نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 ایران، مراغه، دانشگاه مراغه، دانشکده علوم پایه، گروه زیست‌شناسی

2 گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه مراغه، مراغه، ایران

3 دانشکده علوم زیستی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران

4 عضو هیئت علمی دانشگاه مراغه

چکیده

پکتینازها به‌عنوان یک گروه بزرگ از آنزیم‌ها، پکتین را به‌ مولکول‌های ساده‌تر نظیر اسیدگالاکتورونیک تجزیه می‌کنند و به‌طورگسترده توسط بسیاری از میکروارگانیسم‌ها تولید می‌شوند. امروزه ضایعات فراوان صنایع کشاورزی و فرآوری میوه شامل تفاله چغندرقند، سیب و مرکبات به‌عنوان منابع غنی از پکتین برای القاء تولید پکتیناز توسط بسیاری از میکروارگانیسم‌ها بکار برده می‌شوند. هدف این پروژه بهینه‌سازی تولید پکتیناز قارچ پریفورموسپورا ایندیکا از تفاله چغندرقند به روش طراحی آزمایش تاگوچی بود. پریفورموسپورا ایندیکا در محیط کشت کافر حاوی تفاله چغندرقند کشت داده شد، سپس میزان زیست‌توده و تولید اسپور قارچ، فعالیت آنزیمی و پروتئین محلول به مدت ده روز اندازه‌گیری گردید. براساس نتایج، بیشینه تولید زیست‌توده و آنزیم در روز ششم پس از تلقیح به‌ترتیب 125/6 گرم در لیتر و 8/3 واحد در میلی‌لیتر اندازه‌گیری شد. علاوه بر این اثر غلظت‌های مختلف پارامترهایی مانند گلوکز و سولفات آمونیوم به تنهایی و نیز اثر متقابل آنها مورد بررسی قرار گرفت. براساس نتایج، با افزایش غلظت آنها به تنهایی فعالیت آنزیمی روند افزایشی نشان داد اما اثر متقابل آنها با تفاله چغندرقند موجب کاهش فعالیت آنزیمی شد. فعالیت آنزیمی با روش تاگوچی به 35/8 واحد در میلی‌لیتر رسید که 5/2 برابر شرایط غیر بهینه بود. در مجموع تولید پکتیناز توسط پریفورموسپورا ایندیکا از تفاله چغندرقند به‌عنوان سوبسترای مناسب و ارزان قیمت علاوه بر ارزش اقتصادی، موجب کاهش آلودگی زیست محیطی نیز می‌شود.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Optimization of Piriformospora indica pectinase production from sugar beet pulp by Taguchi method

نویسندگان [English]

  • Parisa Fathi Rezaei 1
  • somayyeh Kiani 2
  • Fereshteh Taghavi 3
  • saleh shahabivand 4

1 Department of Biology, Faculty of Science, University Of Maragheh

2 Department of Biology, Faculty of Science, University of Maragheh, Maragheh, Iran

3 Faculty of biological Science, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran

4 Department of Biology, Faculty of Science, University of Maragheh, Maragheh, Iran

چکیده [English]

Pectinases, as a large group of enzymes, catalysis break down of pectin to smaller molecules including galacturonic acid, and they are widely produced by many microorganisms. Nowadays, abundant waste from agriculture and fruit processing industries including sugar beet pulp, apple and citrus pomace as rich source of pectin are employing to induce pectinase production by many microorganisms. The aim of this study was optimization of Piriformospora indica pectinase production by using sugar beet pulp (SBP) by Taguchi method. First, P. indica was cultured on Kaefer medium supplemented with SBP, then biomass and spore production, enzyme activity and total protein content were measured for ten days. According to the results, maximum biomass production and pectinase activity were detected, 6.125 g/l and 3.2 U/ml in the presence of SBP at 6th day, respectively. Furthermore the effect of different concentrations of glucose and ammonium sulphate and their interaction on enzyme activity was investigated. Based on the results by increasing the amount of them alone the activity was increased but in the case of their interaction with sugar beet pulp the activity was decreased. Next, enzyme production was optimized by Taguchi method to 8.35 U/ml which was 2.5 times more than non-optimized condition. In conclusion, because of pectinase production of P. indica by using sugar beet pulp as a suitable and cheap substrate, economically is valuable and moreover cause to decrease environmental pollution.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Agricultural waste
  • pectinase
  • Piriformospora indica
  • Sugar beet pulp

بهینه­سازی تولید پکتیناز پریفورموسپورا ایندیکا از ضایعات چغندرقند به روش تاگوچی

پریسا فتحی­ رضایی*، سمیه کیانی، فرشته تقوی و صالح شهابی وند

ایران، مراغه، دانشگاه مراغه، دانشکده علوم پایه، گروه زیست­شناسی

تاریخ دریافت: 13/8/97                تاریخ پذیرش: 19/1/98

چکیده

پکتینازها بهعنوان یک گروه بزرگ از آنزیم­ها، پکتین را به­ مولکول­های ساده­تر نظیر اسیدگالاکتورونیک تجزیه می­کنند و به­طورگسترده توسط بسیاری از میکروارگانیسم­ها تولید می­شوند. امروزه ضایعات فراوان صنایع کشاورزی و فرآوری میوه شامل تفاله چغندرقند، سیب و مرکبات به­عنوان منابع غنی از پکتین برای القاء تولید پکتیناز توسط بسیاری از میکروارگانیسم­ها بکار برده می­شوند. هدف این پروژه بهینه­سازی تولید پکتیناز قارچ پریفورموسپورا ایندیکا از تفاله چغندرقند به روش طراحی آزمایش تاگوچی بود. پریفورموسپورا ایندیکا در محیط کشت کافر حاوی تفاله چغندرقند کشت داده شد، سپس میزان زیست­توده و تولید اسپور قارچ، فعالیت آنزیمی و پروتئین محلول به مدت ده روز اندازه­گیری گردید. براساس نتایج، بیشینه تولید زیست­توده و آنزیم در روز ششم پس از تلقیح به­ترتیب 125/6 گرم در لیتر و 8/3 واحد در میلی­لیتر اندازه­گیری شد. علاوه بر این اثر غلظت­های مختلف پارامترهایی مانند گلوکز و سولفات آمونیوم به تنهایی و نیز اثر متقابل آنها مورد بررسی قرار گرفت. براساس نتایج، با افزایش غلظت آنها به تنهایی فعالیت آنزیمی روند افزایشی نشان داد اما اثر متقابل آنها با تفاله چغندرقند موجب کاهش فعالیت آنزیمی شد. فعالیت آنزیمی با روش تاگوچی به 35/8 واحد در میلی­لیتر رسید که 5/2 برابر شرایط غیر بهینه بود. در مجموع تولید پکتیناز توسط پریفورموسپورا ایندیکا از تفاله چغندرقندبه­عنوان سوبسترای مناسب و ارزان قیمت علاوه بر ارزش اقتصادی، موجب کاهش آلودگی زیست محیطی نیز می­شود.

