نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 گروه علوم باغبانی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه ارومیه، ایران
2 هیات علمی دانشگاه ارومیه
3 مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی دارویی زنجان، دانشکده داروسازی، دانشگاه علوم پزشکی زنجان، ایران
چکیده
گیاه بذرالبنج مشبک Hyoscyamus reticulatus L.)) منبع غنی از آلکالوئیدهای تروپانی هیوسیامین و اسکوپولامین می باشد. در پژوهش حاضر، ریشههای موئین از ریزنمونههای کوتیلدون دو هفتهای، گیاه بذرالنج مشبک با استفاده از سویه A7 آگروباکتریوم رایزوژنز تهیه شدند. اثر غلظتهای مختلف (صفر، 5، 10 و20 میلیگرم بر لیتر) عصاره قارچ فوزاریوم گرامینهروم در زمانهای مختلف (24، 48 و 72 ساعت) بر میزان رشد، فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدانی، میزان فنل کل، میزان آلکالوئیدهای تروپانی و میزان بیان ژن هیوسیامین-6- بتا هیدروکسیلاز(h6h) در ریشههای موئین بذرالبنج مشبک بررسی گردید. نتایج آنالیز دادهها نشان داد که میزان وزن تر و خشک تحت تاثیر غلظتهای بالای محرک عصاره قارچ فوزاریوم کاهش یافت. فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی شامل کاتالاز، گایاکول پراکسیداز و آسکوربات پراکسیداز و همچنین میزان فنل کل در ریشههای موئین تیمار شده، در مقایسه با شاهد افزایش یافت. نتایج آنالیز GC نشان داد که در تیمار قارچ فوزاریوم بیشترین میزان هیوسیامین و آسکوپولامین (5/27 و 41/40 درصد به ترتیب) در غلظتهای 5 و 10 میلیگرم برلیتر و زمان 48 ساعت بدست آمدند. نتایج آنالیز بیان RT-PCR نشان داد که بیشترین میزان بیان این ژن در تیمار عصاره قارچ فوزاریوم در غلظت 10 میلیگرم برلیتر در 48 ساعت مشاهده شد. براساس این نتایج چنین استنباط میشود که محرک عصاره قارچ فوزاریوم گرامینهروم میتواند به عنوان محرک موثر جهت تولید متابولیتهای ثانویه گیاهی از جمله آلکالوئیدهای تروپانی مورد استفاده قرار گیرد.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
h6h gene transcript enhancement and production of tropane alkaloids in Hyoscyamus reticulatus L. hairy root cultures elicited by Fusarium graminearum extract
نویسندگان [English]
1 Department of Horticulture, Faculty of Agriculture, Urmia University, Iran.
3 Zanjan Pharmaceutical Biotechnology Research Center, Zanjan University of Medical Sciences, Zanjan, Iran
چکیده [English]
Hyoscyamus reticulatus L. is a main source of tropane alkaloids, hyoscyamine and scopolamine. In the present study, hairy roots were prepared from two-weekly cultures of cotyledon transformed by A7 strain of Agrobacterium rhizogenes. The effect of different concentrations of Fusarium graminearum extract (0, 5, 10 and 20 mg/L) at different exposure times (24, 48 and 72 hours) on growth rate, antioxidant enzymes activity, total phenol, tropane alkaloids contents and expression level of Hyoscyanamine-6-beta-hydroxylase (h6h) gene were investigated. Data analysis results showed that fresh and dry weight under influence of high concentrations of Fusarium fungus extract was reduced. The activity of antioxidant enzymes including catalase, guaiacol peroxidase and ascorbate peroxidase as well as total phenol content in treated hairy roots was enhanced compared to control. GC analysis showed that the highest levels of hyoscyamine and scopolamine (27.5 and 40.41% respectively) were found in 5 and 10 mg of elicitor at 48 h exposure time. RT-PCR expression analysis results revealed that the highest expression of this gene was obtained in Fusarium fungus extract (10 mg/l) at 48 h exposure time. Based on these results, it is concluded that the Fusarium graminearum elicitor can be used as an effective stimulant for the production of secondary metabolites, including tropane alkaloids.
کلیدواژهها [English]
افزایش بیان ژن h6h و تولید تروپان آلکالوئیدها در کشت ریشههای مویین گیاه دارویی بذرالبنج مشبک تهییج شده با عصاره قارچ فوزاریوم گرامینهروم
کمال رشیدیاصل1، بهمن حسینی1، علی شرفی2 و حامد محمد پور2
1 ایران، ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده کشاورزی، گروه علوم باغبانی
2 ایران، زنجان، دانشگاه علوم پزشکی زنجان، دانشکده داروسازی، مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی دارویی
تاریخ دریافت:21/9/96 تاریخ پذیرش: 10/4/97
چکیده
گیاه بذرالبنج مشبک Hyoscyamus reticulatus L.)) منبع غنی از آلکالوئیدهای تروپانی هیوسیامین و اسکوپولامین می باشد. در پژوهش حاضر، ریشههای مویین از ریزنمونههای کوتیلدون دو هفتهای، گیاه بذرالنج مشبک با استفاده از سویه A7 آگروباکتریوم رایزوژنز تهیه شد. اثر غلظتهای مختلف (صفر، 5، 10 و20 میلیگرم بر لیتر) عصاره قارچ فوزاریوم گرامینهروم در زمانهای مختلف (24، 48 و 72 ساعت) بر میزان رشد، فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدانی، میزان فنول کل، میزان آلکالوئیدهای تروپانی و میزان بیان ژن هیوسیامین-6- بتا هیدروکسیلاز(h6h) در ریشههای مویین بذرالبنج مشبک بررسی گردید. نتایج آنالیز دادهها نشان داد که میزان وزن تر و خشک تحت تأثیر غلظتهای بالای محرک عصاره قارچ فوزاریوم کاهش یافت. فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی شامل کاتالاز، گایاکول پراکسیداز و آسکوربات پراکسیداز و همچنین میزان فنول کل در ریشههای مویین تیمار شده، در مقایسه با شاهد افزایش یافت. نتایج آنالیز GC نشان داد که در تیمار قارچ فوزاریوم بیشترین میزان هیوسیامین و آسکوپولامین (5/27 و 41/40 درصد به ترتیب) در غلظتهای 5 و 10 میلیگرم برلیتر و زمان 48 ساعت به دست آمد. نتایج آنالیز بیان RT-PCR نشان داد که بیشترین میزان بیان این ژن در تیمار عصاره قارچ فوزاریوم در غلظت 10 میلیگرم برلیتر در 48 ساعت مشاهده شد. براساس این نتایج چنین استنباط میشود که محرک عصاره قارچ فوزاریوم گرامینهروم میتواند به عنوان محرک مؤثر جهت تولید متابولیتهای ثانویه گیاهی از جمله آلکالوئیدهای تروپانی مورد استفاده قرار گیرد.
