 1 نفر در هر 2000 نفر از جمعیت انسانی می‌باشد. به منظور آشکارسازی تغییرات فراوانی پروتئین‌های نمونه‌ی اشک میان دو گروه بیمار و شاهد، مقدارسنجی پپتیدهای حاصل از هضم پروتئولیتیکی پروتئین‌ها، بدون نشاندار کردن آنها با استفاده از استراتژی الکتروفورز ژلی یک بعدی و کروماتوگرافی مایع-طیف سنجی جرمی متوالی انجام شد. نتایج حاصل از آنالیز آماری نشان داد که از میان 42 پروتئینی که بیان آنها بطور متمایزی متاٌثر از قوز قرنیه تغییر کرده بود، به ترتیب 28 و 14 پروتئین کاهش و افزایش سطح بیان نشان دادند. بر اساس نتایج حاصل شده از آنالیزهای بیوانفورماتیکی مانند آنالیز هسته شناسی ژنی فرآیندهای زیستی که بطور عمده‌ای در اثر تغییرات سطح بیان این زیر مجموعه از پروتئین‌ها در آسیب شناسی بیماری درگیر می‌شوند شامل: فرآیندهای سلولی ( % 1/27)، فرآیندهای متابولیکی (% 2/20)، تنظیم زیستی (% 6/11)، سازماندهی اجزای سلولی (%3/9) و پاسخ به محرک‌ها (%3/9) هستند. همچنین آنالیز هسته شناسی ژنی مرتبط با موقعیت مکانی زیر مجموعه‌ی پروتئینی مذکور حاکی از اختصاص گروه عمده ای از این پروتئین‌ها به فضای داخل سلولی می‌باشد. این قبیل مطالعات پروتئومیک می‌توانند به منظور ارتقای دانش پایه‌ی ما از فرآیندهای زیستی و درک عمیق‌تر مکانیسم‌های زمینه‌ساز بیماری‌ها و نیز در حیطه‌ی تحقیقات بالینی در راستای شناسایی نشانگرهای زیستی بالقوه‌ی بیماری و اهداف دارویی بسیار مفید واقع شوند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Identification and relative quantification of differential tear-based proteome alterations affected by Keratoconus.

نویسندگان [English]

  • Soodabeh Shafiee 1
  • khosro Jadidi 2
  • Behrouz vaziri 3
  • khosro khajeh 4

1 Biochemistry,Biological Sciences,Tarbiat Modares University,Tehran,Iran

2 Baqiyatallah University of Medical Sciences, Tehran,Iran

3 Medical Biotechnology, Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran

4 Biochemistry, biological sciences, tarbiat modares university, tehran, Iran

چکیده [English]

Keratoconus is an asymmetric condition of corneal thinning that typically occurs in early adulthood and has an estimated prevalence of about 1/2,000 human population. Aimed at revealing alterations in the abundances of tear proteins between two groups of patients and controls, measurements of peptides derived from proteolytic digestion of proteins was performed using one-dimensional gel electrophoresis and liquid chromatography-tandem mass spectrometry strategy. The results of statistical analysis showed that 42 proteins represented differential expression, of those 28 and 14 proteins indicated decreament and increament in their levels of expression, respectively. Based on the bioinformatics analyses of the differentially expressed tear proteins like gene ontology biological processes, the most affected underlying processes include: cellular processes (27.1%), metabolic processes (20/2%), biological regulation (11/6%), cellular compartment organization (9/3%) and response to stimuli (9/3%). Moreover, gene ontology analysis associated with the cellular localization of this protein subset indicated that a large number of these proteins belonge to the intracellular space. Such proteomic studies can enhance our basic knowledge of biological processes and give rise to a deeper understanding of the disease underlying mechanisms as well as in clinical research to identify potential biomarkers for disease and as drug targets.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Proteomics
  • Keratoconus
  • LC-MS/MS
  • Gene ontology

شناسایی و مقدار سنجی نسبی تغییرات پروتئوم مبتنی بر اشک متأثر از بیماری قوز قرنیه

سودابه شفیعی1، خسرو جدیدی2* و خسرو خواجه1*

1 ایران، تهران، دانشگاه تربیت مدرس، گروه بیوشیمی

2 ایران، تهران، دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله(عج)، گروه چشم پزشکی

تاریخ دریافت: 31/5/1397            تاریخ پذیرش: 22/7/1397

چکیده

قوز قرنیه حالتی نامتقارن از نازک شدن پیشروندۀ قرنیه است که به طور معمول در اوایل نوجوانی بروز می­کند و میزان تخمینی شیوع آن حدود 1 نفر در هر 2000 نفر از جمعیت انسانی است. برای آشکارسازی تغییرات فراوانی پروتئینهای نمونۀ اشک میان دو گروه بیمار و شاهد، مقدارسنجی پپتیدهای حاصل از هضم پروتئولیتیکی پروتئینها، بدون نشاندار کردن آنها و با استفاده از استراتژی الکتروفورز ژلی یک بعدی و کروماتوگرافی مایع-طیف­سنجی جرمی متوالی، انجام شد. نتایج آنالیز آماری برای یافتن پروتئینهای با بیان متفاوت نشان داد که به ترتیب 28 و 14 پروتئین کاهش و افزایش سطح بیان داشتند. بر اساس نتایج حاصل از آنالیز هسته­شناسی ژنی، فرآیندهای زیستی که عمدتاً در اثر تغییرات سطح بیان زیر مجموعۀ پروتئینی فوق الذکر در آسیب شناسی بیماری درگیر می­شوند؛ شامل: فرآیندهای سلولی (1/27 درصد)، فرآیندهای متابولیکی (2/20 درصد)، تنظیم زیستی (6/11 درصد)، سازماندهی اجزای سلولی (3/9 درصد) و پاسخ به محرک­ها (3/9 درصد) می­باشند. علاوه بر این، آنالیز هسته­شناسی ژنی مرتبط با جایگاه سلولی این پروتئینها حاکی از این است که گروه عمده­ای از آنها به فضای درون سلولی تعلق دارند. این قبیل مطالعات پروتئومیک، می­توانند به ارتقای دانش پایۀ ما در حوزۀ فرآیندهای زیستی کمک کرده و درکی عمیق­تر از مکانیسمهای زمینه­ساز بیماریها بدهند.

واژه­های کلیدی: پروتئومیک، قوز قرنیه، کروماتوگرافی مایع- طیف سنجی جرمی، هسته شناسی ژنی

* نویسنده مسئول، تلفن:02182884717، پست الکترونیکی: khajeh@modares.ac.ir

مقدمه

 

ساختار قرنیه چشم عمدتاً شامل آب (78 درصد)، ریزرشته‌‌های منظم کلاژن، پروتئوگلیکان‌ها و سلولهای کراتوسیت‌ می‌باشد و از پنج لایۀ اپی‌تلیوم، بومن (Bowman’s layer)، استروما (90 درصد)، غشای دسمه (Descemet’s membrane) و اندوتلیوم تشکیل شده‌است (4). تاکنون چندین نوع از اختلالات مرتبط با قرنیه مانند خراشیدگی، زوال، زخم، نورگ‌زایی، کراتیت و کراتوکونوس شناسایی شده­اند (23).

کراتوکونوس (قوز قرنیه) که تقریباً از اواسط قرن نوزدهم شناخته شده، عبارت است از اکتازی (Ectasia) غیرالتهابی که تحلیل برند‌ۀ قرنیه چشم است. در این بیماری، اختلال در ساختار یا ترکیب قرنیه منجر به تضعیف و نازک شدن آن می­شود و در نهایت تحت تأثیر فشار داخلی چشم، قرنیۀ ضعیف شده تغییر انحنا داده، برآمده شده و به یک حالت مخروطی تبدیل می‌گردد (4،33 و 35). میزان شیوع این بیماری، در نقاط مختلف دنیا متغیّر است. مطابق با گزارش ارائه شده توسط مؤسسۀ ملی چشم (National Eye Institute (NEI))، این اختلال شایع‌ترین علت زوال قرنیه درایالات متحده بوده و علائم بیماری از میان هر 2000 نفر، حدوداً در یک نفر ظاهر می­شود. اما در گزارشهای دیگر که میزان شیوع بالاتربوده، در هر 500 نفر، یک نفر از جمعیت مذکور علائم بیماری را داشته­است (8 و 18). جدای از آن، تحقیقات مختلفی در ارتباط با اپیدمیولوژی (Epidemiology) بیماری قوز قرنیه در ایران انجام شده‌است. گزارش­های ارائه شده از شهر‌های یزد، تهران، مشهد و شاهرود، میزان بالای شیوع این بیماری را نشان می­دهند؛ به نحوی که متأسفانه این میزان بسیار بیشتر از آمار جهانی بوده­است (49). این موضوع، مطالعه در حوزۀ این بیماری در کشور را امری بایسته و شایان توجه کرده­است.