واژه­های کلیدی: پریفورموسپورا ایندیکا، پکتیناز، تفاله چغندرقند، ضایعات کشاورزی

* ﻧﻮﻳﺴﻨﺪه ﻣﺴﺌﻮل، ﺗﻠﻔﻦ: 37273060-041، پست اﻟﻜﺘﺮونیکی: parisafathirezaei@gmail.com

مقدمه

 

ضایعات کشاورزی به مقدار انبوهی در سراسر جهان تولید می­شوند و حاوی مواد لیگنوسلولزی هستند که می­توانند در تولید اسیدهای آلی، متابولیت­های ثانویه، سوخت­های فسیلی و تولید آنزیم­ها استفاده شوند. هم­چنین به­علت محتوای پکتین بالا می­توانند به­­عنوان سوبسترای قابل دسترس و ارزان قیمت برای تولید پکتیناز به­کار روند. بنابراین استفاده از ضایعات کشاورزی علاوه بر کاهش هزینه­های تولید، باعث کاهش آلودگی محیط زیست نیز خواهد شد (19).

چغندرقند همراه با نیشکر منبع اصلی تولید قند در سراسر دنیا  به­شمار می­رود و به­طورگسترده در اروپا، شمال و جنوب آمریکا، آسیا و بخش­هایی از شمال آفریقا کشت می­شود. پس از استخراج قند، تفاله باقیمانده دارای مقدار قند ناچیزی است، اما به­عنوان یک منبع فیبر و انرژی در دسترس می­باشد. تفاله از 7/28 درصد پکتین، 20 درصد سلولز، 5/17 درصد همی سلولز، 9 درصد  پروتئین، 4/4 درصد  لیگنین، 2/1 درصد چربی، 1/5 درصد خاکستر تشکیل شده است (3 و33). از آنجائی­که محتوای پکتین تفاله بالا است می­تواند برای تولید میکروبی آنزیم­های تجزیه­کننده پکتین بکار برده شود. بای و همکاران از تفاله چغندرقند به­عنوان ماده خام برای القای تولید پکتیناز توسط  Aspergillus nigerاستفاده کرده­اند لی و همکاران تفاله چغندر قند را به­عنوان منبع کربن و همچنین القاءکننده تولید پکتیناز قلیایی خارج سلولی بوسیله Bacillus gibsoni تحت شرایط تخمیر جامد به­کار بردند (6). تفاله چغندر قند عمدتاً در تهیه خوراک دام، تولید گازهای زیستی، پروتئین تک سلولی و وانیلین کاربرد دارد. اخیرا از تفاله چغندرقند برای جذب مواد رنگی از آب استفاده شده است. استفاده از این مواد جانبی صنایع تولید قند، به­عنوان پیش ماده­ای ارزان قیمت و قابل دسترس برای تولید مواد با ارزش افزوده بالا، باعث کاهش آلودگی محیط زیست نیز خواهد شد (4، 5، 12، 22، 30).

پکتینازها یا آنزیم­های تجزیه­کننده پکتین یک گروه ناهمگون از آنزیم­ها هستند که مواد پکتیکی را هیدرولیز می­کنند و عمدتا در گیاهان وجود دارند. آنزیم­های تجزیه­کننده پکتین به­طورگسترده درگیاهان آلی و میکروارگانیسم­ها توزیع شده­اند. پکتین هوموپلی­ساکارید ساختاری واقع در تیغه میانی و دیواره نخستین گیاهان، یک سوم وزن خشک بافت گیاهی را تشکیل می­دهد. پکتین شامل زنجیره­های اسیدگالاکتورونیک با میزان استرهای متیل متفاوت می­باشد. تخمین زده شده است که پکتینازهای میکروبی حدود 25 درصد از کل فروش جهانی آنزیم­های غذایی را به­خود اختصاص داده­اند. پکتینازهای میکروبی می­توانند به­وسیله ارگانیسم­های زیادی نظیر باکتری­ها، اکتینومیست­ها، مخمرها و قارچ­ها تولید شوند. پکتیناز یکی از مهمترین آنزیم­های مورد استفاده در صنعت آبمیوه و سبزیجات برای افزایش میزان بازده می­باشد (30). کاربرد آنزیم­های تجزیه­کننده پکتین با توجه به در دسترس بودن و شرایط فیزیکی متفاوت است. در طول سالیان متمادی پکتینازها در بسیاری از فرآیندهای صنعتی مرسوم مانند نساجی، فرآوری الیاف گیاهی، چای و قهوه، استخراج روغن، تیمار فاضلاب­های صنعتی حاوی مواد پکتیکی و غیره مورد استفاده قرار گرفته­اند. همچنین استفاده از آنها در تخلیص ویروس­های گیاهی و کاغذ­سازی نیز گزارش شده است. اولین کاربرد صنعتی پکتینازها در سال1930 توسط Kertesz گزارش شد (29).

اﺳﺘﺨﺮاج  ﭘﻠﻲ ﮔﺎﻻﻛﺘﻮروﻧﺎز از ﻣﻨﺎﺑﻊ ﻗﺎرﭼﻲ، ﺑﻪ ﻋﻠﺖ ﺑﺎزدﻫﻲ ﺑﺎﻻی ﺗﻮﻟﻴﺪ، ﻛﺎرﺑﺮد ﻓﺮاوان دارد (2). قارچ پریفورموسپورا ایندیکا  (Piriformospora indica)از ریزوسفر خاک­ درختچه­های چوبی(Swartz) DC  Prosopis juliflora  وZizyphus nummulariaدر  بیابان شنی راجستان هندوستان  جدا شده است. قارچ به­آسانی قابل کشت و فاقد میزبان اختصاصی بوده و در ریشه  بسیاری ازگیاهان عمدتاً با حالت اندوفیت ساکن می­شود (32).

روش طراحی آزمایش تاگوچی روش پر­کاربرد از روش­های بهینه­سازی کسری از فاکتوریل است ﻛﻪ اﺟﺮای آن در ﺻﻨﺎﻳﻊ ﻣﺨﺘﻠﻒ ﺑﺎ ﻣﻮﻓﻘﻴﺖ­ﻫﺎی زﻳﺎدی ﻫﻤﺮاه ﺑﻮده­اﺳﺖ. در روش کسری از فاکتوریل که روش آماری نیز خوانده می­شود، تعدادی از ترکیب­های ممکن بین متغیرها انتخاب شده و پس از انجام آزمایش­ها با ارزیابی آماری پاسخ­های بدست آمده، بهترین شرایط که ممکن است در بین حالت­های آزمایش شده نیز موجود نباشد، تعیین می­شود. در روش تاگوچی متغیرها یا فاکتورها در یک آرایه متعامد سازماندهی می­شوند. این روش از طراحی­های کسری از فاکتوریل دو، سه و سطح ترکیبی استفاده می­کند. روش تاگوچی می­تواند به سرعت و با دقت اطلاعات فنی به طراحی و تولید کم هزینه، محصولات و فرآیند­های قابل اعتماد منجر شود. این روش شامل مطالعه سیستم توسط مجموعه­ای از متغیرهای مستقل مورد علاقه است و همزمان عامل­های زیاد دیگری را بهینه می­نماید که اطلاعات زیادی تنها با یکسری از آزمایشات محدود به دست می­آید (1 و 27).

در مطاله قبلی برای اولین بار تولید پکتیناز توسط قارچ پریفورموسپورا ایندیکا از پکتین خالص گزارش شد (15)، برای اولین بار احتمال و بهینه­سازی تولید پکتیناز از ضایعات چغندر قند توسط پریفورموسپورا ایندیکا در این تحقیق بررسی شده است.   

 

مواد و روشها

تهیه پودر تفاله چغندرقند: تفاله چغندرقند ازکارخانه قند مغان به­شکل مرطوب تهیه، در آون با دمای 60 درجه سانتی­گراد به مدت 24 ساعت خشک، با آسیاب برقی پودر و سپس با مِش شماره 35 (اندازه ذرات 500 میکرومتر) غربالگری گردید. پودر آماده شده برای انجام ادامه آزمایش­ها به دور از نور و رطوبت نگهداری شد.

