شناسایی نشانگرهای ISSR، IRAP و iPBS حاوی اطلاعات برای ویژگی‌های برنج در دو شرایط غرقاب و تنش خشکی

حال‌ بی‌بی بادیردست¹، سید یحیی صالحی لیسار¹، حسین صبوری²، علی موافقی¹ و ابراهیم غلامعلی‌پور علمداری²

¹ ایران، تبریز، دانشگاه تبریز، دانشکده علوم طبیعی، گروه علوم گیاهی

² ایران، گنبد‌کاووس، دانشگاه گنبدکاووس، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی گنبد‌کاووس، گروه تولیدات گیاهی

تاریخ دریافت: 10/3/1397            تاریخ پذیرش: 24/9/1397

چکیده

برنج غذای اصلی بیش از نیمی از مردم جهان را تأمین می‌کند. با توجه به نیاز آبی بالای برنج و کمبود منابع آبی، خشکی همواره یکی از عوامل محدود‌کننده کشت این گیاه می‌باشد. بنابراین این تحقیق به‌منظور بررسی تنوع ژنتیکی و شناسایی نشانگرهای ISSR، IRAP و iPBS حاوی اطلاعات ۲۳ صفت مورفولوژیکی در دو شرایط غرقاب و تنش آبی با استفاده از ۱۱۲ ژنوتیب برنج انجام شد. نتایج حاصل از رگرسیون چند متغیره نشان داد که درمجموع ۱۳۷ و ۱۲۰ نوع آلل به ترتیب در شرایط بدون تنش و تنش خشکی با حداقل یکی از صفات مورد بررسی پیوستگی معنی‌دار داشتند. ضریب تبیین در مجموع نشانگر‌های آگاهی‌بخش در شرایط بدون تنش از ۹۸/۰ الی ۲۲/۰ درصد و در شرایط تنش خشکی نیز از ۸۹/۰ تا ۲۵/۰ درصد متغیر بود. در شرایط بدون تنش آلل iPBS2224-6 برای صفت طول برگ پرچم (۹۸/۰) و در شرایط تنش خشکی آلل ISSR16-6 برای صفت وزن کل خوشه‌ها (۸۹/۰) بیشترین ضریب تبیین را به‌عنوان نشانگر سرگروه به خود اختصاص دادند. مقدار قابل‌توجهی از تغییرات مورفولوژیکی با استفاده از آغازگر ISSR22 با بالاترین محتوای چندشکلی (PIC) ۴۹/۰ ، تعداد آللهای مؤثر ۸۸/۱، شاخص تنوع ژنی نی ۴۶/۰ و شاخص شانون ۶۶/۰ توجیه شد. شاخص نشانگری در محدوده ۴۷/۵ الی ۵۰/۰ متغیر بود. این نتایج گویای آن است که از نشانگرهایی که پیوستگی بالایی با صفات مورفولوژیک دارند، می‌توان در شناسایی نشانگرهای مولکولی پیوسته با صفات ژنوتیپهای برنج به‌خصوص در شرایط تنش آبی بهره گرفت.‌