به دلیل ارتباط نزدیک اشک با وضعیّت آسیب­شناختی فیزیولوژیک بسیاری از بیماریهای سطح چشم، تغییرات ناشی از وقایع تأثیرگذار، در ترکیب اجزای تشکیل دهندۀ لایه‌های مختلف اشک منعکس می‌شوند. بنابراین، مطالعۀ مقایسه­ای این تغییرات در افراد مبتلا به قوز قرنیه نسبت به افراد سالم یکی از زمینه‌های تحقیقاتی بوده‌ که در سالهای اخیر بسیار مورد توجه قرار گرفته­است (25 و 46). انواعی از استراتژیهای متعدد پروتئومیکی درجهت شناسایی ترکیب پروتئینی اشک و به دنبال آن تعیین نشانگرهای پروتئینی برای بیماریهای چشمی توسعه یافته­اند. این رویکردها در شناخت نحوة تنظیم عملکردهای سلولی از طریق سیگنال­دهی و پاسخ به محرکها یا تنشهای خاص، درک فرآیندهای سلولی مانند تکثیر، آپوپتوز، تحرک و تمایز و همچنین تغییرات پروتئینی مرتبط با حالت بیمار در مقابل وضعیّت نرمال اهمیت ویژه­ای دارند (13، 30 و 45). در سالهای اخیر نیز، برای مقایسه پروتئینهای اشک بین افراد مبتلا به قوز قرنیه و افراد نرمال از روشهای مختلف پروتئومیکی استفاده شده­است و تفاوت در شناسایی تعداد کلی پروتئینها و زیرمجموعه­های پروتئینی تمایزی به روشهای جمع­آوری نمونه اشک و رویکرد­های مورد استفاده برای تجزیه و تحلیل نمونه­ها مرتبط است (24). در این پژوهش با به کارگیری یکی از تکنیکهای توانمند مبتنی بر طیف­سنجی جرمی، تلاش شد تا مطالعه پروتئوم اشک به صورت جامع­تری مورد بررسی قرار بگیرد، با این هدف که امکان شناسایی پروتئینهای جدیدی که سهمی در آسیب­شناسی بیماری داشته باشند؛ افزایش یابد. برای نیل به این هدف، پروتئوم اشک بدون استفاده از روشهای نشاندار کردن رایج پروتئینها که نیازمند صرف هزینه­های بالا و زمان­پردازش طولانی هستند؛ با بهره­گیری از تکنیک ژل الکتروفورز یک بعدی و کروماتوگرافی مایع-طیف­سنجی جرمی متوالی ارزیابی و با شناسایی و مقدار سنجی پروتئوم، تفاوتهای آماری معنی‌دار در سطح بیان پروتئینهای شاهد و بیمار تعیین شد. با بررسیهای انجام شده به نظر می­رسد این پژوهش اولین مطالعه­ در خصوص نمونه­ اشک بیماران مبتلا به قوز قرنیه است که با استفاده از تکنیک ژل الکتروفورز یک بعدی و کروماتوگرافی مایع-طیف­سنجی جرمی متوالی (1D-SDS PAGE & LC-MS/MS) بر روی نمونه­های بومی انجام می­شود.

مواد و روشها

جمعیت مورد مطالعه و ارزیابی بالینی بیماران. این پژوهش همسو با موازین اخلاقی بیانیه هلسینکی سال 1964 انجام شد. تمام روشهای آزمایشی پس از بررسی و تأیید کمیته اخلاق تحقیقاتی دانشگاه تربیت مدرس اجرا شدند. پس از شفاف سازی تمام جنبه­های تحقیق، امضای فرم رضایت­نامه آگاهانه از همه داوطلبان شرکت کننده اخذ شد. معیارهای ورود به مطالعه شامل: الف) بیماران مبتلا به قوز قرنیه. ب) افراد سالم با نقشه‌های توپوگرافی (Topography) طبیعی قرنیه. معیارهای خروج از مطالعه شامل: 1) مداخلۀ قبلی جراحی در بخش قدامی چشم، بیماری یا آسیب به قرنیه در دوران کودکی. 2) وجود التهاب فعال و یا سیستمی، بیماری چشمی، درمان با داروهای ضد التهاب سیستمی یا موضعی. 3) شرایطی که بر روی ترکیب اشک تأثیر بگذارد مانند استفاده از لنزهای تماسی. 4) بیماری سیستمی. 5) سابقه آسیبهای شیمیایی و یا تأخیر در بهبود اپی­تلیوم. 7) بارداری یا شیردهی در طول مطالعه برای بیماران زن، بودند. در مجموع تعداد 52 نفر برای انجام تستهای کلینیکی در این تحقیق شرکت کردند که در نهایت با در نظر گرفتن معیارهای ورود و خروج از مطالعه، 14 نفر(9 بیمار و 5 سالم) برای جمع­آوری نمونۀ اشک انتخاب شدند. قابل ذکر است که افراد تشکیل دهنده‌ گروه بیمار در این پژوهش درجه یکسانی از شدت بیماری را داشتند.

نمونه­گیری و مراحل پردازش نمونه­ اشک: تست شیرمر 1 (Optitech Eye Care, Allahabad, India) بدون استفاده از قطره­ بیحسی موضعی برای جمع­آوری نمونه­های اشک افراد داوطلب مورد استفاده قرار گرفت. با قرار دادن یک نوار کاغذی استریل در پلک پایین نمونه­گیری انجام شد در حالی که تلاش شد از تحریک ترشح اشک رفلکسی جلوگیری شود (19). نوارهای حاوی اشک بلافاصله منجمد شده و تا پردازش بعدی در دمای 80- درجه سانتی گراد نگهداری شدند. به­طور خلاصه، استخراج پروتئوم اشک با اضافه کردن 150 میکرولیتر از محلول بیکربنات آمونیوم 100 میلی مولار، 1 میکرولیتر مخلوط کوکتل مهار کننده پروتئازی (با غلظت X100- بدون EDTA) (Thermo Scientific™ Pierce, Rockford, IL) و 1 میکرولیتر از محلول EDTA (100 میلی مولار با 8 pH=) انجام شد. سپس پروتئینها با افزودن 4 حجم از استون 80 درصد و انکوباسیون شبانه در دمای 20- درجه رسوب داده شدند. در انتها به رسوب پروتئینی 30-20 میکرولیتر از بافر انحلال نمونه (حاوی غلظت X1 سدیم دودسیل سولفات و 50 میلی مولار احیاگر DTT) اضافه و در دمای 60 درجه سانتی گراد به مدت 10 دقیقه حرارت داده شد. در ادامه غلظت پروتئین کل در هر یک از نمونه­ها با استفاده از روش برادفورد (Thermo Scientific™ Pierce, Rockford, IL) تخمین زده شد(فاکتور رقت= 5/62).

