نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

دانشگاه یاسوج

چکیده

گندم نان مهمترین محصول جهان است که عملکرد آن تحت تأثیر انواع بیماری از جمله بیماری باکتریایی برگ قرار دارد. مناسب ترین روش برای مدیریت این بیماری، استفاده از ارقام مقاوم است. نشانگرهای DNA در زمینه مقاومت به بیماریها در گروه‌بندی گیاه بسیار موثر هستند و در میان این نشانگرها، نشانگر ISSR توصیه می‌شود زیرا اطلاعات پیشین از توالی DNA لازم نیست و پیاده سازی آن آسان و سریع می‌باشد. در این تحقیق، با توجه به مقاومت در برابر بلایت باکتریایی، تنوع ژنتیکی 27 رقم بومی گندم با استفاده از 12 آغازگر ISSR بررسی شدند که 170 باند قابل بررسی را تولید کرد که 156 باند چندشکل بود. بالاترین درصد نوارهای چندشکل متعلق به جایگاه‌هایF7, F8 و F10 و پایین‌ترین مقدار آن مربوط به آغازگر F9 بود. بالاترین مقدار محتوای اطلاعات چندشکلی (PIC) متعلق به آغازگرهای F10 و F5 و کمترین مقدار آن متعلق به آغازگر F7 بود. تجزیه خوشه‌ای این ارقام را به چهار گروه تقسیم کرد: ارقام قدس، امید و آتاک در گروه مقاوم و سایر ارقام در گروه حساس و بسیار حساس قرار گرفتند. چندشکلی بالای به دست آمده در این تحقیق می‌تواند به کارایی بالای نشانگر ISSR در ارزیابی تنوع ژنتیکی ارقام گندم از نظر مقاومت در برابر بیماری‌های مختلف نسبت داده شود.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Study of genetic diversity of wheat bacterial blight (Pseudomonas syringae pv. Syringae) using ISSR molecule marker in Iranian native wheat cultivars

نویسندگان [English]

  • Seyedeh Zahra FatemiFard
  • Rasoul Rezaei

Yasouj University

چکیده [English]

Bread wheat is the most important crop in the world whose yield is affected by several diseases including bacterial leaf blight. The most appropriate method for managing this disease is using resistant cultivars. DNA markers are highly effective in plant grouping in terms of resistance to diseases, and among these markers, the ISSR marker is recommended because of the do not need for prior information from the DNA sequencing and its easy and fast implementation. In this research, genetic variation of 27 Iranian indigenous wheat cultivars with respect to resistance to bacterial blight was investigated using 12 ISSR primers, which produced 170 evaluable bands, of which 156 were polymorphic bands. The highest percentage of polymorphic bands was belonged to F7, F8 and F10 primers, and the lowest of it was related to F9 primer. The highest content of the polymorphism information content (PIC) was belonged to the F10 and F5 primers and the smallest value belonged to the F7 primer. Cluster analysis classified these cultivars into four groups: Ghods, Omid and Atrak cultivars in the cluster of resistant group and other cultivars in sensitive and very sensitive group. The high polymorphism obtained in this study can be attributed to the high efficiency of the ISSR marker in evaluating the genetic diversity of wheat cultivars in terms of resistance to various diseases..

کلیدواژه‌ها [English]