واژه های کلیدی: آنزیمهای آنتی اکسیدانی، بیان ژن، آسکوپولامین، فوزاریوم گرامینهروم، هیوسیامین-6- بتا هیدروکسیلاز
* نویسنده مسئول، تلفن: 044132779558 ، پست الکترونیکی: b.hosseini@urmia.ac.ir
مقدمه
بذرالبنج، گیاهی یک ساله، دوساله و یا چندساله میباشد. رشد اولیه گونههای مختلف بذرالبنج بسیار کند است. ﻫﻴﻮﺳﻴﺎﻣﻴﻦ و اﺳﻜﻮﭘﻮﻻﻣﻴﻦ، از آﻟﻜﺎﻟﻮﺋﻴﺪﻫﺎی ﺗﺮوﭘﺎﻧﻲ ﺑﻮده ﻛـﻪ در ﺑﺬراﻟﺒﻨﺞ ﺗﻮﻟﻴﺪ ﻣﻲﺷﻮﻧﺪ. هیوسیامین و اسکوپولامین به عنوان داروهای مهارکننده اعصاب پاراسمپاتیک میباشند (39) بیوسنتز تروپان آلکالوئیدها مانند هیوسیامین و آسکوپولامین با تشکیل یون -Nمتیل پیرولینیوم از آمینواسیدهای اورنیتینو آرژنین آغاز میشود (28). در مسیر بیوسنتز تروپان آلکالوئیدهای یاد شده، آنزیمهای بسیاری نقش دارند (21 و 29)، در آخرین مرحلة مسیر بیوسنتزی تروپان آلکالوئیدها، هیوسیامین توسط آنزیم هیوسیامین 6-β هیدروکسیلاز (H6H)، هیوسیامین به آسکوپولامین (هیوسین)، کاتالیز میشود. ﺳﻨﺘﺰ ﺷﻴﻤﻴﺎﻳﻲ و ﻣﺼﻨﻮﻋﻲ اﻳﻦ ﺗﺮﻛﻴﺒﺎت، ﭘﻴﭽﻴﺪه و ﻣﻴﺰان ﺗﻮﻟﻴﺪ آﻧﻬﺎ ﺑه طﻮر ﻃﺒﻴﻌﻲ ﻛﻢ ﻣﻲﺑﺎﺷﺪ. ﺑﻨﺎﺑﺮاﻳﻦ اﺻﻼح ﻛﻨﻨﺪﮔﺎن ﮔﻴﺎﻫﻲ ﺳﻌﻲ در اﺳﺘﻔﺎده از روﺷﻬﺎی ﻧﻮﻳﻦ فنآوری زیستی ﺟﻬﺖ اﻓﺰاﻳﺶ ﻣﻴﺰان ﺗﻮﻟﻴﺪ آﻟﻜﺎﻟﻮﺋﻴﺪﻫﺎ و ﻫﻤﭽﻨﻴﻦ ﻛﺎﻫﺶ ﻫﺰﻳﻨﻪﻫﺎی ﺗﻮﻟﻴﺪ اﻳﻦ ﻣﺘﺎﺑﻮلیتها دارﻧﺪ. در طی سالهای اخیر، کشت ریشههای مویین توسعه یافته است و منبع بالقوه و با ارزشی برای تولید متابولیتهای ثانویه میباشند (8 و 33). محرکهای قارچی برای ارتقای سنتز ترکیبات مهم تجاری از محیط کشت سلولهای گیاهی به صورت وسیعتری مورد مطالعه قرار گرفته اند .قارچهایی که معمولاً باعث پاسخهای فوق حساسیتی در سلولهای گیاهی میشوند، باعث فعال شدن مسیرهای دفاعی گیاهی شده و منجر به افزایش تولید فیتوآلکسین میشود (9). در مطالعهای دیگر، افزایش بیوسنتز لیگنین در کشت سوسپانسیون سلولی Linum album توسط عصارههای قارچی نشان داد که عصاره قارچ Fusarium graminearum موجب بالاترین تولید میزان پودوفیلوتوکسین در کشت سلولی کتان سفید (Linum album) شد (5). با توجه به اینکه تولید سریع و انبوه متابولیتهای ثانویه از طریق روشهای شیمیایی عمدتاً پرهزینه، مشکل و یا غیرممکن میباشد و نیز بهدلیل اهمیت اقتصادی این متابولیتها و تولید اندک آنها در گیاهان دارویی، راهکارهایی مثل کشت ریشههای مویین (32)، استفاده از محرکهای زیستی و غیرزیستی میتواند تولید این متابولیتها را بهبود ببخشد. به همین منظور این مطالعه به منظور بررسی اثر عصاره قارچ فوزاریوم گرامینهروم بر روی خصوصیات رشدی، فیتوشیمیایی و بیان ژن h6h انجام گردید.