جداسازی و جزء به جزء کردن بعدی پروتئینها با تکنیک الکتروفورز یک بعدی: میزان 90 میکروگرم از نمونه­ پروتئین اشک با بارگزاری بر روی ژل الکتروفورز 12 درصد، در شرایط دناتوره و احیایی با اعمال ولتاژ ثابت 80 ولت برای ژل استاکینگ و 200 ولت برای ژل تفکیک کننده به مدت تقریبی 60 دقیقه جداسازی شدند. باندهای پروتئینی جدا شده بر روی ژل، با استفاده از روش رنگ آمیزی آبی کوماسی کلوئیدی (Colloidal Coomassie Brilliant Blue G-250) آشکار شدند. مطابق با الگوی تفکیک باندهای پروتئینی، هر ژل به 5 قطعه و هر قطعه به تکه­های ریزتر 1 میلی متری بریده شد. در ادامه، تکه­های ژل مربوط به هر قطعه، جهت آماده شدن برای آنالیز با طیف­سنجی جرمی، به­طور جداگانه مورد پردازشهای بعدی قرار گرفتند. به صورت خلاصه، تکه­های ژل با اضافه کردن بیکربنات آمونیوم و اتانول مطلق آبگیری شدند، سپس احیا و آلکیله کردن باندهای دی سولفید به ترتیب با اضافه کردن 10 میلی­مولار DTT و 55 میلی مولار یدواستامید حل شده در بیکربنات آمونیوم 50 میلی­مولار انجام شد. در ادامه، هضم پروتئولیتیکی پروتئینها توسط تیمار با آنزیم تریپسین اصلاح شده (USA ، Madison، Promega) به مدت 19 ساعت در دمای 37 درجه صورت گرفت. در نهایت، پروتئولیز، توسط اسیدی سازی مخلوط واکنش با 100 میکرولیتر از بافر استخراج (1 درصد تری فلوئوریک اسید) متوقف شد. محلول رویی حاوی پپتیدها جمع­آوری و پپتیدهای باقی­مانده در تکه­های ژل با دو بار شستشوی 20 دقیقه ای در بافر استخراج (1:1 استونیتریل و تری فلوئوریک اسید) و یک مرحله نهایی شستشو با استونیتریل خالص بازیابی شدند. محلولهای رویی مربوط به هر مرحله، جمع­آوری گردید و در SpeedVac (Eppendorf, Darmstadt, Germany) خشک و تغلیظ شدند. نمونه­ها تا زمان آنالیز توسط طیف­سنجی جرمی در دمای 20- درجه نگهداری شدند.

پالایش نمونه پپتیدی توسط ستون معکوس اکتادسیل: پپتیدهای استخراج شده بر روی ستونهای فاز معکوسC18  (Macherey-Nagel, Düren, Germany) دست­ساز پالایش شدند. این فرآیند برای هر نمونه سه مرتبه تکرار گردید و محلول به دست آمده از شستشوی ستون در هر مرتبه جمع­آوری و در SpeedVac (Eppendorf, Darmstadt, Germany) تا خشک شدن کامل تغلیظ شد. قبل از آنالیز با کروماتوگرافی مایع-طیف­سنجی جرمی، پپتیدها با اضافه کردن20 میکرولیتر از محلول 1/0 درصد تری فلوئوریک اسید حل شدند.

آنالیز نمونه­های پپتیدی با کروماتوگرافی مایع-طیف­سنجی جرمی. اتخاذ طیف جرمی نمونه­ پپتیدی با بارگزاری 2 میکرولیتر از نمونه­ خالص شده و حلالهای مورد استفاده به عنوان فاز متحرک شامل حلال A ( آب با درجه خلوص کروماتوگرافی مایع-طیف­سنجی جرمی و 1/0 درصد حجمی/حجمی اسید فرمیک) و حلال B ( استونیتریل با درجه خلوص کروماتوگرافی مایع-طیف­سنجی جرمی و 1/0 درصد حجمی/حجمی اسید فرمیک) در دستگاه کروماتوگرافی مایع-طیف­سنجی جرمی متوالی (Bruker Daltonics, Bremen, Germany) صورت گرفت. شیب 60 دقیقه­ای به کار رفته در آنالیز هر نمونه به شرح زیر بود: 5-0 دقیقه: 10 درصد حلال B، 45-5 دقیقه: 45-10 درصد حلال B، 50-45 دقیقه: 90-45 درصد حلال B، 55-50 دقیقه: 90 درصد حلال B، 60-55 دقیقه: 10درصد حلال B.

آنالیز داده­های خام به­دست آمده از طیف­سنجی جرمی متوالی: طیف کروماتوگرام خام به دست آمده، با استفاده از نرم افزار محاسباتی MaxQuant (نسخه 1، 0، 6، 1) و موتور جستجوی پپتیدی آن، آندرومدا (Andromeda) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. به این منظور، الگوریتم شدت سیگنال به دست آمده از مقدارسنجی بدون نشانه گذاری (Label-Free Quantification intensity) پروتئینها، برای شناسایی پپتیدها به کار گرفته شد. جستجوی طیف جرمی متوالی با استفاده از پایگاه داده UniProtKB انسانی (تاریخ انتشار 29/5/2014) و یک فایل حاوی لیستی از آلوده کننده­های شایع نمونه­های پروتئوم انجام شد. تنظیمات پیش­فرض برای جستجو شامل: تغییرات ثابت اسیدهای آمینه مانند کربامیدومتیلاسیون سیستئین و تغییرات غیر ثابت مثل اکسیداسیون متیونین و استیلاسیون پایانه­ N پروتئین، دارا بودن حداقل 6 اسیدآمینه جهت شناسایی پپتیدها، انتخاب آنزیم Trypsin/P، مجاز بودن دو جایگاه برش از دست رفته و اعمال حد آستانه معادل 1 درصد برای نرخ کشف کاذب جهت شناسایی پروتئین و پپتیدها بودند. مقدارسنجی پپتیدها با بهره­گیری از الگوریتم MaxLFQ ادغام شده (Integrated) در نرم افزار MaxQuant انجام شد (48). آنالیزهای آماری و بیوانفورماتیکی برای پروتئینهای شناسایی و مقدار سنجی شده، با کمک نرم افزار Perseus نسخه (1.6.2.1) و ابزارهای آنلاین  PANTHER (Protein ANalysis THrough Evolutionary Relationships) و STRING (Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins) انجام شد.

نتایج

به منظور یافتن تغییرات فراوانی پروتئینهای نمونه اشک در دو گروه بیمار و شاهد، مقدارسنجی پپتیدهای حاصل از هضم پروتئولیتیکی پروتئینها بدون نشاندار کردن آنها، با استفاده از تلفیقی از استراتژیهای الکتروفورز یک بعدی و کروماتوگرافی مایع-طیف­سنجی جرمی متوالی انجام شد.

در این پژوهش تعداد 52 نفر برای انجام ارزیابیهای بالینی فرا خوانده شدند و در نهایت، مجموعاً 14 نفر(9 بیمار و 5 سالم) برای جمع­آوری نمونه اشک انتخاب شدند. از آنجایی که اغلب افراد مراجعه کننده، مرد بودند بنابراین جمعیت مورد مطالعه تنها شامل جنس مذکر می­شود. علاوه بر این افراد دو گروه از محدوده سنی یکسانی انتخاب شدند. بر اساس میزان پروتئین مورد نیاز برای هر ژل، پروتئینهای به دست آمده از اشک 2 تا 3 فرد به طور تصادفی با هم یکی شدند. غلظت پروتئین کل سنجش شده با روش برادفورد به ترتیب 05/4 ± 9/10 و 5/1 ± 36/5 میلی­گرم بر میلی­لیتر برای گروه شاهد و بیمار بود که این مقادیر با مقادیرگزارش­شده پیشین که حاکی از کاهش 50 درصدی غلظت پروتئین در گروه بیمار نسبت به گروه شاهد بودند، مطابقت دارد (13).

نمایه پروتئینی نمونه اشک جدا شده بر روی ژل الکتروفورز یک بعدی. الگوی باندهای پروتئینی و مرزهای برش هر قطعه در شکل 1 نشان داده شده است. همان گونه که در تصویر مشخص است، قطعه­‌های شماره 2 و 5 نمایانگر حضور تعدادی از پروتئینهای فراوان تر نسبت به سایر پروتئینها هستند. با تقسیم کردن هر ژل به 5 قطعه و آنالیز هر قطعه به صورت جدا از دیگر قطعه­ها، اثر پوشانندگی سیگنال حاصل از حضور این گروه از پروتئینهای با فراوانی بالا بر سیگنال ایجاد شده توسط دسته دیگر از پروتئینها که فراوانی کمتری دارند؛ خنثی خواهد شد و از این راه شناسایی تعداد بیشتری از پروتئینها ممکن می­شود. اثر پوشانندگی ناشی از حضور تعدادی از پروتئینهای با فراوانی بالا، آشکارسازی نشانگرهای زیستی پروتئینی که معمولاً در غلظت­های پایین وجود دارند، را تحت تأثیر قرار می­دهد. دامنه پویایی گسترده غلظت پپتیدها و پروتئینهایی که در یک سیستم زیستی حضور دارند، گلوگاه اصلی برای کشف نشانگرهای زیستی جدید است.

