بیان پروتئین نوترکیب TGF β1 در گیاه توتون و بررسی تأثیر پروتئاز فورین در پردازش فرم نهفته‌ی این پروتئین

سارا خوارزمی، امین باقی زاده^* و مسعود ترکزاده ماهانی

ایران، کرمان، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، گروه بیوتکنولوژی

تاریخ دریافت:3/8/96                   تاریخ پذیرش: 10/4/97

چکیده

TGFβ1 ، یک پروتئین تنظیمی چندکاره است که در طیف وسیعی از فعالیت‌های بیولوژیکی مداخله می‌نماید. این پروتئین، ابتدا به صورت یک فرم پیش ساز غیرفعال، حاوی 390 اسید آمینه سنتز می‌شود که قبل از اتصال به گیرنده‌های TGFβ1، تحت تاًثیر برش پروتئولیتیکی، فرم بالغ TGFβ1 از پروپپتید آن جدا می‌گردد. فرم بالغ این پروتئین شامل 112 اسید آمینه از انتهای C ترمینال فرم غیرفعال آن است. در این مطالعه، در ابتدا توانایی دو سویه‌ی GV3101 و GV3101 (pMP90RK) آگروباکتریوم برای ترانسفورماسیون گیاه Nicotiana benthamiana با ناقل بیان pTRAkc-ERH، به وسیله‌ی ساخت سازه کنترل pTRAkc/ CJG138 (حاوی GFP)، بررسی گردید و نتایج حاصل با تکنیک وسترن بلات و تصویربرداری کانفوکال ارزیابی شد. سپس، به منظور بیان موقت پروتئین TGF β1 از فرم پیش ساز آن در گیاه توتون، سازه‌های نوترکیب pTRAkc/ DCF6 و pTRAkc/ DCF7، به ترتیب دارای توالی نگهدارنده شبکه آندوپلاسمی (SEKEDL) و فاقد این توالی طراحی و ساخته شدند. این سازه‌ها به تنهایی و در ترکیب با سازه‌ی نوترکیب دیگری که حاوی ژن رمز کننده‌ی پروتئاز فورین بود، به گیاهان توتون مایه‌زنی شدند. نتایج حاصل نشان داد که هر دو سازه با موفقیت در گیاه توتون بیان می‌شوند. هرچند پردازش کارآمدتر فرم پیش ساز پروتئین TGF β1 در گیاهان مایه‌زنی شده با سازه‌ی pTRAkc/ DCF7، نشان می‌دهد که تجمع فرم پیش ساز این پروتئین در شبکه آندوپلاسمی از پردازش آن جلوگیری می‌کند. همچنین، در این تحقیق مشخص شد که برش پروتئولیتیکی شبیه به پروتئاز فورین، بین TGFβ1 بالغ و پروپپتید آن، در N. benthamiana اتفاق نمی‌افتد. 

واژه‌های کلیدی: پروتئاز فورین، پروتئین نوترکیب TGF β1، پردازش فرم نهفته‌ی TGF β1، گیاه توتون