مواد و روشها
آزمایشهای مربوط به کشت گیاه بذرالبنج مشبک، آنالیز خصوصیات رشدی و بیوشیمیایی در آزمایشگاه گروه علوم باغبانی دانشگاه ارومیه و آنالیز فیتوشیمیایی آلکالوئیدهای تروپانی و همچنین تحقیقات مولکولی این پژوهش نیز در آزمایشگاه مرکز علوم تحقیقات زیست فناوری پردیس دانشگاه ارومیه در سالهای 1395 و 1396 انجام شد.
کشت گیاه بذرالبنج مشبک: بذرهای گیاه بذرالبنج مشبک از شرکت پاکان بذر اصفهان تهیه گردید. بعد از ضدعفونی با اتانول 70 درصد و هیپوکلریت سدیم، بذرها در داخل محیط کشت MS (25)، کشت شدند. بهمنظور تلقیح ریزنمونههای گیاهی، کوتیلدونها از گیاهچههای مادری استریل جدا و بهمدت 3 دقیقه درون سوسپانسیون باکتریاییAgrobacterium rihzogenes سویه A7 غوطهور شدند. ریزنمونههای تلقیح شده به محیط کشت MS جامد (محیط همکشتی) منتقل و بهمدت 48 ساعت، داخل انکوباتور با دمای 25 درجه سانتی گراد و در شرایط تاریکی نگهداری شدند.
کشت ریشههای مویین با محرک عصاره قارچ فوزاریوم گرامینهروم: میسیلیومهای رشد کرده قارچ فوزاریومگرامینهروم در محیط مایع آماده و عصاره سلولی قارچ، از گروه بیماریشناسی گیاهی دانشگاه ارومیه تهیه گردید. ابتدا میسیلیومها در ازت مایع و با هاون خرد شده و به شکل پودر تهیه گردید .پودر حاصل در آب مقطر استریل حل و به غلظت نهایی200 میلیگرم در لیتر رسانده شد .سوسپانسیون قارچ با 14000 دور در دقیقه به مدت 12 دقیقه در 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ گردید .در انتها مایع رویی برداشته و برای استریل کردن از فیلتر 22 میکرونی استفاده گردید. از غلظتهای (صفر، 5، 10 و20 میلیگرم بر لیتر) عصاره قارچ در زمانهای مختلف (24، 48 و 72 ساعت) استفاده گردید.
استخراج و آنالیز آلکالوئیدها: استخراج آلکالوئیدها به روش Kamada و همکاران (17) انجام شد. به منظورجداسازی و شناسایی آلکالوئیدهای تروپانی هیوسیامین و آسکوپولامین از دستگاه کروماتوگرافی گازی Helwentt-Packard ، مدلHP 7890A GC و کروماتوگراف گازی متصل شده به طیف سنج جرمی Helwentt-Packard ، مدل 5975C ، مجهز به ستون موئینه 5-HP به طول 30 متر و قطر 25/0 میلیمتر، با ضخامت لایه فاز ساکن 25/0 استفاده گردید. دمای محفظه تزریق 270 درجه سانتیگراد، میزان تزریق 1 میکرو لیتر و انرژی یونیزاسیون 70 الکترون ولت بود. برنامه حرارتی در دامنه 280-60 درجه با سرعت 5 درجه بر دقیقه و دمای محفظه تزریق 270 درجه بود.
تأیید مولکولی تراریختی ریشههای موئین: بدینمنظور، DNA ژنومی ریشههای مویین و ریشه غیر تراریخت حاصل از جوانهزنی بذرهای کشت شده به روش CTAB،استخراج شد (19). به منظور تأیید حضور ژن rolB آگروباکتریوم رایزوژنز در ریشههای مویین بذرالبنج مشبک، واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)انجام گردید و توالی آغازگرهای:
Forward Primer: 5' – ATGGATCCCAAATTGCTATTCCCCCACGA-3'
Reverse Primer: 5' – TTAGGCTTCTTTCATTCGGTTTACTGCAGC-3'
به منظور تکثیر قطعات bp 780 ژن rolB مورد استفاده قرار گرفتند.
اندازه گیری فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدانی: استخراج عصاره گیاهی جهت سنجش فعالیت آنزیمها: 5/0 گرم بافت گیاهی تازه توزین و به میزان پنج برابر وزن آن بافر استخراج شامل Tris-HCL 50 میلی مولار با 5.7pH: ، MgCl2 3 میلیمولار و EDTA 1 میلیمولار اضافه و بر روی یخ به مدت 20 دقیقه ساییده شد تا یک عصاره کاملاً همگن به دست آمد. هموژنات حاصل به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد با سرعت 5000 دور در دقیقه سانتریفیوژ گردید و محلول رویی حاصل به عنوان عصاره خام جهت اندازه گیری فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدانی شامل آنزیمهای کاتالاز، گایاکول پراکسیداز و آسکوربات پراکسیداز مورد استفاده قرار گرفت (31) .
استخراج عصاره گیاهی جهت سنجش میزان فنول کل: این آزمایش براساس روش Hajimahdipour و همکاران (13)، با کمی تغییر انجام گرفت. ابتدا 5/0 گرم از ریشه مویین تر داخل هاون سرد قرار داده شد. سپس 10 میلی لیتر متانول 80 درصد به آن اضافه و به طور کامل ساییده شد. سپس به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ در سرعت 10000 دور در دقیقه در دمای 4 درجه انجام گردید. بعد 50 میکرولیتر از عصاره با 1200میکرولیتر معرف فولین 10 درصد داخل لولههای شیشهای تمیز ریخته و پس از 5 دقیقه انتظار، به آن 960 میکرولیتر کربنات سدیم 5/7 درصد اضافه و در آخر 180 میکرولیتر آب مقطر اضافه گردید. سپس لولههای شیشهای به مدت 40-30 دقیقه در تاریکی قرار گرفت. در آخر در طول موج 760 نانومتر با اسپکتوفتومتر خوانده شد. از اسید گالیک برای رسم منحنی استاندارد استفاده شد و نهایتاً نتایج نیز بر اساس میلیگرم اسید گالیک بر گرم وزن تر گزارش گردید.