واژه‌های کلیدی: برنج، تجزیه ارتباط، صفات مورفولوژیک، ISSR، نشانگرهای مولکولی

* نویسنده مسئول، تلفن: 01733228883، پست الکترونیکی: hos.sabouri@gmail.com

مقدمه‌

برنج بعد از گندم مهمترین غله به شمار می‌رود و غذای اصلی بیش از نیمی از مردم دنیا را به خود اختصاص می‌دهد. بیش از ۸۰ درصد کالری و ۷۵ درصد پروتئین مصرفی آسیا از برنج تأمین می‌شود. برنج یکی از غذا‌های اصلی و مهم مردم ایران می‌باشد و مصرف سرانه آن به ۳۸ کیلوگرم در سال می‌رسد (۱۴). برنج گیاهی است نیمه آبزی و تا زمان رسیدن به ۸ – ۲۰ هزار مترمکعب در هکتار آب احتیاج دارد (۲۷). با توجه به نیاز آبی بالای برنج، آب یکی از منابع مهم محدودکننده در تولید محصول برنج می‌باشد (۲۵). لذا معرفی ژنوتیپهایی از برنج‌ که تحت شرایط با منابع محدود آبی قادر به رشد باشند ضروری به نظر می‌رسد. با توجه به تأثیر شرایط نامساعد محیطی و موقعیت اقلیمی حاکم بر کشور ایران بر رشد گیاهان، خشکی هنوز عمده‌ترین محدودیت در تولید محصولات زراعی محسوب می‌شود، به گونه‌ایی که از بین تنشهای زنده و غیرزنده، خشکی به‌تنهایی مسبب ۴۵ درصد از کاهش عملکرد محصولات زراعی می‌باشد. لذا شناسایی صفات مرتبط با تحمل به خشکی می‌تواند در گزینش ژنوتیپهای سازگار، کمک‌کننده و یاری‌رسان باشد (۳). ازآنجایی‌که تنوع ژنتیکی در سازگاری و بقای گیاهان در برابر تغییرات محیطی نقش مهمی ایفاء می‌کند، بنابراین آگاهی از تنوع ژنتیکی درون و بین جمعیتهای گیاهی دارای اهمیت ویژه‌ای است (۱۷ و ۲۸). روشهای مختلفی برای بررسی تنوع ژنوتیپی وجود دارد و در بین این روشها، بررسی تنوع به کمک نشانگر‌های مولکولی که چندشکلی را در سطح DNA آشکار می‌کنند (21) و در نتیجه تحت تأثیر شرایط محیطی یا مراحل تکوینی گیاه قرار نمی‌گیرند، اهمیت ویژه‌ای دارد. از نشانگر‌های مولکولی کارآمد می‌توان به (Inter Sequence Specific Repeat) ISSR و نشانگر‌های مبتنی بر رتروترانسپوزون‌ها ازجمله (Inter-Retro transposon Amplified Polymorphism) IRAP و (inter Primer Binding Site Amplification) iPBS اشاره نمود که به دلیل پوشش ژنومی بالا، تکرارپذیری زیاد و چندشکلی بالا برای بررسی تنوع ژنتیکی، تهیه نقشه‌های ژنتیکی، تجزیه ‌و تحلیل شجره‌ها و تجزیه ارتباط صفات مختلف مورد استفاده قرار می‌گیرند (۱۰ و ۱۳). تحمل به خشکی یک صفت پیچیده و کمی است و روش اندازه‌گیری مستقیمی برای اندازه‌گیری آن وجود ندارد و این امر باعث مشکل شدن شناسایی ژنوتیپهای متحمل به خشکی می‌شود (۷). در روشهای مولکولی مثل مکان‌یابی ارتباطی از عدم تعادل پیوستگی بین مکانهای ژنومی برای شناسایی و مکان‌یابی جایگاه صفات کمی استفاده می‌شود. در یک تحقیق، تجزیه ارتباط ۱۲۸ ژنوتیپ برنج و ۱۱ صفت زراعی در طول دو سال مورد مطالعه قرار گرفت. این بررسی با استفاده از ۱۲۵ نشانگر ریز ماهواره که سراسر ژنوم را پوشش می‌داد، انجام شد. در کل ۱۶ نشانگر، ارتباط معنی‌داری با صفتهای مختلف نشان دادند. این محققین بیان داشتند که استفاده از تجزیه ارتباط برای بررسی ژنوتیپهای مختلف برنج در روند برنامه‌های اصلاحی مفید و کارآمد است (۱۴). بررسی ارتباط بین ۳۸ ژنوتیب با ۱۴ نشانگر مولکولی SSR نشان داده است که مکانهای ریز ماهواره RM434، RM104، RM257، RM262 با اکثر صفات مورد بررسی در ارتباط هستند (۱۱). این محققین بیان داشتند که تجزیه ارتباط می‌تواند به‌عنوان ابزاری قدرتمند در شناسایی نشانگرهای آگاهی‌بخش در برنامه‌های اصلاحی مورداستفاده قرار گیرد. با مطالعه گیاهچه‌های ۲۲ ژنوتیپ برنج در دو شرایط بدون تنش و تنش خشکی درمجموع ۱۶ نشانگر ریز ماهواره آگاهی‌بخش در دو شرایط شناسایی شده است (۴). در بررسی که به کمک ۸ نشانگر‌ ISSR، IRAP و iPBS بر روی ۶۰ ژنوتیپ گندم صورت پذیرفته است ۵ آغازگر چند‌شکلی مناسبی داشته و از ۶۱ باند تولیدشده ۴۷ باند چند شکل، ۰۵/۷۷ درصد از باند‌ها چند شکل، میانگین چند‌شکلی ۶۰/۷۲ درصد و تعداد آللهای چند شکل به‌طور متوسط ۸۷/۵ آلل بوده است. محتوای اطلاعات چند شکل نیز بین ۳۱/۰ تا ۴۱/۰ متغیر بوده و میانگین آن ۳۶/۰ به ازای هر نشانگر بوده است بیشترین و کمترین درصد چندشکلی مربوط به آغازگر ISSR و iPBS بوده که به ترتیب ۱۰۰ و ۵۰ درصد است این محققین عنوان می‌نمایند که مجموعه نشانگر‌های ISSR،IRAP و iPBS استفاده‌شده برای شناسایی، تمایز، ارزیابی تنوع و روابط ژنتیکی جمعیتهای گندم مورد بررسی سودمند بوده و می‌تواند برای مدیریت ذخایر ژنی از طریق شناسایی نمونه‌های تکراری و همنام مفید باشد (۱۲). ازآنجاکه انتخاب به کمک نشانگر، یکی از مهمترین کاربردهای نشانگرهای مولکولی به‌ویژه در راستای ایجاد ژنوتیپهای متحمل به تنشهای محیطی می‌باشد، پژوهش حاضر با هدف بررسی تنوع ژنتیکی و شناسایی نشانگرهای مثبت و آگاهی‌بخش مرتبط با برخی صفات مورفولوژیک برنج در شرایط تنش خشکی و بدون تنش با استفاده از یک ژرم پلاسم بزرگ برنج و روش تجزیه ارتباط طرح‌ریزی شد.‌