* نویسنده مسئول، تلفن: 09131414156، پست الکترونیکی: A.baghizadeh@kgut.ac.ir

مقدمه

TGF β  (Transforming growth factor β) یک خانواده از سایتوکین‌های مهم است و متعلق به ابرخانواده بزرگ TGF β  (TGF β superfamily) می‌باشد. این سایتوکین در پستانداران دارای سه ایزوفورم TGF β1، TGF β2 و TGF β3 است که از طریق دو گیرنده‌ی غشایی I و II پیام خود را به داخل سلول ارسال می‌کند (4, 7). ایزوفورم TGF β1، یک پروتئین تنظیمی چند کاره است که در طیف وسیعی از فعالیت‌های بیولوژیکی مانند تحریک و مهار رشد و تمایز سلولی، پیشرفت سیکل سلولی، رشد سلولهای سرطانی و مهار آنها نقش مهمی را ایفا می کند (6). این پروتئین، در ابتدا به صورت یک فرم پیش ساز غیرفعال، حاوی 390 اسید آمینه سنتز می‌شود که از دو بخش سیگنال پپتید (29 اسید آمینه از انتهای N ترمینال) و توالی پروپپتید- TGF β1 ( Pro-TGF β1) تشکیل شده است. این پروتئین قبل از اینکه بوسیله سلول‌ها ترشح شود، تحت تاًثیر چندین مرحله‌ی پردازش درون سلولی قرار می‌گیرد. مهمترین مرحله‌ی پردازش، شکاف پروتئولیتیکی حاصل از فعالیت اندوپپتیداز فورین در توالی پروپپتید است که سبب برش توالی پروتئینی در اسید آمینه‌ی 278 گردیده و منجر به رهاسازی توالی‌های LAP  (Latency-associated protein) و فرم بالغ TGF β1 می‌شود. فرم بالغ این پروتئین شامل 112 اسید آمینه از انتهای C ترمینال توالی پیش ساز (فرم غیرفعال) آن است که یک پروتئین هومودایمر با وزن مولکولی 25 کیلو دالتون را ایجاد می‌کند. این پروتئین شامل 9 اسید آمینه‌ سیستئین می‌باشد که یکی از آنها، زیر واحدهای مونومر این پروتئین را به یکدیگر متصل می‌‌نماید (3, 11, 12). به علت دخالت این پروتئین در فرآیندهای بیولوژیکی متفاوت و کاربرد کلینیکی آن در تست کردن روش‌های درمانی، تا کنون تلاش‌های زیادی برای تولید پروتئین نوترکیب TGF β1 در سیستم‌های بیانی مختلف صورت گرفته است اما به دلیل پیچیده بودن ساختار این پروتئین و روش‌های خالص سازی آن، دست یافتن به مقادیر زیاد این پروتئین نوترکیب رضایت بخش نبوده است (10, 18, 19). در دو دهه‌ی گذشته، استفاده از گیاهان برای تولید پروتئین‌های نوترکیب مورد توجه محققان قرار گرفته است. توانایی گیاهان در انجام تغییرات پس از ترجمه‌ی پروتئین، همانند N گلیکوزیلاسیون و تشکیل باندهای دی سولفیدی، تولید ارزان پروتئین نوترکیب در مقیاس بالا و کاهش خطر آلودگی پروتئین نوترکیب با پاتوژن‌های انسانی، آنها را به عنوان کارخانه‌ی مناسبی جهت تولید فاکتورهای رشد تبدبل نموده است (18). در این مطالعه، توانایی گیاه N. benthamiana در بیان و پردازش پروتئین نوترکیب TGF β1 از توالی رمز کننده فرم غیر فعال این پروتئین مورد بررسی قرار گرفت و نیز تاًثیر بیان همزمان پروتئاز فورین در پردازش پروتئین TGF β1 حفظ شده در شبکه آندوپلاسمی و پروتئین ترشح شده ارزیابی گردید.

مواد و روشها

طراحی و ساخت سازه‌های نوترکیب: به منظور بیان موقت پروتئین TGF β1 در گیاه توتون، از توالی رمز کننده‌ی فرم پیش ساز این پروتئین و ناقل بیان pTRAkc-ERH (Fraunhofer Institute, Germany)  استفاده شد و سازه‌های نوترکیب DCF6، DCF7 و DCF17  مطابق زیر طراحی و ساخته شدند. همچنین سازه‌های نوترکیب DCI5 (حاوی توالی رمز کننده پروتئاز فورین) و CJG138 (حاوی ژن GFP) به شرح زیر ساخته شدند.

