نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسنده
Department of Biology, Faculty of Science, University Of Maragheh
چکیده
نانوذرات بدلیل ویژگیهای منحصربفرد فیزیکوشیمیایی کاربرد گستردهای در زمینه زیستفناوری دارند. سیر (Allium sativum) از دیرباز بصورت گسترده بعنوان دارو و ادویه استفاده میشود. آلیسین بعنوان مهمترین ماده مؤثره سیر اثرات زیستی بسیار متنوعی دارد. هدف این پروژه، بررسی اثر دو الیسیتور غیرزیستی نانوذرات نقره و نیترات نقره بر رشد و برخی از پارامترهای بیوشیمیایی ریزنمونههای سیر میباشد. در گیاهان تیمار شده با نیترات نقره، وزن تر، میزان آلیسین و پروتئین، فعالیت آنزیمهای کاتالاز و گایاکول پراکسیداز کمتر از گیاهان کنترل اندازهگیری شد. در غلظت 25 میلی گرم در لیتر نانوذره نقره افزایش رشد و محتوای آلیسین و پروتئین نمونهها مشاهده شد. میزان آلیسین نمونههای تیمار شده با نانوذرات نقره در هر دو غلظت بالاتر از بقیه تیمارها، گیاهان در معرض نیترات نقره 25 میلی گرم در لیتر مشابه کنترل و در غلظت 50 میلی گرم در لیتر از همه تیمارها کمتر بود. بدلیل نقش مهم آلیسین در خواص دارویی سیر احتمالاً نانوذرات نقره کاندیدای خوبی برای افزایش میزان آلیسین سیر باشد.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Evaluation of abiotic elicitor effects on some biochemical parameters of garlic
نویسنده [English]
Department of Biology, Faculty of Science, University Of Maragheh
چکیده [English]
Nanoparticles due to their unique physicochemical properties, are widely used in biotechnology. Garlic (Allium sativum) is used as spice and drug for many years. Allicin as the best known active compound of garlic has a vast variety of biological effects. In this project effect of two abiotic elicitors including silver nanoparticles (AgNPs) and silver nitrate on growth and some biochemical parameters of garlic explants were studied. On silver nitrate-exposed samples; fresh weight, allicin, protein and cysteine contents, and catalase and guaiacol peroxidase activity was less than control. On AgNPs 25 ppm, growth, allicin, protein and cysteine contents was higher than untreated explants. Allicin content of AgNPs-treated explants was greater than the other treatments, on 25 ppm silver nitrate similar to control group and in 50 ppm-treated explants was the least. In conclusion because of the medicinal effects of allicin probably AgNPs could be a good candidate to increase allicin content.
کلیدواژهها [English]
ارزیابی اثر الیسیتور غیرزیستی بر برخی پارامترهای بیوشیمیایی گیاه سیر
پریسا فتحی رضایی*
ایران، مراغه، دانشگاه مراغه، دانشکده علوم پایه، گروه زیستشناسی
تاریخ دریافت: 8/8/97 تاریخ پذیرش: 12/5/98
چکیده
نانوذرات به دلیل ویژگیهای منحصربه فرد فیزیکوشیمیایی کاربرد گستردهای در زمینه زیستفناوری دارند. سیر (Allium sativum) از دیرباز به صورت گسترده به عنوان دارو و ادویه استفاده میشود. آلیسین به عنوان مهمترین ماده مؤثره سیر اثرات زیستی بسیار متنوعی دارد. هدف این پروژه، بررسی اثر دو الیسیتور غیرزیستی نانوذرات نقره و نیترات نقره بر رشد و برخی از پارامترهای بیوشیمیایی ریزنمونههای سیر میباشد. در گیاهان تیمار شده با نیترات نقره، وزن تر، میزان آلیسین و پروتئین، فعالیت آنزیمهای کاتالاز و گایاکول پراکسیداز کمتر از گیاهان کنترل اندازهگیری شد. در غلظت 25 میلی گرم در لیتر نانوذره نقره افزایش رشد و محتوای آلیسین و پروتئین نمونهها مشاهده شد. میزان آلیسین نمونههای تیمار شده با نانوذرات نقره در هر دو غلظت بالاتر از بقیه تیمارها، گیاهان در معرض نیترات نقره 25 میلی گرم در لیتر مشابه کنترل و در غلظت 50 میلی گرم در لیتر از همه تیمارها کمتر بود. به دلیل نقش مهم آلیسین در خواص دارویی سیر احتمالاً نانوذرات نقره کاندیدای خوبی برای افزایش میزان آلیسین سیر باشد.
واژههای کلیدی: آلیسین، آنزیم آنتی اکسیدان، الیسیتور زیستی، پروتئین، سیر
* ﻧﻮﻳﺴﻨﺪه ﻣﺴﺌﻮل، ﺗﻠﻔﻦ: 37273060-041، پست اﻟﻜﺘﺮونیک: parisafathirezaei@gmail.com
مقدمه
سیر با نام علمی Allium sativum گیاهی از راسته مارچوبهایها و متعلق به خانواده لیلیاسه است. متابولیت ثانویه در سیر اسید آمینه غیرپروتئینی به نام آلئین است که تحت تأثیر آنزیم آلییناز به ترکیب فرار دی آلیل تیوسولفینات (آلیسین) تبدیل میشود (18). آلیسین به عنوان یکی از مهمترین ترکیبات ارگانوسولفوره سیر دارای خواص زیستی و دارویی وسیعی از جمله ضدمیکروبی، ضدسرطانی، ضدفشارخون، ضدآرتریت، تعدیلکننده سیستم ایمنی، ضدپیری، سمزدایی فلزات سنگین و کاهنده قند و چربی خون میباشد (6).
الیسیتورها ترکیباتی هستند که از طریق القای پاسخهای دفاعی باعث بیوسنتز و انباشت متابولیتهای ثانویه میشوند. امروزه با پیشرفت فناوری، روشهای متعددی برای تولید متابولیتهای ثانویه وجود دارد شامل استفاده از الیسیتورهای زیستی مانند الیسیتورهای قارچی، باکتریایی و مخمر و الیسیتورهای غیرزیستی مانند پلی ساکاریدها، گلیکوپروتئینها، آنزیمهای غیر فعال شده و نمکهای فلزات سنگین (7). الیسیتورها ممکن است با فعالسازی ژنهای برخی از آنزیمها در نهایت مسیرهای بیوسنتزی مختلفی را راهاندازی کنند و باعث تشکیل متابولیتهای ثانویه شوند. میزان اثر الیسیتور بر تولید متابولیتهای ثانویه در کشت بافت به غلظت و مدت زمان تیمار وابسته است (25).
نانوذرات نقره (AgNPs) حاوی یونهای نقره هستند و معمولاً دامنه اندازه آنها از 100- 10 نانومتر متغیر است. این نانوذرات، به دلیل اندازه کوچکشان دارای سطح تماس بالا میباشند. بنابراین، میزان چسبندگی آنها به سطوح سلولی افزایش یافته و به همین دلیل کارآیی آنها نسبت به سایر ترکیبات بیشتر میشود (23). بسته به خواص نانو ذرات، این مواد در گیاهان بسیاری از تغییرات مورفولوژیکی و فیزیولوژیکی را اعمال میکنند. اثر نانو ذرات به ترکیب شیمیایی، اندازه، پوشش سطح، واکنشپذیری و از همه مهمتر غلظت نانوذره وابسته بوده و از گیاهی به گیاه دیگر متفاوت است (24).
با این حال، گزارشهای بسیار کمی در ارتباط با تأثیر نانوذرات نقره بر عملکرد و میزان تولید متابولیتهای ثانویه گیاهی وجود دارد. با بررسیهای انجام شده در پایگاههای اطلاعاتی مختلف تاکنون گزارشی مبنی بر تأثیر نانوذرات نقره بر میزان تولید آلیسین در گیاه سیر وجود ندارد. بر همین اساس، در این تحقیق تأثیر غلظتهای مختلف نیترات نقره (AgNO3) و نانوذرات نقره بر تولید آلیسین گیاه سیر در شرایط کشت درونشیشهای بررسی شده است.