در بسیاری از مطالعات پروتئومیک، دامنه پویای وسیع پروتئینها در اشک انسان به ویژه حضور چندین پروتئین در مقادیر بالا نسبت به سایر پروتئینها، می­تواند از شناسایی موفق نشانگرهای زیستی با فراوانی کمتر ممانعت به عمل آورد؛ از این رو، روشهای مختلف جزء به جزء کردن، حذف یا غنی سازی برای ساده سازی نمونه­های زیستی ناهمگون و پیچیده توسعه یافته­اند. از آنجایی که هنوز پیچیدگی نمونه­ها از ظرفیت سیستمهای تحلیلی موجود کنونی تجاوز می­کند، در مجموع فرآیند آماده­سازی برخی از نمونه­ها به عنوان چالش مهمی در تجزیه و تحلیل آنها باقی خواهد ماند (17).

 

شکل 1- پروتئوم اشک دو گروه شاهد و بیمار جدا شده بر روی ژل الکتروفورز یک بعدی. خطوط نشان دهنده محلهای برش ژل به 5 قطعه می­باشد. قطعه­های شماره 2 و 5 موقعیت پروتئینهای دارای فراوانی بالا را نشان می­دهند، با برش ژل به چند قطعه، اثر پوشانندگی پروتئینهای موجود در این دو قطعه بر روی ردیابی سایر پروتئینها کاهش خواهد یافت.

مرور کلی یافته­های پروتئومیکی در پژوهش حاضر: آنالیز قطعه­های ژل با ابزار کروماتوگرافی مایع-طیف­سنجی جرمی متوالی، تعداد 1125 پروتئین غیرتکراری با ضریب اطمینان بالا را شناسایی کرد. میزان واریانس پروتئوم بین گروهها، با محاسبه ضریب همبستگی پیرسون مورد ارزیابی قرار گرفت. بدین منظور، از شدت سیگنال (متناظر با سطح بیان پروتئین) مستخرج از تجزیه و تحلیل با نرم افزار MaxQuant استفاده شد. مقادیر ضریب همبستگی خطی پیرسون محاسبه شده برای هر 6 نمونه در نمودار Multi-scatter نشان داده شده­اند(شکل 2 (الف)). به طور کلی، مقایسه اعداد متناظر با ضریب همبستگی پیرسون حاکی از تکرارپذیری بالای کل کار آزمایی و شباهت بالای نمونه­ها در هر گروه می­باشد؛ به نحوی که میانگین ضریب همبستگی پیرسون بین 3 تکرار مستقل از گروه شاهد و گروه بیمار به ترتیب معادل 01/0 ± 93/0 و 01/0 ± 94/0 است. از سوی دیگر ضریب همبستگی پیرسون بین گروه شاهد و گروه بیمار به طور میانگین متناظر با 03/0 ± 87/0 می­باشد که حاکی از وجود شباهت کمتر بین پروتئوم گروه شاهد و بیمار است. در مرحله­ بعد، به منظور شناسایی زیرمجموعه­ پروتئینی که به طور قابل توجهی در گروه بیمار نسبت به گروه شاهد تمایز بیان نشان می­دهند، تحلیل آماری در نرم افزار Perseus با انجام آزمون آماری دو نمونه­ای (05/0 P <) صورت گرفت. از میان 42 پروتئینی که سطح بیان آنها در بیماری قوز قرنیه تحت تأثیر قرار گرفته، به ترتیب 28 و 14 پروتئین کاهش و افزایش بیان نشان دادند. در شکل 2 (ب) با ترسیم نمودار volcano تفاوتهای به دست آمده از مقایسه دوگانه پروتئوم گروه بیمار و گروه شاهد به تصویر کشیده شده­است. در این نمودار مقدار کسر تغییرات پروتئینها بر روی محور X و عدد مربوط به نقاط داده معنی­دار حاصل از تحلیل آماری تمایزی (–Log(p-value))، بر روی محور Y نمایش داده شده­اند. برای به تصویر کشیدن داده­های گرافیکی از یکی از ابزارهای دیداری سازی داده بهره گرفته شد. پس از جایگزین کردن نقاط داده ماتریکسی فاقد مقدار با مقادیر عددی متناظر با استفاده از توزیع نرمال، این نقاط بر اساس نمره Z نرمال شدند و پس از انتخاب پارامترهای فاصله و اتصالات بر اساس معیار Euclidean و Average، نقشه حرارتی نقاط داده با نمودار خوشه­بندی سلسله مراتبی مرتبط با آن ایجاد شد. با انجام این آنالیز، پروتئینهایی که از نظر مقدار عددی شدت بیان و پروفایل بیانی مشابهت دارند در خوشه­های واحدی قرار می­گیرند و تلفیق این خوشه­ها با هم یک دندروگرام را ایجاد می­کند.

 

(ب)

(الف)

شکل 2- الف) نمودار multi-scatter که نشان­دهنده میزان واریانس بین نمونه­های مورد آزمون می­باشد. اعداد نمایش داده شده در بالای هر نمودار مقدار ضریب همبستگی پیرسون را نشان می­دهند. ب) نقاط داده­ای معنی­دار از نظر آماری، با دو رنگ قرمز و آبی در شکل نشان داده شده­اند که به ترتیب نمایانگر نقاط دارای افزایش بیان و نقاط دارای کاهش بیان در گروه بیمار نسبت به گروه شاهد هستند. نرخ کشف کاذب با حد آستانه متناظر با 05/0 و مقدار واریانس S0 معادل با 1/0 جهت رسم نمودار استفاده شده است.

 

نقشه حرارتی نشان داده شده در شکل3، تفکیک خوشه­ای سلسله مراتبی نقاط داده را نشان می­دهد که در آن نمونه­ها در دو زیر خوشه A و B جدا شده­اند. در گام بعدی، دسته­بندی پروتئینهای با الگوی بیانی متمایز توسط تجزیه و تحلیل جامع هسته­شناسی ژنی مرتبط با موقعیت سلولی (GOCC)، عملکرد مولکولی (GOMF) و فرآیند زیستی (GOBP) این پروتئینها انجام شد. این کار با بهره­گیری از یک سیستم طبقه­بندی مبتنی بر وب تحت عنوان سیستم آنالیز پروتئینها با استفاده از روابط تکاملی، PANTHER، صورت گرفت. PANTHER یک منبع داده چندمتغیره برای طبقه­بندی توالیهای پروتئینی با کمک تاریخچه تکاملی و عملکرد آنها می­باشد. شالوده این منبع داده، یک کتابخانه جامع از درختهای فیلوژنتیکی است که از خانواده­های ژنی کد کننده پروتئینها ایجاد شده­اند.

 

 

شکل 3- مقدار شدت بیان ترانسفورم شده لگاریتمی خطی نرمال شده پروتئینها برای آنالیز و ایجاد نقشه حرارتی و خوشه بندی سلسله مراتبی استفاده شد. در نقشه حرارتی بالا رنگ قرمز و رنگ آبی به ترتیب نشان دهنده افزایش و کاهش بیان پروتئین هستند.

 

این ابزار که برای طبقه­بندی پروتئینها و ژنهای آنها با توان عملیاتی بالا طراحی شده­است؛ لیستی از ژنهای کد کننده پروتئینهای با بیان متمایز را با ژنهای موجود در یک ژنوم مرجع (در اینجا ژنوم انسان) مقایسه می­کند و از طریق اطلاعات تعریف شده­ای که در مورد ویژگیها و عملکردهای زیستی محصولات این ژن­ها وجود دارد و نیز از راه ارتباط دادن این عملکردها با همدیگر، این پروتئینها را دسته­بندی می­کند (27). آنالیز هسته­شناسی ژنی، عملکرد زیستی محصول پروتئینی را از سه منظر شرح می­دهد: عملکرد مولکولی (فعالیتهای انجام شده توسط محصول ژنی در سطح مولکولی)، اجزاء سلولی (جایگاههای منتسب به ساختارهای سلولی که در آن محصول ژن عمل می­کند) و فرآیند زیستی (برنامه­های زیستی که توسط فعالیتهای مولکولی چندگانه انجام می­شوند) (27). خلاصه ای از آنالیز هسته­شناسی ژنی این پروتئینها در شکل 4 نشان داده شده­است. به طور کلی، تجزیه و تحلیل هسته­شناسی ژنی مرتبط با موقعیت سلولی پروتئینهای متمایز در این مطالعه، چندین پروتئین خارج سلولی و سیتوپلاسمی را نشان داد. فراوانی بیشتری از پروتئینهای سیتوپلاسمی و اندامکی از جمله پروتئینهای اسکلت سلولی و شبکه آندوپلاسمی در مقایسه با پروتئینهای خارج سلولی مشاهده شد.