طراحی سازه‌ی نوترکیب DCF6 و ساخت سازه‌ی بیانی pTRAkc/ DCF6: جهت طراحی سازه‌ی DCF6، در ابتدا توالی سیگنال ترشحی (29 اسیدآمینه) از انتهای آمینی توالی رمز کننده‌ی فرم پیش ساز پروتئین TGF β1 NM_000660.5, NP_000651.3)) حذف شد. سپس توالی باقیمانده (LAP-TGF β1)، در پایین دست سیگنال LPH موجود در ناقل بیان pTRAkc-ERH که خود در هدایت پروتئین نوترکیب به سمت شبکه آندوپلاسمی در مسیر ترشحی داخل سلول، نقش مهمی را ایفاء می‌کند قرار داده شد. برای قرارگیری پروتئین TGF β1 در شبکه آندوپلاسمی، از توالی سیگنال SEKDEL در انتهای کربوکسیل سازه‌ی نوترکیب DCF6، استفاده شد. همچنین به منظور شناسایی پروتئین نوترکیب بیان شده، توالی  tag His در انتهای آمینی توالی رمزکننده‌ی فرم پیش ساز پروتئین TGF β1، قرار داده شد (شکل 1). تکثیر قطعه­ی 1170 جفت بازی سازه‌ی DCF6، با استفاده از آغازگر رفتDCF6^F و آغازگرهای برگشتDCF6^R1 و DCF6^R2 (جدول 1) انجام شد. در واکنش PCR، از یک سازه‌ی نوترکیب حاوی توالی‌های رمز کننده‌ی فرم پیش ساز پروتئین TGF β1 و  His tagبه عنوان الگو استفاده گردید. سپس محصول PCR برش داده شده با آنزیم DpnI ، با روش SLIC (Sequence and ligation independent cloning) به درون ناقل بیان pTRAkc-ERH (هضم شده با آنزیم‌های NcoI و XhoI) همسانه سازی شد.

طراحی سازه‌ی نوترکیب DCF7 و ساخت سازه‌ی بیانی pTRAkc/ DCF7: سازه‌ی نوترکیب DCF7 مشابه سازه‌ی DCF6 طراحی شد، با این تفاوت که در سازه‌ی DCF7، توالی SEKDEL از انتهای کربوکسیل سازه‌ی مورد نظر حذف گردید (شکل 1). به منظور ساخت سازه‌ی pTRAkc/ DCF7، قطعه­ی 1152 جفت بازی سازه‌ی DCF7 با استفاده از آغازگرهای DCF6^F و DCF7^R (جدول 1) تکثیر گردید و پس از هضم با آنزیم DpnI،با روش SLIC به درون ناقل بیان pTRAkc-ERH (هضم شده با آنزیم‌های NcoI و XhoI) همسانه سازی شد.

طراحی سازه‌ی نوترکیب DCI5 و ساخت سازه‌ی بیانی pTRAkc/ DCI5: به منظور طراحی سازه‌ی نوترکیب DCI5، در ابتدا توالی سیگنال پپتید (24 اسیدآمینه) از انتهای آمینی توالی رمز کننده‌ی پروتئاز فورین (794 اسید آمینه ،X17094.1) حذف شد و توالی باقیمانده در پایین دست سیگنال LPH موجود در ناقل بیان pTRAkc-ERH قرار داده شد. همچنین توالی‌های  His tag و SEKDEL، به ترتیب در پایین دست توالی رمز کننده پروتئاز فورین قرار گرفتند (شکل 1). جهت ساخت سازه‌ی pTRAkc/ DCI5، در ابتدا قطعه‌ی 2335 جفت بازی DCI5، با استفاده از آغازگر رفتDCI5^F و آغازگر برگشتDCI5^R(جدول 1) تکثیر گردید (از پلاسمید حاوی توالی رمزکننده‌ی پروتئاز فورین، خریداری شده از کمپانی addgene، به عنوان الگو در انجام واکنش PCR استفاده شد). سپس قطعه‌ی تکثیر شده به درون سایت NcoI و NotI ناقل pTRAkc-ERH، همسانه‌سازی گردید.