مواد و روشها
کشت و آمادهسازی نمونههای گیاهی و اعمال تیمارها: صفحه پایگاهی بوتههای سیر شهرستان آذرشهر (واقع در استان آذربایجانشرقی) پس از ضدعفونی سطحی با توئین و محلول هیپوکلریت سدیم 50 درصد و الکل اتیلیک 70 درصد به ترتیب به مدت 30 و 10 دقیقه و شستشو با آب مقطر استریل در محیط کشت جامد موراشیگ و اسگوک (MS) کشت شدند. ریزنمونهها در محیط کشت MS کشت و پس از 4 هفته به محیطهای کشت تازه حاوی غلظتهای مختلف نانوذره نقره (اندازه 5/4 نانومتر و کروی شکل، توسط آقای دکتر رستمنیا همکار محترم گروه شیمی دانشگاه سنتز شده بود) و نیترات نقره (0، 25 و 50 میلیگرم در لیتر) منتقل شدند. به مدت یک هفته تمامی ریزنمونهها در داخل فیتوترون با تناوب نوری 16 ساعت روشنایی و دمای 27 درجه سانتی گراد نگهداری، و نمونههای جمعآوری شده به منظور انجام آزمایشهای بعدی در فریزر نگهداری شدند.
اندازهگیری رشد ریزنمونههای سیر: قبل از جمعآوری، ویژگیهای مورفولوژیکی نمونهها بررسی شد. میزان وزن تر نمونهها با استفاده از ترازو ثبت شد.
عصارهگیری از نمونههای گیاهی به منظور بررسی محتوی آلیسین: عصارهگیری از نمونههای گیاهی و بررسی محتوی آلیسین به روش ایبرل انجام شد (16). بدین منظور، یک گرم از بافت تر گیاهی ساییده، و با افزودن 30 میلیلیتر آب در دمای اتاق به مدت 30 دقیقه انکوبه شد. سپس نمونهها در دمای 4 درجه سانتی گراد با سرعت 15000 دور در دقیقه به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ گردید. در ادامه 400 میکرولیتر از فاز رویی با فاز متحرک به حجم 1 میلیلیتر رسانده و مجدداً به مدت 5 دقیقه با سرعت 8000 دور در دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شد. در خاتمه محلول رویی به منظور سنجش میزان آلیسین در فریزر 80- درجه سانتی گراد نگهداری شد. بررسی میزان آلیسین نمونههای سیر با استفاده از دستگاه HPLC و ستون C18 در طول موج 254 نانومتر، سرعت جریان حلال 1 میلیلیتر بر دقیقه و فاز متحرک شامل متانول، آب و استونیتریل به نسبت 9 : 41 : 50 انجام شد. در نهایت 20 میکرولیتر عصاره گیاهی به دستگاه تزریق شد. محتوای آلیسین در نمونههای مورد بررسی بر اساس زمان بازداری به دست آمده از ترکیب استاندارد و سطح زیر منحنی پیکهای مربوط به هر نمونه، با استفاده از نمودار استاندارد آلیسین محاسبه شد.
سنجش میزان سیستئین کل: میزان سیستئین محلول کل به روش گایتوند اندازهگیری شد (12). به این صورت که ابتدا 50 میلیگرم از نمونه گیاهی با 1 میلی لیتر اسید پرکلریک 5 درصد به مدت 6 دقیقه در سونیکاتور قرار داده شد. سپس به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد و با سرعت 10000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شده، بعد از اتمام زمان مورد نظر، محلول رویی جمعآوری و برای سنجش مورد استفاده قرار گرفت. برای اندازهگیری، ابتدا 200 میکرولیتر از عصاره گیاهی با 200 میکرولیتر معرف نین هیدرین و 200 میکرولیتر اسید استیک گلاسیال مخلوط و به مدت 10 دقیقه در حمام آب گرم 90 درجه سانتی گراد قرار داده شد. بعد از اتمام زمان مورد نظر، سریعاً به حمام آب سرد انتقال داده و میزان جذب نمونهها در طول موج 560 نانومتر به وسیله اسپکتروفتومتر قرائت شد. منحنی استاندارد با استفاده از غلظتهای مختلف سیستئین(15 و 10، 8، 6، 4، 2، 1 میکروگرم در میلی لیتر) رسم و در نهایت غلظت سیستئین محلول نمونههای گیاهی با استفاده از منحنی استاندارد بر حسب میکروگرم بر گرم بافتتر گیاهی محاسبه شد.
استخراج و سنجش پروتئین محلول کل از گیاهچههای سیر: مقدار نیم گرم از بافت تر گیاهی در هاون چینی با افزودن 50 میلی گرم پلی وینیل پیرولیدن (Polyvinylpyrrolidone) و 5/1 میلی لیتر از بافر فسفات پتاسیم (pH=7) ساییده و با دور rpm 15000 در دمای 4 درجه سانتی گراد به مدت 30 دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس فاز رویی در ویالهای کوچکتر تقسیم و ویالها در فریزر 80- درجه سانتی گراد به منظور انجام مطالعات بعدی نگهداری شد. میزان پروتئین محلول کل در این بررسی به روش بردفورد تعیین شد (2).
سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز: فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT, EC: 1.11.1.6) به روش ابی اندازه گیری شد (4). به این ترتیب که 20 میکرولیتر عصاره آنزیمی با بافر فسفات پتاسیم 100میلی مولار (pH=7) آب مقطر استریل و پراکسید هیدروژن 70 میلی مولار محلول در بافر فسفات پتاسیم 100 میلی مولار (PH=7) (750 میکرولیتر) مخلوط شدند. فعالیت آنزیم کاتالاز توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 240 نانومتر در مدت زمان 180 ثانیه اندازهگیری شد. از مخلوط بدون عصاره آنزیمی به عنوان بلانک استفاده شد. فعالیت آنزیم کاتالاز بر اساس میزان تجزیه شدن پراکسید هیدروژن در طول موج 240 نانومتر و با استفاده از معادله (1) محاسبه شد. فعالیت ویژه آنزیم کاتالاز به صورت تعداد میکرومول پراکسید هیدروژن تجزیه شده در دقیقه در میلیگرم پروتئین گزارش شد.
∆A240 × I× Vt × df |
= فعالیت آنزیم (واحد در میلی لیتر) |
Vs× t× l Ꜫ × |
∆A240: تفاوت میزان جذب مخلوط واکنش در زمان شروع و پایان واکنش
l: ضریب پراکسیدهیدروژن در معادله، Vt: حجم مخلوط واکنش، df: فاکتور رقیقکننده، t: مدت زمان واکنش، Vs: حجم نمونه،
ε: ضریب خاموشی برابر mM-1cm-1 4/39 و l: طول مسیر عبور نور از مخلوط واکنش.
سنجش فعالیت گایاکول پراکسیداز: فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز (POX, EC: 1.11.1.7) به روش چانس و مهلی اندازه گیری شد (10). مخلوط واکنش شامل محلولهای بافر فسفات پتاسیم 100 میلی مولار (PH=7)، گایاکول ده میلی مولار محلول در آب دوبار تقطیر، پراکسید هیدروژن 70 میلی مولار محلول در فسفات پتاسیم 100 میلی مولار (pH=7)، آب دوبار تقطیر استریل و عصاره آنزیمی است. فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 470 نانومتر در مدت زمان 180 ثانیه اندازهگیری شد. از مخلوط بدون عصاره آنزیمی به عنوان بلانک استفاده شد. فعالیت ویژه آنزیم پراکسیداز به صورت تعداد میکرومول پراکسید هیدروژن تجزیه شده در دقیقه در میلیگرم پروتئین گزارش شد.
∆A270 × I× Vt × df |
= فعالیت آنزیم (واحد در میلی لیتر) |
Vs× t× l Ꜫ × |
∆A270: تفاوت میزان جذب مخلوط واکنش در زمان شروع و پایان واکنش، l: ضریب پراکسیدهیدروژن در معادله، Vt: حجم مخلوط واکنش، df: فاکتور رقیقکننده، t: مدت زمان واکنش، Vs: حجم نمونه، ε: ضریب خاموشی برابر mM-1cm-1 6/26 و l: طول مسیر عبور نور از مخلوط واکنش.