میکروارگانیسم و شرایط محیط کشت: در این تحقیق، قارچ پریفورموسپورا ایندیکا (™(ATCC® 204458 از گروه پاتولوژی گیاهی، دانشکده کشاورزی دانشگاه تربیت مدرس تهیه شد. جهت تکثیر این قارچ ابتدا محیط کشت جامد از محیط کشت تغییر یافته هیل–کافر (16) به­علاوه آگار 5/0 درصد تهیه و سپس در شرایط استریل قطعه­ای به ابعاد 1×1 سانتی­متر از محیط اولیه جدا و بر روی پلیت­های با قطر 10 سانتی­متر منتقل گردید. پلیت­ها در انکوباتور با دمای 1±29 درجه سانتی­گراد قرار داده شدند. محیط کشت مایع، مشابه محیط کشت جامد بدون افزودن آگار تهیه و پس از تلقیح با 5 درصد از محلول حاوی اسپور در انکوباتور شیکردار با دمای 1±29 درجه سانتی­گراد و دور rpm 200 به­مدت ده روز قرار داده شد که به­عنوان محیط پیش تولید نگهداری و مورد استفاده قرار گرفت. 

برای تهیه یک لیتر محیط کشت کافر، 10 گرم برلیتر پودر تفاله چغندرقند به محیط پایه افزوده و pH محیط کشت با پتاس ده نرمال به 5/6 رسانده شد. محیط­های کشت بدون تفاله چغندرقند به­عنوان کنترل تهیه و نمونه­ها به­مدت 15 دقیقه با دمای 121 درجه سانتی­گراد اتوکلاو شدند. پس از رسیدن دمای نمونه­ها به دمای 50-45 درجه سانتی­گراد یک میلی­لیتر از محلول ذخیره ویتامین فیلتر استریل شده به آنها اضافه شد (16) و پس از تلقیح با 5 درصد از محلول حاوی اسپور در انکوباتور شیکردار با دمای 1±29 درجه سانتی­گراد و دور rpm 200 به­مدت ده روز قرار داده شدند. در ادامه جهت بررسی رشد قارچ و فعالیت پکتیناز یک روز در میان طی بازه زمانی 10-0 روز نمونه برداری انجام شد. در این تحقیق تمام آزمایش­ها در ارلن­های 50 میلی لیتری حاوی 20 میلی لیتر محیط کشت انجام شد.

بررسی میزان رشد قارچ

اندازه­گیری وزن تر و خشک توده سلولی: در ادامه، بمنظور بررسی میزان رشد قارچ نمونه­های با و بدون تفاله چغندرقند به­صورت یک روز در میان طی بازه زمانی 10-0 روز پس از جداسازی توده سلولی از محیط کشت بوسیله کاغذ صافی واتمن شماره 1، وزن تر با ترازوی دیجیتال اندازه­گیری شد. در ادامه­، توده­های سلولی جدا شده در آون با دمای 60 درجه سانتی­گراد به مدت 24 ساعت خشک و سپس توزین گردید. میزان بازده زیست توده (YX/S) و همچنین سرعت رشد ویژه (µ) طبق روابط مربوط محاسبه شدند (18).

بررسی pH محیط کشت:  به­منظور بررسی تغییرات pH در طی بازه زمانی مورد نظر، pH محلول فیلتر شده با کاغذ صافی اندازه­گیری شد.

شمارش اسپورهای قارچ: برای بررسی رشد قارچ، شمارش مستقیم اسپورهای گلابی شکل قارچ بر روی لام نئوبار انجام شد. بدین­ترتیب که برای آزاد شدن اسپورهای انتهای هیف­ میکروویال­های حاوی قارچ با استفاده از یک میله فلزی به­هم زده شد و پس از ورتکس نمودن به مدت 10 دقیقه، به اندازه حدود 100 میکرو لیتر از محلول با استفاده از لام نئوبار شمارش و تعداد اسپورها در یک میلی­لیتر محاسبه گردید.

تهیه محلول رویی حاوی آنزیم: به­منظور تعیین میزان پروتئین کل و سنجش فعالیت پکتیناز نمونه­های مورد نظر، محلول فیلتر شده با کاغذ صافی در سانتریفیوژ با دور rcf 12880 و دمای 4 درجه سانتی­گراد به­مدت ۱۵ دقیقه سانتریفیوژ شدند.

تعیین غلظت پروتئین کل: میزان پروتئین کل نمونه­ها در بازه زمانی 10-0 روز با روش بردفورد اندازه­گیری شد (7). غلظت­های متفاوت سرم آلبومین گاوی (0و 2/0، 4/0، 6/0، 8/0، 1 و 2/1 میلی گرم در میلی لیتر) بعنوان نمودار استاندارد مورد استفاده قرار گرفت. میزان 25 میکرولیتر از محلول آنزیمی با 750 میکرولیتر معرف بردفورد (X1) مخلوط و به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد. سپس میزان جذب نمونه­ها در طول موج 595 نانومتر بوسیله اسپکتروفتومتر قرائت شد.

سنجش فعالیت آنزیم پکتیناز: جهت تعیین میزان و زمان بهینه تولید آنزیم پکتیناز نمونه­های موجود در انکوباتور در بازه زمانی 10-0 روز از طریق سنجش  فعالیت آنزیم به روش DNS انجام شد (15). غلظت­های متفاوت اسید گالاکتورونیک (5، 4، 3، 2، 1 میلی گرم در میلی لیتر) بعنوان استاندارد مورد استفاده قرار گرفت. بدین منظور 25 میکرولیتر از محلول رویی با 25 میکرولیتر از پکتین 1 درصد (محلول در بافر فسفات سدیم با pH 5/7) ترکیب و در دمای 60 درجه سانتی­گراد به مدت 5 دقیقه گرماگذاری شد. پس از طی مدت زمان مذکور، به میزان 125 میکرولیتر از محلول DNS به میکروویال­ها افزوده و در بن ماری با دمای 100 درجه سانتی­گراد به مدت 15 دقیقه قرار داده شدند. پس از خنک شدن نمونه­ها، با افزودن 1250 میلی­لیتر آب مقطر به 142۵ میلی­لیتر رسانده و میزان جذب نمونه­ها در طول موج 530 نانومتر بوسیله دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت شد. میزان فعالیت آنزیم برحسب واحد (U) مقدار آنزیمی که تشکیل یک میکرومول اسیدگالاکتورونیک را در مدت زمان یک دقیقه تحت شرایط آزمایش آزاد می­کند، بیان شد (رابطه 1) (20).


(رابطه 1)     

1

 ×Dilution factor  ×

1

×

Supernatant (µl)

mg/ml ×

ES-EB-SB

Enzyme activity=

MW GalA

t (min)

Final volume (µl)

slope

=ES آنزیم و سوبسترا      EB= بلانک آنزیم      SB= سوبسترا بلانک         GalA= وزن مولکولی اسید گالاکتورونیک

slope= شیب نمودار استاندارد اسید گالاکتورونیک


بهینه­سازی تولید آنزیم پکتیناز: در این مطالعه از روش بهینه­سازی، یک متغیر در یک زمان، طراحی آزمایش تاگوچی استفاده شد.