طراحی سازه‌ی نوترکیب DCF17 و ساخت سازه‌ی بیانی pTRAkc/ DCF17: در طراحی این سازه، توالی رمزکننده‌ی فرم پیش‌ساز پروتئین TGF β1 در پایین دست توالی رمز کننده‌ی پروتئاز فورین، قرار داده شد و یک سایت قابل شناسایی فورین  (Furin recognition site)(FRS) (R-H-R-R)، در محل اتصال این دو توالی تعبیه شد. لازم به ذکر است، توالی سیگنال پروتئاز فورین در این سازه حذف شد و توالی رمز کننده‌ی پروتئاز فورین در پایین دست سیگنال LPH قرار داده شد. به منظور نگهداری پروتئین TGF β1 و پروتئاز فورین در شبکه آندوپلاسمی، دو  توالی سیگنال SEKDEL به ترتیب در انتهای کربوکسیل توالی رمز کننده‌ی فورین و انتهای کربوکسیل سازه‌ی نوترکیب DCF17 و قبل از توالی  His tag قرار داده شد (شکل 1). به منظور ساخت سازه‌ی pTRAkc/ DCF17، در ابتدا قطعه‌ی 1178 جفت بازی از انتهای کربوکسیل سازه DCF17 (بجز توالی فورین)، با استفاده از آغازگرهای رفتDCF17^F1 و DCF17^F2 و آغازگر برگشتDCF17^R  (جدول 1) تکثیر شد و پس از هضم با آنزیم DpnI،با روش SLIC به درون ناقل بیان نوترکیب pTRAkc/ DCI5 (هضم شده با آنزیم NotI) همسانه‌سازی گردید.

طراحی سازه‌ی نوترکیب CJG138و ساخت سازه‌ی بیانی pTRAkc/ CJG138: در این سازه توالی رمز کننده‌ی ژن GFP در پایین دست سیگنال LPH  و بالا دست توالی SEKDEL قرار داده شد (شکل 1). برای ساخت سازه‌ی بیانی pTRAkc/ CJG138، قطعه‌ی 787 جفت بازی سازه CJG138، با استفاده از آغازگر فوردارد CJG138^F و آغازگرهای برگشتCJG138^R1 و CJG138^R2 جدول 1) تکثیر گردید  و پس از هضم با آنزیم DpnI،با روش SLIC به درون ناقل pTRAkc-ERH (هضم شده با آنزیم‌های NcoI و XhoI) همسانه سازی شد.

در نهایت پلاسمیدهای نوترکیب حاصل، با روش شوک حرارتی به درون سلول‌های مستعد E. Coli (NEB Turbo) ترانسفورم شدند و کلون‌های صحیح (حاوی سازه‌‌های مورد نظر) با روش تعیین ترادف تأیید گردیدند.

ترانسفورماسیون گیاهان توتون با آگروباکتریوم حاوی سازه‌های نوترکیب: سازه‌های نوترکیب تأیید شده، به طور جداگانه به درون دو سویه‌ی GV3101 و GV3101 (pMP90RK) آگروباکتریوم ترانسفورم شدند و پس از تهیه سوسپانسیون باکتری، برای مایه زنی گیاه N. benthamiana  با روش آگرواینفیلتریشن، استفاده گردیدند(1). نمونه برداری از گیاهان مایه زنی شده 3، 5 و 7 روز پس از آگرواینفیلتریشن انجام شد. استخراج پروتئین، بلافاصله بعد از برداشت نمونه‌های برگی انجام شد.

شکل 1- شکل شماتیک سازه‌های بیانی.

جدول 1- نام و خصوصیات آغازگرهای مورد استفاده در واکنش زنجیره ای پلیمراز

در جدول 1، توالی SEKDEL با شماره 1، توالی His tag با شماره 2  و سایت قابل شناسایی فورین (FRS) با شماره 3 مشخص شده است.

در فاصله‌ی زمانی برداشت تا انجام استخراج پروتئین، نمونه‌های برگ بر روی یخ قرار داده شدند. این آزمایش در دو تکرار انجام شد و از آگروباکتریوم حاوی ژن رمزکننده‌ی بازدارنده خاموشی p19، برای جلوگیری از فرآیند خاموشی ژن پس از نسخه برداری (PTGS) (Post transcriptional gene silencing) استفاده گردید. پروتئین مهارکننده‌ی خاموشی p19، با مهار آغازکننده‌های PTGS مانند (ds)RNAها و (si)RNA‌ها، از شروع فرآیند خاموشی جلوگیری می‌کند (17). پس از تهیه سوسپانسیون باکتری، این آگروباکتریوم به نسبت مساوی 1:1 یا 1:1:1، با سویه‌های آگروباکتریوم حاوی سازه‌های نوترکیب مخلوط گردید و به گیاهان توتون مایه‌زنی شد.