آنالیز آماری: به منظور مقایسه نتایج بهدست آمده و تعیین اهمیت تفاوتهای مشاهده شده در آزمایشات از نرم افزار SPSS (ویرایش 22) استفاده شد. جهت بررسی تفاوت بین گروههای آزمایشی از آنالیز واریانس یک طرفه (one-way ANOVA) و سپس برای مقایسه میانگین گروهها از آزمون دانکن استفاده شد. نتایج آزمایشها به صورت .Mean±S.D دادههای حاصل از حداقل 3 بار آزمایش مجزا ارائه و نتایج آنالیزهای آماری با مقدار P کوچکتر از 05/0 معنیدار در نظر گرفته شد. رسم نمودارها به وسیلهMicrosoft Excel انجام گرفت.
نتایج
پس از اینکه نرمال بودن توزیع اشتباهات آزمایشی توسط آزمون کولموگروف اسمیرنوف تک نمونهای و بررسی یکنواختی واریانس گروههای آزمایشی با استفاده از آزمون لون در سطح احتمال 5 درصد، تجزیه واریانس دادهها بر اساس آزمون فاکتوریل در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی انجام پذیرفت که در جدول 1 آمده است.
جدول 1- تجزیه واریانس صفات مورد مطالعه در ریزنمونههای گیاه سیر
(M.S) میانگین مربعات |
df |
منابع تغییر |
|||||
وزن تر |
آلیسین |
سیستئین |
پروتئین |
کاتالاز |
گایاکول پراکسیداز |
|
|
019/0 ** |
432/44 ** |
381/2523 ** |
896/32 ** |
078/0 n.s |
276/13 ** |
1 |
اندام |
031/0 ** |
073/176 ** |
37/1872 ** |
62/2 ** |
138/0 * |
66/3 ** |
4 |
تیمار |
015/0 * |
45/80 ** |
66/361 ** |
25/2 ** |
44/2 ** |
35/12 ** |
4 |
اندام × تیمار |
001/0 |
086/3 |
616/6 |
028/0 |
040/0 |
045/0 |
10 |
خطا |
n.s، * و ** به ترتیب غیرمعنیدار و معنیدار در سطح احتمال پنج و یک درصد است.
تأثیر نانوذره نقره و نیترات نقره بر رشد ریزنمونههای سیر: اثر اعمال الیسیتورها بر وزن تر گیاه در شکل 1 آمده است.
شکل 1- تأثیر نانوذرات نقره و نیترات نقره بر وزن تر ریزنمونهها. میانگینهای با ﺣﺮوف ﻣﺘﻔﺎوت ﺑﺎﻻی ﻧﻤﻮدارﻫﺎ در هر ستون بر اساس آزمون چند دامنهای دانکن در ﺳﻄﺢ 5 درﺻﺪ اختلاف ﻣﻌﻨﻲداری دارند. CTRL: کنترل، AgNPs: نانوذرات نقره و AgNO3: نیترات نقره.
کاهش معنیدار (در سطح 1 درصد) وزن تر در ریشههای تیمار شده با نیترات نقره 25 و و50 میلی گرم در لیتر نسبت به کنترل مشاهده شد. در بخش هوایی نمونههای تیمار شده با نیترات نقره 50، نانونقره 25 و 50 میلی گرم در لیتر کاهش معنیدار (در سطح 1 درصد) وزن تر نسبت به کنترل مشاهده شد.
تأثیر نانوذره نقره و نیترات نقره بر میزان آلیسین ریزنمونههای سیر: کروماتوگرام آلیسین مورد استفاده برای اندازهگیری میزان آلیسین بیوسنتز شده در نمونههای گیاهی در شکل (2-الف) و میزان تولید آلیسین در نمونههای مختلف گیاهی با استفاده از این کروماتوگرام به صورت نمودار در شکل (2-ب) نشان داده شده است. در نمونههای تیمار شده با نانونقره 25 میلی گرم در لیتر در هر دو بخش ریشه و هوایی میزان آلیسین نسبت به کنترل افزایش نشان داد که افزایش در بخش ریشه معنیدار (در سطح 1 درصد) بود. میزان آلیسین در نمونههای تیمار شده با نانونقره 50 میلی گرم در لیتر در بخش ریشه و هوایی افزایش معنیدار (در سطح 1 درصد) نسبت به کنترل مشاهده شد. در نمونههای تیمار شده با نیترات نقره 25 میلی گرم در لیتر میزان آلیسین در هر دو بخش هوایی و ریشه تفاوت معنیدار با نمونه های کنترل مشاهده نشد، در مقابل میزان آلیسین در نمونههای در معرض 50 میلی گرم در لیتر نیترات نقره میزان آلیسین در هر دو بخش کاهش قابل توجه و معنیدار (در سطح 1 درصد) نسبت به کنترل نشان داد.
شکل 2- اثر الیسیتور نانوذره نقره و نیترات نقره بر میزان آلیسین بخش ریشه و اندام هوایی ریزنمونههای سیر. الف) کروماتوگرامHPLC آلیسین. ب) میزان محتوای آلیسین تام در ریزنمونههای سیر تحت تیمار با نانوذره نقره (AgNPs) و نیترات نقره (AgNO3) است. میانگینهای با ﺣﺮوف ﻣﺘﻔﺎوت ﺑﺎﻻی ﻧﻤﻮدارﻫﺎ در هر ستون بر اساس آزمون چند دامنهای دانکن در ﺳﻄﺢ 5 درﺻﺪ اختلاف ﻣﻌﻨﻲداری دارند.
اثر الیسیتور نانوذره نقره و نیترات نقره بر محتوای سیستئین تام ریزنمونههای سیر: از آنجائی که اسید آمینه سیستئین پیش ماده سنتز آلیسین میباشد، لذا تغییرات میزان سیستئین نمونههای سیر در پایان بازههای زمانی مورد نظر مورد سنجش قرار گرفت که نتایج در شکل 3 آمده است. بر اساس نتایج حاصل از ارزیابی میزان سیستئین تحت تیمارهای مختلف، بیشترین میزان اسیدآمینه سیستئین و تفاوت معنیدار (در سطح 1 درصد) با تمام گروهها در نمونههای تیمار شده با نانوذره نقره سنجش شد که در هر دو بخش ریشه و بخش هوایی مربوط به غلظت 50 میلیگرم در لیتر نانوذره نقره بود. در بخش ریشه و هوایی گیاهان در معرض نیترات نقره کمترین میزان اسیدآمینه سیستئین نسبت به سایر تیمارها مشاهده شد.
تأثیر نانوذره نقره و نیترات نقره بر میزان پروتئین کل ریزنمونههای سیر: نتایج حاصل از اندازهگیری میزان پروتئین کل در نمونههای گیاهی در شکل 4 نشان داده شده است. میزان پروتئین کل بخش هوایی در نمونههای تیمار شده و نشده به طور معنیداری (در سطح 1 درصد) بیشتر از میزان آن در بخش ریشه بود. بیشترین میزان پروتئین در بخش هوایی گیاهان تیمار شده با نانو ذره نقره 25 و 50 میلی گرم در لیتر مشاهده شد. میزان پروتئین بخش ریشه در نمونههای تیمار شده با نیترات نقره 50 میلی گرم در لیتر کمتر از سایر تیمارها بود.
تأثیر تیمار نانوذره نقره و نیترات نقره بر فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز ریزنمونههای سیر: نتایج حاصل از بررسی فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز در نمونههای گیاهی در شکل 5 نشان داده شده است.
شکل 3- اثر الیسیتور نانوذره نقره و نیترات نقره بر محتوای سیستئین تام ریزنمونههای سیر. الف) منحنی استاندارد سیستئین. ب) میزان محتوای سیستئین تام در ریزنمونههای سیر تحت تیمار با نانوذره نقره (AgNPs) و نیترات نقره (AgNO3). میانگینهای با ﺣﺮوف ﻣﺘﻔﺎوت ﺑﺎﻻی ﻧﻤﻮدارﻫﺎ در هر ستون بر اساس آزمون چند دامنهای دانکن در ﺳﻄﺢ 5 درﺻﺪ اختلاف ﻣﻌﻨﻲداری دارند.