علاوه بر این، تجزیه و تحلیل هسته­شناسی ژنی مرتبط با عملکرد زیستی این پروتئینها در دو گروه مورد مطالعه، چندین پروتئین دخیل در بیماری با عملکرد ضد باکتریایی، پاسخ ایمنی، مهارکننده پروتئازی و آنزیمهای متابولیکی را نشان داد. همانطور که در شکل 4 نشان داده شده­است، فرآیندهای زیستی غنی شده در این آنالیز شامل فرآیندهای سلولی (1/27 درصد)، فرآیندهای متابولیکی (2/20 درصد)، تنظیم زیستی (6/11 درصد)، سازماندهی اجزای سلولی (3/9 درصد) و پاسخ به محرکها (3/9 درصد) و ... هستند.

 

 

 

شکل 4- آنالیز هسته­شناسی ژنی مرتبط با تغییرات تمایزی پروتئینهای شناسایی شده در این مطالعه. سهم هر فرآیند در آسیب شناسی فیزیولوژی بیماری در نمودار دایره­ای بالا در مقیاس درصد مشخص شده­است. جایگاه سلولی زیرمجموعه‌های پروتئینی تمایزی نیز در نمودار دایره­ای پایین نشان داده شده ‌است.

 

برای نشان دادن نقش محصولات ژنی در مسیرهای زمینه­ساز و پیش برنده بیماری قوز قرنیه که در این تحقیق به عنوان پروتئینهای با الگوی بیانی متمایز شناسایی شده­اند؛ تحلیل ارتباطی-عملکردی ژنها انجام شد. شبکه تعاملات عملکردی متقابل بین پروتئینهای با الگوی بیانی متمایز با استفاده از منبع پایگاه داده آنلاین STRING(http://string-db.org) ترسیم شد.

حد آستانه­ای که برای ایجاد شبکه تعاملی پروتئینی تعیین شد معادل میزان بالای اطمینان یعنی 7/0 (حداقل امتیاز مورد نیاز برای ایجاد میانکنش متقابل بین دو پروتئین) بود، که بر وجود ارتباط بین دو ژن با امکان بیشتر از 70 درصد دلالت دارد. برای این شبکه، 5 خوشه­ پروتئینی مجزا ایجاد شد و پروتئینهایی که میانکنشی با دیگر پروتئینها نداشتند، از شبکه حذف شدند (شکل 5).

بحث و نتیجه­گیری

در این پژوهش تغییرات پروتئوم اشک بین دو گروه شاهد و بیمار با به کارگیری تکنیک الکتروفورز ژلی یک بعدی و کروماتوگرافی مایع-طیف­سنجی جرمی مورد مطالعه قرار گرفت.

در مجموع 1125 پروتئین در نمونه­ اشک هر دو گروه شناسایی شد که نشان دهنده­ حضور فراوان پروتئین در اشک می­باشد. در این پژوهش، علاوه بر تأیید تغییرات تعدادی از گزینه­های پروتئینی گزارش شده قبلی، پروتئینهای جدیدی شناسایی گردیده­اند که تاکنون در بیماری­زایی قوز قرنیه گزارش نشده­ بودند. در گزارشهای اخیر با به کارگیری تکنیکهای قدرتمند مبتنی بر طیف سنجی جرمی، عدد پروتئوم اشک نرمال انسان به طور معنی­داری به حدود 2000 پروتئین افزایش یافته­است که بیش از 90 درصد از کل این مجموعه را پروتئینهای LYZ (لیزوزیم)، LTF (لاکتوترانسفرین)،LCN1 (لیپوکالین)، SIgA (ایمونوگلوبولین آ ترشحی)، LACRT (لاکریتین) و PRPs (پروتئینهای غنی از پرولین) تشکیل می­دهند (12،40).  

 

 

 

شکل5- شبکه میانکنشهای متقابل پروتئینهای تمایزی در دو گروه بیمار و کنترل. گرههای فاقد میانکنش از شبکه حذف شدند و تنها پروتئینهای دارای تعامل متقابل باقی ماندند که در 5 مدل مجزا خوشه­بندی شدند.

 

پروتئینهایی که در مقایسه با افراد نرمال، در افراد بیمار افزایش بیان داشته­‌اند شامل: PSME1، UBB، DIAPH1، FN1، PODXL، AHSG، PDLIM1، CLIC1، PGLS، LDHA، GSN، IVL، CTSB و LGALS3 می­باشند. و در مقابل زیرمجموعه پروتئینهایی که کاهش بیان داشته­اند؛ PSAP، PLS3، AKR1C2، PLOD1، HSP90B1، ITIH4، TKT، NUCB2، HYOU1، HRG، ALDH3A1، A2M، QSOX1، B4GALT4، SLIT3، ADH1A، PGK1، ENO1، ESD، CLU، EZR، TGM2، HSP90AA1، PFN1، ANXA1، SERPINA1، P4HB و FGA را شامل می‌شوند. از این تعداد پروتئین تمایزی، چندین مورد قبلاً گزارش شده­اند (5، 7، 8 و 27) و تعدادی دیگر برای اولین بار در این پژوهش شناسایی شده­اند. لیست کامل نام ژن، میزان تفاوت بین دو گروه و نیز مقدار p-value به­دست آمده برای پروتئینهای تمایزی در جدول شماره 1 نشان داده شده­است.

در ادامه به خلاصه­ای از عملکرد فیزیولوژیک این پروتئینها پرداخته می­شود. در شبکه میانکنشهای پروتئین-پروتئین مرتبط با این مجموعۀ پروتئینهای تمایزی، پس از حذف اجزایی که تعاملی با سایرین نداشتند؛ 5 خوشه­ میانکنش پروتئینی ایجاد شد.

 

جدول1- پروتئینهای تمایزی پس از انجام آزمون آماری دو نمونه­ای T (05/0 P <)

شماره

نام ژن

میزان تفاوت بین دو گروه

-Log student's T-test p-value KCN_CTRL

1

PSME1

32733/1

77493/5

2

UBB

02872/1

95931/3

3

DIAPH1

52556/1

93183/2

4

FN1

49943/1

38514/5

5

PODXL

09712/1

94069/3

6

AHSG

2108/1

03035/5

7

PDLIM1

977237/0

85521/4

8

CLIC1

39084/1

57729/3

9

PGLS

86008/1

01687/4

10

LDHA

38615/2

78717/3

11

GSN

09836/2

23248/4

12

IVL

34805/1

82444/3

13

CTSB

52901/1

58767/3

14

LGALS3

1946/1

75675/4

15

TGM2

890649/0-

55844/4

16

EZR

05856/1-

32843/3

17

HSP90B1

27454/1-

36219/3

18

CLU

67439/1-

9751/4

19

ESD

788525/0-

37981/4

20

HSP90AA1

01773/1-

87403/2

21

PFN1

39437/1-

97673/4

22

P4HB

972616/0-

76757/6

23

ENO1

01009/1-

88196/3

24

HRG

94966/0-

10328/4

25

ANXA1

6304/2-

60136/5

26

FGA

04281/2-

54231/4

27

SERPINA1

928247/0-

77972/5

28

PGK1

516981/0-

97246/2

29

ADH1A

05219/2-

45836/3

30

SLIT3

62736/1-

90756/2

31

B4GALT4

66972/1-

28971/3

32

QSOX1

17377/1-

53485/3

33

A2M

18118/1-

31393/4

34

ALDH3A1

52879/1-

33347/4

35

HYOU1

49499/1-

06668/4

36

NUCB2

78907/1-

8872/3

37

TKT

39518/2-

82116/4

38

ITIH4

36226/2-

19958/5

39

PLOD1

80852/1-

60047/4

40

AKR1C2

85885/0-

87925/3

41

PLS3

9507/1-

49779/3

42

PSAP

06592/2-

48127/5

 

 