  • genotype
  • Cluster analysis
  • Polymorphism
  • molecular marker

بررسی تنوع ژنتیکی مقاومت به بیماری بلایت باکتریایی گندم

(Pseudomonas syringae­­ pv. Syringae) با استفاده از نشانگر

مولکولیISSR در ارقام گندم بومی ایران

سیده ‌زهرا فاطمی‌فرد، اسد معصومی‌اصل* و رسول رضایی

ایران، یاسوج،  دانشگاه یاسوج، دانشکده کشاورزی، گروه اصلاح نباتات

تاریخ دریافت: 21/6/97                تاریخ پذیرش: 25/10/97

چکیده

گندم نان مهمترین محصول جهان است که عملکرد آن تحت تأثیر چندین بیماری از جمله بیماری باکتریایی برگ قرار دارد. مناسب ترین روش برای مدیریت این بیماری، استفاده از ارقام مقاوم است. نشانگرهای DNA در زمینه مقاومت به بیماریها در گروه­بندی گیاه بسیار موثر هستند و در میان این نشانگرها، نشانگر ISSR توصیه می­شود زیرا اطلاعات پیشین از توالی DNA لازم نیست و پیاده سازی آن آسان و سریع می­باشد. در این تحقیق، تنوع ژنتیکی 27 ارقام بومی گندم بومی ایران با توجه به مقاومت در برابر بلایت باکتریایی با استفاده از 12 آغازگر ISSR مورد بررسی قرار گرفت که 170 باند قابل بررسی را تولید کرد که 156 باند چندشکل است. بالاترین درصد نوارهای چندشکل متعلق به آغازگرهای F7juinkhliF8 ، و F10 و پایین­ترین مقدار آن مربوط به آغازگر F9 بود. بالاترین مقدار محتوای اطلاعات چندشکلی (PIC) متعلق به آغازگرهای F10 و F5 و کمترین مقدار آن متعلق به آغازگر F7 بود. تجزیه خوشه­ای این ارقام را به چهار گروه تقسیم کرد: ارقام قدس، امید و آتاک در گروه مقاوم و سایر ارقام در گروه حساس و بسیار حساس قرار گرفتند. چندشکلی بالای به دست آمده در این تحقیق می­تواند به کارایی بالای نشانگر ISSR در ارزیابی تنوع ژنتیکی ارقام گندم از نظر مقاومت در برابر بیماری­های مختلف نسبت داده شود.

واژه­های کلیدی: ژنوتیپ، تجزیه خوشه‌ای، چندشکلی، نشانگر مولکولی

* نویسنده مسئول، تلفن: 07433224840  ،  پست الکترونیکی: Masoumiasl@yu.ac.ir

مقدمه

 

گندم نان (Triticum aestivum L.) از نظر تولید و سطح زیر کشت جهانی نسبت به دیگر غلات دانه‌ای رتبه اول را دارا می‌باشد (15). بنابراین با توجه به وسعت سطح زیر کشت این گیاه و افزایش نیاز روزافزون به آن، نیازمند ارقام سازگار و پایدار از جهت عملکرد نسبت به تنش‌های زنده و غیر زنده می‌باشیم.  براساس آمار منتشر شده، بیماری‌های گیاهی منجر به کاهش 35 درصدی تولیدات گندم می­شوند (10). در صورت مناسب بودن شرایط محیطی، بیماری بلایت برگی می‌تواند سبب کاهش قابل ملاحظه محصول شود (25، 2 و 23). این بیماری در ایران نخستین بار در استان کرمان مشاهده شد (2) و تاکنون از مزارع گندم استان­های کهگیلویه و بویراحمد، فارس (1)، سیستان و بلوچستان و گیلان (22) نیز گزارش شده است. مناسب‌ترین روش مدیریت این بیماری استفاده از ارقام مقاوم است (8).

در برنامه­های اصلاحی، از نشانگرهای مولکولی به عنوان ابزاری مناسب و مکمل روش­های اصلاح کلاسیک استفاده  می­شود. این نشانگرها به علت پوشش وسیع ژنومی و همچنین سهولت آشکارسازی و تشخیص، کاربرد فراوانی داشته و استفاده از اطلاعات به­دست آمده در مدیریت بهتر ژرم‌پلاسم موجود و استفاده بهینه از آن در برنامه به­نژادی مفید  می­باشد. نشانگرهای مولکولی به­ویژه نشانگرهای مبتنی بر DNA با ایجاد تعداد نامحدودی نشانگر و با حذف اثرات ناشی از عوامل محیطی، توانسته اند بسیاری از مشکلات مربوط به نشانگرهای مورفولوژیک را برطرف کنند (18 و 19). در تکنیک گزینش به کمک نشانگر، همبستگی بین نشانگرهای DNA و صفات مهم زراعی همچون مقاومت به عوامل بیماری‌زا، حشرات، نماتدها، تحمل به تنش‌های غیرزنده، پارامترهای کیفیت و صفات کمی مورد بررسی قرار می‌گیرد. در این روش نشانگرهایی که در مجاورت ژن هدف قرار دارند، شناسایی و انتخاب می‌شوند. به این ترتیب این روش به شناسایی گیاهان حامل ژن‌های هدف به طور هم زمان و بدون قرار دادن در معرض هجوم بیمارگر یا حشره در نسل‌های اولیه، کمک خواهد کرد (3). در تحقیق دیگر بیان شد که شناسایی نشانگرهای مولکولی پیوسته با ژن‌های کنترل کننده‌ صفات، به عنوان روشی بسیار مفید جهت شناسایی ارقام مقاوم می‌باشد (26).