آنالیز بیان ژنh6h : ذخیره کردن توالی ژنها از پایگاههای اطلاعاتی و طراحی آغازگر: ژن h6h از مهمترین ژنهای درگیر در مسیر تولید تروپان آلکالوئیدها در گیاه بذرالبنج مشبک میباشد. به منظور طراحی آغازگر برای این ژن ابتدا توالی، نواحی کدکننده ژن مذکور از بانک اطلاعاتی NCBI ذخیره شد. در این تحقیق از نرم افزارهای Fast PCR برای طراحی استفاده شد. توالی آغازگرهای ژن h6h و 18s rRNA مطابق جدول 1 میباشد.
جدول1- مشخصات آغازگرهای مورد استفاده در تکنیک RT- PCR
ژن |
14(5'→3')"> توالی |
دمای اتصال |
طول قطعه تکثیری(bp) |
h6h |
F: TGGCTACTTTTGTGTCGAACTGG |
66 |
625 |
|
R: CTTGGGTCTGGGCATGGTG |
|
|
18s rRNA |
F: ATGATAACTCGACGGATCGC |
60 |
165 |
|
R: CTTGGATGTGGTAGCCGTTT |
|
|
استخراج RNA و سنتز cDNA: استخراج RNA از نمونههای ریشه مویین خشک با استفاده از محلول استخراج RNAX-plus (سیناکلون، ایران) مطابق دستورالعمل پیشنهادی شرکت سازنده با کمی تغییرات انجام شد. برای سنتز cDNAاز RNAی استخراجی با استفاده از کیت First Strand cDNA Synthesis (سیناکلون، ایران) مطابق دستورالعمل پیشنهادی شرکت سازنده با کمی تغییرات انجام شد. قبل از شروع کار تمام وسایل استریل شده و به مدت 15 دقیقه زیر نور UV در داخل هود قرار گرفتند و تمام مراحل استخراج بر روی یخ انجام شد.
بررسی صحت ساختcDNA و بهینه سازی دمای اتصال ژنهای مربوطه: cDNAبا استفاده از آغازگرهای ژن 18s-rRNA در فرآیند PCR با حجم نهایی 20 میکرولیتر تکثیر شد. برای انجام واکنش PCR از 5/12 میکرولیترPCR Master Mix (پیشگامان)، 5/0 میکرولیتر از هر کدام از آغازگرهای رفت و برگشت، 2 میکرولیتر cDNA استفاده شد. شرایط دمایی مورد استفاده برای ژن 18s-rRNA شامل واسرشتسازی اولیه در دمای 94 درجه به مدت 5 دقیقه، 35 چرخه شامل دمای 94 درجه به مدت 30 ثانیه، 60 درجه به مدت 30 ثانیه، 72 درجه به مدت 40 ثانیه و بسط نهایی در 72 درجه به مدت 5 دقیقه میباشد. محصولات PCR پس از افزودن 7 میکرولیتر لودینگ بافر بر روی ژل آگارز 1 درصد قرار گرفت و بعد از الکتروفورز 90 ولت برای 1 ساعت، عکسبرداری انجام گرفت. برای انجام واکنش PCR ژنh6h از 5/12 میکرولیترPCR Master Mix (پیشگامان)، 5/0 میکرولیتر از هر کدام از آغازگرهای رفت و برگشت، 2 میکرولیتر cDNA رقیق شده (50 :1) و 5/4 میکرولیتر آب عاری از DNA استفاده شد. شرایط دمایی مورد استفاده برای ژن h6hشامل واسرشت سازی اولیه در دمای 94 درجه به مدت 5 دقیقه، 35 چرخه شامل دمای 94 درجه به مدت 1 دقیقه، 66 درجه به مدت 55/1 دقیقه، 72 درجه به مدت 40/1 دقیقه و بسط نهایی در 72 درجه به مدت 10 دقیقه میباشد.
برای بررسی صحت تکثیر ژن h6h از واکنش کنترل منفی –RT و NTC استفاده شد.
واکنش کنترل منفی RT: این واکنش جهت تشخیص وجود آلودگی DNA در نمونههای RNA استخراج شده ضروری است. در این واکنش تمام اجزای واکنش برای سنتز cDNA به جز آنزیم Reverse transcriptase مورد استفاده قرار میگیرد. با توجه به عدم استفاده از آنزیم نباید در این نمونهcDNA سنتز شود بنابراین در مرحله تکثیر ژن مورد مطالعه با استفاده از این cDNA نباید باندی مشاهده شود. وجود باند بیانگر وجود آلودگی DNA است.
آنالیز داده ها و محاسبات آماری: آزمایشات مربوط به هر محرک به صورت فاکتوریل در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی و با سه تکرار انجام گردید و دادههای حاصل از آزمایش با استفاده از نرم افزار SAS 9.1 مورد تجزیه تحلیل قرار گرفت. مقایسات میانگین توسط آزمون چند دامنهای دانکن انجام گردید و برای رسم نمودارها از نرم افزار Excel استفاده شد. همچنین برای آنالیز کردن نتایج RT-PCR از نرم افزار Pixcavator 6.0 استفاده شد.
نتایج
تعیین منحنی رشد ریشههای مویین گیاه بذرالبنج مشبک: قبل از اعمال تیمار مورد نظر، وضعیت رشد 5/0 گرم ریشه مویین به مدت 5 هفته در محیط کشت MS پایه مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که بعد از کشت، وزن تر سلولها شروع به افزایش کرده که این روند افزایش تا هفته سوم به صورت لگاریتمی بود. بعد از این زمان سرعت افزایش وزن کاهش یافت و در هفته پنجم روند رشدی نامحسوس شد (شکل 1). در اواخر دوره لگاریتمی و در آستانه دوره ایستایی (روز 22-19ام) که در این زمان زیست توده ریشه مویین به حد مناسبی رسیده بود، به عنوان زمان القای محرکها انتخاب گردید.