پروتئینهای ITIH4، FGA، SERPINA1، CLU، QSOX1، A2M، HRG خوشه­ شماره 1 از شبکه را ایجاد می­کنند. آنالیز هسته­شناسی ژنی مرتبط با عملکرد مولکولی این پروتئینها شامل تنظیم ترجمه، نقش اتصالی و فعالیت کاتالیتیکی می­شود. چندین عامل زمینه­ساز اتیولوژی بیماری قوز قرنیه در نظر گرفته می­شوند هرچند مکانیسم آن هنوز کاملاً شناخته نشده­است. سه فاکتور اصلی استرس اکسیداتیو، حضور التهاب و افزایش آپوپتوز سلولی در آسیب شناسی این بیماری سهیم هستند (22 و 42). نازک شدن استروما در قوز قرنیه را به افزایش فعالیت آنزیمهای پروتئازی و کاهش میزان مهار کننده­های این آنزیمها نسبت می­دهند. یکی از مهمترین این پروتئازها CTSB و دو تا از مهمترین این مهارکننده­ها پروتئینهای SERPINA1 (A1AT) و A2M هستند (32 و 43). در این مطالعه نیز افزایش سطح بیان پروتئاز CTSB و کاهش سطح بیان مهار کننده­های SERPINA1 و A2M تأیید شد. CTSB یا Cathepsin V/ L2 از خانواده پپتیدازهای C1 است و یکی از سیستئین پروتئازهای لیزوزومی است که در فیزیولوژی قرنیه نقش مهمی دارد. گزارشهایی مبنی بر حضور مقادیر بالای این آنزیم و آنزیمهای دیگری از این خانواده در قوز قرنیه وجود دارد (41 و 47). علاوه بر فعالیت پروتئولیزی، تحریک اختلال در عملکرد میتوکندری و افزایش تولید گونه­های فعال اکسیژنی توسط Cathepsin نیز نشان داده شده­است (34). مقادیر افزایشی گونه‌های فعال اکسیژنی از جمله سوپر اکسیدها توسط فیبروبلاستهای آسیب دیده قوز قرنیه­ نسبت به قرنیه‌ سالم تولید می‌شوند (11). فاکتور دیگری که در آسیب­شناسی بیماری قوز قرنیه و نازک شدن قرنیه در این بیماری دخیل می­دانند افزایش مرگ سلولی برنامه ریزی شده یا آپوپتوز کراتوسیتهای استرومای قرنیه است (21). برخلاف قرنیه­ نرمال که میزان آپوپتوز در آن تقریباً ناچیز و قابل اغماض است اما در قوز قرنیه حجم گسترده­ای از آپوپتوز کراتوسیتها مشاهده شده­است (9). چند پروتئین که در مطالعه­ حاضر تغییر بیان نشان دادند و به نظر می­رسد سهمی در افزایش میزان آپوپتوز مشاهده شده در بیماری قوز قرنیه داشته باشند شامل CLU، HSP90B1، HSP90AA1، P4HB، ANXA1 و GSN هستند. چهار پروتئین اول که همگی کاهش بیان داشته­اند، چاپرونهای مولکولی هستند که در تاخوردگی صحیح پروتئینها نقش دارند. کاهش P4HB یا PDI که از چاپرونهای شبکه آندوپلاسمی است و در پاسخ پروتئین تانخورده نقش دارد، حاکی از افزایش استرس شبکه­ آندوپلاسمی در نتیجة افزایش تجمع پروتئینهای تانخورده و همزمان با آن افزایش گونه­های فعال اکسیژنی در شبکه آندوپلاسمی است. در صورت تداوم فعالیت پاسخ پروتئین تانخورده، این شرایط منجر به استرس مزمن شبکه­ آندوپلاسمی گردیده و سلول به سمت آپوپتوز پیش می­رود (16 و 20). CLU یا ApoJ یک گلیکوپروتئین 85-70 کیلودالتونی با پیوند دی سولفید است و عملکرد آن در ارتباط با پاکسازی باقیمانده­های حاصل از تخریب سلولی و آپوپتوز می­باشد. همچنین، این پروتئین یک چاپرون مولکولی است که مسئول کمک به تاخوردگی پروتئینهای ترشح شده ­است، در تعاملات سلول-سلول نقش دارد، سه ایزوفرم آن که هسته­ای، سیتوپلاسمی و خارج سلولی هستند، عملکردهای متفاوتی دارند و در فرآیندهای پیش یا ضد آپوپتوزی، تکثیر سلولی و التهاب دخیل هستند (44). دو پروتئین مهم GSN و EZR از خانواده Gelsolin هستند و نقش ضد آپوپتوزی و ضد التهابی دارند. این دو پروتئین در تحرک سلولی نیز اهمیت دارند. برای پروتئین GSN هر دو نقش پیش آپوپتوزی و ضد آپوپتوزی گزارش شده­است و بنابراین می­تواند آپوپتوز را افزایش داده یا مهار کند که این عملکرد به ماهیت شرایط پاتولوژیک، هویت انواع سلولها و بافتهای خاصی که درگیر هستند، بستگی دارد. کاسپاز 3، پروتئین GSN را به دو قطعة پایانه­-N و پایانه­-C برش می­دهد. GSN کامل و دست­نخورده به اکتین-DNase1 متصل می­شود و این کمپلکس سه تایی پایدار است، اما قطعۀ پایانه-N متعلق به پروتئین GSN به طور رقابتی به اکتین در کمپلکس ­ دوتایی اکتین-DNase1 متصل شده و کمپلکس را بهم می­زند، DNase1 را آزاد می­کند تا DNA میتوکندری را تخریب و آپوپتوز را تسریع کند (26). پروتئین EZR نیز در تنظیم چسبندگی کانونی نقش دارد و کاهش بیان آن باعث نقص در تشکیل چسبندگیهای کانونی ضروری برای مهاجرت سلولی می­شود. پروتئین ANXA1 در بازآرایی اسکلت سلولی و مهاجرت سلولها، کاهش التهاب، مهار فعالیت SPLA2-IIA و نیز کاهش آپوپتوز نقش دارد (37). در سطح ریخت­شناسی قرنیه، قرار گرفتن در معرض اشعۀ فرابنفش می‌تواند موجب کاهش تکثیر سلولهای اپی‌تلیال، تغییرات در ضخامت لایۀ اپی‌تلیوم و استروما شود، که علت آن افزایش آپوپتوز کراتوسیتهای لایه استروما و از دست رفتن ظرفیت متابولیسمی سلولهای قرنیه است (2 و 10). تعامل دوسویه پروتئینهای LDHA، ENO1 و PGK1 خوشه­ دیگری را در شبکه پروتئینی ایجاد کرد. آسیب به قرنیه تجمع مقادیر افزوده گونه‌های فعال اکسیژنی را به دنبال دارد که این تغییر شرایط می‌تواند منجر به افزایش بیان LDHA به عنوان نشانگر افزایش استرس اکسیداتیو و سلولهای اپی تلیال در حال تمایز و همچنین افزایش بیان IVL دیگر نشانگر تمایز سلول اپی تلیال در طول التیام جراحت شود (39). علاوه بر اینها، چندین فاکتور رونویسی مؤثر در تنظیم و ایجاد تغییرات بیانی گزارش شده­اند مانند AP1 و Sp1 که بیان هر دوی این فاکتورها در قوز قرنیه افزایش می‌یابد و به ترتیب بیان پروتئینهای A1AT و IVL را کاهش و افزایش می­دهند؛ به علاوه، افزایش بیان و فعالیت این فاکتورهای رونویسی منجر به کاهش تکثیر کراتوسیتها و اپی­تلیوم می­شود (3). پروتئینهای ENO1 و PGK1، علاوه بر نقشی که در متابولیسم گلوکز دارند، به عنوان نشانگر تمایز سلولهای بنیادی لایه پایه اپی­تلیوم شناخته می­شوند و کاهش آنها در قوز قرنیه می­تواند نشانة عدم توانایی لایه­ اپی­تلیوم از لحاظ رشد و جمعیت­زایی باشد (36).