استخراج پروتئین نوترکیب از برگ‌ گیاهان مایه‌زنی شده: در ابتدا 1 تا 2/1 گرم از بافت برگ نمونه های جمع آوری شده در ازت مایع پودر گردید و با 3-2 میلی‌لیتر بافر استخراج (NaCl 8 g/L, KCL 0.2 g/L, Na₂HPO₄ 1.44 g/L, KH₂PO₄ 0.24 g/L, pH 7.4.) مخلوط شد. عصاره‌ی گیاه از یک توری عبور داده شد و سوسپانسیون حاصل با سرعت 13000 دور در دقیقه، در دمای C^◦4، به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ گردید. عصاره‌ی خام استخراج شده از گیاه، حاوی پروتئین محلول کل (Total soluble proteins) بود که در آزمایشات بعدی به منظور بررسی بیان پروتئین نوترکیب استفاده شد.   

آنالیز بیان پروتئین نوترکیب با استفاده از تکنیک وسترن بلات:

پس از انجام الکتروفورز، باند‌های پروتئین از ژل به غشاء PVDF منتقل شدند و  بررسی بیان پروتئین نوترکیب TGF β1، با استفاده از آنتی بادیهای Anti-His6-Peroxidase antibody (Roche) و Polyclonal rabbit anti-TGFbeta1 Ab (Santa Cruz) انجام شد. همچنین از آنتی بادی anti-GFP برای آنالیز بیان پروتئین GFP استفاده گردید. در نهایت، پروتئین‌های مورد نظر به صورت باندهای آبی رنگ (حاصل از فعالیت HRP متصل به آنتی بادی، در حضور سوبسترایTMB (3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine)) بر روی غشاء PVDF، ظاهر شدند.

بررسی بیان پروتئین GFP با استفاده از میکروسکوپ کانفوکال:

سه روز پس از مایه زنی گیاه توتون با آگروباکتریوم حاوی pTRAkc/ CJG138، قطعه‌ی برگی کوچکی از برگ‌های آگرواینفیلتریت شده جدا گردید و بیان پروتئین GFP در برگ، با استفاده از میکروسکوپ کانفوکال بررسی گردید.

نتایج

بررسی بیان پروتئین نوترکیب TGF β1 در  گیاهان  مایه

زنی شده با سویه‌ی GV3101 حاوی سازه‌های نوترکیب:

به منظور بررسی توانایی گیاه توتون (N. benthamiana) در بیان پروتئین TGF β1 و پردازش این پروتئین از توالی رمز کننده‌ی فرم پیش‌ساز آن، سازه‌های بیان pTRAkc/ DCF6 و pTRAkc/ DCF7 به طور جداگانه، به درون سویه‌ی GV3101 آگروباکتریوم ترانسفورم شدند. سپس به همراه آگروباکتریوم حاوی ژن رمزکننده‌ی بازدارنده خاموشی p19، به درون برگ‌های گیاه توتون مایه‌زنی گردیدند. بیان پروتئین مورد نظر، 3، 5 و 7 روز پس از مایه زنی به وسیله‌ی وسترن بلات ارزیابی گردید. نتایج وسترن بلات با دو آنتی بادی Anti-His (شکل 2) وanti-TGF β1  (نتایج نشان داده نشده است) از پروتئین استخراج شده از برگهای مایه زنی شده، به ظاهر نشان داد که این سازه‌ها قادر به بیان پروتئین TGF β1 در گیاه توتون نمی‌باشند (باندهای پروتئینی ضعیف مشاهده شده در شکل 2، مربوط به پروتئین مورد نظر نیست). همچنین نتایج حاصل از آلودگی همزمان گیاه توتون با هر یک از سازه‌های مذکور به همراه سویه‌ی GV3101 حاوی پروتئاز فورین نشان داد که پروتئاز فورین، تاًثیری در بیان و پردازش پروتئین TGF β1 ندارد. نتایج مشابهی نیز از بیان سازه pTRAkc/ DCF17 در گیاهان مایه زنی شده با سویه‌ی GV3101 آگروباکتریوم حاصل گردید. با توجه به نتایج حاصل، دو فرضیه مطرح شد: 1) سویه‌ی GV3101 آگروباکتریوم (حاوی ناقل‌های نوترکیب pTRAkc) قادر به ترانسفورماسیون کارآمد گیاه توتون نمی‌باشد 2) ترانسفورماسیون گیاه توتون به خوبی انجام شده است اما سازه‌های نوترکیب، قادر به بیان پروتئین TGF β1، در گیاه توتون نیستند. از این رو، به منظور بررسی توانایی سویه‌ی GV3101 آگروباکتریوم در ترانسفورماسیون توتون، سازه بیانی pTRAkc/ CJG 138، حاوی ژن رمزکننده‌ی GFP، به درون این سویه‌ منتقل گردید و به برگ توتون مایه‌زنی شد. اگرچه نتایج وسترن بلات، با استفاده از آنتی بادی anti-GFP، باند ضعیفی را در محدوده‌ی مورد نظر (kDa 32) نشان داد (شکل 3)، اما حضور پروتئین GFP در سلول‌های برگ، با میکروسکوپ فلورسنت قابل مشاهده نبود. در مجموع، بر اساس نتایج حاصل می‌توان اظهار داشت که احتمالاً سویه‌ی مذکور، قادر به ترانسفورماسیون کارآمد گیاه توتون نمی‌باشد.