شکل 1- نرخ رشد ریشه های مویین گیاه بذرالبنج مشبک در محیط کشت MS مایع در دمای 25 درجه و سرعت شیکر 120 دور در دقیقه
تأثیر محرک عصاره قارچ فوزاریومگرامینهروم بر رشد ریشههای مویین بذرالبنج مشبک: نتایج تجزیه واریانس تأثیر غلظت و مدت زمان تیمار با عصاره قارچ فوزاریومگرامینهروم بر رشد ریشههای مویین بذرالبنج مشبک در جدول 2 نشان داده شده است. نتایج مقایسه میانگین دادهها نشان داد که اثرات متقابل غلظت و مدت زمان تیمار با عصاره قارچ فوزاریومگرامینهروم بر رشد ریشههای مویین بذرالبنج مشبک در سطح احتمال 1و 5 درصد به ترتیب در وزن تر و خشک ریشههای مویین تیمار شده معنیدار گردید. بیشترین میزان وزن تر (16/14 گرم) در تیمار 5 میلیگرم بر لیتر در مدت 72 ساعت تیمار و کمترین میزان وزن تر (57/5) در تیمار 20 میلیگرم برلیتر به مدت 72 ساعت مشاهده گردید (شکل 2). بیشترین میزان وزن خشک (91/0 گرم) در تیمار شاهد و در مدت زمان تیمار 72 ساعت نگهداری در محیط مایع و کمترین میزان وزن خشک (48/0 گرم) در تیمار 20 میلیگرم برلیتر در مدت زمان تیمار 72 ساعت به دست آمد (شکل 2).
جدول 2- تجزیه واریانس تأثیر غلظت و مدت زمان تیمار با محرک عصاره قارچ فوزاریوم گرامینه روم بر رشد ریشه های مویین بذرالبنج مشبک
میانگین مربعات |
|||
وزن خشک ( گرم ) |
وزن تر ( گرم( |
درجه آزادی |
منابع تغییرات |
**132/0 |
**92/68 |
3 |
غلظت تیمار (a) |
ns01/0 |
**03/18 |
2 |
زمان تیمار (b) |
*018/ |
**41/8 |
6 |
اثر متقابل (a*b) |
006/0 |
35/2 |
24 |
اشتباه آزمایشی |
/11 |
40/14 |
|
ضریب تغییرات (درصد) |
** * و ns به ترتیب نشان دهنده اختلاف معنیدار در سطح احتمال 1و 5 درصد و عدم وجود اختلاف معنیدار میباشد.
الف |
ب |
شکل 2- مقایسه میانگین اثرات متقابل غلظت و زمان تیمار با محرک عصاره قارچ فوزاریوم گرامینهروم بر وزن تر (الف) و خشک (ب) ریشههای مویین بذرالبنج مشبک. حروف مشابه نشاندهنده عدم وجود اختلاف معنیدار در سطح احتمال 5 آزمون دانکن میباشد
تأثیر محرک عصاره قارچ فوزاریومگرامینهروم بر میزان فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی ریشههای مویین بذرالبنج مشبک: نتایج تجزیه واریانس تأثیر غلظت و مدت زمان تیمار با عصاره قارچ فوزاریومگرامینهروم بر میزان فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی ریشههای مویین بذرالبنج مشبک در جدول 3 نشان داده شده است. نتایج مقایسه میانگین نشان داد که اثرات متقابل غلظت و زمان تیمار عصاره قارچ فوزاریومگرامینهروم فقط در آنزیمهای گایاکولپراکسیداز در سطح احتمال 5 درصد معنیدار بود. حداکثر میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در غلظت 10 میلیگرم عصاره قارچ، گایاکولپراکسیداز در غلظت 10 میلیگرم و آسکورباتپراکسیداز در غلظت 5 میلیگرم محرک و به ترتیب در مدت زمانهای 24، 72 و 24 ساعت زمان تیمار ثبت گردید. حداقل میزان فعالیت آنزیمهای کاتالاز، گایاکولپراکسیداز و آسکورباتپراکسیداز در تیمار شاهد مشاهده گردید (شکل 3).
جدول 3- تجزیه واریانس تأثیر غلظت و مدت زمان تیمار با محرک عصاره قارچ فوزاریوم گرامینه روم بر میزان فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدانی و میزان فنول کل ریشه های مویین بذرالبنج مشبک
|
میانگین مربعات |
||||
فنل کل (mg GA/g FW) |
APX (mg pro/min) |
GPX (mg pro/min) |
CAT (mg pro/min) |
درجه آزادی |
منابع تغییرات |
**88/9 |
**47/72 |
**84/259 |
**88/389 |
3 |
غلظت تیمار (a) |
**98/16 |
ns64/9 |
**34/404 |
**87/762 |
2 |
زمان تیمار (b) |
*18/1 |
ns93/1 |
*47/25 |
ns19/10 |
6 |
اثر متقابل (a*b) |
41/0 |
04/3 |
57/9 |
54/8 |
24 |
اشتباه آزمایشی |
35/10 |
60/13 |
82/7 |
31/7 |
|
ضریب تغییرات (درصد) |
** * و ns به ترتیب نشان دهنده اختلاف معنی دار در سطح احتمال 1و 5 درصد عدم وجود اختلاف معنیدار میباشد
|
ب |
د |
ج |
الف |
شکل 3- مقایسه میانگین اثر ساده غلظت (الف) و زمان(ب) تیمار با محرک عصاره قارچ فوزاریوم گرامینهروم بر میزان فعالیت آنزیم کاتالاز و مقایسه میانگین اثرات ساده و متقابل غلظت و زمان تیمار با محرک عصاره قارچ فوزاریوم گرامینهروم بر میزان فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز (ج) و آسکوربات پراکسیداز (د) ریشههای مویین بذرالبنج مشبک. حروف مشابه نشاندهنده عدم وجود اختلاف معنیدار در سطح احتمال 1 درصد آزمون دانکن میباشد
تأثیر محرک عصاره قارچ فوزاریومگرامینهروم بر میزان فنول کل ریشههای مویین بذرالبنج مشبک: نتایج تجزیه واریانس تأثیر غلظت و مدت زمان تیمار با عصاره قارچ فوزاریومگرامینهروم بر میزان فنول کل ریشههای مویین بذرالبنج مشبک در جدول 3 نشان داده شده است. نتایج مقایسه میانگین نشان داد اثرات متقابل غلظت و زمان تیمار در سطح احتمال 5 درصد تأثیر معنیداری بر میزان فنول کل ریشههای مویین بذرالبنج نشان داد. طوریکه بیشترین میزان فنول کل در تیمار 10 میلیگرم بر لیتر در مدت زمان 72 ساعت تیمار (82/8 میلیگرم معادل اسید گالیک بر گرم وزن تر) و کمترین میزان فنول کل در تیمار شاهد در مدت زمان 24 ساعت (88/3 میلیگرم معادل اسید گالیک بر گرم وزن تر) مشاهده شد (شکل4).