‌مواد و روشها‌

مواد گیاهی پژوهش حاضر شامل تعداد ۱۱۲ لاین برنج تهیه ‌شده از مؤسسه بین‌المللی تحقیقات برنج (International Rice Research Institute: IRRI) در قالب طرح بین‌المللی مشترک بین آن مؤسسه و دانشگاه گنبد‌کاووس بود (جدول ۱).

جدول ۱- شماره و نام ژنوتیپهای ارزیابی‌شده در این مطالعه‌.

لاینهای مذکور در دو آزمایش جداگانه در قالب طرح لاتیس در دو شرایط نرمال و تنش خشکی در سه تکرار ارزیابی شدند. ابتدا لاینهای مذکور در گلدانهایی کشت شدند و بعد به زمین اصلی منتقل گشتند و نشاکاری انجام شد. به‌منظور ارزیابی خصوصیات فیزیکی و شیمیایی خاک نمونه‌گیری از خاک مزرعه انجام شد و به آزمایشگاه خاک‌شناسی شهرستان کلاله منتقل گردید (جدول ۲). هرکدام از ۱۱۲ لاین با فاصله بین و روی ردیف ۲۵ سانتیمتر در مساحت ۲ متر و ۲۵ سانتی‌متر مربع کشت شدند. آبیاری در شرایط بدون تنش به­صورت غرقاب در طول دوره رشد ژنوتیپها انجام شد، اما در محیط تنش آبیاری مزرعه از ۴۰ روز پس از نشاکاری (مرحله با حداکثر پنجه­زنی) به‌منظور اعمال تنش، آبیاری قطع شد و بعد از ۴۰ روز به فاصله ۱۵ روز آبیاری انجام گردید. پس از ۱۵ روز از خاک مزرعه نمونه‌برداری شد و وزن خشک و تر آن تعیین گردید و رطوبت وزنی آن اندازه‌گیری شد و با توجه به منحنی رطوبتی خاک مزرعه برحسب بار تخمین زده شد که در مرحله اول پتانسیل آب خاک مزرعه ۱۵ بار و در مرحله دوم پتانسیل آب خاک ۲۵ بار بود. برای جلوگیری از نفوذ آب از حاشیه مزرعه، فاصله بین آزمایشها دو متر در نظر گرفته شد و از پوشش پلاستیکی برای ممانعت از نفوذ آب استفاده گردید. از ۴۹ بوته موجود، بعد از رسیدگی کامل ۱۰ بوته از هر لاین با رعایت اثر حاشیه برداشت شد و برای اندازه‌گیری صفات به آزمایشگاه منتقل گردید و ۲۳ صفت مورفولوژیک؛ تعداد روز از کشت تا گلدهی، بیوماس، ارتفاع گیاه، تعداد پنجه بارور، تعداد پنجه‌ کل، طول و عرض برگ پرچم، طول خروج از غلاف، قطر ساقه، طول خوشه اصلی، وزن کل خوشه‌ها، وزن خوشه اصلی، وزن کل ساقه‌، وزن دانه‌های پر، وزن دانه‌های پوک، تعداد دانه پر، تعداد دانه پوک، تعداد خوشه چه اولیه، تعداد خوشه چه ثانویه؛ بر اساس دستورالعمل استاندارد ارزیابی صفات برنج (SES,2013) اندازه‌گیری و ثبت گردیدند.

جدول ۲- خصوصیات فیزیکی و شیمیایی خاک محل آزمایش.‌

استخراج DNA و انجام PCR: از برگهای تازه و جوان ژنوتیپها، نمونه‌های برگی به‌منظور استخراج DNA به روش CTAB استفاده شد (۲۹). پس از استخراج DNA کیفیت و کمیت تقریبی آن به‌وسیله ژل آگارز ۸/۰ درصد تعیین شد. این آزمایش با استفاده از ۳۰ آغازگر ISSR، IRAP و iPBS ژنوم گیاه برنج انجام شد. این نشانگرها طبق مطالعات پیشین با استفاده از جمعیتها و زمینه‌های ژنتیکی متعدد، پیوسته با‌QTL های مرتبط با تنش خشکی در گیاه برنج شناسایی‌شده بودند. برای انتخاب این نشانگرها از مقالات استفاده شد (۱۸ و ۱۹). اطلاعات مرتبط با این نشانگرها در جدول ۳ ارائه‌شده است.