بررسی اثر غلظت گلوکز: برای بررسی اثر غلظت گلوکز به­عنوان منبع کربنی بر رشد قارچ و تولید پکتیناز، به محیط­ کشت کافر، گلوکز با غلظت­های (1۰-8-6-4-2-0 درصد) افزوده و از محیط­های کشت بدون تفاله هم به­عنوان نمونه­های کنترل استفاده شد. نمونه­های تهیه شده، پس از تلقیح اسپور قارچ، درون انکوباتور شیکردار با دمای 29 درجه سانتی­گراد و با دور گردش  rpm200 به­مدت 6 روز قرار داده شدند. پس از طی این بازه زمانی نمونه­ها مورد ارزیابی قرارگرفتند.

بررسی اثر سولفات آمونیوم: به­منظور بررسی اثر سولفات آمونیوم به­عنوان منبع نیتروژنی، بر رشد قارچ و تولید آنزیم، به محیط­کشت کافر، سولفات آمونیوم با غلظت­­های (5/0-4/0-3/0-2/0-1/0 درصد) اضافه گردید. نمونه­های تهیه شده، پس از تلقیح اسپور قارچ، درون انکوباتور شیکردار با دمای 29 درجه سانتی­گراد و با دور گردش rpm200 به­مدت 6 روز قرار داده شدند. پس از طی این بازه زمانی نمونه­ها مورد ارزیابی قرارگرفتند.

بهینه­سازی به روش تاگوچی: بهینه­سازی به روش تاگوچی با استفاده از نرم افزار  Qualitek-4انجام گرفت. بر اساس عوامل و سطوح تعیین شده 9 آزمایش بوسیله نرم افزار طراحی و سپس داده­های حاصل از اجرای آزمایش­ها (آرایه­ها) برای تجزیه و تحلیل و تعیین سطوح بهینه به نرم افزار وارد شد. در بررسی حاضر سه عامل اصلی تفاله چغندرقند، گلوکز و سولفات آمونیوم در سه سطح  مختلف تعیین شدند. آرایه­های پیشنهاد شده بوسیله نرم افزار در جدول1 آورده شده است.

براساس این سطوح، 9 آرایه پیشنهادی نرم افزار در جدول 2 آمده است. در این جدول سطوح با اعداد یک تا سه مشخص می­­شود که مقادیر واقعی آن­ها در جدول نشان داده شده است.

جدول 1- عوامل و سطوح منتخب در طراحی آزمایش تاگوچی.

عامل

سطح 1

سطح 2       

سطح 3

گلوکز

40

60

80

سولفات آمونیوم

2

4

6

تفاله چغندرقند

5

10

15 

مقادیر بر حسب گرم بر لیتر می­باشند.

بمنظور انجام آزمایش­های پیشنهادی محیط کشت طبق جدول فوق تهیه­، استریل، تلقیح و در انکوباتور شیکردار در دمای 29 درجه سانتی­گراد با دورگردشrpm  200 به مدت 6 روز قرار داده شدند. داده­های حاصل از سنجش جهت تجزیه وتحلیل به نرم افزار وارد شد تا نرم افزار سطوح بهینه را پیشنهاد دهد.

 

جدول 2 - آرایه­های پیشنهادی توسط نرم افزار Qualitek-4.

 شماره آزمایش

 

گلوکز

 

سولفات آمونیوم  

تفاله چغندرقند

1

 

40

          

2

5

2

 

40

 

4

10

3

 

40

 

6

15

4

 

60

 

2

10

5

 

60

 

4

15

6

 

60

 

6

5

7

 

80

 

2

15

8

 

80

 

2

10

9

 

80

 

6

10

                مقادیر برحسب گرم در لیتر می­باشند.


نتایج

بررسی میزان رشد قارچ  P. indica : با توجه به نتایج بدست آمده، میزان رشد قارچP.indica   براساس وزن تردر محیط کشت دارای تفاله چغندرقند در مقایسه با محیط کشت بدون تفاله چغندر قند دارای بیشترین مقدار بود.در هر دو نوع محیط بیشترین میزان رشد در روز ششم پس از تلقیح مشاهده شد. براساس یافته­ها، میزان رشد براساس وزن خشک قارچ P.indica در محیط کشت حاوی تفاله بیشتر از رشد آن در محیط فاقد تفاله بود. همچنین بیشترین میزان رشد قارچ در هر دو محیط در روز ششم پس از تلقیح مشاهده شد (جدول 3 و شکل­ 1).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


جدول 3 مقایسه ویژگی­های رشد قارچ P.indica در محیط­های کشت کافر حاوی و فاقد تفاله.

زمان رسیدن به حداکثر مقدار اسپور(روز)

زمان رسیدن به حداکثر رشد ( روز)

سرعت رشد ویژه µ (d-1 )

بازده زیست توده YX/S (g g-1)

حداکثر وزن خشک (g/L)

محیط کشت

8

6

30/0

61/0

125/6

 واجد تفاله

10

6

-

-

7/3

  فاقد تفاله


تعیین تعداد اسپورهای قارچ: تحت شرایط، اندازه تلقیح 5 درصد، سرعت همزنیrpm  200، حجم کاری 30 درصد، pH اولیه 5/6، دمای 30 درجه سانتی­گراد، بیشینه وزن خشک توده سلولی پس از گذشت 5 روز بدست آمده است. اسپورزایی پس از 6 روز شروع شده و بیشینه مقدار تولید اسپور بعد از 8 روز بدست آمد. در این مطالعه، تعداد اسپورهای موجود در محیط­های حاوی قارچ در طی بازه­ زمانی معین شمارش گردید. بر­اساس بررسی­های انجام شده، اسپورها در محیط حاوی تفاله در روز ششم و در محیط فاقد تفاله در روز هشتم مشاهده شد و در روز دهم به حداکثر مقدار رسید. تعداد اسپورهای مشاهده شده در حجم یک میلی لیتر از محیط کشت حاوی 1 درصد تفاله و در محیط فاقد تفاله در جدول 4 نشان داده شده است.

 

 

جدول 4 - تعداد اسپورهای موجود در یک میلی لیتر محیط کشت.

دهم

هشتم

ششم

روز

107×7/1

107×2/1

 107×7/0

محیط دارای تفاله

107×5/1

107×1/1

-

محیط فاقد تفاله

 


بررسی pH  محیط کشت: براساس بررسی­های انجام شده، میزانpH   محیط تا روز ششم در محیط حاوی تفاله روند کاهشی داشت. اما در محیط فاقد تفاله، تغییرات pH تا پایان بازه زمانی مورد مطالعه روند صعودی مشاهده شد (شکل 1).

تعیین پروتئین محلول کل:  میزان غلظت پروتئین کل محلول با استفاده از منحنی استاندارد سرم آلبومین-گاوی (BSA) تعیین شد. براساس نتایج بدست آمده، بیشترین میزان تولید پروتئین در محیط واجد و فاقد تفاله در روز ششم پس از تلقیح مشاهده شد. نمونه­برداری­ به­صورت یک روز در میان در بازه زمانی10 روزه و با سه تکرار انجام شد (شکل 1).

سنجش فعالیت آنزیم پکتیناز: تولید آنزیم پکتیناز، با استفاده از روش میلر سنجش شد. با توجه به نتایج بدست آمده، تولید آنزیم و فعالیت در هر دو نوع محیط­ کشت در روز ششم از تلقیح بیشینه مقدار را نشان داد (شکل 1). میزان فعالیت آنزیم در محیط کشت حاوی تفاله تقریبا 5/1 برابر محیط فاقد تفاله بود.