شکل 2- نتایج حاصل از آنالیز وسترن بلات (آنتی‌بادی anti-His) از پروتئین استخراج شده از گیاهان مایه‌زنی شده با سویه GV3101 (حاوی سازه‌های نوترکیب) 3، 5 و 7 روز پس از مایه‌زنی

شکل 3- نتایج حاصل از آنالیز وسترن بلات (آنتی‌بادی anti-GFP) از  پروتئین استخراج شده از گیاهان مایه‌زنی شده با سویه GV3101 حاوی سازه‌ی بیانی CJG 138

بررسی بیان پروتئین نوترکیب TGF β1 در گیاهان مایه زنی شده با سویه‌ی GV3101 (pMP90RK) حاوی سازه‌های نوترکیب: در آزمایش دیگری، سازه‌های نوترکیب مذکور، به درون سویه‌ی GV3101 (pMP90RK) آگروباکتریوم منتقل شدند و برای مایه زنی گیاه توتون استفاده گردیدند. نتایج وسترن بلات حاصل از نمونه‌ پروتئینی به دست آمده از گیاه مایه‌زنی شده با سویه‌ی GV3101 (pMP90RK)، حاوی pTRAkc/ CJG 138 (کنترل)، نشان داد که پروتئین GFP، 3 روز پس از مایه‎زنی، در گیاه توتون بیان می‌شود (شکل 44A-). همچنین تصویر برداری کانفوکال از نمونه‌ی برگی گیاه مزبور، تجمع سطح بالای پروتئین GFP را در شبکه آندوپلاسمی نشان داد (شکل 4-B). قرار گیری پروتئین GFP در شبکه آندوپلاسمی، به دلیل حضور توالی SEKDEL در انتهای کربوکسیل توالی رمزکننده‌ی GFP می‌باشد. بیان موفق GFP در نمونه‌های مایه‌زنی شده با سویه‌ی نوترکیب GV3101 (pMP90RK)، نشان داد که این سویه‌ی آگروباکتریوم برای ترانسفورم کارآمد گیاه توتون با ناقل بیان pTRAkc مناسب می‌باشد. از این رو سازه‌های pTRAkc/ DCF6، pTRAkc/ DCF7، pTRAkc/ DCF17 و pTRAkc/ DCI5 به درون سویه‌ی GV3101 (pMP90RK) ترانسفورم شدند و بیان پروتئین TGF β1، 3 روز پس از مایه‌زنی، در گیاهان مایه‌زنی شده با سازه‌های DCF6، DCF7،  DCF6 + DCI5،  DCF7 + DCI5 و DCF17 به وسیله‌ی وسترن بلات (آنتی بادی Anti-His) ارزیابی گردید. همانطور که در شکل 5 دیده می‌شود، در نمونه‌ حاصل از گیاهان مایه‌زنی شده با سازه DCF6، یک باند در محدوده‌ی تقریباً 70 کیلو دالتون مشاهده می‌شود. این باند احتمالاً مربوط به ساختار TGF β1 LAP/ است که از فولدینگ صحیحی برخوردار نمی‌باشد. به طور کلی، انجام اصلاحات پس از ترجمه در ساختار TGF β1 LAP/، یک فرآیند پیچیده است که در چندین مرحله کنترل می‌شود. ترشح دایمرهای فعال TGF β1، در مرحله‌ی اول مستلزم دایمر شدن پروپپتید TGF β1 LAP/ در شبکه آندوپلاسمی است (9). همچنین این ساختار در سه اسید آمینه در موقعیت‌های 82، 136 و 176 N گلیکوزیله می‌شود (2, 16). نگهداری