 نشانگرهای بین ریزماهوارهای ژنومی یا ISSR، یک دسته از نشانگرهای مولکولی مبتنی بر تکثیر قطعات کوتاه DNA، درون توالی‌های تکراری ساده می‌باشند. این قطعات، حتی در میان ژنوتیپ‌های بسیار نزدیک، چندشکلی بالایی نشان می‌دهند که ناشی از فقدان محدودیت‌های کارکردی در این مناطق ژنومی می‌باشد. در بررسی تنوع ژنتیکی 48 رقم گندم نان و 51 رقم گندم دوروم در کشور پرتغال که با استفاده از 18 آغازگر ISSR انجام شد، در مجموع 3/96 درصد چندشکلی برای ارقام گندم نان و 5/98 درصد چندشکلی برای ارقام گندم دوروم گزارش کردند (14). این پژوهشگران اشاره کردند که ISSR بازتاب خوبی از تنوع ژنتیکی درون ‌گونه‌ای، بین گونه‌ای و بین ارقام‌ها را نشان می‌دهد. فتحی و همکاران (7) تنوع ژنتیکی 40 گونه از توده Aegilops triuncialis جمع­آوری شده از مناطق غربی ایران را با استفاده از آغازگر ISSR بررسی کردند که 118 نوار چندشکل به ­دست آمد و از بین آنها آغازگر UBC817 با 16 نوار و آغازگرهایUBC811  و UBC823 با 14 نوار بیشترین و آغازگر UBC825 با 4 نوار، کمترین تعداد نوار را تشکیل دادند. تجزیه خوشه­ای، 40 توده بررسی شده را در سه گروه طبقه بندی کرد که هر گروه به ترتیب شامل 13، 9 و 18 توده بودند. استفاده از 9 آغازگر ISSR برای شناسایی تنوع ژنتیکی مرتبط با بیماری فوزاریوم در گیاه نخود مشخص کرد از این آغازگرها در مجموع 61 باند تولید شد که در این میان 44 نوار چندشکل (1/72 درصد) ایجاد شد (17). همچنین در پژوهش مسعودی و همکاران (11) برای ارزیابی مقاومت به بیماری سفیدک پودری که با استفاده از نشانگرهای ISSR، iBPS و IRAP، بر روی 115 ژنوتیپ گندم انجام گردید، بیشترین و کمترین درصد چندشکلی مربوط به آغازگر نوع ISSR و iBPS به ترتیب با 100 و 50 درصد بود و آلل PR50-60 بیشترین ارتباط را با صفات مورد ارزیابی در این پژوهش داشت.

      هدف از این پژوهش، بررسی تنوع ژنوتیپ‌های گندم ایرانی از لحاظ مقاومت به بیماری بلایت باکتریایی می‌باشد. از آنجا که ایران از کشورهای غنی از ذخایر توارثی برخی محصولات مهم از جمله گندم است، ارزیابی اولیه و پیشرفته ذخایر ارزشمند گندم در ارتباط با  اهداف اصلاحی این محصول که برطرف کننده مشکلات تولید است باید در اولویت قرار گیرد.