جدول ۳- اطلاعات مربوط به نشانگرهای مورد‌استفاده در این مطالعه‌.

رقیق‌سازی DNA در حجم ۱۰ میکرولیتر، با اجزای ۲ میکرولیتر DNA، ۱ میکرولیتر از بافر (10X)PCR، ۴/۰ میکرولیتر از هر آغازگر با غلظت ۶۰ نانوگرم در میکرولیتر، ۶/۰ میکرولیتر مخلوط dNTP (۲ میلی مولار)، ۱۲/۰ میکرولیتر آنزیم DNA Taq polymerase (۵ واحد در میکرولیتر) و ۵ میکرولیتر آب دیونیزه شده انجام شد. واکنش PCR به‌صورت تاچ داون و توسط دستگاه ترموسایکلر  Bio-Rad iCycler m100(ساخت کشور آمریکا) صورت گرفت. چرخه حرارتی شامل یک چرخه واسرشت اولیه برای DNA الگو در دمای ۹۴ درجه سانتی‌گراد به مدت ۴ دقیقه و به دنبال آن ۱۰ چرخه شامل ۴۵ ثانیه در دمای ۹۴ درجه سانتی‌گراد، ۴۵ ثانیه در دمای ۶۵ درجه سانتی‌گراد (با کاهش هر یک درجه سانتی‌گراد در هر چرخه تا رسیدن به دمای اتصال) و یک دقیقه در دمای ۷۲ درجه سانتی‌گراد و به دنبال آن ۲۶ چرخه شامل ۴۵ ثانیه در دمای ۹۴ درجه سانتی‌گراد، ۴۵ ثانیه در دمای ۵۵ درجه سانتی‌گراد و یک دقیقه در دمای ۷۲ درجه سانتی‌گراد بود. پس از اتمام ۲۶ چرخه فوق، نمونه‌ها به‌منظور انجام بسط نهایی پنج دقیقه در دمای ۷۲ درجه سانتی‌گراد قرار گرفتند. سپس فرآورده‌های PCR با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز ۵/۱ درصد تفکیک شدند و  پس از رنگ‌آمیزی با safe staining توسط اشعه ماوراءبنفش ملاحظه و عکس‌برداری شدند. در نهایت امتیازدهی نوارها انجام گرفت. به‌منظور تجزیه ‌و تحلیل داده‌های مولکولی و به دست‌ آوردن اطلاعات مربوط به تنوع نشانگر‌های مورد ‌بررسی از نرم‌افزار POP gene v1.32، برای تجزیه به مؤلفه‌های اصلی از نرم‌افزارv3.21   PAST و رسم نمودار درختی و سایر اطلاعات تنوع ژنتیکی از نرم‌افزار v3.0 Power marker استفاده شد. شاخص اطلاعات چندشکلی آغازگر از طریق فرمول PIC= Σ (1- pi ²)/n محاسبه شد که pi فراوانی آلل i م و n تعداد کل ژنوتیپها می‌باشد. شاخص نشانگر از حاصل‌ضرب تعداد نوارهای چند شکل در شاخص محتوای چندشکلی محاسبه شد (۲۶). به منظور گروه­بندی ژنوتیپهای مورد بررسی از تجزیه به مؤلفه­های اصلی استفاده شد. برای این منظور از نرم افزار  PAST v3.21 استفاده شد. تجزیه رگرسیون چندگانه به روش گام‌به‌گام برای ۲۳ صفت مورفولوژیک به کمک نرم‌افزار SPSS Ver. 20 انجام شد و سپس با استفاده از رگرسیون مرحله‌ای نشانگر‌های تأثیر‌گذار برای هر صفت مشخص شد.

