نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانشگاه تبریز
2 ایران، ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، گروه مهندسی تولید و ژنتیک گیاهی
3 بخش تحقیقات اصلاح و تهیه نهال و بذر، مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی استان آذربایجان غربی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، ارمیه – ایران
چکیده
شناسایی نشانگرهای چند شکل مرتبط با صفات کمی امکان استفاده موثر از تنوع موجود در بانکهای ژنی را فراهم میسازد. در این مطالعه به منظور شناسایی نشانگرهای مرتبط با 20 صفت زراعی-موروفولوژیک در کتان زراعی (Linum usitatissimum L.) از هفت آغازگرIRAP (Inter-retrotransposon amplified polymorphism) و 13 آغازگر REMAP (Retrotransposon-microsatellite amplified polymorphism) و تجزیه ارتباط به روش مدل خطی مخلوط (Mixed linear model) استفاده شد. صفات زراعی-موروفولوژیک مورد مطالعه شامل ارتفاع بوته، وزن ساقه اصلی، وزن شاخه فرعی، تعداد شاخههای اولیه، تعداد شاخههای ثانویه، تعداد کپسول ساقه اصلی، تعداد کپسول ساقه فرعی، وزن کپسول ساقه اصلی، وزن کپسول ساقه فرعی، وزن برگ، وزن هزار دانه، عملکرد دانه، عملکرد بیولوژیک، شاخص برداشت، درجه روز از کاشت تا سبز شدن، درجه روز از کاشت تا گلدهی، درجه روز از کاشت تا کپسولدهی، درصد روغن، درصد پروتئین و درصد نیتروژن بود. مطالعه ساختار جمعیت به روش بیزین (Bayesian)، بیانگر وجود دو زیر گروه احتمالی (2K=) در جمعیت مورد مطالعه بود. میانگین شاخص تثبیت یا Fst (Fixation index) در دو گروه نسبتا بالا بود که بیانگر تمایز قابل توجه بین دو گروه میباشد. بر اساس مدل خطی مخلوط، 21 مکان مرتبط با صفات (P≤0.01) شناسایی شد. صفت وزن برگ بیشترین تعداد مکان پیوسته را دارا بود. نشانگر LTR1833-LTR1868-3 با نواحی ژنومی کنترلکننده صفات شاخص برداشت، درصد پروتئین و درصد نیتروژن پیوسته بود. نتایج مطالعه حاضر میتواند به عنوان نقطه شروعی جهت استفاده از گزینش به کمک نشانگر در برنامههای اصلاحی کتان مفید باشد.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Association analysis for yield and plant characteristics in Iranian flax genotypes (Linum usitatissimum L.) using IRAP and REMAP markers
نویسندگان [English]
1 University of Tabriz
2 Dept. of Plant Production and Genetics, Faculty of Agriculture and Natural Resources, Urmia University, Urmia, I.R. of Iran.
3 Seed and Plant Improvement Department, West Azerbaijan Agricultural, and Natural Resources Research and Education Center, AREEO, Urmia, Iran
چکیده [English]
The identification of polymorphic markers associated with various quantitative traits allows us to test their performance for the exploitation of the extensive quantitative variation maintained in gene banks. In the current investigation, 7 IRAP and 13 REMAP primers and mixed linear model (MLM)-based association analysis was used to identify molecular markers associated with 20 agro-morphological traits in cultivated flax (Linum usitatissimum L.). Agro-morphological traits studied, were plant height, primary stem weight, secondary stem weight, number of primary branches, number of secondary branches, number of capsules per primary stem, number of capsules per secondary stem, weight of primary stem capsules, weight of secondary stem capsules, leaf weight, thousand seed weight, grain yield, biological yield, harvest index, days to growing, days to flowering, days to capsuling, oil, protein, and nitrogen percentages. Analysis of population structure revealed two possible subgroups (K=2) in the studied population. Fst mean values of the groups were relatively high, indicating remarkable differentiation among the groups. Association analysis using mixed linear model (MLM) identified 21 loci significantly (p < 0.01) associated with agro-morphological traits. The maximum number of associated loci was identified for leaf weight. LTR1833-LTR1868-3 marker was associated with harvest index, protein and nitrogen percentage. The results of the current study could be as a starting point for using MAS in flax breeding programs.