شکل 4- اثر الیسیتور نانوذره نقره و نیترات نقره بر میزان پروتئین کل بخش ریشه و اندام هوایی ریزنمونههای سیر. الف) نمودار استاندارد پروتئین سرم آلبومین گاوی. ب) میزان پروتئین نمونههای تیمار شده با نانوذره نقره (AgNPs) و نیترات نقره (AgNO3). میانگینهای با ﺣﺮوف ﻣﺘﻔﺎوت ﺑﺎﻻی ﻧﻤﻮدارﻫﺎ در هر ستون بر اساس آزمون چند دامنهای دانکن در ﺳﻄﺢ 5 درﺻﺪ اختلاف ﻣﻌﻨﻲداری دارند.
با توجه به نتایج حاصل، در بخش ریشه گیاهان تیمار شده با نانوذره نقره در هر دو غلظت، فعالیت آنزیم افزایش معنیدار (در سطح 1 درصد) نسبت به شاهد، در مقابل در بخش اندام هوایی در هر دو غلظت نانو ذره نقره میزان فعالیت آنزیم کاهش معنیدار (در سطح 1 درصد) نسبت به شاهد مشاهد شد. در گیاهان تیمار شده با نیترات نقره در هر دو غلظت و در هر دو بخش کاهش معنیدار (در سطح 1 درصد) نسبت به کنترل مشاهده شد.
شکل 5- اثر الیسیتور نانوذره نقره و نیترات نقره بر فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز (GPX) بخش ریشه و اندام هوایی ریزنمونههای سیر. میانگینهای با ﺣﺮوف ﻣﺘﻔﺎوت ﺑﺎﻻی ﻧﻤﻮدارﻫﺎ در هر ستون بر اساس آزمون چند دامنهای دانکن در ﺳﻄﺢ 5 درﺻﺪ اختلاف ﻣﻌﻨﻲداری دارند.
تأثیر تیمار نانوذره نقره و نیترات نقره بر فعالیت آنزیم کاتالاز ریزنمونههای سیر: با توجه به نتایج بررسی فعالیت آنزیم کاتالاز (شکل 6) فعالیت آنزیم در بخش ریشه گیاهان تیمار شده با نیترات نقره نسبت به کنترل به طور معنیدار (در سطح 1 درصد) نسبت به شاهد افزایش اما در بخش هوایی نسبت به شاهد کاهش مشاهده شد. در بخش ریشه و هوایی گیاهان تیمار شده با نانوذره نقره تفاوت معنیدار نسبت به کنترل مشاهده نشد.
شکل 6- اثر الیسیتور نانوذره نقره و نیترات نقره بر فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT) بخش ریشه و اندام هوایی ریزنمونههای سیر. میانگینهای با ﺣﺮوف ﻣﺘﻔﺎوت ﺑﺎﻻی ﻧﻤﻮدارﻫﺎ در هر ستون بر اساس آزمون چند دامنهای دانکن در ﺳﻄﺢ 5 درﺻﺪ اختلاف ﻣﻌﻨﻲداری دارند.
بحث
تجمع ﻧﻘﺮه در غلظتهای ﺑﺎﻻ، اﺣﺘﻤﺎل اﺛﺮات ﻛﺸﻨﺪه آن را اﻓﺰاﻳﺶ ﻣﻲدﻫﺪ. ﺳﻤﻴﺖ ﻧﻘﺮه در محیطهای آﺑﻲ ﺑﻪ ﻏﻠﻈﺖ یونهای ﻧﻘﺮه آزاد واﺑﺴﺘﻪ اﺳﺖ و ﻛﺎﻫﺶ ﻣﻴﺰان دﺳﺘﺮﺳﻲ زﻳﺴﺘﻲ ﺑﻪ ﻳﻮن ﻧﻘﺮه از ﺳﻤﻴﺖ آن ﻣﻲﻛﺎﻫﺪ. ﺑﻪ ﻃﻮر ﻛﻠﻲ در ﻣﻴﺎن ﺗﺮﻛﻴﺒﺎت ﻧﻘﺮهدار، ﺗﺮﻛﻴﺒﺎت ﻗﺎﺑﻞ ﺣﻞ ﻣﺎﻧﻨﺪ نیترات ﻧﻘﺮه ﺳﻤﻴﺖ ﺑﻴﺸﺘﺮی ﻧﺴﺒﺖ ﺑﻪ اﺷﻜﺎل ﻏﻴﺮﻗﺎﺑﻞ ﺣﻞ ﻧﻘﺮه دارﻧﺪ. ﺣﺴﺎﺳﻴﺖ ﮔﻮﻧﻪﻫﺎی ﻋﺎﻟﻲ ﺧﺸﻜﻲزی ﮔﻴﺎﻫﻲ در ﺑﺮاﺑﺮ ﺳﻤﻴﺖ ﻧﺎﺷﻲ از ﻧﻘﺮه ﻣﺘﻨﻮع اﺳﺖ (1).
بر اساس گزارش سیف سهندی و همکاران، پاشش برگی نیترات نقره (0، 10، 20 و 30 میلی مولار) و نانوذره (0، 2/0، 4/0 و 6/0 میلی مولار) بر ویژگیهای رویشی و فیتوشیمیایی گیاه گل گاوزبان در مرحله گلدهی، به طور معنیداری ویژگیهای رشدی (مانند تعداد برگ، سبزینگی برگها، وزن خشک گیاه، وزن خشک گل آذین و ریزش گلبرگ) و فیتوشیمیایی (محتوای فنول، تانن و آلکالوئید، درصد موسیلاژ و شاخص تورم) را افزایش داد. که از میان تیمارهای استفاده شده، تیمار 6/0 میلی مولار نانوذرات نقره از بقیه تیمارها کارآیی بیشتری داشت (28). در مطالعه استامپلیس و همکاران، نانوذرات اکسید روی تفاوت معنیداری در جوانهزنی بذر گیاه کدو سبز و رشد طول ریشه این گیاه ایجاد نکرد، درحالی که اعمال غلظت مشابه نانوذرات مس و نقره باعث مهار رشد ریشه شد (31). نانوذرات نقره با اندازه متفاوت (80-20 نانومتر) در گیاه شاهی تاله حتی در غلظت بسیار پایین، منجر به کاهش رشد این گیاه در مقایسه با گروه شاهد شد. در این آزمایش افزایش غلظت نانوذرات نقره، همراه با کاهش وزن تر ریشه و طول ریشه بوده است که این نتیجه میتواند به دلیل افزایش سمیت نانوذره بوده باشد (22). خاصیت ضد قارچی و باکتریایی نانوذرات نقره - سیلیکات در گیاهان نشان داده شده است. علاوه بر این، این ترکیب بدون عوارض سمی در گیاهان مورد آزمایش، به عنوان عامل کنترل کننده بیماری در گیاه نیز معرفی شده است (19). با افزایش غلظت نانوذرات نقره، رشد ریشه گیاه
Lolium multiflorum کاهش یافت که میتواند بیانگر افزایش سمیت نانوذرات باشد (34). بر اساس نتایج حاصل از این بررسی، تیمار نانوذره در هر دو غلظت و در هر دو بخش اثر کاهشی معنیدار بر میزان وزن تر ریزنمونههای سیر نسبت به شاهد نداشته، در مقابل، هر دو غلظت نیترات نقره در هر دو بخش موجب کاهش معنیدار میزان وزن تر نمونهها نسبت به شاهد شده است که احتمالاً میتواند ناشی از اثر نیترات نقره باشد.