اثرمنبع کربن (گلوکز) بر رشد قارچ و تولید پکتیناز: در تحقیق حاضر، گلوکز به­عنوان منبع کربنی اضافه به محیط کشت حاوی تفاله چغندرقند اضافه و از محیط بدون تفاله  و با گلوکز هم به­عنوان کنترل استفاده شد. بر اساس نتایج بدست آمده گلوکز با غلظت 6 درصد  باعث بیشینه تولید پکتیناز در هر دو نوع محیط شد به­طوری­که میزان تولید آنزیم در محیط حاوی تفاله 66/3 برابر نسبت به محیط فاقد تفاله و 45/1 برابر نسبت به محیط غیر بهینه افزایش داشت (شکل 2). مقایسه ویژگی­های رشدی قارچ در محیط با تفاله وگلوکز و در محیط بدون تفاله با گلوکز در جدول 5 آورده شده است.

 

 

جدول5 - مقایسه ویژگی­های رشدی قارچ در محیط­ کشت حاوی گلوکز.

سرعت رشد ویژه µ (d-1 )

بازده زیست توده YX/S (g g-1)

حداکثر وزن خشک (g/L)

محیط کشت

54/0

44/0

45/26

تفاله + گلوکز

45/0

26/0

625/15

گلوکز


اثر سولفات آمونیوم  بر رشد قارچ و تولید پکتیناز: در این مطالعه علاوه بر اینکه محیط کافر دارای سه منبع نیتروژنی آلی شامل عصاره مخمر، پپتون و کازئین هیدرولیزات می­باشد از منبع نیتروژنی غیرآلی سولفات آمونیوم نیز بمنظور تحریک و القای رشد و افزایش تولید آنزیم استفاده شد (شکل3). مقایسه ویژگی­های رشدی قارچ در محیط با تفاله و سولفات آمونیوم و در محیط بدون تفاله با سولفات آمونیوم در جدول 6 آورده شده است.


 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


بهینه­­سازی تولید آنزیم پکتیناز در محیط حاوی تفاله چغندرقند به روش تاگوچی: با استفاده از روش تاگوچی و نرم­افزار  Qualitek-4بهینه­سازی تولید آنزیم پکتیناز در محیط حاوی تفاله چغندر­قند توسط پریفورموسپورا ایندیکا انجام گرفت. نتایج 9 آزمایش طراحی شده با سطوح مختلف بوسیله نرم افزار برای عوامل تفاله چغندرقند، گلوکز و سولفات آمونیوم در شکل 4 نشان داده شده است. بیشینه میزان تولید آنزیم در آزمایش شماره 5 (گلوکز 60 گرم در لیتر، سولفات آمونیوم 4 گرم در لیتر و تفاله چغندر قند 15 گرم در لیتر) مشاهده شد.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


جدول 6 - مقایسه ویژگی­های رشدی قارچ در محیط­ کشت حاوی سولفات آمونیوم.

سرعت رشد ویژه µ (d-1 )

بازده زیست توده YX/S (g g-1)

حداکثر وزن خشک (g/L)

محیط کشت

61/0

54/0

675/۷

تفاله + سولفات آمونیوم

27/1

28/0

95/3

سولفات آمونیوم

                                                                                                                                                    

 

چغندرقند و گلوکز با افزایش سطح، تاثیر آنها در تولید پکتیناز نیز افزایش می­یابد. در مورد عامل سولفات آمونیوم کاهش سطح اثر افزایشی بر روند فعالیت پکتیناز دارد.

در بخش دیگری از تجزیه وتحلیل داده­ها توسط نرم افزار، تاثیر برهمکنش عوامل منتخب انجام شد که نتایج آنها در جدول 7  آورده شده است.

 

 

 


 

 

 

 

 

 

 

پس از تجزیه و تحلیل نتایج بدست آمده توسط نرم افزار، همانطور که در شکل 5 مشخص می­شود، در مورد عوامل تفاله

 

 

 

 

 

 

 

 

 


جدول 7 - تاثیر برهمکنش عوامل منتخب (تفاله چغندر قند، گلوکز و سولفات آمونیوم) برتولید پکتیناز توسط پریفورموسپورا ایندیکا.

شماره

عوامل برهمکنش دهنده

ستون­ها

درصد اهمیت

1

سولفات آمونیوم × تفاله چغندرقند

2×3

53/24

2

تفاله چغندرقند × گلوکز

1×3

2/16

3

گلوکز × سولفات آمونیوم

1×2

69/3

         

 

 

در ادامه تجزیه تحلیل آماری داده­ها، درصد اهمیت هریک از عوامل منتخب در جدول 8 به صورت جداگانه  آورده شده است.

جدول 8 -درصد اهمیت عوامل در تولید پکتیناز توسط پریفورموسپورا ایندیکا.

عامل

درصد اهمیت

گلوکز

264/67

سولفات آمونیوم

556/21

تفاله چغندرقند

94/5

همانطورکه در جدول 8 مشاهده می­شود گلوکز به­عنوان منبع کربنی دارای بیشترین تأثیر بر تولید پکتیناز می­باشد. اثرگذاری سولفات آمونیوم به­عنوان منبع نیتروژنی غیرآلی به­میزان 556/21 درصد در درجه دوم بوده و سپس تفاله­ چغندرقند با اثرگذاری 94/5 درصد در القاء تولید پکتیناز در درجه بعدی قرار می­گیرد. برطبق این نتایج می­توان گفت علاوه بر اهمیت عوامل به­طور انفرادی بر تولید پکتیناز، برهمکنش بین عوامل در تولید پکتیناز نیز از اهمیت زیادی برخوردار است. بنابراین طبق جدول 7 برهمکنش بین سولفات آمونیوم و تفاله چغندرقند بیشترین تأثیر را در تولید پکتیناز دارا می­باشد. نرم افزار همچنین آزمایشی را به­عنوان آزمایش بهینه پیشنهاد می­دهد که با انجام آن می­توان بیشترین تولید را بدست آورد.

جدول 9 - شرایط بهینه­ پیشنهادی توسط نرم افزار Qualitek-4.

عامل

توصیف سطح

سطح

سهم

 

گلوکز

60

2

914/0

 

سولفات آمونیوم

4

1

705/0

 

تفاله­ چغندرقند

15

3

566/0

 

نتیجه مورد انتظار در شرایط بهینه (واحد بر میلی لیتر)                              78/8

طبق نتایج بدست آمده، مقدار پکتیناز تولیدی به روش تاگوچی 35/8  واحد بر میلی لیترتقریباً حدود 5/2 برابر بیشتر از شرایط غیر بهینه می­باشد. براساس سطوح پیشنهادی بوسیله نرم افزار آزمایش تائیدی انجام شد و مقدار آنزیم تولید شده مورد سنجش قرار گرفت. با انجام سطوح پیشنهادی میزان فعالیت پکتینازی به 45/8 واحد در میلی­لیتر رسید (جدول 9).

بحث

براساس یافته­ها، میزان رشد بر اساس وزن خشک قارچ P.indica در محیط کشت حاوی تفاله بیشتر از رشد آن در محیط فاقد تفاله بود. همچنین بیشترین میزان رشد قارچ در هر دو محیط در روز ششم پس از تلقیح مشاهده شد. کومار و همکاران (2011)،  نیز بیشترین میزان رشد قارچ را در محیط کشت کافر در روز ششم گزارش کردند (18).