کلیدواژهها [English]
تجزیه ارتباط عملکرد و برخی صفات گیاهی در ژنوتیپهای کتان ایرانی با استفاده از نشانگرهای IRAP و REMAP
حسین عباسی هولاسو1، بابک عبدالهی مندولکانی2* و عبدالله حسنزاده قورت تپه3
1 ایران، تبریز، دانشگاه تبریز، دانشکده کشاورزی، گروه بهنژادی و بیوتکنولوژی گیاهی
2 ایران، ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، گروه مهندسی تولید و ژنتیک گیاهی
3 ایران، ارومیه، آموزش و ترویج کشاورزی، سازمان تحقیقات، مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی استان آذربایجان غربی، بخش تحقیقات اصلاح و تهیه نهال و بذر
تاریخ دریافت: 12/2/97 تاریخ پذیرش: 25/10/97
چکیده
شناسایی نشانگرهای چند شکل مرتبط با صفات کمی امکان استفاده مؤثر از تنوع موجود در بانکهای ژنی را فراهم میسازد. در این مطالعه به منظور شناسایی نشانگرهای مرتبط با 20 صفت زراعی-موروفولوژیک در کتان زراعی (Linum usitatissimum L.) از هفت آغازگرIRAP (Inter-retrotransposon amplified polymorphism) و 13 آغازگر REMAP (Retrotransposon-microsatellite amplified polymorphism) و تجزیه ارتباط به روش مدل خطی مخلوط (Mixed linear model) استفاده شد. صفات زراعی-موروفولوژیک مورد مطالعه شامل ارتفاع بوته، وزن ساقه اصلی، وزن شاخه فرعی، تعداد شاخههای اولیه، تعداد شاخههای ثانویه، تعداد کپسول ساقه اصلی، تعداد کپسول ساقه فرعی، وزن کپسول ساقه اصلی، وزن کپسول ساقه فرعی، وزن برگ، وزن هزار دانه، عملکرد دانه، عملکرد بیولوژیک، شاخص برداشت، درجه روز از کاشت تا سبز شدن، درجه روز از کاشت تا گلدهی، درجه روز از کاشت تا کپسولدهی، درصد روغن، درصد پروتئین و درصد نیتروژن بود. مطالعه ساختار جمعیت به روش بیزین (Bayesian)، بیانگر وجود دو زیر گروه احتمالی (2K=) در جمعیت مورد مطالعه بود. میانگین شاخص تثبیت یا Fst (Fixation index) در دو گروه نسبتاً بالا بود که بیانگر تمایز قابل توجه بین دو گروه میباشد. بر اساس مدل خطی مخلوط، 21 مکان مرتبط با صفات (P≤0.01) شناسایی شد. صفت وزن برگ بیشترین تعداد مکان پیوسته را دارا بود. نشانگر LTR1833-LTR1868-3 با نواحی ژنومی کنترلکننده صفات شاخص برداشت، درصد پروتئین و درصد نیتروژن پیوسته بود. نتایج مطالعه حاضر میتواند به عنوان نقطه شروعی جهت استفاده از گزینش به کمک نشانگر در برنامههای اصلاحی کتان مفید باشد.
واژههای کلیدی: تجزیه بیزین، ساختار جمعیت، عملکرد دانه، کتان، مدل خطی مخلوط
* نویسنده مسئول، تلفن: 09122386990، پست الکترونیکی: b.abdollahi@urmia.ac.ir
مقدمه
کتان (Linum usitatissimum L., 2n= 2x=30) یکی از گونههای ارزشمند جنس لینوم (Linum) است که منبع غنی از اسیدهای چرب ضروری به ویژه اسیدهای چرب امگا 3 و امگا 6 میباشد. گیاه کتان خودگشن و اندازه ژنوم آن حدود Mb370 میباشد (23) و علی رغم اهمیت زیاد آن، در کشور ایران کمتر مورد توجه قرار گرفته است. در مقابل، به دلیل ارزش اقتصادی زیاد بذر آن در جوامع محلی، رویشگاههای این گونه مورد برداشتهای شدید قرار گرفته و سالهای سال در معرض فرسایش شدید ژنتیکی است. روشهای اصلاحی مرسوم، پایه و اساس بهبود ژنتیکی کتان شده و ارقام جدیدی با مقاومت پایدار به بیماریها، سازگاری زراعی و پایداری عملکرد بالا تولید شده است. با این وجود، پایه ژنتیکی محدودی جهت توسعه ارقام زراعی کتان مورد استفاده قرار گرفته است (9). دسترسی محدود به گونههایی با تنوع جدید در این گیاه، کمبود سیستمهای مؤثر جهت تولید واریتههای هیبرید و ابزار ژنومیکی محدود برای اصلاح مولکولی کتان از جمله مواردی است که مانع تولید ارقامی با عملکرد بالا و کیفیت بهتر صفات کیفی در این گیاه شده است (10 و 13).
در کتان عملکرد دانه و اجزاء عملکرد همانند وزن هزار دانه، تعداد دانه در کپسول، و تعداد کپسول در بوته جزء صفات مهم، پیچیده و کمی محسوب میشوند و توسط تعداد زیادی ژن کنترل میشوند. فهم اساس ژنتیکی صفات مرتبط با عملکرد از ارزش کاربردی برای اصلاحگران داراست زیرا چنین اطلاعاتی در طراحی استراتژیهای اصلاحی کمک شایانی خواهد کرد (30). صفات زراعی دیگری همچون زمان گلدهی، ارتفاع گیاه و تعداد شاخه ممکن است به صورت غیر مستقیم توسط مکانیسمهای فیزیولوژیکی متنوعی بر عملکرد اثر بگذارند (18). تخمین مکانهای ژنتیکی کنترلکننده صفات کمی (QTL) از جمله عملکرد و اجزای آن و دیگر ویژگیهای زراعی در کتان از اهمیت ویژهای برای انتخاب به کمک نشانگر (MAS) برخوردار است (30). با استفاده از انتخاب به کمک نشانگر میتوان کارآیی اصلاح صفات مهمی مانند محتوای روغن و عملکرد را در کتان بهبود بخشید (29). با وجود این، انتخاب به کمک نشانگر نیازمند توسعه ابزار ژنومیکی همانند نقشه ژنتیکی و نشانگرهای مولکولی پیوسته با صفات میباشد (9 و 10).