طی پژوهشهای متعددی، دانشمندان اقدام به اندازهگیری ترکیبات دارویی موجود در گیاه سیر و موسیر، به ویژه ترکیب دارویی آلیسین نمودهاند و بدین منظور روشهای متعددی نیز پیشنهاد شده است. در روش HPLC مقدار آلیسین گزارش شده، بسته به محیط رشد گیاه، شرایط استخراج، روش سنجش، طول موج اندازهگیری، فاز متحرک و شدت جریان حلال نتایج مختلفی گزارش شده است. در عصارهگیری موسیر با استفاده از اتانول و اتیلاتر و HPLC با فاز متحرک دیهیدروژن فسفات، اسید هپتان سولفونیک و استونیتریل، مقدار آلیسین را 78/5 میلیگرم در لیتر گزارش شده است (13). در حالی که میزان آلیسین در عصاره کلروفرمی موسیر به روش HPLC با فاز موبایل متانول، آب، اسید فرمیک، 1/0 ± 4/3 میلیگرم در یک گرم وزن خشک تعیین شده است (14).
مقدار آلیسین در عصاره آبی گیاه سیر به روش HPLC با فاز موبایل آب و متانول، 01/0 ± 48/0 میلیگرم در میلیلیتر گزارش شده است (8). مطالعه24 واریته سیر جمعآوری شده از نقاط مختلف ایران که با استفاده از اسید فرمیک، متانول و آب عصاره گیری شده بودند، میزان آلیسین به روش HPLC با فاز موبایل متانول و آب در تمام اکوتیپهای بررسی شده، بیشتر از استانداردهای بینالمللی (5/4 میلیگرم بر گرم وزن تر) گزارش شده است (9).
در بررسی سیرهای کشت شده در آرژانتین، چین، ایتالیا و اسپانیا به ترتیب، میزان 6/3، 4/4،7/3، 5/4 میلیگرم آلیسین در یک گرم وزنتر گیاه گزارش شده است (16). افزایش میزان آلیین در نمونههای سیر کشت شده در مزرعه تحت تأثیر کود سولفات کلسیم (200 کیلوگرم در هکتار) گزارش شده است (17). برخی از مطالعات نیز تأثیر شرایط محیطی بر محتوای آلیسین را اثبات کرده است. برای مثال مشخص شده که میزان آلیسین سیر نگهداری شده در مقایسه با سیر تازه برداشت شده بیشتر است و همچنین مشخص شده که دمای پایین محیط (6-4 درجه سانتی گراد) و رطوبت بالا باعث افزایش چشمگیر میزان آلیسین میشود. طبق گزارشهای انجام شده، دلیل این افزایش فعالیت حداکثری آنزیم گاما-گلوتامیل ترانس پپتیداز (آنزیم مرحله نهایی تشکیل آلیین) در دمای 4 درجه سانتی گراد است (32). در مرور منابع، گزارشی در مورد اثر نانوذرات بر میزان آلیسین گیاه سیر مشاهده نشد. میزان آلیسین نمونههای در معرض نانونقره در هر دو بخش نسبت به کنترل بیشتر بود، قابل ذکر است که در بخش ریشه و اندام هوایی به ترتیب کاهش و افزایش میزان آلیسین با افزایش غلظت مشاهده شد. در نمونههای تیمار شده با نیترات نقره 25 میلی گرم در لیتر میزان آلیسین در هر دو بخش نسبت به کنترل تفاوت غیر معنیدار بود، اما در غلظت 50 میلی گرم در لیتر کاهش شدید نسبت به کنترل مشاهده شد.
میزان پروتئین کل اندام هوایی در نمونههای در معرض نانوذرات نقره 25 و 50 میلی گرم در لیتر نسبت به شاهد افزایش معنیداری نشان داد. در مقابل میزان پروتئین کل هر دو بخش در گیاهان در معرض نیترات نقره کاهش معنیدار نسبت به کنترل نشان داد که نتایج با نتایج مربوط به سنجش آنزیمی در ارتباط میباشد. در معرض قرار دادن گیاهان با فلزات سنگین موجب القای پاسخهای زیادی در سطح فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی میگردد. برخی مطالعات نشان دادهاند که فلزات سنگینی مانند کادمیوم، سرب، نیکل و نقره موجب تغییر در مقدار پروتئین کل گیاهان میشوند (33).
در مطالعات دیگری مشخص شده که نانوذرات نقره اعمال شده بر گیاه Bacopa monnieriباعث کاهش محتوای پروتئین و از طرفی، باعث افزایش میزان کربوهیدرات کل این گیاه شده است. گزارش شده که این نتایج، نشان دهنده برهمکنش این نانوذرات با پروتئینهای مرتبط با فتوسیستمها، مکانیسمهای سنتز نشاسته و یا انتقال کربوهیدراتها در گیاه بوده است (21).
در ﺗﻨﺶ اﻛﺴﻴﺪاﺗﻴﻮ ﺗﻮﻟﻴﺪ ﺑﻴﺶ از ﺣﺪ ﮔﻮﻧﻪﻫﺎی ﻓﻌﺎل اﻛﺴﻴﮋن (Reactive oxygen species, ROS) ﺑﺎﻋﺚ آﺳﻴﺐ ﺑﻪ DNA، ﭘﺮوتئینهای ﺳﺎﺧﺘﺎری و ﻟﻴﭙﻴﺪﻫﺎ ﻣﻲﺷﻮﻧﺪ و ﻫﻤﭽﻨﻴﻦ ﻣﻲﺗﻮاﻧﻨﺪ واکنشهای زﻧﺠﻴﺮهای غیرقابل ﻛﻨﺘﺮل ﻣﺜﻞ واکنشهای اﻛﺴﻴﺪاﺳﻴﻮن و ﭘﺮاﻛﺴﻴﺪاﺳﻴﻮن را موجب شوند. از ﻣﻬﻤﺘﺮﻳﻦ ﻋﻮاﻣﻠﻲ ﻛﻪ ﺗﻨﺶ اﻛﺴﻴﺪاﺗﻴﻮ در ﮔﻴﺎﻫﺎن را اﻟﻘﺎء ﻣﻲﻧﻤﺎﻳﻨﺪ میتوان به ﻓﻠﺰات ﺳﻨﮕﻴﻦ از ﻗﺒﻴﻞ ﻛﺒﺎﻟﺖ، ﻣﺲ، آﻟﻮﻣﻴﻨﻴﻮم، ﻧﻴﻜﻞ و ﻧﻘﺮه اشاره کرد. ﮔﻴﺎﻫﺎن از ﻃﺮﻳﻖ دو ﻣﺴﻴﺮ ﺳﻴﺴﺘﻢ آﻧﺘﻲ اﻛﺴﻴﺪان؛ آﻧﺰﻳﻤﻲ و ﻏﻴﺮآﻧﺰﻳﻤﻲ ﺳﻤﻴﺖ اﻳﻦ رادیکالها را ﻛﺎﻫﺶ ﻣﻲدﻫﻨﺪ. در ﺷﺮاﻳﻂﻛﻨﺘﺮل ﺷﺪه از اﻳﻦﻓﻠﺰات ﻣﻲﺗﻮان ﺑﻪ ﻋﻨﻮان ﻣﺤﺮک ﺑﺮای ﺗﻮﻟﻴﺪ ﻣﺘﺎﺑﻮلیتهای ﺛﺎﻧﻮیه ﻛﻪ ارزش داروﻳﻲ ﺑﺴﻴﺎری دارﻧﺪ ﻣﻮرد اﺳﺘﻔﺎده ﻗﺮار داد (3). حفظ سطح مناسب و صحیح گونههای واکنشگر اکسیژن برای رشد و سیگنالینگ مهم میباشد، به عنوان مثال، گونههای واکنشگر اکسیژن در رشد قطبی سلول، مسیر سیگنالیگ اسید آبسیزیک و در پاسخ به پاتوژنها دخالت دارند (11).