 در مطالعه کومار و همکاران با استفاده از پوسته سویا در محیط کشت کافر به عنوان محصول جانبی، میزان بیشتری از اسپور پریفورموسپورا ایندیکا تولید شد که به فرض آنها با مصرف آهسته منابع کربن و نیتروژن موجود در محیط کشت و دسترسی مداوم به این منابع، زمان رسیدن به حداکثر میزان اسپورزایی کاهش می­یابد (18). در تحقیق حاضر از تفاله چغندرقند در محیط کشت کافر استفاده شد. زمان شروع اسپورزایی قارچ در روز ششم و بیشینه مقدار اسپورزایی در روز هشتم تعیین شد.

دلیل احتمالی کاهش  pHو اسیدی شدن محیط می­تواند با افزایش رشد قارچ و تولید اسید گالاکتورونیک از پکتین تفاله مرتبط باشد. بنابراین پس از نقطه اوج رشد، به­علت کاهش رشد و متابولیسم، میزان pH روندی صعودی نشان می­دهد و یا به­علت تغییر در فرایند متابولیتی قارچ و یا تولید محصولات خنثی­کننده باشد. همچنین افزایش pH همراه با بازی شدن محیط می­تواند با آزاد شدن آمونیاک از متابولیسم پروتئین مرتبط باشد. احتمال دیگر می­تواند به­علت واکنش­های متابولیکی که منجر به جذب نیترات از محیط کشت و یا متابولیسم اسید­های آلی باشد (15).

با توجه به­ این­که میزان رشد زیست­توده هم در روز ششم از تلقیح می­باشد می­توان گفت که افزایش رشد با افزایش تولید پروتئین توأم شده است. میزان بالای پروتئین موجود در محیط کشت در شروع  بازه زمانی رشد به­علت رشد ناکافی میکروارگانیسم و عدم  مصرف پروتئین موجود در محیط کشت می­باشد.

با توجه به نتایج بدست آمده، تولید آنزیم و فعالیت در هر دو نوع محیط­ کشت در روز ششم از تلقیح بیشینه مقدار را نشان داد. کاهش تولید آنزیم پس از نقطه اوج می­تواند به­علت مصرف ترکیب اصلی یا تولید و فعال شدن مهارکننده­های بیوسنتز آنزیم مرتبط باشد. بای و همکاران (2004)، با استفاده از تفاله چغندرقند برای القاء تولید پکتیناز توسط قارچ Aspergillus niger بیشترین میزان فعالیت پکتینازی را بعد از چهار روز گزارش نمودند (6). گلدیال و همکاران در سال 1981، گزارش کرده­اندکه زمان انکوباسیون به سرعت رشد میکروارگانیسم و الگوی تولید آنزیم بستگی دارد و بیشینه تولید آنزیم­های پکتیکی از کپک­ها بین 6-1 روز متغیر است (14). در تحقیقی راماچاندرا و همکاران در سال 2003، به بررسی تولید و تخلیص پکتیناز با استفاده از تفاله چغندرقند بوسیله قارچ Mucor flavus پرداختند، تولید پکتیناز در این بررسی در روز پنجم بیشترین مقدار را نشان داد (11). اولسان و همکاران در سال 2003، در مطالعه­ای با استفاده از تفاله چغندرقند بوسیله Trichoderma reesei Rut C-30 به روش تخمیر جامد پکتیناز تولیدکردند. درطی دوره کشت ۶ روزه، محتوای پروتئین در روز سوم به میزان 43/0گرم برلیتر رسید که همزمان با بیشترین میزان اسپورزایی و همچنین بیشترین فعالیت پکتیناز (81/0 واحد بر میلی لیتر) بود  (23). راموس و همکاران در سال 2010، بالاترین میزان فعالیت پکتینازی قارچColletotrichum truncatum  در محیط کشت مایع حاوی پکتین گزارش کردندکه متعاقباَ مقدار زیست­توده هم بیشترین مقدار را داشت  (26). تیم پژوهشی محمد و همکاران در سال 2002، با هدف تولید پکتیناز جدید بوسیله  Trichoderma reeseiبا استفاده از مدل­های مختلف پکتین در میزان درجه متیلاسیون و استیلاسیون، تفاله چغندرقند و لیموترش مطالعه­ای را انجام دادند. براساس نتایج بدست آمده، بیشترین مقدار تولید پکتیناز با استفاده از پکتین تفاله چغندرقند به­عنوان سوبسترا بوده است (21). در تحقیق حاضر، از تفاله چغندرقند برای القای تولید پکتیناز بوسیلهPiriformospora indica  استفاده شد. نتایج بدست آمده نشان داد که بیشینه مقدار تولید پکتیناز، میزان اسپورزایی، محتوای پروتئین کل و مقدار بیشینه زیست توده به طور همزمان در روز ششم از دوره کشت می­باشد (شکل 1).

به­طور کلی رشد میکروارگانیسم و تولید پکتیناز به نوع سویه و ترکیب محیط کشت بستگی دارد. استفاده از منابع کربنی و نیتروژنی در ترکیب با ضایعات کشاورزی باعث افزایش تولید پکتیناز می­شود. نوع و غلظت موادکربنی و نیتروژنی در ترکیب محیط کشت حائز اهمیت است. در این تحقیق بهینه­سازی غلظت این ترکیبات درآزمایش­های اولیه با روش بهینه­سازی یک متغیر در یک زمان برای افزایش تولید پکتیناز انجام شد. از سطوح بهینه شده در روش تاگوچی استفاده گردید.  

در تحقیق حاضر، گلوکز به­عنوان منبع کربنی به محیط کشت حاوی تفاله چغندرقند اضافه و از محیط بدون تفاله و با گلوکز هم به­عنوان کنترل استفاده شد. بر اساس نتایج بدست آمده گلوکز با غلظت 6 درصد باعث بیشینه تولید پکتیناز در هر دو نوع محیط شد. به­طوری­که میزان تولید آنزیم در محیط حاوی تفاله 66/3 برابر نسبت به محیط فاقد تفاله و 45/1 برابر نسبت به محیط غیر بهینه افزایش داشت (شکل 2). مقایسه ویژگی­های رشدی قارچ در محیط با تفاله وگلوکز و در محیط بدون تفاله با گلوکز در جدول 5 آمده است.

گلوکز یک منبع مناسب کربن به­عنوان منبع انرژی برای رشد مطلوب و مؤثر بر متابولیسم میکروارگانیسم ضروری است. تولید آنزیم­­های پکتینولیتیکی از بسیاری از قارچ­ها در حضور مواد پکتیکی در محیط کشت افزایش می­یابد. فاوول و همکاران در سال 2003، در بررسی که انجام دادند به این نتیجه رسیدند که پکتین و اسید پلی­گالاکتورونیک تولید آنزیم­های پکتینولیتیکی را بهبود می­بخشند و در محیط­هایی که گلوکز به عنوان تنها منبع کربن استفاده شده بود این آنزیم­ها تولید نشدند و این نتایج طبیعت القایی آنزیم­های پکتینولیتیکی قارچ A. nigerرا منعکس می­کند (9). از آنجائی­که پکتین نمی­تواند وارد سلول شود پیشنهاد شده است این ترکیبات تولید آنزیم­های پکتینولیتیکی بوسیله میکروارگانیسم­ها را القاء می­کنند. پلی­گالاکتوروناز و پکتین لیاز در محیط فاقد مواد پکتیکی تولید نمی­شوند و تولید آنها القایی می­باشد. استفاده از قندهای ساده و ارزان به ویژه گلوکز به همراه منابع کربنی پیچیده ضایعات صنعتی وکشاورزی به دلیل سهولت استفاده به رشد سلولی در مراحل اولیه تخمیر کمک می­کند. درحالی­که منابع کربنی پیچیده غنی از پکتین می­توانند باعث القای تولید پکتیناز شوند، زمانی که هر دو ترکیب همزمان در محیط کشت حضور دارند. در تحقیقی اثر پکتین و گلوکز به­عنوان منبع کربنی بر تولید آنزیم پکتیناز در محیط کشت حاوی سبوس گندم را مورد بررسی قرار دادند. طبق نتایج آنها اضافه شدن گلوکز و پکتین به ترتیب با غلظت­های 10 درصد و 6 درصد به محیط کشت، تولید پکتیناز و رشد زیست توده را به مقدار قابل توجهی افزایش داد (10). بعلاوه پاتیل و همکاران در سال 2006، تولید پکتیناز با استفاده از طَبَق آفتابگردان بدون دانه به­عنوان سوبسترا توسط Aspergillus niger مورد بررسی قرار دادند. براساس یافته­های آنها گلوکز با غلظت 6-4 درصد  به­عنوان منبع کربنی در سیستم تخمیر غوطه­ور باعث افزایش تولید پکتیناز شد (24).