یکی از برنامههای کاربردی در مطالعه صفات کمی در دهه اخیر، مکانیابی ژنهای کنترلکننده صفات کمی (QTL mapping) است. به طور کلی روشهای مورد استفاده در شناسایی و مکانیابی جایگاه صفات کمی به دو گروه اصلی نقشه یابی پیوستگی (Linkage mapping) و نقشهیابی ارتباطی (Association mapping) یا نقشهیابی عدم تعادل لینکاژی (Linkage disequilibrium mapping) تقسیم میشوند. اگرچه نقشهیابی ژنهای کنترلکننده صفات کمی بر اساس تجزیه پیوستگی برای شناسایی مناطق ژنومی تأثیرگذار روی ساختار کتان مؤثر است (29) ولی محدودیتهایی مانند تعداد کم نوترکیبی و در نتیجه پیوستگی ضعیف بین نشانگر و صفت در جمعیتهای دو والدی، و در دسترس نبودن جمعیتهای نقشهیابی و احتیاج به زمان زیاد برای تولید آنها، وضوح ژنتیکی نسبتاً پایینی را در این روش فراهم میکند (37). امروزه برای غلبه بر این مشکلات از روش تجزیه یا مکانیابی ارتباطی به عنوان روش تلفیقی جهت شناسایی ارتباطات بین نشانگر و صفت استفاده میشود که به طور گستردهای در ژنتیک انسانی و جانوری که در آنها ایجاد جمعیتهای در حال تفرق بزرگ غیر ممکن میباشد استفاده میشود (17). در تجزیه ارتباط، رابطه بین ژنوتیپ و فنوتیپ گیاه مستقیماً برای شناسایی نواحی کروموزومی دخیل در کنترل صفت با استفاده از عدم تعادل پیوستگی موجود در جمعیتهای طبیعی و مجموعههای ژرمپلاسم بررسی میشود (7). در اینگونه مطالعات به دلیل اینکه از جوامع طبیعی استفاده میشود اولا تنوع ژنتیکی وسیعتری نسبت به جمعیتهای حاصل از تلاقی دو والدی مورد بهرهبرداری قرار میگیرد، ثانیا از آنجایی که در این نوع نقشهیابی تمام رویدادهای میوزی که در طول تاریخچه تکاملی گیاه انباشته شده است در نظر گرفته میشود دقت نقشهیابی بالاتر است (31).
در پژوهشی سوتو-سردا و همکاران ( b2014) برای شناسایی QTLهای مؤثر در محتوای روغن و اسیدهای چرب کتان، جمعیتی شامل 390 ژنوتیپ کتان کانادایی را با استفاده از 464 نشانگر SSR در سه سال و در شش محیط مورد بررسی قرار دادند. در این تحقیق نه QTL برای صفت محتوای روغن شناسایی شد، که 58 درصد از اللهای QTL در ارقام کانادایی اختصاصی بودند (29). در مطالعهای دیگر تجزیه ارتباط نه صفت زراعی با 112 نشانگر SSR در 532 ژنوتیپ کتان کانادایی نشان داد که برخی از نشانگرها با بیش از یک صفت در ارتباط هستند (30). گلشن و همکاران (1396) به منظور مطالعه ارتباط 13 آغازگر چند شکل RAPD (آغازگرهای سری OPA، OPB و OPD) با 13 صفت مورفولوژیکی کتان زراعی از تجزیه رگرسیون گام به گام استفاده نمودند. نتایج آنها نشان داد که هر یک از نشانگرهای OPA-06 و OPB-05 با هشت صفت مورد بررسی رابطه معنی داری دارند و ضریب تبیین مربوط به این دو نشانگر در حدود 98/0 بود. سایر صفات نیز با حداقل یک و حداکثر پنج نشانگر ( ضریب تبیین حدود 45/0 الی 99/0) ارتباط معنی داری نشان دادند (3).
علیرغم اهمیت اقتصادی کتان در ایران، در زمینه شناسایی و مکانیابی ژنهای کنترلکننده صفات مهم در این گیاه تحقیقات زیادی صورت نگرفته است. هدف از این تحقیق، تجزیه ارتباط برای صفات زراعی-مورفولوژیک در کتان زراعی با استفاده از نشانگرهای رتروترنسپوزنی IRAP و REMAP میباشد. شناسایی مکانهای ژنی کنترلکننده صفات میتواند به اصلاحگران در پیشبرد مؤثر برنامههای گزینشی در اصلاح ارقام با پتانسیل عملکرد بالا کمک شایانی نماید.