نتایج‌

نتایج حاصل از نشانگرهای مولکولی در ۱۱۲ ژنوتیب مورد مطالعه: ۳۰ آغازگر مورد ‌استفاده الگوی نواربندی مناسب و قابل امتیازدهی تولید نمودند (جدول ۴). این آغازگرها درمجموع ۲۸۹ باند با میانگین ۶۳/۹ باند به ازای هر آغازگر تولید نمودند؛ که از این میان ۲۱۸ باند چند شکل، و ۷۱ باند یک‌‌شکل با میانگین ۲۷/۷ باند چند شکل به ازای هر آغازگر بودند. درصد چندشکلی از ۵۰/۸۷ برای آغازگر‌ ISSR11 تا ۱۴/۵۷ درصد برای آغازگر ترکیبی iPBS2077+iPBS2239 متغیر بود و میانگین آن برای همه آغازگر‌ها ۳۳/۷۵ درصد بود. توزیع مقدار PIC برای آغازگرهای مورداستفاده در محدوده ۴۹/۰ برای ISSR22 الی ۰۶۲/۰ برای iPBS2237+iPBS2240 با میانگین ۳۶/۰ قرار داشت. شاخص نشانگر نیز از ۴۷/۵ تا ۵۰/۰ با میانگین ۵۷/۲ متغیر بود. تعداد آللهای مؤثر (۱۶) بین ۸۸/۱ (ISSR22) تا ۰۸/۱ (iPBS2237+iPBS2240) متغیر بود و میانگین آن ۴۵/۱ برای همه نشانگر‌ها به دست آمد. بررسی تنوع ژنتیکی بر اساس شاخص تنوع ژنی نی (۲۰و24) و شاخص اطلاعات شانون (۱۷) نشان داد که شاخص تنوع ژنی نی در آغازگر ISSR22  برابر ۴۶/۰ و کمترین مقدار آن در نشانگر iPBS2237+iPBS2240 برابر ۰۴۹/۰ متغیر بود و میانگین آن در همه نشانگر‌های مورد‌بررسی ۲۶/۰ بود.

جدول ۴-‌ اطلاعات مربوط به چندشکلی نشانگرها در این بررسی

میانگین شاخص شانون در همه نشانگر‌ها ۴۰/۰ بود. بیشترین میزان این شاخص ۶۶/۰ در آغازگر ISSR22 و کمترین مقدار آن ۰۸/۰ در آغازگر iPBS2237+iPBS2240 مشاهده گردید.

تجزیه به مؤلفه‌های اصلی‌: به‌منظور تعیین میزان همبستگی بین صفات و توجیه مقادیر واریانس متغیرهای اولیه چند مؤلفه اصلی اول، تجزیه به مؤلفه‌های اصلی انجام شد. در کل ۱۱۱ مؤلفه تغییرات را توجیه نمود که از این میان بیشترین توجیه مربوط به ۱۰ مؤلفه اول و به خصوص مؤلفه اولین بود(جدول ۵).

جدول ۵- اطلاعات مربوط به ۱۰ مؤلفه اول‌ در ژنوتیپهای برنج مورد ارزیابی‌‌

اولین مؤلفه ۵۰/۲۱ درصد تغییرات را توجیه نمود دومین مؤلفه ۰۷/۷ درصد از تغییراتی را که توسط مؤلفه اول توجیه نشده بود را توجیه کرد و به همین ترتیب روند توجیه تغییرات ادامه یافت تا اینکه مؤلفه دهم ۱۴/۲ درصد از تغییراتی را که توسط ۹ مؤلفه قبل توجیه نشده بود را توجیه نمود و در کل ده مؤلفه اول ۸۱/۵۲ درصد تغییرات را توجیه نمودند.  تجزیه به مؤلفه‌های اصلی ژنوتیپهای برنج مورد بررسی را به ۴ گروه تقسیم‌بندی نمود (جدول ۶ و شکل ۱)‌. گروه اول مؤلفه اول و دوم بالا، گروه دوم مؤلفه اول بالا و مؤلفه دوم پایین، گروه سوم مؤلفه اول پایین و مؤلفه دوم بالا و نهایتاً گروه چهارم در هر دو مؤلفه دارای ارزشهای پایینی بودند. بررسیهای صفات مرفوفنولوژیک بین گروهها نشان داد که ‌در شرایط بدون تنش گروه اول قطر ساقه، تعداد خوشچه اصلی و شاخص برداشت بالاتری در مقایسه با سه گروه دیگر داشتند. این گروه در شرایط تنش خشکی تعداد پنجه بارور، تعداد پنجه کل و شاخص برداشت بالاتری دارا بودند. گروه دوم در شرایط بدون تنش طول برگ پرچم، طول خروج از غلاف و باروری بیشتری داشتند در شرایط تنش خشکی این گروه از نظر خصوصیاتی مثل طول برگ پرچم، طول خروج از غلاف بالاتر بودند.