خوشه­ دیگری از شبکه شامل پروتئینهای ALDH3A1، ADH1A و ESD می­باشد. هر سه این پروتئینها در دفاع آنتی اکسیدانتی علیه مقادیر افزایش یافتۀ گونه‌های فعال اکسیژنی نقش دارند. علاوه بر اینها پروتئینهای دیگری که در این مطالعه شناسایی شدند مانند TKT، AKR1C2 و PDLIM1 نیز اجزای سیستم دفاعی علیه استرس اکسیداتیو را تشکیل می­دهند. دو آنزیم ALDH3A1 و TKT از کریستالینهای قرنیه بوده و سلولهای اپی‌تلیال قرنیۀ نرمال سطوح بالایی از این کریستالینها را بیان می‌کنند که به ترتیب حدود 50 و 10 درصد از پروتئینهای محلول در آب را تشکیل می‌دهند (1 و 38). آنزیم ALDH3A1 به طور مستقیم اشعة فرابنفش را جذب کرده و سوبستراهای آلدئیدی حاصل از پراکسیداسیون لیپیدها را سم­زدایی می­نماید. این آنزیم در حفاظت پروتئازوم از غیرفعال شدن اکسیداتیو نقش دارد  پس مانع انباشت پروتئین و در نتیجه پراکندگی نور در قرنیه می­شود (31). آسیب به استرومای قرنیه به پدیدار شدن دو فنوتیپ ترمیمی کراتوسیتهای استروما یعنی فیبروبلاست و میوفیبروبلاست منجر می‌شود که بیان پروتئینی متفاوتی از فنوتیپ کراتوسیتی خاموش متناظر خود دارند. برخلاف قرنیه­ متأثر شده از بیماری قوز قرنیه، کراتوسیتهای قرنیه نرمال فنوتیپ خاموش دارند. تبدیل از حالت طبیعی به فنوتیپ ترمیمی همراه با کاهش بیان کریستالینهای قرنیه می­باشد که ممکن است با از دست دادن شفافیت سلولی همراه گردد. بیان کریستالین ALDH3A1 در فنوتیپ ترمیمی کراتوسیت انسانی در مقایسه با کراتوسیتهای طبیعی کاهش می یابد (14). علاوه براین، کاهش قابل توجه فعالیت آنزیمهای متابولیکی، ADH و ALDH و همچنین آنزیمهای آنتی اکسیدانت قرنیه مانند GSS و GPx پس از قرار گرفتن در معرض اشعة فرابنفش در آسیب­شناسی قوز قرنیه گزارش شده­اند. پراکسیداسیون لیپیدها، تغییرات پروتئینها و آسیب فراوان به DNA که ماحصل مقادیر افزایش یافته اشعة فرابنفش هستند، به طور جداگانه یا تجمعی می‌توانند منجر به از دست رفتن قدرت بقای سلولهای اپی­تلیال و افزایش مرگ آپوپتوزی کراتوسیتها شوند (28، 29 و 38).

تعدادی از پروتئینهای مرتبط با پویایی و سازمان‌دهی مجدد اسکلت سلولی، نیز در این مطالعه شناسایی شدند که خوشه­ بعدی از شبکه را ایجاد کرده­اند. PLS3 یا T Plastin و EZR جزء پروتئینهای اتصالی به اکتین هستند و در اتصال اسکلت سلولی به غشای پلاسمایی نقش دارند (15).

DIAPH1 یا mDia از خانواده Formin است که بر عکس پروتئین CFL1 با بسپارش رشته­های اکتین فیبرهای طویل را ایجاد می­کند. mDia بسپارش اکتین را از طریق یک مکانیزم وابسته به PFN1 وساطت می­کند و همچنین تثبیت انتهای مثبت میکروتوبولها در طول مهاجرت سلولی را برعهده دارد؛ هدف پروتئین Rho GTPase است و اعمال آن را میانجی­گری می­کند. این پروتئینها احتمالاً در ترانسفورماسیون سلولهای کراتوسیت و تنظیم چسبندگیهای سلول-سلول یا سلول-ماتریکس و مهاجرت سلولی نقش ایفاء می­کنند (5 و 6).

به طور کلی یافته­های این پژوهش علاوه بر تأیید گزارشهای پیشین از چگونگی تغییرات بیان پروتئوم اشک در بیماری قوز قرنیه و نقش احتمالی آنها در بیماری­زایی آن، گزینه­های پروتئینی جدیدی را شناسایی کرد که احتمالاً تغییرات آنها می­تواند در آسیب­شناسی زیستی قوز قرنیه سهم مهمی داشته باشد.

  • غلامپور فاروجی، ن.، حداد مشهدریزه، ع.، دولت آبادی، س. (1394). ﺑﺮرﺳﻲ زﻳﺴﺖ­داده­ای وﻳﮋﮔﻴﻬﺎی ﺳﺎﺧﺘﺎری، ﻋﻤﻠﻜﺮدی و داﻣﻨﻪ ﻣﻴﺰﺑﺎﻧﻲ آﻧﺰﻳﻤﻬﺎی ﺑﺎﻛﺘﺮﻳﺎﻳﻲ ﻣﺆﺛﺮ درﻣﻘﺎوﻣﺖ ﺑﻪاﺳﺘﺮﺳﻬﺎی اﻛﺴﻴﺪاﺗﻴﻮ. ﻣﺠﻠﻪ ﭘﮋوﻫﺸﻬﺎی ﺳﻠﻮﻟﻲ و ﻣﻮﻟﻜﻮﻟﻲ (ﻣﺠﻠﻪ زﻳﺴﺖ ﺷﻨﺎﺳﻲ اﻳﺮان). 29(4)، 423-409.
  • صادقی، ا.، بهمنش، م.، شریفی، م.، و همکاران. (1391). اﻟﻘﺎی آﭘﻮﭘﺘﻮز رده ﺳﻠﻮﻟﻲ ﻛﺎرﺳﻴﻨﻮﻣﺎی ﻣﺜﺎﻧﻪ 5637 در اﺛﺮ ﺗﻴﻤﺎر ﺑﺎ ﭘﻮدوﻓﻴﻠﻮﺗﻮﻛﺴﻴﻦ. ﻣﺠﻠﻪ ﭘﮋوﻫﺸﻬﺎی ﺳﻠﻮﻟﻲ و ﻣﻮﻟﻜﻮﻟﻲ (ﻣﺠﻠﻪ زﻳﺴﺖ ﺷﻨﺎﺳﻲ اﻳﺮان). 27(3)، 405-399.

 