مواد و روشها
مواد گیاهی و ارزیابی فنوتیپی: در این مطالعه 80 فرد متعلق به 9 جمعیت کتان زراعی (جدول 1) بر پایه طرح بلوکهای کامل تصادفی در مزرعه تحقیقاتی مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی آذربایجان غربی در 3 تکرار روی خطوطی به طول دو متر کشت شده و 20 صفت زراعی-موروفولوژیک یادداشت گردید. صفات مورد مطالعه شامل ارتفاع بوته (سانتیمتر)، وزن ساقه اصلی (گرم)، وزن شاخه فرعی (گرم)، تعداد شاخههای اولیه، تعداد شاخههای ثانویه، تعداد کپسول ساقه اصلی، تعداد کپسول ساقه فرعی، وزن کپسول ساقه اصلی (گرم)، وزن کپسول ساقه فرعی (گرم)، وزن برگ (گرم)، وزن هزار دانه (گرم)، عملکرد (کیلوگرم/هکتار)، عملکرد بیولوژیکی (کیلوگرم در هکتار)، شاخص برداشت، روز از کاشت تا سبز شدن، روز از کاشت تا گلدهی، روز از کاشت تا کپسولدهی، درصد روغن، درصد پروتئین و درصد نیتروژن بود (30).
جدول 1- محل جمعآوری، کد جمعیتها، تعداد افراد هر جمعیت و اطلاعات جغرافیایی جمعیتهای کتان مورد استفاده در این مطالعه
کد جمعیتها |
محل جمعآوری |
تعداد افراد هر جمعیت |
طول جغرافیایی |
عرض جغرافیایی |
ارتفاع از سطح دریا |
TN97-33 |
زابل |
10 |
ʹ1 °31 |
ʹ30 °61 |
483 |
TN97-55 |
بناب |
10 |
ʹ20 °37 |
ʹ3 °46 |
1288 |
TN97-92 |
شاهیندژ |
10 |
ʹ40 °36 |
ʹ34 °46 |
1370 |
TN97-106 |
مشکینشهر |
10 |
ʹ23 °38 |
ʹ40 °47 |
1422 |
TN97-246 |
اراک |
8 |
ʹ5 °34 |
ʹ41 °49 |
1748 |
TN97-273 |
اصفهان |
9 |
ʹ39 °32 |
ʹ40 °51 |
1579 |
TN97-27442 |
زنجان |
9 |
ʹ40 °36 |
ʹ28 °48 |
1644 |
TN97-27819 |
اردبیل |
7 |
ʹ15 °38 |
ʹ16 °48 |
1349 |
TN97-907A |
کرج |
7 |
ʹ50 °35 |
ʹ56 °50 |
1301 |
ارزیابی ژنتیکی: DNA ژنومی نمونههای گیاهی به روش CTAB (15) در پژوهشکده زیست فناوری دانشگاه ارومیه استخراج شد. کیفیت و کمیت DNA استخراج شده با استفاده از ژل آگارز یک درصد و اسپکتوفتومتری (Bio-Photometer 6131, Eppendorf, Germany) ارزیابی شد. 10 آغازگر IRAP و 84 آغازگر REMAP (26) جهت ارزیابی چندشکلی ادغامی و ثبت ژنوتیپ در افراد مورد مطالعه استفاده شد (جدول 2). تکثیر قطعات DNA در یک واکنش 20 میکرولیتری حاوی بافر PCR ده برابر، 2/0 میکرومولار dNTP، 5/1 میلی مولار MgCl2، 10 پیکومول آغازگر، 5/0 واحد آنزیم Taq polymerase و 20 نانوگرم DNA ژنومی در دستگاه ترموسایکلر اپندورف صورت گرفت. الگوی دمایی واکنشهای PCR شامل واسرشت سازی اولیه در 94 درجه سانتیگراد به مدت 4 دقیقه، سپس 35 چرخه شامل 45 ثانیه در 94 درجه سانتیگراد، 40 ثانیه در 55 درجه سانتیگراد، دو دقیقه در 72 درجه سانتیگراد و تکثیر نهایی در 72 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه انجام شد. الکتروفورز محصولات PCR در ژل آگارز 8/1 درصد و بافر TBE نیم برابر در ولتاژ 80 به مدت 3 ساعت انجام شد. برای رنگآمیزی ژلها از اتیدیوم بروماید استفاده شد.
جدول 2-توالی آغازگرهای مورد استفاده در این مطالعه (اسمایکل و همکاران، 2011) (26)
توالی (5'-3') |
آغازگر |
توالی (5'-3') |
آغازگر |
ACACACACACACACACACT |
UBC443 |
CTTGCTGGAAAGTGTGTGAGAGG |
LTR1833 |
CTCTCTCTCTCTCTCTT |
UBC815 |
GCATCAGCCTGGACCAGTCCTCGTCC |
LTR1854 |
ACACACACACACACACT |
UBC825 |
CACTTCAAATTTTGGCAGCAGCGGATC |
LTR1868 |
ACACACACACACACACC |
UBC826 |
ATTCTCGTCCGCTGCGCCCCTACA |
LTR1886 |
CACACACACACACACARG |
UBC848 |
GTGTGTGTGTGTCC |
A13 |
ACACACACACACACACYT |
UBC855 |
GAGAGAGAGAGACC |
UBC425 |
R : پورین A/G)) ، : Yپریمیدین (C/T)
R: purine (A/G), Y: pyrimidine (C/T)
تجزیههای آماری: باندهای حاصل از هر دو نشانگر به صورت یک (حضور) و صفر (عدم حضور) امتیازدهی و ماتریس حاصل برای بررسی ساختار جمعیت استفاده شد. ساختار جمعیت و تعداد زیرجمعیتهای احتمالی بر اساس دادههای حاصل از تلفیق دو نشانگر با استفاده از نرمافزار STRUCTURE 2.3.4 و مدل بیزین (21) در حالت Admixture با 50000 بار Burn-in و 50000 بار تکرار ماتریس سهم عضویت (Q) برآورد شد. همچنین میانگین شاخص تثبیت (Fst) برای زیرگروههای احتمالی نیز با استفاده از همین نرمافزار برآورد گردید. عدد K بهینه (تعداد زیرجمعیتهای احتمالی) بر اساس روش Delta K (12) با استفاده از نرمافزار STRUCTURE HARVESTER (11) تعیین شد. ماتریس روابط خویشاوندی افراد (ماتریس Kinship) و تجزیه ارتباط به روش مدل خطی مخلوط (MLM) با نرمافزار TASSEL 3 انجام گرفت (5) و نشانگرهای پیوسته با صفات مورد بررسی در سطح معنیدار یک درصد مشخص شد. در مدل MLM علاوه بر ساختار جمعیت (ماتریس Q)، روابط خویشاوندی بین افراد جمعیت (ماتریس K) نیز در تجزیه ارتباط به عنوان متغیر کمکی در نظر گرفته میشود و بنابراین ارتباطات و پیوستگیهای کاذب بین نشانگر و صفت به حداقل میرسد (34 و 36).