در مطالعه یوسفی و همکاران، ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ آﻧﺰﻳﻢ ﻛﺎﺗﺎﻻز در ﺗﻴﻤﺎر ﺑﺎ ﻏﻠﻈﺖ 25 ﻣﻴﻜﺮوﻣﻮﻻر اﻟﻴﺴﻴﺘﻮر ﻧﻘﺮه به صورت ﻣﻌﻨﻲدار ﻧﺴﺒﺖ ﺑﻪ ﻧﻤﻮﻧﻪ ﺷﺎﻫﺪ اﻓﺰاﻳﺶ ﻧﺸﺎن ﻣﻲدﻫﺪ. وﻟﻲ ﺑﺎ اﻓﺰاﻳﺶ ﻏﻠﻈﺖ اﻟﻴﺴﻴﺘﻮر در ﻣﺤﻴﻂ (در تیمار ﺑﺎ غلظتهای 50 و 100ﻣﻴﻜﺮوﻣﻮﻻر) ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ آﻧﺰﻳﻢ ﻧﺴﺒﺖ ﺑﻪ ﻧﻤﻮﻧﻪ ﺷﺎﻫﺪ ﻛﺎﻫﺶ ﻣﻌﻨﻲ دار ﻳﺎﻓﺘﻪ اﺳﺖ. ﻛﻤﺘﺮﻳﻦ ﻣﻴﺰان ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ آﻧﺰﻳﻢ در ﻏﻠﻈﺖ 50 ﻣﻴﻜﺮوﻣﻮﻻر گزارش شد. اما ﻛﺎﻫﺶ ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ آﻧﺰﻳﻢ در ﻏﻠﻈﺖ 50 ﻣﻴﻜﺮوﻣﻮﻻر و اﻓﺰاﻳﺶ ﺟﺰﺋﻲ آن در غلظت 100 ﻣﻴﻜﺮوﻣﻮﻻر اﺧﺘﻼف ﻣﻌﻨﻲداری ﺑﺎ ﺷﺎﻫﺪ ﻧﺪاﺷﺖ. در ﻣﻘﺎﺑﻞ، اﻟﻴﺴﻴﺘﻮر ﻣﺲ ﺑﺎﻋﺚ اﻓﺰاﻳﺶ ﻣﻨﻈﻢ ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ اﻳﻦ آﻧﺰﻳﻢ در ﻫﺮ ﺳﻪ ﻏﻠﻈﺖ ﻣﻮرد اﺳﺘﻔﺎده ﮔﺮدﻳﺪ ﺑﻪ ﻃﻮریﻛﻪ ﺑﺎ اﻓﺰاﻳﺶ ﻏﻠﻈﺖ اﻟﻴﺴﻴﺘﻮر در ﻣﺤﻴﻂ، ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ ﻛﺎﺗﺎﻻز در ﻛﻠﻴﻪ ﺗﻴﻤﺎرﻫﺎ اﻓﺰاﻳﺶ ﻣﻌﻨﻲ داری ﻧﺴﺒﺖ ﺑﻪ ﮔﺮوه ﺷﺎﻫﺪ نشان داد. ﻏﻠﻈﺖ 50 و 100 ﻣﻴﻜﺮوﻣﻮﻻر اﻟﻴﺴﻴﺘﻮر ﻧﻘﺮه ﺑﺎﻋﺚ اﻓﺰاﻳﺶ معنیدار ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ آﻧﺰﻳﻢ ﭘﺮاﻛﺴﻴﺪاز در ﻣﻘﺎﻳﺴﻪ ﺑﺎ ﻧﻤﻮﻧﻪ ﺷﺎﻫﺪ و ﺗﻴﻤﺎر با ﻏﻠﻈﺖ ﻣﻴﻜﺮوﻣﻮﻻر 25 شد. ﺑﻴﺸﺘﺮﻳﻦ اﻓﺰاﻳﺶ ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ اﻳﻦ آﻧﺰﻳﻢ در ﻏﻠﻈﺖ ﻣﻴﻜﺮوﻣﻮﻻر 100 ﻣﺸﺎﻫﺪه ﺷﺪ ﻛﻪ ﺗﻔﺎوت ﻣﻌﻨﻲداری در ﻣﻘﺎﻳﺴﻪ ﺑﺎ ﺳﺎﻳﺮ غلظتها داﺷﺖ. آنها بیان کردند که اﻓﺰاﻳﺶ ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ ﭘﺮاﻛﺴﻴﺪاز و ﻛﺎﺗﺎﻻز ﻛﻪ ﻧﻘﺶ ﻣﻜﻤﻞ در ﺟﺎروب ﻛﺮدن و پاﻛﺴﺎزی H2O2 دارﻧﺪ در ﮔﻴﺎﻫﭽﻪﻫﺎی ﺗﻴﻤﺎر ﺷﺪه ﺑﺎ اﻟﻴﺴﻴﺘﻮر ﻧﻘﺮه ﻧﺴﺒﺖ ﺑﻪ ﮔﻴﺎه ﺷﺎﻫﺪ، ﺑﻴﺎﻧﮕﺮ اﻋﻤﺎل ﺗﻨﺶ ﺗﻮﺳﻂ اﻳﻦ ﻋﻨﺼﺮ در ﮔﻴﺎه ﻣﻲ ﺑﺎﺷﺪ. از ﻃﺮف دﻳﮕﺮ اﻓﺰاﻳﺶ ﻣﺤﺘﻮای پروتئینهای ﻣﺤﻠﻮل در ﮔﻴﺎﻫﭽﻪﻫﺎی ﺗﻴﻤﺎر ﺷﺪه ﻧﺴﺒﺖ ﺑﻪ ﮔﺮوه ﺷﺎﻫﺪ ﻣﻲﺗﻮاﻧﺪ ﺑﻪ دﻟﻴﻞ اﻓﺰاﻳﺶ ﻣﻘﺪار آنزیمهای ﺗﻌﺪﻳﻞ ﻛﻨﻨﺪه ﺷﺮاﻳﻂ ﺗﻨﺶ از ﻗﺒﻴﻞ آنزیمهای آﻧﺘﻲاﻛﺴﻴﺪان و آنزیمهای درﮔﻴﺮ در ﺑﻴﻮﺳﻨﺘﺰ ﺗﺮﻛﻴﺒﺎت آﻧﺘﻲ اﻛﺴﻴﺪاﻧﻲ ﺑﺎﺷﺪ (3).
گزارش شده نانوذرات نقره در دانهرستهای Brassica juncea موجب کاهش تولید پر اکسیدهیدروژن و افزایش کارآیی واکنشهای ردوکس شدند. همچنین غلظتهای بالای نانونقره موجب افزایش فعالیت آنزیمهای متابولیزه کننده پراکسید هیدروژن شد (29).
برگهایBacopa monnieri (Linn.)Wettst. تحت تأثیر نانوذرات نقره، فعالیت بالای کاتالاز و پراکسیداز، کمترین میزان تولید گونههای فعال اکسیژن و در نتیجه کمترین میزان سمیت را نشان دادند. کاتالاز و پراکسیداز نقش مهم و اصلی را در حفاظت از گیاهان در معرض نانوذرات نقره در مقابل آسیب اکسیداتیو برعهده دارند. اثبات شده است که کاهش فعالیت توأم آسکوربات پراکسیداز، سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز موجب افزایش تولید گونههای واکنشگر اکسیژن درون سلولی که به طور مستقیم یا غیر مستقیم در پراکسیداسیون لیپیدها، پیری و مرگ سلولی گیاهی نقش دارند، میشود (21).
در این مطالعه در بخش ریشه نمونههای تیمار شده با نانو نقره 50 میلی گرم در لیتر افزایش قابل توجه فعالیت GPX نسبت به شاهد مشاهده شد که احتمالاً به دلیل تولید ROS و حذف آنها و کاهش سمیت این ترکیبات میباشد. اما کاهش بسیار قابل توجه فعالیت آنزیم در نمونههای تیمار شده با نیترات نقره به احتمال به دلیل اثر مهاری این ترکیبات بر تولید پروتئین و در نتیجه آنزیمها میباشد. شایان ذکر است که کاهش معنیدار رشد نیز در تیمار نیترات نقره نسبت به شاهد نیز مشاهده شد.