شکل4- مقایسه میانگین اثرات متقابل غلظت و زمان تیمار با محرک عصاره قارچ فوزاریوم گرامینهروم بر میزان فنول کل ریشههای مویین بذرالبنج مشبک. حروف مشابه نشاندهنده عدم وجود اختلاف معنیدار در سطح احتمال 5 درصد آزمون دانکن میباشد
تأثیر محرک عصاره قارچ فوزاریومگرامینهروم بر تولید آلکالوئیدهای تروپانی در کشت ریشههای مویین بذرالبنج مشبک: نتایج تجزیه واریانس تأثیر غلظت و مدت زمان تیمار با عصاره قارچ فوزاریومگرامینهروم بر تولید آلکالوئیدهای تروپانی هیوسیامین و آسکوپولامین در ریشههای بذرالبنج مشبک در جدول 4 نشان داده شده است. نتایج مقایسه میانگین اثرات متقابل غلظت و زمان تیمار با محرک عصاره قارچ فوزاریومگرامینهروم نشان داد که سطوح مختلف غلظت و زمان در سطح احتمال 5 درصد بهطور معنیداری تولید هیوسیامین و آسکوپولامین را تحت تأثیر قرار داد. بیشترین میزان هیوسیامین (5/27 درصد) در اثر تیمار ریشههای مویین با غلظت 5 میلیگرم برلیتر عصاره قارچ فوزاریومگرامینهروم در مدت زمان 48 ساعت مشاهده گردید که میزان تولید آن نسبت به ریشههای مویین شاهد (44/9 درصد) در مدت زمان 48 ساعت، حدود 91/2 برابر افزایش نشان داد و حداقل میزان هیوسیامین (7/6 درصد) در شاهد در مدت زمان 24 ساعت مشاهده شد (جدول 4) و (شکل 5 الف). همچنین بیشترین میزان آسکوپولامین (41/40 درصد) در اثر تیمار ریشههای مویین با غلظت 10 میلیگرم برلیتر عصاره قارچ فوزاریومگرامینهروم در مدت زمان 48 ساعت مشاهده گردید که تولید آن 95/3 برابر نسبت به ریشههای مویین شاهد (22/10 درصد) در زمان 48 ساعت تیمار افزایش یافت و کمترین میزان آسکوپولامین (10 درصد) در تیمار شاهد در مدت زمان 24 ساعت مشاهده گردید (جدول4) و (شکل 5 ب).
جدول 4- تجزیه واریانس تأثیر غلظت و مدت زمان تیمار با محرک عصاره قارچ فوزاریومگرامینهروم بر تولید آلکالوئیدهای تروپانی در ریشههای مویین بذرالبنج مشبک
|
میانگین مربعات |
||
منابع تغییرات |
درجه آزادی |
میزان هیوسیامین (درصد) |
میزان آسکوپولامین (درصد) |
غلظت تیمار(a) |
3 |
**73/748 |
**41/570 |
زمان تیمار(b) |
2 |
**09/ 180 |
**12/174 |
اثرمتقابل(a*b) |
6 |
**76/22 |
*50/35 |
اشتباه آزمایشی |
24 |
10/8 |
13/13 |
ضریب تغییرات (درصد) |
|
34/16 |
48/16 |
** * و ns به ترتیب نشان دهنده اختلاف معنیدار در سطح احتمال 1 و 5 درصد، عدم وجود اختلاف معنیدار میباشد
شکل5- مقایسه میانگین اثر متقابل غلظت و زمان تیمار درصد هیوسیامین (الف) و درصد آسکوپولامین (ب) در سطوح مختلف عصاره قارچ فوزاریومگرامینهروم بر ریشههای مویین بذرالبنج مشبک. حروف مشابه نشاندهنده عدم وجود اختلاف معنیدار در سطح احتمال 5 درصد آزمون دانکن میباشد
تأثیر محرک عصاره قارچ فوزاریومگرامینهروم بر سطح رونوشت ژن h6h: نتایج تجزیه واریانس تأثیر عصاره قارچ فوزاریومگرامینهروم بر میزان بیان ژن h6hدر ریشههای بذرالبنج مشبک در جدول 5 نشان داده شده است. نتایج مقایسه میانگین اثرات متقابل غلظت و زمان تیمار با محرک عصاره قارچ فوزاریومگرامینهروم نشان داد که سطوح مختلف غلظت و زمان در سطح احتمال 5 درصد بهطور معنیداری میزان بیان ژن h6h را تحت تأثیر قرار داد. بیشترین میزان بیان ژن h6hدر تیمار با غلظت 10 میلیگرم برلیتر عصاره قارچ فوزاریومگرامینهروم در مدت زمان 48 ساعت مشاهده گردید که میزان تولید آن نسبت به ریشههای مویین شاهد 72/4 برابر افزایش یافت. کمترین میزان بیان ژن h6hدر شاهد در مدت زمان 48 ساعت مشاهده گردید (شکل 7).