نتایج
ساختار ژنتیکی جمعیت: چهار آغازگر منفرد، سه ترکیب آغازگری IRAP و 13 ترکیب آغازگری REMAP الگوی باندی چندشکل و قابل امتیازدهی تولید کردند (شکل 1). در کل 210 مکان تکثیر شد که از این تعداد، 119 مکان (67/56 درصد) چند شکل بودند. مهمترین محدودیت جهت استفاده از تجزیه ارتباط در گیاهان زراعی، ناشناخته بودن ساختار جمعیت و اختلاط جمعیت به علت فاکتورهایی همانند اهلیکردن و سازگاری جمعیت میباشد (32). در بررسی ساختار جمعیت بر اساس مقادیر LnP (D) و Delta K (ΔK)، دو زیر جمعیت (شکل 2) در بین 80 فرد مشخص و مقدار 2K= مناسبترین عدد برای محاسبه متوسط شاخص تثبیت برای هر گروه برآورد شد. در بارپلات ارائه شده، محور افقی مربوط به افراد و محور عمودی سهم تعلق افراد به هر گروه را نشان میدهد (شکل 3). همچنین در این پلات هر گروه با رنگی متمایز مشخص شده است که دو رنگ مجزا از هم برای هر فرد نشان دهنده تعلق آن فرد به یکی از دو گروه یا هر دو گروه میباشد. متوسط شاخص تثبیت برای گروههای احتمالی I و II به ترتیب 25/0 و 12/0 بود. در هر دو گروه مقادیر متوسط Fst نسبتاً بالا بود که نشاندهنده متمایز بودن ژنوتیپهای مورد مطالعه در دو گروه احتمالی است. ماتریس سهم عضویت افراد در این دو گروه (جدول 3) نیز نشان داد که ژنوتیپها با ضرایب بالایی به یک گروه تعلق دارند.
جدول 3- ماتریس سهم عضویت جمعیتهای کتان در هر کلاستر بر اساس محاسبات نرمافزار Structure 2.3.1 در 2K=
جمعیت |
گروه |
|
|
1 |
2 |
زابل |
75/0 |
25/0 |
بناب |
94/0 |
06/0 |
شاهیندژ |
88/0 |
12/0 |
مشکینشهر |
80/0 |
20/0 |
اراک |
86/0 |
14/0 |
اصفهان |
86/0 |
14/0 |
زنجان |
87/0 |
13/0 |
اردبیل |
78/0 |
23/0 |
کرج |
63/0 |
37/0 |
شکل 1- الگوی باندی مربوط به آغازگر منفرد LTR1854، M: نشانگر وزن مولکولی بر حسب bp، اندازه باندها بر حسب جفت باز میباشد، 10 نمونه اول از سمت چپ مربوط به جمعیت شاهیندژ و 10 نمونه دوم مربوط به جمعیت زابل میباشد.
شکل 2- نمودارهای دو سویه برای تعیین تعداد مناسب زیر جمعیت در ژنوتیپهای کتان زراعی مورد مطالعه (2(K= بر اساس نشانگرهای رتروترنسپوزونی IRAP و REMAP با استفاده از نرمافزار Structure 2.3.1
شکل 3- تجزیه کلاستر مبتنی بر مدل بیزین (Bayesian) برای 80 فرد کتان مورد مطالعه بر اساس 20 آغازگر IRAP و REMAP (2(K=. هر رنگ یک زیر جمعیت یا کلاستر را نشان میدهد. اعداد روی محور افقی و عمودی به ترتیب شماره افراد و ضریب تعلق هر فرد به هر کلاستر را نشان میدهد.
تجزیه ارتباط: در این مطالعه برای شناسایی نشانگرهای پیوسته با صفات مورد مطالعه و حذف پیوستگیهای دروغین نشانگر-صفت از روش MLM استفاده شد. از 210 نشانگر تکثیری، 21 نشانگر (13 نشانگر REMAP و هشت نشانگر IRAP) با 11 صفت پیوستگی معنی داری (P≤0.01) نشان دادند (جدول 4).