همچنین، اضافه کردن نیترات نقره و نانوذرات نقره به محیط کشت گیاه شابیزک موجب تغییر فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدان تحت شرایط کشت درون شیشهای شده است. فعالیت آنزیم کاتالاز در تیمارهای نانوذرات نقره افزایش و در بقیه موارد فعالیت آنزیمها با کاهش مواجه شده است. این نتایج بیانگر آن است که کاربرد نانوذرات نقره در گیاه شابیزک، بیان برخی از پروتئینهای خاص را تنظیم میکند. در تحقیقی که بر روی گیاه آرابیدوپسیس تالیانا انجام شده است، ژنهای زیادی در پاسخ به نانوذرات نقره واکنش نشان دادند. یون نقره موجب افزایش بیان ژنهای دخیل در تنش اکسیداتیو نظیر سوپراکسید دیسموتاز و پراکسیداز شده و از طرف دیگر، کاهش بیان ژنهای درگیر در پاسخ به پاتوژنها و هورمونها را به دنبال داشت (20).
تغییر در میزان فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانت میتواند به عنوان سیگنالی برای تنظیم مکانیسمهای پاکسازی کننده گونههای فعال اکسیژن (ROS) عمل نماید. نفوذپذیری غشایی نانوذرات نقره به مراتب نسبت به نیترات نقره بیشتر است. علت این امر به اندازه بسیار کوچک نانوذرات نقره مربوط است که موجب اتصال بیشتر به بافتهای گیاهی میگردد. همچنین مطالعات نشان میدهد که تحرک یونهای نقره در نانوذرات نقره بسیار بالاتر از نیترات نقره و تیوسولفات نقره میباشد (33).
نانوذره نقره تیمار شده با عصاره آبی برگهای Acalypha indica Linn. در گیاه Bacopa monnieri (Linn)Wettst، افزایش فعالیت پراکسیداز و کاتالاز را موجب شد و هیچگونه اثر سمی در مطالعات مورفولوژی مشاهده نشد. علاوه براین، انتقال نقره در ریشه و ساقه B. monnieri (Linn.) Wettstبه وسیله اسپکتروفتومتر جذب اتمی تأیید شد. تیمار نانوذره نقره با عصاره Acalypha indica Linn موجب کاهش قابل توجه اثر سمی نانوذره بر جوانه زنی و رشد گیاه B. monnieriگردید (21).
در گیاهان، نقش آنزیمهای کاتالاز، آسکوربات پراکسیداز و گایاکول پراکسیداز به عنوان تنظیمکننده میزان پراکسید هیدروژن داخل سلولی بسیار مهم است، به طوریکه افزایش فعالیت این آنزیمها در تیمارهای مختلف، نشاندهنده کارآمدی مهار فعالیت ROS توسط سیستم آنتی اکسیدانی عنوان شده است (15).
در مطالعات متعددی عنوان شده که آنزیم گایاکول پراکسیداز در مقایسه با کاتالاز حساسیت کمتری به وضعیت تنش دارد، در بیشتر موارد، سطح پایین پراکسیداز نشان دهنده شروع پاسخ غیراختصاصی گیاه به تنش است. نتایج برخی از مطالعات نیز نشان داده است که فعالیت پراکسیداز با افزایش غلظت نانوذرات اعمال شده کاهش یافته است، کاهش معنیدار فعالیت گایاکول پراکسیداز در تیمارهای نانوذرات نقره و نیترات نقره در بخش هوایی ریزنمونهها نسبت به شاهد مشاهده شد.این نتایج به احتمال به دلیل غیر فعال شدن مولکولهای پراکسیداز توسط نانوذرات به دلیل جذب و یا سایر فعل و انفعالات شیمیایی و یا کاهش تولید آنزیم مربوط میشود (30).
در مطالعه شبانی و همکاران، ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ آﻧﺰﻳﻢ ﻛﺎﺗﺎﻻز ﺗﺤﺖ ﺗﻴﻤﺎر ﻧﻴﺘﺮات ﻧﻘﺮه در ﺗﻤﺎم غلظتها ﻧﺴﺒﺖ ﺑﻪ ﺷﺎﻫﺪ اﻓﺰاﻳﺶ ﻣﻌﻨﻲداری نشان داد. ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ آﻧﺰﻳﻢ آﺳﻜﻮرﺑﺎت ﭘﺮاﻛﺴﻴﺪاز در ﺗﻴﻤﺎر 01/0 و 1/0 ﻣﻴﻠﻲﻣﻮﻻر ﻧﺴﺒﺖ ﺑﻪ ﺷﺎﻫﺪ ﻛﺎﻫﺶ ﻣﻌﻨﻲداری ﻳﺎﻓﺖ. ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ آﻧﺰﻳﻢ ﮔﺎﻳﺎﻛﻮل ﭘﺮاﻛﺴﻴﺪاز ﺗﻨﻬﺎ در ﺗﻴﻤﺎر 1/0 ﻣﻴﻠﻲ ﻣﻮﻻرﻛﺎﻫﺶ ﻣﻌﻨﻲ داری ﻧﺴﺒﺖ ﺑﻪ ﺷﺎﻫﺪ ﻧﺸﺎن داد. ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ آﻧﺰﻳﻢ ﮔﻠﻮﺗﺎﺗﻴﻮن ردوﻛﺘﺎز در ﺗﻴﻤﺎر 01/0 ﻣﻴﻠﻲﻣﻮﻻر اﻓﺰاﻳﺶ و در ﺗﻴﻤﺎر 1/0 میلیﻣﻮﻻر ﻛﺎﻫﺶ ﻣﻌﻨﻲداری ﻧﺸﺎن داد. آنها بیان کردند اﻓﺰاﻳﺶ ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ آنزیمهای ﻛﺎﺗﺎﻻز و ﮔﺎﻳﺎﻛﻮل ﭘﺮاﻛﺴﻴﺪاز ﺗﻮﺳﻂ ﻧﻴﺘﺮات ﻧﻘﺮه ﻧﺸﺎن ﻣﻲدﻫﺪ ﻛﻪ اﻳﻦ آنزیمها ﺑﺎ ﻫﻤﻜﺎری ﻫﻢ در ﺣﺬف ﭘﺮاﻛﺴﻴﺪ ﻫﻴﺪروژن ﻋﻤﻞ ﻣﻲﻛﻨﻨﺪ و ﻧﻴﺰ دﻟﻴﻠﻲ ﺑﺮ ﺷﺮوع دﻓﺎع آﻧﺘﻲ اﻛﺴﻴﺪان ﻣﻲﺑﺎﺷﺪ ﺑﻪ ﻃﻮری ﻛﻪ ﺑﻪ ﻋﻨﻮان ﻣﺜﺎل ﭘﺎﺳﺦ ﻧﺎﻛﺎﻓﻲ ﻳﻚ آﻧﺰﻳﻢ ﺑﻪ ﻧﻴﺘﺮات ﻧﻘﺮه ﺗﻮﺳﻂ اﻓﺰاﻳﺶ ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ آﻧﺰﻳﻤﻲ دﻳﮕﺮ ﺟﺒﺮان ﻣﻲﺷﻮد. ﻛﺎﺗﺎﻻز در ﭘﺮاﻛﺴﻲزوم ﺳﻠﻮلهای ﮔﻴﺎﻫﻲ ﺣﻀﻮر دارد و ﻣﻬﻤﺘﺮﻳﻦ آﻧﺰﻳﻢ ﺑﺮای ﺣﺬف ﭘﺮاﻛﺴﻴﺪ ﻫﻴﺪروژن اﺳﺖ. اﻳﻦ آﻧﺰﻳﻢ سلولها را از اﺛﺮات ﺳﻤﻲ ﭘﺮاﻛﺴﻴﺪ ﻫﻴﺪروژن از ﻃﺮﻳﻖ ﺗﺠﺰﻳﻪ آﻧﻬﺎ ﺑﻪ اﻛﺴﻴﮋن ﻣﻮﻟﻜﻮﻟﻲ و آب، ﺑﺪون ﺗﻮﻟﻴﺪ رادیکالهای آزاد ﺣﻔﺎﻇﺖ ﻣﻲﻛﻨﺪ (1).