ارتباط تجمع آسکوپولامین با میزان بیان نسبی ژن h6h تحت تیمار عصاره قارچ فوزاریومگرامینهروم: نمودار همبستگی تجمع آسکوپولامین با میزان بیان ژن h6h تحت تأثیر عصاره قارچ فوزاریوم گرامینه روم نشان داد که بین تجمع آسکوپولامین و میزان بیان ژن h6h ارتباط معنیداری در سطح احتمال 5 درصد وجود دارد. الگوی تجمع آسکوپولامین تحت تأثیر عصاره قارچ فوزاریوم گرامینه روم روند تقریباً مشابهی با روند بیان ژن نشان داد (شکل8).
جدول6- تجزیه واریانس تأثیر غلظت و مدت زمان تیمار با عصاره قارچ فوزاریوم بر میزان بیان نسبی ژن h6h در ریشههای مویین بذرالبنج مشبک
میانگین مربعات |
|
|
میزان بیان نسبی ژن |
درجه آزادی |
منابع تغییرات |
**۱۴/۱۱۵ |
3 |
غلظت تیمار(a) |
*۳۶/۱۶ |
2 |
زمان تیمار(b) |
*۲۶/۱۳ |
6 |
اثرمتقابل(a*b) |
۲۹/۴ |
24 |
اشتباه آزمایشی |
۶/۲۵ |
|
ضریب تغییرات (درصد) |
** * و ns به ترتیب نشان دهنده اختلاف معنیدار در سطح احتمال 1 و 5 درصد، عدم وجود اختلاف معنیدار میباشد
الف |
ب |
شکل7- مقایسه میانگین اثرات غلظت و مدت زمان تیمار عصاره قارچ فوزاریوم گرامینه روم بر میزان بیان ژن h6h در ریشههای مویین بذرالنج مشبک (الف). حروف مشابه نشان دهنده عدم وجود اختلاف معنیدار در سطح احتمال 5 درصد بر اساس آزمون دانکن میباشد. آنالیز RT-PCR بر میزان بیان ژن h6h تحت تأثیر محرک عصاره قارچ فوزاریوم گرامینه روم در غلظتهای 0، 5، 10 و 20 میلی گرم بر لیتر و آنالیز RT-PCR بر میزان بیان ژن 18s کنترل داخلی (ب) شاهد : C1، غلظت 5 میلی گرم برلیترC2: ، غلظت 10 میلی گرم برلیترC3:، غلظت 20 میلی گرم برلیترC4:، 24 ساعت T1:، 48 ساعتT2:، 72 ساعتT3: ، واکنش کنترل منفی NTC:، واکنش کنترل منفیRT:
شکل8- ارتباط میزان تجمع آسکوپولامین با میزان بیان نسبی ژن h6h تحت تیمار عصاره قارچ فوزاریوم گرامینه روم در غلظتهای (0، 5، 10 و 20 میلیگرم برلیتر) و در زمانهای (24، 48 و 72 ساعت). ضریب همبستگی پیرسون بین دو متغیر معنیدار میباشد.
تأیید مولکولی ماهیت تراریختی ریشههای موئین: بررسی ماهیت تراریختی ریشههای مویین را میتوان با ردیابی ژنهای موجود روی T-DNA باکتری آگروباکتریوم رایزوژنز که مهمترین آنها ژنهای rolA، rolB و rolC هستند انجام داد. در واکنش زنجیرهای پلیمراز با کمک آغازگر اختصاصی ژن rolB، قطعاتی به طول bp780 تولید کردند که حضور آنها روی ژل نشاندهنده وجود این توالی و در نتیجه انتقال توالی T-DNA به ژنوم سلول گیاهی میباشد. (شکل 9).
شکل9- نمایه الکتروفوزی حاصل از واکنش PCR (قطعه 780 جفت بازی) از ژن rolB روی ژل آگارز 8/0 درصد. L) DNA Marker 1 kb ، C+) باند تکثیر شده از DNA آگروباکتریوم سویه A7 به عنوان کنترل مثبت، C1-) ریشههای شاهد غیر تراریخت به عنوان کنترل منفی اول، C2-) واکنش PCR بدون الگوی DNA به عنوان کنترل منفی دوم، لاین 1 تا 3) ریشههای مویین القاء شده در ریزنمونههای برگ دو هفتهای توسط سویه A7 آگروباکتریوم رایزوژنز
بحث
مطالعات نشان میدهد محرکهای قارچی میتوانند باعث مهار رشد سلولهای گیاهی شود (24). به طور مثال رشد سلولهایMorinda elliptica تحت تأثیر عصاره قارچ Aspergillus niger بیش از 35 درصد نسبت به نمونههای شاهد کاهش یافت (11). کاهش رشد سلولی تحت تأثیر محرکهای قارچی در کشت سلول Rhodiola sachalinesis ,Catharanthus roseus و Taxus spp گزارش شده است (11). این کاهش رشد سلولها، تحت تأثیر محرکهای قارچی میتواند به دلیل کاهش متابولیسم اولیه و آغاز متابولیسم ثانویه باشد (10 و 35). در کشت سوسپانسیون درمنه خزری هم افزودن محرکهای زیستی و غیر زیستی باعث کاهش رشد سلولها در مقایسه با شاهد گردید (2). گزارشاتی نیز مبنی بر افزایش رشد تحت تأثیر محرکهای قارچی وجود دارد، بنابراین به نظر میرسد محرکهای قارچی اثرات متنوعی بر رشد دارند.
محرکهای قارچی باعث افزایش میزان تولید متابولیتهای ثانویه، بهویژه متابولیتهایی که در سازوکارهای دفاعی گیاه نقش دارند، میشود ( 18 و 30). قارچها همانند گیاهان دارای دیواره سلولی میباشند ولی ترکیب دیواره سلولی آنها با گیاهان متفاوت است. محرکها به ترکیبات دیواره سلولی حمله میکنند و در پی پاسخ به پیام محرک، سیستم دفاعی گیاه فعال میشود. محرکها بهوسیله گیرنده گیاهی یا R پروتئین شناسایی میشوند. شناسایی در دیواره پلاسما، آغاز سیگنال پاسخدهی میباشد. بعد از سیگنال تحریک، گیرندههای گیاهی، سیگنال اجراییشان را مثل نشت یونی، انفجار اکسیداتیو و اکسیژن فعال، فسفریلاسیون و دفسفریلاسیون پروتئینها را بهکار میگیرند و بهوسیله مولکولهای پیامرسان ثانویه مثلH2O2 ، اسید جاسمونیک، اسید سالسلیک، آزادکنندههای کلسیم داخلی و تلفیق چند ژن و سرانجام بیان ژن دفاعی که همان تولید بالای متابولیت ثانویه حاصل میشود (26 و 27).