  • Adhikary, G., Crish, J. F., Bone, F., Gopalakrishnan, R., Lass, J., & Eckert, R. L. (2005). An involucrin promoter AP1 transcription factor binding site is required for expression of involucrin in the corneal epithelium in vivo. Investigative ophthalmology & visual science46(4), 1219-1227.
  • Ambekar, R., Toussaint Jr, K. C., & Johnson, A. W. (2011). The effect of keratoconus on the structural, mechanical, and optical properties of the cornea. Journal of the mechanical behavior of biomedical materials4(3), 223-236.
  • Anderson, S., DiCesare, L., Tan, I., Leung, T., & SundarRaj, N. (2004). Rho-mediated assembly of stress fibers is differentially regulated in corneal fibroblasts and myofibroblasts. Experimental cell research298(2), 574-583.
  • Aspenström, P. (2004). Integration of signalling pathways regulated by small GTPases and calcium. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research1742(1-3), 51-58.
  • Balasubramanian, S. A., Wasinger, V. C., Pye, D. C., & Willcox, M. D. (2013). Preliminary identification of differentially expressed tear proteins in keratoconus. Molecular vision19, 2124.
  • Barbara, R., Turnbull, A. M., Hossain, P., Anderson, D. F., & Barbara, A. (2017). Epidemiology of keratoconus. In Keratoconus(pp. 13-23). Springer, Cham.
  • Bykhovskaya, Y., Gromova, A., Makarenkova, H. P., & Rabinowitz, Y. S. (2016). Abnormal regulation of extracellular matrix and adhesion molecules in corneas of patients with keratoconus. International journal of keratoconus and ectatic corneal diseases5(2), 63.
  • Cheung, I. M., McGhee, C. N., & Sherwin, T. (2013). A new perspective on the pathobiology of keratoconus: interplay of stromal wound healing and reactive species‐associated processes. Clinical and Experimental Optometry, 96(2), 188-196.
  • Chwa, M., Atilano, S. R., Reddy, V., Jordan, N., Kim, D. W., & Kenney, M. C. (2006). Increased stress-induced generation of reactive oxygen species and apoptosis in human keratoconus fibroblasts. Investigative ophthalmology & visual science47(5), 1902-1910.
  • Cox, J., Hein, M. Y., Luber, C. A., Paron, I., Nagaraj, N., & Mann, M. (2014). MaxLFQ allows accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction. Molecular & cellular proteomics, mcp-M113.
  • Cutillas, P. R., & Timms, J. F. (2010). LC-MS/MS in proteomics: methods and applications. New York, NY: Humana Press.
  • Estey, T., Piatigorsky, J., Lassen, N., & Vasiliou, V. (2007). ALDH3A1: a corneal crystallin with diverse functions. Experimental eye research84(1), 3-12.
  • Fiévet, B., Louvard, D., & Arpin, M. (2007). ERM proteins in epithelial cell organization and functions. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research1773(5), 653-660.
  • Fini, M. E., Bauskar, A., Jeong, S., & Wilson, M. R. (2016). Clusterin in the eye: an old dog with new tricks at the ocular surface. Experimental eye research147, 57-71.
  • Finoulst, I., Pinkse, M., Van Dongen, W., & Verhaert, P. (2011). Sample preparation techniques for the untargeted LC-MS-based discovery of peptides in complex biological matrices. BioMed Research International2011.
  • Gokhale, N. S. (2013). Epidemiology of keratoconus. Indian journal of ophthalmology61(8), 382.
  • Green-Church, K. B., Nichols, K. K., Kleinholz, N. M., Zhang, L., & Nichols, J. J. (2008). Investigation of the human tear film proteome using multiple proteomic approaches. Molecular vision14, 456.
  • Hoffstrom, B. G., Kaplan, A., Letso, R., Schmid, R. S., Turmel, G. J., Lo, D. C., & Stockwell, B. R. (2010). Inhibitors of protein disulfide isomerase suppress apoptosis induced by misfolded proteins. Nature chemical biology6(12), 900.
  • Kaldawy, R. M., Wagner, J., Ching, S., & Seigel, G. M. (2002). Evidence of apoptotic cell death in keratoconus. Cornea21(2), 206-209.
  • Kenney, M. C., & Brown, D. J. (2003). The cascade hypothesis of keratoconus. Contact Lens and Anterior Eye26(3), 139-146.
  • Klintworth, G. K. (1977). The cornea--structure and macromolecules in health and disease. A review. The American journal of pathology89(3), 718.
  • Lema, I., Brea, D., Rodríguez-González, R., Díez-Feijoo, E., & Sobrino, T. (2010). Proteomic analysis of the tear film in patients with keratoconus. Molecular vision16, 2055.
  • Lema, I., Sobrino, T., Duran, J. A., Brea, D., & Diez-Feijoo, E. (2009). Subclinical keratoconus and inflammatory molecules from tears. British Journal of Ophthalmology.
  • Mar, P. K., Roy, P., Yin, H. L., Cavanagh, H. D., & Jester, J. V. (2001). Stress fiber formation is required for matrix reorganization in a corneal myofibroblast cell line. Experimental eye research72(4), 455-466.
  • Mi, H., Huang, X., Muruganujan, A., Tang, H., Mills, C., Kang, D., & Thomas, P. D. (2016). PANTHER version 11: expanded annotation data from Gene Ontology and Reactome pathways, and data analysis tool enhancements. Nucleic acids research45(D1), D183-D189.
  • Mootha, V. V., Kanoff, J. M., Shankardas, J., & Dimitrijevich, S. (2009). Marked reduction of alcohol dehydrogenase in keratoconus corneal fibroblasts. Molecular vision15, 706.
  • Nielsen, K., Birkenkamp-Demtröder, K., Ehlers, N., & Orntoft, T. F. (2003). Identification of differentially expressed genes in keratoconus epithelium analyzed on microarrays. Investigative ophthalmology & visual science44(6), 2466-2476.
  • Ong, S. E., Foster, L. J., & Mann, M. (2003). Mass spectrometric-based approaches in quantitative proteomics. Methods29(2), 124-130.
  • Pei, Y., Reins, R. Y., & McDermott, A. M. (2006). Aldehyde dehydrogenase (ALDH) 3A1 expression by the human keratocyte and its repair phenotypes. Experimental eye research83(5), 1063-1073.
  • Pescosolido, N., Barbato, A., Pascarella, A., Giannotti, R., Genzano, M., & Nebbioso, M. (2014). Role of protease-inhibitors in ocular diseases. Molecules19(12), 20557-20569.
  • Rabinowitz, Y. S. (1998). Keratoconus. Survey of ophthalmology42(4), 297-319.
  • Reiser, J., Adair, B., & Reinheckel, T. (2010). Specialized roles for cysteine cathepsins in health and disease. The Journal of clinical investigation120(10), 3421-3431.
  • Romero-Jiménez, M., Santodomingo-Rubido, J., & Wolffsohn, J. S. (2010). Keratoconus: a review. Contact Lens and Anterior Eye33(4), 157-166.
  • Soiberman, U., Foster, J. W., Jun, A. S., & Chakravarti, S. (2017). Suppl-1, M9: Pathophysiology of Keratoconus: What Do We Know Today. The open ophthalmology journal11, 252.
  • Sugimoto, M. A., Vago, J. P., Teixeira, M. M., & Sousa, L. P. (2016). Annexin A1 and the resolution of inflammation: modulation of neutrophil recruitment, apoptosis, and clearance. Journal of immunology research2016.
  • Swamynathan, S. K. (2013). Ocular surface development and gene expression. Journal of ophthalmology, 2013..
  • Tong, L., Corrales, R. M., Chen, Z., Villarreal, A. L., De Paiva, C. S., Beuerman, R., ... & Pflugfelder, S. C. (2006). Expression and regulation of cornified envelope proteins in human corneal epithelium. Investigative ophthalmology & visual science47(5), 1938-1946.
  • Tong, L., Zhou, X. Y., Jylha, A., Aapola, U., Liu, D. N., Koh, S. K., ... & Zhou, L. (2015). Quantitation of 47 human tear proteins using high resolution multiple reaction monitoring (HR-MRM) based-mass spectrometry. Journal of proteomics115, 36-48.
  • Whitelock, R. B., Fukuchi, T., Zhou, L., Twining, S. S., Sugar, J., Feder, R. S., & Yue, B. Y. (1997). Cathepsin G, acid phosphatase, and alpha 1-proteinase inhibitor messenger RNA levels in keratoconus corneas. Investigative ophthalmology & visual science38(2), 529-534.
  • Wojcik, K. A., Blasiak, J., Szaflik, J., & Szaflik, J. P. (2014). Role of biochemical factors in the pathogenesis of keratoconus. Acta Biochimica Polonica, 61(1).
  • Wojcik, K. A., Kaminska, A., Blasiak, J., Szaflik, J., & Szaflik, J. P. (2013). Oxidative stress in the pathogenesis of keratoconus and Fuchs endothelial corneal dystrophy. International journal of molecular sciences14(9), 19294-19308.
  • Zhao, G., Lu, H., & Li, C. (2015). Pro-apoptotic activities of PDI and PDIA3: a role of Bcl-2 protein Bak. Journal of Biological Chemistry, jbc-M114.
  • Zhou, L., & Beuerman, R. W. (2012). Tear analysis in ocular surface diseases. Progress in retinal and eye research31(6), 527-550.
  • Zhou, L., & Beuerman, R. W. (2017). The power of tears: how tear proteomics research could revolutionize the clinic.
  • Zhou, L., Sawaguchi, S., Twining, S. S., Sugar, J., Feder, R. S., & Yue, B. Y. (1998). Expression of degradative enzymes and protease inhibitors in corneas with keratoconus. Investigative ophthalmology & visual science39(7), 1117-1124.
  • Zhou, L., Zhao, S. Z., Koh, S. K., Chen, L., Vaz, C., Tanavde, V., ... & Beuerman, R. W. (2012). In-depth analysis of the human tear proteome. Journal of proteomics75(13), 3877-3885.
  • Ziaei, H., Jafarinasab, M. R., Javadi, M. A., Karimian, F., Poorsalman, H., Mahdavi, M., ... & Katibeh, M. (2012). Epidemiology of keratoconus in an Iranian population. Cornea31(9), 1044-1047.
دوره 34، شماره 1
اردیبهشت 1400
صفحه 77-92
  • تاریخ دریافت: 31 مرداد 1397
  • تاریخ پذیرش: 22 مهر 1397