مواد و روشها

27رقم گندم بومی ایران از موسسه تحقیقات، اصلاح و تهیه نهال و بذر کرج تهیه شد که اسامی آنها در جدول 1 آورده شده است. این ارقام در گلدان حاوی خاک جمع آوری و الک شده (خاک زراعی، کود حیوانی و ماسه‌ شسته بود) در گلخانه تحقیقاتی دانشگاه یاسوج و در قالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار کشت شدند. گیاهان از زمان کاشت تا زمان برداشت در شرایط کنترل شده نور، دما، کنترل آلودگی و رطوبت نگهداری شدند.

 

 

جدول1- ارقام گندم مورد مطالعه

1- آزادی

2- الموت

3- الوند

4- اترک

5- امید

6- اینیاء

7- بزوستایا

8- بولانی

9- تجن

10- چمران

11- داراب2

12- روشن

13- زرین

14- سبلان

15- سرخ‌تخم

16- سرداری

17- شعله

18- طبسی

19- فلات

20- قدس

21- کارچیا

22- کویر

23- گلستان

24- ماهوتی

25- مهدوی

26- میهن

27- نیک‌نژاد

 

                                                                                                                                                                       

 

برای انجام محلول پاشی برگی، از سوسپانسون اولیه باکتری که از گروه گیاهپزشکی دانشکده کشاورزی دانشگاه یاسوج تهیه شد، کشت 16 خطی انجام گردید و سپس از کشت مجدد اولیه، کشت 24 ساعته انجام شد. از کشت 24 ساعته کلونی باکتری درون ارلن حاوی آب مقطر یک بار تقطیر اتوکلاو شده منتقل و سوسپانسون تهیه شد. سپس میزان جذب نوری سوسپانسیون باکتری در طول موج نوری 600 قرائت گردید. اسپری پاشی دستی در مرحله 5-4 برگی انجام شد (24). گیاهان شاهد نیز با آب یک بار تقطیر اتوکلاو شده، اسپری پاشی برگی گردیدند. به منظور بررسی میزان آلودگی برگی بوسیله باکتری Pss، نمونه‌برداری در بازه­های زمانی 7، 14 و 18 روز پس از محلول‌پاشی برگی انجام گرفت. سپس از برگهای تلقیح شده عکس تهیه شده و سطح آلودگی با استفاده از نرم‌افزار IMAGE J محاسبه گردید. گروه‌بندی ارقام در 6 گروه و طبق رده‌بندی (19) انجام گرفت. بر طبق این رده‌بندی، صفر: یعنی فاقد هرگونه علامت قابل مشاهده. یک: یعنی کلروز بدون بافت‌مردگی. دو: یعنی بافت‌مردگی کمتر از 10 درصد. سه: یعنی بافت‌مردگی بین 11 تا 30 درصد. چهار: یعنی بافت‌مردگی بین 31 تا 70 درصد. پنج: یعنی بافت‌مردگی بین 71 تا 100 درصد. و شش: یعنی گسترش بافت‌مردگی به ناحیه فراتر از ناحیه مایه‌زنی شده. نتایج بین صفر تا دو به عنوان واکنش مقاومت و بین 1/2  تا 6 به عنوان واکنش حساسیت در نظر گرفته شد.  