اثر منابع نیتروژنی آلی و غیرآلی بر رشد و تولید پکتیناز به­طور وسیعی مطالعه شده است. در بیشتر میکروارگانیسم­ها هر دو نوع منابع نیتروژنی به اسید­های آمینه، اسید نوکلئیک، پروتئین­ها و ترکیبات دیواره سلولی متابولیزه می­شوند. مطابق با یافته­های کاشیاپ و همکاران در سال 2003، عصاره مخمر، پپتون وکلرید آمونیوم باعث افزایش تولید آنزیم تا 24 درصد شده و اضافه کردن  نیترات آمونیوم، اوره وگلایسین باعث مهار تولید آنزیم می­شوند که این ممکن است به­علت رشد ضعیف میکروارگانیسم باشد (17). ساپنوا و همکاران در سال 1997، مشاهده کردند که سولفات آمونیوم سنتز پکتیناز را تحریک می­کند، چنانچه در نبود آن قارچ اندکی فعالیت پروتئولیتکی )پروتئازی) دارد و پکتیناز خارج سلولی تولید نمی­شود (28). بعلاوه نتایج بدست آمده از مطالعات تیم پژوهشی پاتولا و همکاران در سال 2005، نشان داد که محیط حاوی عصاره مخمر و سولفات آمونیوم منبع خوبی برای تولید آنزیم­های پکتینولیتیکی می­باشند  (25). براساسیافته­های هائورس و همکاراندر سال 1988، منابع نیتروژنی سولفات آمونیوم با غلظت 16/0 درصد در محیط کشت، تأثیری بر تولید پکتیناز نداشته است (8). در این مطالعه، اثر منبع نیتروژنی غیرآلی سولفات آمونیوم در محیط حاوی و فاقد تفاله چغندرقند بر رشد میکروارگانیسم و تولید پکتیناز توسط P. indica بررسی شد. براساس نتایج به­دست آمده (شکل3) بیشینه فعالیت آنزیم در غلظت 4/0 درصد سولفات آمونیوم به میزان 29/4 واحد بر میلی­لیترکه تقریباً 57/1 برابر تولید در محیط فاقد تفاله و 29/1 برابر نسبت به محیط بدون سولفات آمونیوم بود. بای و همکاران در سال 2004، از تفاله چغندرقند به­عنوان سوبسترا برای تولید آنزیم پکتینازاستفاده نمودند، که از منابع نیتروژنی مختلف به­کار برده شده سولفات آمونیوم، پودر عصاره مخمر، پپتون سویا، پودر تفاله لوبیا و مونوسدیم گلوتامات فاضلاب، بیشترین فعالیت پکتیناز در محیط کشت حاوی تفاله چغندرقند مشاهده شد (6). همچنین تاکور و همکاران (2010)، گزارش کرده­اند که بیشینه مقدار تولید پکتیناز زمانی است که کازئین هیدرولیزات و عصاره مخمر هر دو باهم استفاده شوند (3 و 31).

براساس سطوح پیشنهادی بوسیله نرم افزار آزمایش تأییدی انجام شد و مقدار آنزیم تولید شده مورد سنجش قرار گرفت. با انجام سطوح پیشنهادی میزان فعالیت پکتینازی به 45/8 واحد در میلی­لیتر رسید. هر چندکه در مورد سوبسترای مورد بررسی گزارشی برای روش تاگوچی مشاهده نشده اما در این راستا، کومار و همکاران درسال 2010، به­منظور تولید پکتیناز با استفاده از پوست انبه توسط Fusarium moniliforme با این روش به بررسی اثر عوامل و تعیین سطوح بهینه آنها پرداختند و هشت عامل مختلف را در سه سطح ارزیابی کردند. در این بررسی دمای انکوباسیون بیشترین تأثیر را با مقدار 12/32 درصد و متعاقب آن سولفات روی، فسفات هیدروژن پتاسیم، مایع تلقیح به ­ترتیب با 62/14 درصد، ۷۹/12 درصد و42/11 درصد بیشترین و سولفات منیزیم کمترین سهم را داشتند. با اجرای آزمایش پیشنهادی توسط نرم افزار مقدار تولید آنزیم 2/43 واحد بر گرم سوبسترا بدست آمد. تولید پکتیناز بعد از بهینه­سازی بوسیله روش تاگوچی به میزان 32/3 برابر افزایش داشت (19). آیمن و همکاران در سال 2015، در بخشی از مطالعه انجام شده بمنظور تولید پکتیناز از پوست هویج توسط Bacillus mojavensis روش آماری تاگوچی را به­کار بردند و اثر ده عامل مختلف را در سه سطح بررسی کردند و سطوح بهینه تعیین شده با انجام آزمایش در سطوح  بهینه همه فاکتورها، مقدار تولید آنزیم 5/30 واحد برمیلی­لیتر بدست آمد که افزایش 9/2 برابری نسبت به بهینه­سازی به روش یک فاکتور در یک زمان حاصل شد (13). در مطالعه حال حاضر، با استفاده از بهینه­سازی به روش تاگوچی مقدار تولید پکتیناز 45/8 واحد برمیلی­لیتر بدست آمد که افزایش 5/2 برابری نسبت به حالت غیربهینه شده نشان داد. برطبق این مطالعه و همچنین بررسی­های قبلی انجام شده می­توان با استفاده از روش تاگوچی میزان تولید را افزایش داد و استفاده از تفاله چغندرقند یک سوبسترای مناسب برای القای تولید آنزیم می­باشد.

در مجموع، بر اساس نتایج بدست آمده می­توان گفت که قارچ پریفورموسپورا ایندیکا می­تواند در حضور تفاله چغندر قند برای القای تولید آنزیم، بعنوان منبعی در دسترس و مطمئن برای تولید آنزیم پکتیناز با ارزش تجاری و صنعتی مورد استفاده قرار گیرد.

1-      فتوحی چاهکوهی، ف.، امین زاده، س.، جعفریان، و.، تابنده، ف. و تابنده، م. (1397). ﻣﺠﻠﻪ ﭘﮋوﻫﺸ­ﻬﺎی ﺳﻠﻮﻟﻲ و ﻣﻮﻟﻜﻮﻟﻲ، 31.