ﻃﺒﻖ ﻧﺘﺎﻳﺞ گزارش شده ﺗﻮﺳﻂ Schutzendubelو ﻫﻤﻜﺎران، افزودن ﻛﺎدﻣﻴﻮم 50 ﻣﻴﻜﺮوﻣﻮﻻر ﺑﻪ ﻛﺸﺖ ﻫﻴﺪروﭘﻮﻧﻴﻚ رﻳﺸﻪﻫﺎیPinus sylvestris در 6 ﺳﺎﻋﺖ اول ﺑﺎﻋﺚ اﻓﺰاﻳﺶ ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ ﻛﺎﺗﺎﻻز، آﺳﻜﻮرﺑﺎت ﭘﺮاﻛﺴﻴﺪاز و ﺳﻮﭘﺮاﻛﺴﻴﺪدﻳﺴﻤﻮﺗﺎز ﻣﻲﺷﻮد، و ﺑﻌﺪ از 12 ﺳﺎﻋﺖ ﻛﺎﻫﺶ ﻣﻲﻳﺎﺑﺪ. در اﻳﻦ ﺗﺤﻘﻴﻖ ﺑﺎ ﺗﻮﺟﻪ ﺑﻪ اﻳﻨﻜﻪ ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ آﻧﺰﻳﻢ ﻛﺎﺗﺎﻻز در ﺗﻤﺎم ﺗﻴﻤﺎرﻫﺎ اﻓﺰاﻳﺶ ﻳﺎﻓﺘﻪ گزارش کردند ﻛﻪ ﺣﺬف اﻛﺴﻴﮋنهای ﻓﻌﺎل ﺑﻴﺸﺘﺮ از ﺳﺎﻳﺮ آنزیمها ﺑﺮ ﻋﻬﺪه ﻛﺎﺗﺎﻻز ﺑﻮده و ﭘﺎﺳﺦ ﻧﺎﻛﺎﻓﻲ ﺳﺎﻳﺮ آنزیمها را ﺟﺒﺮان ﻛﺮده اﺳﺖ. ﺳﺎﻳﺮ آنزیمها در ﺗﻤﺎم ﺗﻴﻤﺎرﻫﺎ ﻳﺎ ﺗﻐﻴﻴﺮ ﻣﻌﻨﻲداری ﻧﺪاﺷﺘﻪ ﻳﺎ ﻛﺎﻫﺶ ﻳﺎﻓﺘﻨﺪ (27). ﺗﻐﻴﻴﺮات اﻳﺠﺎد ﺷﺪه در ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ آنزیمهای آﻧﺘﻲاﻛﺴﻴﺪان ﻣﻤﻜﻦ اﺳﺖ در ارﺗﺒﺎط ﺑﺎ ﺗﻨﺶ اﻛﺴﻴﺪاﺗﻴﻮ وارده ﺑﻪ ﮔﻴﺎه در اﺛﺮ ﺗﺠﻤﻊ ROS ﻫﺎ در ﭘﻲ ﺗﻴﻤﺎر ﻓﻠﺰ ﺳﻨﮕﻴﻦ ﻧﻘﺮه و ﻫﻤﭽﻨﻴﻦ ﺗﺸﺪﻳﺪ ﻓﺮآﻳﻨﺪ ﭘﺮاﻛﺴﻴﺪاﺳﻴﻮن ﻟﻴﭙﻴﺪﻫﺎی ﻫﻤﺴﻮ ﺑﺎ اﻳﻦ ﺗﻨﺶ ﺑﺎﺷﺪ. در ﻛﻞ اﻓﺰاﻳﺶ ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ آﻧﺰﻳﻤﻲ ﻣﻲﺗﻮاﻧﺪ ﺑﺮاﺑﺮ ﺑﺎ اﻓﺰاﻳﺶ ﺳﺮﻋﺖ ﺳﻤﻴﺖزداﻳﻲ ROS ﻫﺎ در ﮔﻴﺎه ﺑﺎﺷﺪ. اﺣﺘﻤﺎﻻ ﻋﻠﺖ ﻛﺎﻫﺶ ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ آنزیمها ﻣﻲﺗﻮاﻧﺪ به دلیل ﺗﺸﺪﻳﺪ اﺛﺮات ﻣﺨﺮب ﻧﻘﺮه و ﻳﺎ ROS ﻫﺎی اﻟﻘﺎء ﺷﺪه ﺑﺮ ﺳﺎﺧﺘﺎر و ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ اﻳﻦ آنزیمها ﺑﺎﺷﺪ. ﻣﺸﺨﺺ ﺷﺪه ﻛﻪ ﻧﻘﺮه ﻣﻲﺗﻮاﻧﺪ ﺟﺎﻧﺸﻴﻦ ﻓﻠﺰاﺗﻲ ﻛﻪ ﺑﻪ ﻋﻨﻮان ﻛﻮﻓﺎﻛﺘﻮر آﻧﺰﻳﻤﻲ در ﺳﺎﺧﺘﺎر آﻧﺰﻳﻢ ﻗﺮار دارﻧﺪ، ﮔﺮدد و ﺑﻪ اﻳﻦ ﺗﺮﺗﻴﺐ ﺑﺮ ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ آن اﺛﺮ ﻣﻨﻔﻲ داشته ﺑﺎﺷﺪ (26). بر اساس نتایج حاصل از این پژوهش نیز کاتالاز بیش از گایاکول پراکسیداز در حذف تنش حاصل از تیمارها موثر میباشد.
سیستئین نقش بسیار مهمی در ساختمان فضایی پروتئینها برعهده دارد چرا که عامل تیول سیستئین در یک زنجیره پلی پپتیدی با از دست دادن هیدروژن، پیوند کووالانس تشکیل میدهند و موجب پایداری واحدهای پروتئین میگردند. سیستئین یک اسید آمینه تیولدار در گیاهان میباشد که در تولید چند ترکیب سلولی مهم از جمله گلوتاتیون، متالوتیونینها، فیتوکلاتینها و هیدروژن سولفید به عنوان مولکول علامت دهنده شرکت دارد. همه این ترکیبات نقش مهمی در افزایش تحمل به تنشها ایفاء میکنند. غلظت سیستئین آزاد در گیاهان پایین بوده ولی فرآوردههای حاصل از متابولیسم آن در گیاه متعدد است که ناشی از تقاضای بالا برای این فرآوردهها در شرایط عادی و تنش میباشد. با بررسی غلظتهای مختلف مس بر روی دو رقم ذرت گزارش دادند که تنش ایجاد شده موجب تجمع فلز در قسمت اندام هوایی بوده و تفاوتهایی در مرحله جوانهزنی مشاهده شده است. با بررسی برخی پارامترهای بیوشیمیایی سطح گلوتاتیون، سیستئین و پراکسیداسیون لیپیدی با افزایش غلظت تنش مس افزایش یافت(5).
در بررسی حاضر نیز میزان سیستئین در هر دو بخش با اعمال نانوذره نقره افزایش و در مورد تیمار نیترات نقره در هر دو بخش کاهش قابل توجه نسبت به کنترل مشاهده شد.
به طور کلی رفته میتوان گفت ریزنمونههای سیر به تیمار ﻧﺎﻧﻮذرات نقره و نیترات نقره ﺣﺴﺎس اﺳﺖ و ﻣﻴﺰان ﺣﺴﺎﺳﻴﺖ به نیترات نقره بیشتر از نانوذرات نقره است. الیسیتور نیترات نقره بر خلاف نانوذره نقره در غلظتهای مشابه اعمال شده در زمان تیمار اثر منفی بر گیاه دارد که با کاهش معنیدار رشد، میزان آلیسین و سیستئین قابل مشاهده است. براساس نتایج، نانوذره نقره به دلیل نداشتن اثر سمی بر رشد و همچنین میزان پروتئین کل ریزنمونههای سیر در غلظتهای به کار رفته در این بررسی و القاء افزایش میزان تولید آلیسین میتواند محرک خوبی برای افزایش تولید آلیسین با خواص ارزشمند دارویی باشد.
قدردانی و تشکر
این مقاله از طرح پژوهشی خاتمه یافته (به شماره 1478/د/94) از محل اعتبارات پژوهشی دانشگاه مراغه مستخرج شده است. همچنین نویسنده از دانشگاه مراغه به دلیل حمایت مالی به منظور انجام این پروژه تشکر و قدردانی مینمایند.