جدول ۶- گروه بندی ژنوتیپهای برنج بر اساس تجزیه به مؤلفه های اصلی و شماره ژنوتیپهای هر گروه

گروه سوم در شرایط بدون تنش از نظر خصوصیاتی مثل عرض برگ پرچم، مساحت برگ پرچم، طول خوشه اصلی، وزن کل خوشه‌ها، وزن خوشه اصلی، تعداد دانه پر، وزن دانه پر، تعداد خوشچه ثانویه، بیوماس و عملکرد برتر بودند، گروه سوم در شرایط تنش خشکی مساحت برگ پرچم، قطر ساقه، طول خوشه اصلی، وزن کل خوشه‌ها، وزن خوشه اصلی، وزن کل ساقه‌ها، تعداد دانه پر، وزن دانه پر، تعداد خوشچه اولیه، بیوماس و عملکرد بالاتری داشتند. گروه چهارم در شرایط بدون تنش تعداد پنجه بارور، تعداد پنجه کل، وزن کل ساقه‌ها، تعداد دانه پوک، وزن دانه پوک و روز تا گلدهی بالاتری دارا بودند در شرایط تنش خشکی گروه چهارم عرض برگ پرچم و تعداد خوشچه ثانویه بالاتری داشتند.

شکل ۱- پلات دو‌بعدی کلاستر‌ها به کمک نشانگر‌های ISSR، IRAP و iPBS.

رگرسیون داده‌های مولکولی و مورفولوژیکی‌: نتایج حاصل از تجزیه رگرسیون ۳۰ نشانگر ISSR، IRAP و iPBS ارتباط معنی‌دار میان ۱۳۷ نوع آلل در شرایط بدون تنش و ۱۲۰ نوع آلل در شرایط تنش خشکی را با صفات بررسی‌شده نشان داد. بیشترین تعداد آلل آگاهی‌بخش در شرایط بدون تنش مربوط به صفت طول برگ پرچم (۴۱ آلل) و کمترین تعداد آلل شناسایی‌شده در ارتباط با صفت عرض برگ پرچم بود. بیشترین و کمترین تعداد آلل آگاهی‌بخش در شرایط تنش خشکی به ترتیب مربوط به صفت وزن کل خوشه‌ها (۲۷ آلل) و صفت بیوماس (۴ آلل) بود. در نشانگر‌های مورداستفاده ضریب تبیین در مجموع نشانگر‌های آگاهی‌بخش در شرایط بدون تنش از ۹۸/۰ (صفت طول برگ پرچم) الی ۲۲/۰ (عرض برگ پرچم) متغیر بود. در ارتباط با عملکرد (۱۴ آلل)، وزن خوشه اصلی (۱۷ آلل) و وزن کل خوشه‌ها (۱۲ آلل) به ترتیب با ضرایب تبیین ۵۹۳/۰، ۷۰۵/۰ و ۶۵/۰ شناسایی شد. در شرایط تنش خشکی نیز بیشترین ضریب تبیین ۸۹/۰ درصد (وزن کل خوشه‌ها) و کمترین ضریب تبیین ۲۵/۰ (بیوماس) شناسایی شد. در شرایط تنش خشکی برای عملکرد (۷ آلل) و وزن خوشه اصلی (۱۸ آلل) با ضرایب ۴۴۷/۰ و ۷۶۳/۰ تبیین گردیدند (جدولهای ۷ و ۸).

تجزیه خوشه‌ای ژنوتیپها به کمک نشانگرهای مورد‌استفاده‌: پس از اینکه مناطق مورد نظر در ژنوم ژنوتیپهای مورد بررسی با استفاده از نشانگرهای ترانسپوزونی استفاده شده مورد تکثر قرار گرفت، ژنوتیپها با توجه به تکثیر یا عدم تکثیر منطقه مورد نظر در ژنوم به صورت صفر و یک (عدم وجود باند و وجود باند) تعیین ژنوتیپ شدند و داده­های مولکولی حاصل برای گروه بندی ژنوتیپها با استفاده از نرم افزار PAST مورد استفاده قرار گرفتند. گروه‌بندی ژنوتیپها با استفاده از نرم‌افزار PAST بر اساس داده‌های مولکولی با روش UPGMA و معیار ضریب کوفنینگ (۹۲/۰) موجب شد ژنوتیپها در ۷ گروه قرار گیرند (شکل ۲).‌‌ بررسی صفات مرفوفنواوژیک بین گروهها نشان داد که گروه ۱ در هر دو شرایط برتری خاصی در هیچ یک از صفات نداشت گروه دوم در شرایط بدون تنش تعداد خوشچه ثانویه بیشتری داشت و در شرایط تنش خشکی در تعداد خوشچه ثانویه برتر بود. گروه سوم در شرایط بدون تنش تعداد پنجه بارور بیشتر و در شرایط تنش خشکی تعداد پنجه بارور و تعداد پنجه کل بیشتری داشت. گروه چهارم در شرایط بدون تنش وزن خوشه اصلی بیشتر و در شرایط تنش خشکی تعداد دانه پر، وزن دانه پر و تعداد خوشچه ثانویه بالاتری دارا بود. گروه پنجم در شرایط نرمال در صفت باروری برتر بود و در شرایط تنش خشکی برتری خاصی در هیچ کدام از صفات نداشت. گروه ششم در شرایط نرمال طول برگ پرچم، مساحت برگ پرچم، وزن کل خوشه‌ها، تعداد دانه پر، تعداد خوشچه اولیه، بیوماس و عملکرد بیشتری در مقایسه با گروههایی دیگر داشت این گروه در شرایط تنش خشکی طول برگ پرچم، مساحت برگ پرچم، قطر ساقه، وزن کل خوشه‌ها، وزن کل ساقه‌‌‌‌‌ و عملکرد بالاتری دارا بود. گروه هفتم در شرایط بدون تنش قطر ساقه، طول خوشه اصلی و شاخص برداشت بیشتر و در شرایط تنش خشکی طول خوشه بیشتری داشت.