این ساختار (نهفته) در شبکه آندوپلاسمی و دستگاه سیس-گلژی، سبب می‌شود که ترشح آن به درون شبکه ترانس-گلژی به آهستگی انجام شود و فقط پروتئین‌هایی به ترانس-گلژی ترشح شوند که به درستی گلیکوزیله شده‌اند (5, 14). بنابراین مشاهده باند تقریباً 70 کیلو دالتونی، در گیاهان آلوده شده با سازه‌ی DCF6، احتمالاً نشان دهنده‌ی پروپپتید TGF β1 LAP/ است که به درستی گلیکوزیله نشده است و به دلیل حضور توالی SEKDEL در انتهای کربوکسیل این سازه به درون شبکه آندوپلاسمی برگشت داده شده است. زمانیکه سازه‌ی DCF6  به همراه پروتئاز فورین به گیاه توتون مایه‌زنی شد، در نتایج وسترن بلات علاوه بر باند حدوداً 70 کیلو دالتونی، دو باند در محدوده‌های 55 و  35 کیلو دالتون مشاهده گردید که به ترتیب مربوط به TGF β1 LAP/ و LAP بود (شکل 5). مشاهده این باندها نشان داد که احتمالاً بخشی از پروپپتید بیان شده، به درستی گلیکوزیله می‌شود و به درون شبکه ترانس-گلژی منتقل می‌شود، جائیکه تحت تاثیر پروتئاز فورین، LAP از TGF β1 جدا گردیده است، اما همچنان  با برهمکنش‌های غیرکووالانسی به یکدیگر متصل هستند. این در حالی است که نتایج حاصل از مایه‌زنی گیاهان با سازه‌ی DCF7 به تنهایی، در مقایسه با سازه‌ی DCF6، علاوه بر باند تقریباً 70 کیلو دالتونی، باند 55 کیلو دالتونی مربوط به پروپپتید TGF β1 LAP/  را نشان داد (شکل 5). حضور باند 55 کیلو دالتونی، در نتایج وسترن بلات نشان می‌دهد که به دلیل فقدان توالی سیگنال SEKDEL، در سازه‌ی DCF7، مقدار بیشتری از پروپپتید بیان شده از این سازه، به درستی گلیکوزیله شده است و در مسیر ترشح وارد شبکه ترانس گلژی می‌شود، اما در آنجا به تنهایی قادر به پردازش و تولید فرم بالغ TGF β1 نمی‌باشد.

شکل 4- نتایج حاصل از آنالیز وسترن بلات با استفاده از آنتی‌بادی anti-GFP (A)، و تصویر برداری میکروسکوپ کانفوکال (B) از نمونه‌های برگی گیاه توتون مایه‌زنی شده با سویه‌ی GV3101 (pMP90RK) (حاوی سازه‌ی نوترکیب CJG 138) 3 روز پس از مایه‌زنی. 1: پروتئین GFP در شبکه آندوپلاسمی، 2: اتوفلورسانس کلروفیل به رنگ قرمز، 3: عکس برداری با نور سفید (Bright field)، 4 و 5: مشابه موارد 1، 2 و 3، اما با بزرگنمایی بیشتر

شکل 5: نتایج حاصل از آنالیز وسترن بلات با استفاده از آنتی‌بادی anti-His از نمونه‌های پروتئین استخراج شده از گیاهان مایه‌زنی شده با سویه GV3101::pMP90RK (حاوی سازه‌های‌ نوترکیب)، 3 روز پس از مایه‌زنی.