ترکیبات فنولی، مهارکننده قوی برای تنش اکسایشی هستند و در این رابطه مشتقات سینامیک اسید مؤثرتر از مشتقات بنزوئات هستند. ترکیبات فنولی در همکاری با پراکسیدازها در جمع آوری یا حذف پراکسید هیدروژن شرکت میکنند (22). آنزیم PAL که آغازکننده نخستین مرحله از مسیر بیوسنتزی فنیل پروپانوئیدها میباشد، پل ارتباطی بین متابولیتهای اولیه و برخی از متابولیتهای ثانویه میباشد (38). افزایش فعالیت PAL و دیگر آنزیمهای مسیر فنیل پروپانوئیدی که منجر به افزایش ترکیبات فنولی میشود، از نخستین پاسخهای گیاهان در شرایط تنش میباشد (36). مطالعات نشان می دهد فعالیت این آنزیم تحت تاثیر محرکهای قارچی نیز افزایش مییابد (15). عصاره قارچ Fusarium oxysporum در کشت سلول تاکسوس باعث افزایش تاکسول و ترکیبات فنولی شد (20). افزایش ترکیبات فنولی تحت تأثیر محرکهای قارچی در کشت سلول کتان زراعی (Linum usitatissimum) مشاهده شده است (15). با توجه به بررسی مطالعات انجام شده، نتایج مشاهده شده در این مطالعه با گزارشات سایر محققین در مورد کاربرد عصاره قارچی در افزایش میزان فنول کل مطابقت دارد.
کاربرد قارچAspergillus nigerبهعنوان محرک زیستی در کشت سوسپانسیون سلولی گیاه پریوش(Catharanthus roseus)، سبب افزایش تولید آلکالوئیدهای وینبلاستین و وینکریستین شد (34). Wiktorowaka و همکاران (37) گزارش کردند که تیمار کشت سلولی گل همیشه بهار (Calendula officinalis)با عصاره هموژن شده از قارچ Trichoderma viride موجب افزایش تولید الئونیک اسید شد. در تیمار ریشههای مویین گیاه داتوره با عصارهFusarium monoliforme ، Aspergillus niger و Alternarie sp، بیشترین مقدار هیوسیامین در محیطهای حاوی عصاره میسیلیومی قارچ A. niger مشاهده گردید (4). استفاده از محرک قارچی Aspergillus niger در افزایش آرتمیزینین در گیاه Artemisia annua، (23)، اثر تحریکی محرک دیواره سلولی قارچ Phytophthora cinnamon بر تجمع رزمارینیک اسید در ریشههای مویین گیاه ریحان(Ocimum basilicum) (6)، اثر کیتوسان بر تولید رزمارینیک اسید در زرین گیاه (1) کاربرد قارچ Phytophthora parasitica به عنوان محرک زیستی بر ریشههای مویین گیاه کاسنی (Cichorium intybus L) گزارش شده است (7). با توجه به بررسی مطالعات انجام شده، نتایج مشاهده شده در این مطالعه با گزارشات سایر محققین در مورد کاربرد عصاره قارچی در افزایش تولید متابولیتهای ثانویه مطابقت دارد.
همان طور که ذکر شد هنگامی که گیاهان مورد تهاجم و حمله قارچها قرار میگیرند آنزیمهای تولید کننده متابولیتهای ثانویه مانند PAL بیان میشوند این آنزیم به نوبه خود باعث تحریک تولید هورمونهای غیر کلاسیک از جمله جاسموناتها و سالیسیلاتها میشود (12) . این هورمونها نقش سیگنال را برعهده دارند و باعث افزایش فعالیت آنزیمهای نیترات ردوکتاز میگردد در نتیجه بیان ژنهای h6h بیشتر میشود. فعالیت بالای ژن h6h یک اثر مثبت در تولید آلکالوئیدهای تروپانی بهویژه آسکوپولامین دارد. این اثر مثبت همچنین در بافتهای گیاه شابیزک مشاهده شده است (16). نتایج این مطالعه نشان داد که ارتباط مستقیمی بین میزان بیان ژن h6h و تولید آسکوپولامین وجود دارد (شکل 8). بنابراین میتوان احتمال داد که تنظیمها در سطح بیان، در فعالیت آنزیم H6H نقش بیشتری نسبت به سایر تنظیمات دارند. همچنین میتوان از این ژنها به عنوان عاملی کلیدی و تنظیمکننده مهم، در تولید تروپان آلکالوئید آسکوپولامین نام برد (14).
نتیجهگیری کلی
نتایج آزمایش حاضر نشان داد که بهترین تیمار عصاره قارچ فوزاریوم گرامینهروم بهمنظور سنتز آلکالوئیدهای تروپانی هیوسیامین و آسکوپولامین به ترتیب غلظت 5 و 10 میلیگرم بر لیتر به مدت 48 ساعت میباشد. بنابراین بهنظر میرسد که عصاره قارچ فوزاریوم گرامینهروم بهعنوان یک محرک زیستی میتواند راهکار مناسبی جهت افزایش تولید و بهرهوری گیاهان دارویی محسوب شود.
تقدیر و تشکر
این تحقیق با استفاده از اعتبارات پژوهشکده زیست فنآوری دانشگاه ارومیه انجام شده است. از ریاست پژوهشکده و کارشناسان محترم آن و همچنین معاونت پژوهشی دانشگاه ارومیه تشکر و قدردانی میشود.