جدول 4- نشانگرهای پیوسته با صفات مورد مطالعه در 80 فرد کتان
صفت |
مکان |
نوع مارکر |
P-value |
R2 |
وزن برگ |
LTR1868-UBC848-4 |
REMAP |
009/0 |
095/0 |
LTR1868-UBC848-6 |
REMAP |
009/0 |
097/0 |
|
LTR1886-A13-8 |
REMAP |
001/0 |
133/0 |
|
LTR1886-A13-11 |
REMAP |
0002/0 |
183/0 |
|
شاخص برداشت |
LTR1833-LTR1868-3 |
IRAP |
006/ |
100/0 |
LTR1854-LTR1868-9 |
IRAP |
004/0 |
117/0 |
|
LTR1868-A13-9 |
REMAP |
007/0 |
095/0 |
|
درجه روز تا گلدهی |
LTR1886-UBC425-5 |
REMAP |
003/0 |
111/0 |
LTR1854-UBC848-4 |
REMAP |
005/0 |
102/0 |
|
LTR1854-A13-4 |
REMAP |
0008/0 |
151/0 |
|
درصد پروتئین (%) |
LTR1833-LTR1868-3 |
IRAP |
006/0 |
100/0 |
|
LTR1868-UBC826-10 |
REMAP |
003/0 |
116/0 |
درصد نیتروژن (%) |
LTR1833-LTR1868-3 |
IRAP |
006/0 |
100/0 |
|
LTR1868-UBC826-10 |
REMAP |
003/0 |
116/0 |
وزن کپسول ساقه اصلی |
LTR1868-LTR1886-7 |
IRAP |
007/0 |
097/0 |
LTR1854-UBC443-4 |
REMAP |
00005/0 |
237/0 |
|
عملکرد بیولوژیکی |
LTR1854-4 |
IRAP |
007/0 |
098/0 |
وزن شاخه فرعی |
LTR1854-LTR1868-13 |
IRAP |
008/0 |
090/0 |
تعداد کپسول ساقه اصلی |
LTR1854-UBC443-3 |
REMAP |
005/0 |
106/0 |
وزن کپسول ساقه فرعی |
LTR1886-3 |
IRAP |
007/0 |
096/0 |
درجه روز تا کپسولدهی |
LTR1854-UBC443-5 |
REMAP |
0001/0 |
208/0 |
مقدار شاخص R2 (ضریب تغییرات فنوتیپی توجیه شده) از 090/0 (LTR1854-LTR1868-13) تا 23/0 (LTR1854-UBC443-4) متغیر بود. مقدار احتمال (P-value) از 0000509/0 (LTR1854-UBC443) تا 009/0 (LTR1868-UBC848-4 و LTR1868-UBC848-6) متغیر بود. تعداد چهار مکان پیوسته با صفت وزن برگ، سه مکان پیوسته با شاخص برداشت، سه مکان پیوسته با درجه روز تا گلدهی، دو مکان پیوسته با وزن کپسول ساقه اصلی، دو مکان پیوسته با درصد پروتئین، دو مکان پیوسته با درصد نیتروژن، یک مکان پیوسته با عملکرد بیولوژیکی، یک مکان پیوسته با وزن شاخه فرعی، یک مکان پیوسته با تعداد کپسول ساقه اصلی، یک مکان پیوسته با وزن کپسول ساقه فرعی و یک مکان پیوسته با درجه روز تا کپسولدهی شناسایی شد.
بحث
با توجه به اینکه در تجزیه ارتباط و شناسایی نشانگرهای مرتبط با صفات، یکی از ارکان اساسی بررسی ساختار جمعیت است، بنابراین ابتدا ساختار جمعیت مورد مطالعه با استفاده از هفت آغازگر IRAP و 13 آغازگر REMAP مورد بررسی قرار گرفت. این آغازگرها در کل 119 مکان ژنومی را تکثیر نمودند که 67/56 درصد مکانهای تکثیری دارای چندشکلی بودند. چندشکلی نسبتاً بالای حاصل در پژوهش حاضر را میتوان به فعالیت بالای رتروترنسپوزونها در ژنوم کتان و درج آنها در نواحی یوکروماتینی و ژنی و وسعت مناطق جغرافیایی نمونهبرداری شده نسبت داد (26). اسمایکل و همکاران (2011) با استفاده از روش iPBS حدود 90 خانواده رتروترنسپوزونی LTR دار کتان (L. usitatissimum) شناسایی و گزارش نمودند که این رتروترنسپوزونها در گونههای مختلف جنس لینوم (Linum) فعال بوده و چندشکلی قابل توجهی نشان میدهند و میتوان از آنها به عنوان نشانگرهای مولکولی در این جنس استفاده نمود (26). در مطالعه ملنیکوا و همکاران (2014)، از بین آغازگرهای مورد مطالعه دو آغازگر LTR1845 و LTR1899 با فعالیت ادغامی بالا به عنوان آغازگرهای منحصر به فرد شناخته شده و برای بررسی تنوع ژنتیکی واریتههای کتان مورد استفاده قرار گرفتند (20).