در مرحله 6-4 برگی و در بازه‌های زمانی 1، 3 و 5 روز پس از مایه‌زنی، نمونه‌های برگی جمع آوری و استخراج DNA از برگ خشک شده گیاه، بدون نیاز به نیتروژن مایع و SDS، با تغییراتی در روش اسفندانی بزچلوئی (1396) انجام گردید. پس از تعیین کیفیت و کمیت DNA استخراجی با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز یک درصد و دستگاه اسپکتروفتومتری، واکنش PCR با استفاده از 12 آغازگر ISSR (جدول 2) انجام گردید. واکنش PCR با استفاده از (2X)PCR Master Mix شرکت آمپلی‌کون آماده مصرف (تهیه شده از شرکت سیناژن) به میزان 10 میکرولیتر، 5/1 میکرولیتر DNA استخراج شده (10 نانوگرم در میلی­لیتر) و 2 میکرولیتر از آغازگر (10 میکرومول) و 5/6 میکرولیتر آب دوبار تقطیر انجام گردید. الگوی دمایی واکنش زنجیره‌ای پلیمراز شامل یک چرخه واسرشت اولیه به مدت 2 دقیقه در دمای 94 درجه سانتگراد، 35 چرخه شامل واسرشت سازی به مدت 30 ثانیه و در دمای 94 درجه سانتیگراد، اتصال آغازگر به الگو در دمای 6/63-8/40 درجه سانتیگراد به مدت 45 ثانیه (جدول 2)، مرحله بسط در دمای 72 درجه سانتیگراد و به مدت 3/1 دقیقه. و یک چرخه بسط نهایی به مدت 20 دقیقه در دمای 72 درجه سانتیگراد. محصولات PCR با استفاده از ژل آگارز 5/2 درصد با ولتاژ 100 با استفاده از دستگاه الکتروفورز از هم تفکیک شدند. قطعات DNA تکثیر شده به صورت صفر (عدم حضور باند) و یک (حضور باند) امتیازبندی و از ضریب تشابه جاکارد برای محاسبه تشابه بین هر یک از زوج‌های ژنوتیپی استفاده گردید. جهت به دست آوردن تعداد آلل مشاهده شده (Na)، تعداد آلل موثر (Ne)، شاخص شانن (I)، میزان هتروزیگوسیتی مورد انتظار (He) از نرم‌افزار GenAlex استفاده گردید. همچنین ترسیم درخت فیلوژنی و نمودار دو بعدی و سه بعدی با استفاده از نرم‌افزار NTSYS ver 2.02 انجام گردید. جهت تعیین گروه‌بندی ارقام، از آزمون T2هتلینگ در نرم افزار SAS استفاده گردید. برای محاسبه PIC از نرم‌افزار آنلاین PIC COLTIVATUR استفاده گردیده و MI از رابطه MI= PIC × EMR بدست آمد.

 

 

جدول2- توالی و دمای اتصال آغازگرهای مورد استفاده

اسم آغازگر

توالی آغازگر ( '3→ '5)

دمای اتصال (درجه سانتیگراد)

F1

ACC ACC ACC ACC ACC ACC

6/63

F2

ACA CAC ACA CAC ACA CCG

3/56

F3

CTC TCT CTC TCT CTC TG

4/52

F4

GAT AGA TAG ACA GAC A

2/43

F5

GGG TGG GGT G

36

F6

GTG TGT GTG TGT GTG TYA

6/52

F7

CTC TCT CTC TCT CTC TGC

3/56

F8

CTC TCT CTC TCT CTA

5/43

F9

CAG CAG CAG GC

38

F10

GTG TGT GTG TGT CC

7/43

F11

CAC ACA CAC ACA AC

8/40

F12

CAC ACA CAC ACA GT

8/40

 


نتایج و بحث

تجزیه و تحلیل درصد آلودگی برگی ارقام گندم در دومین زمان برداشت (14 روز پس از محلول‌پاشی برگی)، نشان داد که ارقام امید، اترک و قدس جزو ارقام مقاوم (کمتر از 10 درصد بافت‌مردگی) و سایر ارقام جزو ارقام حساس (بیشتر از ده درصد آلودگی در ناحیه مایه‌زنی شده) به بیماری بلایت باکتریایی قرار گرفتند. همچنین ارقام آزادی، چمران، داراب2، فلات و کویر حساسیت زیادی (31 تا 70 درصد آلودگی برگی) نسبت به این بیماری نشان دادند تا جایی که حساسیت آن‌ها از رقم گلستان (رقم حساس- شاهد) نیز بیشتر بود. همچنین رقم اترک مقاومت بیشتری نسبت به رقم امید (رقم مقاوم- شاهد) نشان داد.