2-      فهیمی بایرامی، ا، فرخی، ن. و امین زاده، س. (1395). اﺳﺘﺨﺮاج و ﺑﺮرﺳﻲ ﭘﺎﻳﺪاری و ﭘﺎراﻣﺘﺮﻫﺎی ﺗﺮﻣﻮدﻳﻨﺎﻣﻴﻜﻲ ﻳﻜﻲ از ﭘﻠﻲﮔﺎﻻﻛﺘﻮروﻧﺎزﻫﺎی ﻗﺎرچ Macrophomiona phaseolinaooo. ﻣﺠﻠﻪ ﭘﮋوﻫﺸﻬﺎی ﺳﻠﻮﻟﻲ و ﻣﻮﻟﻜﻮﻟﻲ، 29، 243-234.

3-      نجف پور، ذ.ا.(۱۳۹۲). نگاهی به بازار شکردر ایران  طی سال­های (1391-1380). مجله اقتصادی، ۱۴۲-۱۳۱.

 

4- Aarabi, A., Mizani, M. and Honarvar, M. (2017) The use of sugar beet pulp lignin for the production of vanillin. International Journal of Biological Macromolecules, 94, 345-354.

5- Aksu, Z. and Isoglu, I. A. (2006) Use of agricultural waste sugar beet pulp for the removal of Gemazol turquoise blue-G reactive dye from aqueous solution. Journal of hazardous materials, 137, 418-430.

6- Bai, Z., Zhang, H., Qi, H., Peng, X. and Li, B. (2004) Pectinase production by Aspergillus niger using wastewater in solid state fermentation for eliciting plant disease resistance. Bioresource Technology, 95, 49-52.

7- Bradford, M. M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry, 72, 248-254.

8- Cavalitto, S. F., Areas, J. A. and Hours, R. A. (1996) Pectinase production profile of Aspergillus foetidus in solid state cultures at different acidities. Biotechnology Letters, 18, 251-256.

9- Fawole, O. and Odunfa, S. (2003) Some factors affecting production of pectic enzymes by Aspergillus niger. International Biodeterioration & Biodegradation, 52, 223-227.

10- Fontana, R. C., Salvador, S. and Da Silveira, M. M. (2005) Influence of pectin and glucose on growth and polygalacturonase production by Aspergillus niger in solid-state cultivation. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 32, 371-377.

11- Gadre, R. V., Van Driessche, G., Van Beeumen, J. and Bhat, M. K. (2003) Purification, characterisation and mode of action of an endo-polygalacturonase from the psychrophilic fungus Mucor flavus. Enzyme and Microbial Technology, 32, 321-330.

12- Gailing, M., Guibert, A. and Combes, D. (2000) Fractional factorial designs applied to enzymatic sugar beet pulps pressing improvement. Bioprocess and Biosystems Engineering, 22, 69-74.

13- Ghazala, I., Sayari, N., Romdhane, M. B., Ellouz-Chaabouni, S. and Haddar, A. (2015) Assessment of pectinase production by Bacillus mojavensis I4 using an economical substrate and its potential application in oil sesame extraction. Journal of food science and technology, 52, 7710-7722.

14- Ghildyal, N., Ramakrishna, S., Nirmala Devi, P., Lonsane, B. and Asthana, H. (1981) Large scale production of pectolytic enzyme by solid state fermentation. Journal of Food Science and Technology, 18, 248-251.

15- Heidarizadeh, M., Rezaei, P. F. and Shahabivand, S. Novel pectinase from Piriformospora indica, optimization of growth parameters and enzyme production in submerged culture condition. Turkish Journal of Biochemistry, 43, 289-295.

16- Käfer, E. (1977) Meiotic and mitotic recombination in Aspergillus and its chromosomal aberrations. Advances in genetics, 19, 33-131.

17- Kashyap, D. R., Soni, S. K. and Tewari, R. (2003) Enhanced production of pectinase by Bacillus sp. DT7 using solid state fermentation. Bioresource Technology, 88, 251-254.

18- Kumar, V., Sahai, V. and Bisaria, V. (2011) High-density spore production of Piriformospora indica, a plant growth-promoting endophyte, by optimization of nutritional and cultural parameters. Bioresource technology, 102, 3169-3175.

19- Kumar, Y. S., Varakumar, S. and Reddy, O. (2010) Production and optimization of polygalacturonase from mango (Mangifera indica L.) peel using Fusarium moniliforme in solid state fermentation. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 26, 1973-1980.

20- Kuvvet, C. (2016). Pectinase production using apple pomace as carbon source by mixed culture fermentation. Thesis.

21- Mohamed, S. A., Christensen, T. M. and Mikkelsen, J. D. (2003) New polygalacturonases from Trichoderma reesei: characterization and their specificities to partially methylated and acetylated pectins. Carbohydrate Research, 338, 515-524.

22- Nigam, P. and Vogel, M. (1991) Bioconversion of sugar industry by-products—molasses and sugar beet pulp for single cell protein production by yeasts. Biomass and Bioenergy, 1, 339-345.

23- Olsson, L., Christensen, T. M., Hansen, K. P. and Palmqvist, E. A. (2003) Influence of the carbon source on production of cellulases, hemicellulases and pectinases by Trichoderma reesei Rut C-30. Enzyme and Microbial Technology, 33, 612-619.

24- Patil, S. R. and Dayanand, A. (2006) Production of pectinase from deseeded sunflower head by Aspergillus niger in submerged and solid-state conditions. Bioresource technology, 97, 2054-2058.

25- Phutela, U., Dhuna, V., Sandhu, S. and Chadha, B. (2005) Pectinase and polygalacturonase production by a thermophilic Aspergillus fumigatus isolated from decomposting orange peels. Brazilian Journal of Microbiology, 36, 63-69.

26- Ramos, A. M., Gally, M., García, M. C. and Levin, L. (2010) Pectinolytic enzyme production by Colletotrichum truncatum, causal agent of soybean anthracnose. Revista iberoamericana de micologia, 27, 186-190.

27- Rao, R. S., Kumar, C. G., Prakasham, R. S. and Hobbs, P. J. (2008) The Taguchi methodology as a statistical tool for biotechnological applications: a critical appraisal. Biotechnology journal, 3, 510-523.

28- Sapunova, L., Lobanok, A. and Mikhailova, R. (1997) Conditions of synthesis of pectinases and proteases by Aspergillus alliaceus and production of a complex macerating preparation. Applied Biochemistry and Microbiology, 33, 257-260.

29- Sharma, N., Rathore, M. and Sharma, M. (2013) Microbial pectinase: sources, characterization and applications. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology, 12, 45-60.

30- Silva, D., Martins, E. d. S., Silva, R. d. and Gomes, E. (2002) Pectinase production by Penicillium viridicatum RFC3 by solid state fermentation using agricultural wastes and agro-industrial by-products. Brazilian Journal of Microbiology, 33, 318-324.

31- Thakur, A., Pahwa, R., Singh, S. and Gupta, R. (2010) Production, purification, and characterization of polygalacturonase from Mucor circinelloides ITCC 6025. Enzyme research, 2010.

32- Verma, S., Varma, A., Rexer, K.-H., Hassel, A., Kost, G., Sarbhoy, A., Bisen, P., Bütehorn, B. and Franken, P. (1998) Piriformospora indica, gen. et sp. nov., a new root-colonizing fungus. Mycologia, 896-903.

33- Xue, M., Liu, D., Zhang, H., Qi, H. and Lei, Z. (1992) A pilot process of solid state fermentation from sugar beet pulp for the production of microbial protein. Journal of fermentation and bioengineering, 73, 203-205.