ساختار ژنتیکی جمعیت نشاندهنده اثر متقابل بین گونهها با توجه به تاریخ تکامل طولانی مدت، جهش و نوترکیبی، راندهشدگی ژنتیکی، سیستم تولید مثلی، جریان ژنی و انتخاب طبیعی میباشد (25). بنابراین ارزیابی ساختار ژنتیکی پیش نیاز حفاظت و استفاده کارآمد از ژرمپلاسم در دسترس برای برنامههای اصلاحی میباشد (19). همچنین در مطالعات تجزیه ارتباط در حالت ایدهآل نباید ساختاری در جمعیت مورد مطالعه وجود داشته باشد، یعنی جمعیت نباید خود به لحاظ ساختاری به زیر گروهها تقسیم شود، زیرا وجود ساختار در جمعیت میتواند عامل بازدارنده در جهت دستیابی به نتایج قابل اعتماد باشد. در صورتیکه اثر ساختار جمعیت و روابط خویشاوندی در تجزیه ارتباط در نظر گرفته نشوند، احتمال حصول نتایج مثبت کاذب در مطالعه وجود خواهد داشت (6). بنابراین آگاهی از ساختار جمعیت به عنوان یک پیشنیاز در نقشهیابی ارتباطی میتواند به منظور اجتناب از ارتباطات دروغین بین نشانگرها و صفات استفاده شود (22). به همین منظور، در این تحقیق ساختار ژنتیکی جمعیت و تعداد مناسب زیر جمعیتها بر اساس روش بیزین در نرمافزار Structure برآورد شد تا به عنوان کوواریت در تجزیه ارتباط در نظر گرفته شود. بر اساس نتایج حاصل، دو زیرجمعیت احتمالی در ژرمپلاسم مورد مطالعه شناسایی شد (شکل 2) که به عنوان K بهینه در تخمین ساختار جمعیت و ماتریس سهم عضویت افراد در هر کلاستر (ماتریس Q) در نظر گرفته شد. در گروه اول متوسط شاخص تثبیت بیش از 21/0 بود که نشاندهنده تمایز نسبتاً بالا و جریان ژنی نسبتاً پایین بین جمعیتها میباشد (8).
نقشهیابی ارتباطی به منظور تشخیص و شناسایی ارتباط بین نشانگر-صفت نیازمند وجود تنوع ژنتیکی و فنوتیپی بالا در جمعیت مورد مطالعه میباشد (37). وجود ساختار و روابط خویشاوندی در جمعیت مورد مطالعه منجر به ایجاد ارتباط کاذب نشانگر-صفت در نقشهیابی ارتباطی میشود (2). مدلهای مختلفی برای کاهش نتایج مثبت کاذب در تجزیه ارتباط مورد استفاده قرار میگیرد که از آن جمله میتوان به ماتریس K در داخل مدل K و ماتریس Q در داخل مدل Q اشاره نمود. مدل دیگر Q+K میباشد که ترکیبی از دو مدل قبلی است و تأثیر آن در کاهش نتایج مثبت کاذب بیشتر از دو مدل Q و K میباشد (33).
در مدل خطی عمومی (GLM) تنها ساختار جمعیت، ولی در مدل خطی مخلوط (MLM) علاوه بر ماتریس ساختار جمعیت (ماتریس Q)، ماتریس روابط خویشاوندی (ماتریس K) بین افراد جمعیت نیز در تجزیه ارتباط بهعنوان کوواریت در نظر گرفته میشوند و بنابراین ارتباطات و پیوستگیهای دروغین بین نشانگر و صفت به حداقل میرسد. همچنین میزان تأثیر نشانگرها به وسیله ضریب Benferroni تصحیح گردید که این تصحیح نیز باعث کاهش ارتباطات دروغین نشانگر صفت میشود (35). با کاربرد مدل MLM در کتان نیز، بهبود معنیداری در کاهش نتایج مثبت دروغین در بررسی صفاتی مانند وزن هزار دانه، ارتفاع گیاه، شروع گلدهی، پایان گلدهی و شاخهدهی گیاه در مقایسه با مدلهای خطی منفرد K یا Q نشان داده شده است (30). سوتو-سردا و همکاران (2013) در مکانیابی ارتباطی در ژرمپلاسم کتان روغنی و فیبری اظهار داشتند که استفاده از مدل MLM به کاهش نتایج مثبت دروغین (ارتباطات کاذب نشانگر-صفت) و اریبی کمتر نتایج کمک زیادی میکند (27). عبدالهی مندولکانی و عزیزی (1393) برای شناسایی نشانگرهای مرتبط با صفات مورفولوژیک در یونجه از تجزیه ارتباط مبتنی بر نشانگرهای ISSR استفاده نمودند و بیان کردند که این روش برای شناسایی مکانهای آگاهی بخش مرتبط با صفات مورفولوژیک مفید و مطمئن بوده و نشانگرهای حاصل از این مطالعات میتواند در برنامههای گزینش به کمک نشانگر و تهیه جمعیتهای نقشهیابی استفاده شوند (1). هوشیاردل و همکاران (1394) جهت شناسایی مکانهای ژنی کنترلکننده زمان گلدهی در جمعیت ژنتیکی شامل 100 فرد F2 حاصل از تلاقی ژنوتیپ توتون شرقی SPT406 (والد پدری) و Basma seres 31 (والد مادری) با استفاده از روشهای مکانیابی