شکل ۲- دندروگرام تجزیه خوشه‌ای ژنوتیپهای برنج مورد بررسی به کمک نشانگر‌های مولکولی.

بحث

آگاهی از میزان تنوع ژنتیکی ژرم‌پلاسم و رابطه ژنتیکی بین ژنوتیپها به محافظت و استفاده مناسب از منابع ژنتیکی کمک شایانی می‌کند (2 و 22). مطالعه و بررسی تنوع ژنتیکی به روشهای مختلفی صورت می‌پذیرد، اما در بین روشهای مورد استفاده بررسی در سطح مولکولی و ماده ژنتیکی، جدیدتر، راحت‌تر، قابل‌اعتمادتر و با سرعت بیشتری انجام می‌شود (5 و ۶).در مطالعه‌ای دیگر بر روی ۱۸ ژنوتیپ جو از ۳۴ آغازگر ISSR ارزیابی‌شده ۹ آغازگر با الگوی نواربندی مناسب تولید شده است. این آغازگر‌ها ۶۱ نوار با میانگین ۸۷/۶ نوار به ازای هر آغازگر تولید نموده‌اند که از این میان ۱۱ نوار یک‌شکل و ۵۰ نوار چند شکل بوده است. میانگین درصد چند‌شکلی برای تمامی آغازگر‌های استفاده‌شده ۲۹/۸۲ درصد و میزان اطلاعات چندشکلی برای آغازگر‌های مورد بررسی بین ۳/۰ تا ۵۷/۰ متفاوت بوده است. شاخص نشانگر نیز بین ۵/۱ تا ۵۶/۴ بوده است این گروه از محققین عنوان می‌‌نمایند که آگاهی از روابط ژنتیکی ژنوتیپها روشی مناسب برای کسب اطلاعات ارزشمند برای جهت‌دهی به برنامه‌های به نژادی و مدیریت منابع ژرم‌پلاسم می‌باشد (۵). ISSR و نشانگر‌های رتروترانسپوزونی بازتاب خوبی از تنوع درون، بین‌گونه‌ای و ارقام را به نمایش می‌گذارند (۱۶). در این مطالعه نیز نشانگر‌های مورد استفاده تنوع خوبی را در ژرم‌پلاسم برنج مورد بررسی به معرض نمایش گذاشتند به‌گونه‌ای که بالاترین میزان شاخصهایی مثل محتوای اطلاعات چند‌شکلی (PIC) شاخصی که برای نشان دادن ارزش یک نشانگر در نمایش چندشکلی موجود درون یک جمعیت به کار می‌رود و معیار دقیقی که مستقل از تعداد نمونه مورد مطالعه عمل می‌کند (۱۵) به همراه میزان شاخص اطلاعات شانون و معیار تنوع ژنی نی در نشانگر‌ ISSR22 دیده شد. در تجزیه به مؤلفه‌های اصلی همان‌گونه که انتظار می‌رفت مؤلفه اول بیشترین میزان تغییرات را توجیه نمود در اطلاعات حاصل از نشانگر‌های مولکولی کم بودن درصد تبیین تغییرات مولکولی در تجزیه‌های چندمتغیره مثل تجزیه به مؤلفه‌های اصلی اول، بر مستقل بودن مکانها و نشانگر‌های مورد ‌مطالعه و توزیع مناسب آنها در نواحی مختلف ژنوم دلالت دارد. درصورتی‌که نشانگرها از بخشهای مختلف ژنوم انتخاب ‌شده باشند پیوستگی بین آنها کم خواهد بود و درنتیجه تعداد بیشتری مؤلفه برای توجیه کل تغییرات لازم است و توزیع مناسب نشانگر‌ها در سراسر ژنوم به معنی سنجش دقیق‌تر و بهتر تنوع مولکولی به دلیل نمونه‌برداری مناسب از کل ژنوم است (۱، ۹، ۱۳ و ۲۳)؛ بنابراین نتایج تجزیه به مؤلفه های اصلی در این بررسی نشان داد که نشانگر‌های مورد بررسی در این مطالعه در نواحی مختلف ژنوم پراکنده هستند. پیوستگی ژنتیکی بین نشانگر‌ها و مکانهای ژنی صفات کمی، محتمل‌ترین توجیه برای ارتباط بین نشانگر‌های مولکولی و صفات کمی می‌باشد استفاده از پیوستگی بین نشانگر‌های مولکولی و ژنهای کنترل‌کننده صفات کمی، فرآیند شناسایی جایگاههای ژنی مؤثر در صفات و بنابراین به نژادی گیاهان را تسریع می‌نماید (۳۰). بر اساس نتایج حاصل از این بررسی می‌توان اظهار داشت که این نشانگرها پتانسیل استفاده به کمک نشانگر برای صفات مورد بررسی را دارا هستند و پویش در نواحی کروموزومی اطراف این نشانگر‌ها می‌تواند محققین را در شناسایی ژنهای کنترل‌کننده صفات مورد‌نظر یاری نماید. در بررسی که بر روی ۴۸ ژنوتیپ برنج به کمک ۱۸ نشانگر SSR صورت پذیرفته است بیشترین نشانگر‌های مثبت مرتبط با صفات برای طول دانه، طول ریشک و کمترین نشانگر مثبت برای عرض دانه، عرض لما و جرم حجمی شناسایی شده است. بیشترین تغییرات مربوط به صفت عرض دانه (۹۸ درصد) توسط نشانگر RM282 و کمترین ضریب تبیین مربوط به عرض پالئا (۶ درصد) به کمک نشانگر RM6283 تبیین شده است. این محققین این‌گونه نتیجه‌گیری نموده‌اند که با توجه به اینکه اکثر آغازگر‌های مورد ‌استفاده بر صفات مورد مطالعه مؤثر بوده‌اند بنابراین به‌احتمال‌زیاد بتوان از این آغازگر‌ها همراه با اطلاعات مربوط به صفات مورفولوژیک در اصلاح ارقام برنج و شناسایی والدین مناسب برای تولید ارقام هیبرید استفاده نمود (۸). نتایج تجزیه خوشه‌ای در این مطالعه نشان داد ژنوتیپهایی که در یک گروه قرار دارند باوجود تفاوتهای ظاهری توالیهای تکراری مشابه در ساختمان ژنوم خود دارند. چون نشانگر‌های مورد‌استفاده جزء نشانگر‌های تصادفی می‌باشند بنابراین قرار‌گیری ژنوتیپهای متفاوت در کنار‌ هم شاید به علت تکثیر مناطق غیر رمز کننده توسط نشانگر‌های مورداستفاده و تأثیر عوامل محیطی در بروز صفات ریختی ژنوتیپهای مورد بررسی در این مطالعه باشد.