فاصلهای ساده و مرکب به ترتیب 9 و 2 QTL برای صفت مورد مطالعه شناسایی کردند (4). در مطالعه حاضر از روش MLM جهت شناسایی مکانهای پیوسته با ژنهای کنترلکننده صفات زراعی-مورفولوژیک استفاده شد که در نهایت 21 مکان پیوسته با 20 صفت شناسایی شد. سوتو-سردا و همکاران ( a2014) با استفاده از نشانگرهای SSR، نه نشانگر را در Pale flax و پنج نشانگر را در کتان زراعی شناسایی نمودند که رابطه معنیداری با صفات مختلف زراعی-مورفولوژیک نشان میدادند (28). بیشترین تعداد مکان پیوسته (چهار مکان) برای صفت وزن برگ و کمترین تعداد (یک مکان) برای صفات عملکرد بیولوژیکی، وزن شاخه فرعی، تعداد کپسول ساقه اصلی، وزن کپسول ساقه فرعی و درجه روز تا کپسولدهی شناسایی شد (جدول 4). نتایج حاصله با نتایج سوتو-سردا و همکاران ( c2014) که وزن هزار دانه (با پنج مکان) بیشترین تعداد مکان پیوسته را به خود اختصاص داد مغایر بود (30). این تفاوت ممکن است به دلیل نوع نشانگرهای مورد استفاده و اندازه جمعیت در هر تحقیق باشد. مکان LTR1854-UBC443-4 (مرتبط با صفت وزن کپسول ساقه اصلی) بیشترین مقدار ضریب تغییرات فنوتیپی توجیه شده (R2) را داشت. از این رو میتوان گفت که 23 درصد از تنوع فنوتیپی صفت وزن کپسول ساقه اصلی توسط این مکان توجیه میشود. کم بودن مقدار ضریب تبیین (R2) برای اکثر نشانگرهای مرتبط مؤید ماهیت توارث کمی و چندژنی صفات مورد ارزیابی میباشد و نشاندهنده توجیه بخش کمی از تغییرات این صفات از طریق مکانهای ژنی شناسایی شده و بنابراین تأثیر بیشتر اثر محیط روی تغییرات این صفات میباشد. در این تحقیق، برای برخی از صفات مکانهای مشترک شناسایی شد. به عنوان مثال مکان LTR1833-LTR1868-3 با سه صفات زراعی-مورفولوژیک مورد مطالعه پیوستگی نشان داد (جدول 4). شناسایی مکانهای مشترک میتواند ناشی از اثرات پلیوتروپی و یا پیوستگی نواحی ژنومی دخیل در کنترل این صفات باشد (16). وجود چنین حالتی کارآیی گزینش بر اساس نشانگر را افزایش داده و موجب میشود به دنبال اصلاح یک صفت در یک گیاه، احتمال افزایش یا کاهش ارزش صفات همبسته دیگر نیز وجود داشته باشد (14). بهبود عملکرد کتان از طریق اجزاء عملکرد و صفات وابسته همانند زمان گلدهی میتواند مفید باشد. از طرف دیگر عملکرد بذر به عنوان صفت اقتصادی مهم در این گیاه به شمار میآید که عوامل زیادی همچون ژنوتیپ و محیط روی آن تأثیر میگذارند (30). بنابراین از مکانهای LTR1833-LTR1868-3، LTR1854-LTR1868-9، LTR1868-A13-9، LTR1868-LTR1886-7، LTR1854-UBC-4 و LTR1854 -4 در صورت تأیید میتوان برای گزینش افراد جهت افزایش شاخص برداشت، وزن کپسول ساقه اصلی و عملکرد بیولوژیکی و در نتیجه افزایش عملکرد بذر و عملکرد روغن کتان بهره جست. عملکرد روغن از ترکیب عملکرد بذر و مقدار روغن به دست میآید. بنابراین کاهش عملکرد دانه باعث کاهش عملکرد روغن میشود (30). نتایج این تحقیق میتواند در انتخاب غیر مستقیم صفات از طریق نشانگرهای مرتبط و پیوسته با آنها مفید باشد. البته برای اطمینان از وجود ارتباط پیوستگی بین نشانگرها و صفات مختلف زراعی-مورفولوژیک نیاز به تهیه جمعیتهای تفرق مانند F2، RIL و DH میباشد تا بر اساس این جمعیتها نقشههای پیوستگی تهیه و سپس محل مکانهای کنترلکننده این صفات روی کروموزومها مشخص شود (24). نتایج مطالعه حاضر بیانگر کارآیی مدل MLM در شناسایی نشانگرهای پیوسته با صفات مهم مرتبط با عملکرد دانه در ژنوتیپهای کتان زراعی میباشد. البته بهتر است جهت افزایش کارآیی شناسایی نشانگرهای مرتبط، از نشانگرهای بیشتر و مؤثرتر مانند نشانگرهای SNP و SSR در مطالعات تجزیه ارتباط استفاده شود. همچنین لازم است نشانگرهای شناسایی شده در چنین مطالعاتی در جمعیتهای بزرگ با تنوع ژنتیکی بالا مورد بررسی قرار گیرند تا از ارتباط آنها با صفات مورد مطالعه اطمینان حاصل شود و بدین ترتیب کارآیی کاربرد این نشانگرها در برنامههای بهنژادی کتان زراعی افزایش یابد.