‌نتیجه‌گیری کلی‌

بررسی تنوع ژنتیکی به کمک نشانگر‌های ISSR، IRAP و iPBS بازتاب خوبی از تنوع ژنوتیپهای مورد بررسی را به نمایش گذاشت. بیشترین تعداد نوار چند شکل در بین آغازگر‌های مورد ‌مطالعه مربوط به نشانگر‌ ISSR9 با ۱۲ نوار چند شکل و کمترین آن متعلق به آغازگر ترکیبی iPBS2239+iPBS2240 با ۴ نوار چند شکل بود. بالاترین میزان اطلاعات چند شکل، تعداد آللهای مؤثر، شاخصهای تنوع ژنی نی و شانون مربوط به آغازگر ISSR22 بود. میانگین شاخص نشانگر برای کلیه نشانگر‌های مورد‌بررسی ۵۷/۲ به دست آمد. در شرایط بدون تنش بیشترین ارتباط معنی‌دار با بالاترین ضریب تبیین (۹۸/۰) مربوط به آلل iPBS2224-6 در صفت طول برگ پرچم بود. در شرایط تنش خشکی بیشترین ارتباط معنی‌دار در صفت وزن کل خوشه‌ها در ارتباط با آلل ISSR16-6 به‌عنوان آلل سرگروه با ضریب ۸۹/۰ تبیین گردید. تجزیه به مؤلفه‌های اصلی نشان داد که نشانگر‌ها در ژنومهای مورد بررسی از توزیع مناسبی برخوردار هستند و بنابراین این امر سنجش دقیق تنوع مولکولی از کل ژنوم، ژنوتیپهای مورد بررسی را فراهم ساخت؛ در کل می‌توان گفت که با بررسی بیشتر آللهای شناسایی‌شده در ارتباط با صفاتی مثل طول برگ پرچم، وزن خوشه‌اصلی در شرایط بدون تنش و وزن کل خوشه‌ها می‌توان از نشانگر‌های مولد این آللها در گزینش به کمک نشانگر بهره‌برداری نمود.