در این پژوهش، بالاترین میزان چندشکلی مربوط به آغازگرهای F10،F5  وF6بود (شکل 1) و لذا از این آغازگرها برای آنالیز مجموعه ژرم‌پلاسم‌های ارقام دیگر گندم در پژوهش‌های بعدی می­توان بهره گرفت. کمترین میزان چندشکلی مربوط به آغازگر F7بود. این آغازگر توانایی خوبی برای جداسازی ژرم‌پلاسم‌ها از خود نشان نداد در حالیکه دیگر آغازگرهای مطالعه شده در این تحقیق به شدت چندشکلی را نشان دادند (جدول 3). مقدار چندشکلی برای نشانگرهای غالب حداکثر باید 375/0 باشد (21). هر چه این عدد بزرگتر باشد و به مقدار 375/0 نزدیکتر باشد، بیانگر فراوانی بیشتر چندشکلی برای آن جایگاه در جمعیت تحت بررسی است. محتوای اطلاعات چندشکلی در اکثر آغازگرهای مورد استفاده عدد بزرگی بود که نشان ‌دهنده انتخاب صحیح و کارائی بالای این آغازگرها می‌باشد. شاخص نشانگری (MI) آغازگرهای استفاده شده در این مطالعه بین 317/6 تا 166/0 متغیر بود. از MI به عنوان معیاری مناسب برای پیشگوئی کارایی نشانگر در یک ژرم‌پلاسم استفاده می‌گردد. آغازگرهای 5F  و F12در این مطالعه بالاترین مقدار شاخص نشانگری را به خود اختصاص دادند (جدول 3). از شاخص نشانگری به عنوان معیاری مناسب برای پیشگویی کارایی نشانگر در یک ژرم‌پلاسم استفاده می‌گردد. بنابراین آغازگرهایی که بالاترین مقدار شاخص نشانگری را به خود اختصاص دادند، می‌توانند برای مطالعه ژرم‌پلاسم گندم در سطح وسیع استفاده گردند.

 

1   2   3    4    5   6   7   8    M    9    10   11   12   13   14   15  16  17  18   19   20   21   22  23   24  25  26   27   M 

 


     

شکل 1- الگوی باندی مربوط به آغازگر  6F، شماره‌ها به ترتیب مربوط به ارقام: 1– آزادی، 2- الموت، 3- الوند،  4- اترک، 5- امید،             6 - اینیاء، 7 - بزوستایا، 8- بولانی، 9- تجن، 10- چمران، 11- داراب2، 12- روشن، 13- زرین، 14- سبلان، 15- سرخ‌تخم، 16- سرداری، 17- شعله، 18- طبسی، 19- فلات، 20- قدس، 21- کارچیا، 22- کویر، 23- گلستان، 24- ماهوتی، 25- مهدوی، 26- میهن و 27- نیک‌نژاد و M : نشان دهنده نشانگر وزنی می‌باشد.

 

آغازگر F7کمترین و آغازگرهایF10، F5وF6 بیشترین He را نشان دادند (جدول 3). هتروزیگوسیتی مورد انتظار برای کل جمعیت در تمام جایگاه‌ها به طور متوسط 37/0 بدست آمد که با سیستم گرده‌افشانی گندم تطابق دارد. هتروزیگوسیتی مورد انتظار (He)، معیاری برای ارزیابی تنوع ژنی بوده و با تعداد آلل موثر ارتباط مستقیم دارد (16).

مقدار میانگین I در این تحقیق 550/0 بوده است که در این میان کمترین داده مربوط به آغازگر F7و حداکثر آن مربوط به آغازگر F10بود. شاخص شانون در این مطالعه برای اکثر آغازگرهای انتخاب شده بالا بود. شاخص شانون (I) بیانگر میزان تنوع در هر آغازگر می‌باشد. حداقل و حداکثر آلل موثر به دست آمده در این تحقیق، به ترتیب مربوط به آغازگرهای F7و F10 بود. تعداد آلل‌های موثر (Ne)، بیانگر تعداد آلل‌هایی است که برای دستیابی به هتروزیگوسیتی انتظار می‌رود. تعداد آلل‌های متفاوت (Na)، بیان کننده تعداد آلل­های مشاهده شده و تعداد واقعی آلل‌هایی است که در جمعیت وجود دارند. کمترین مقدار به دست آمده برای Na متعلق به آغازگر F9و بیشترین مقدار آن مربوط به سایر آغازگرها (به جز F9و F12) بود (جدول 3). کاهش غنای آللی می‌تواند منجر به کاهش پتانسیل جمعیت برای سازگاری با تغییرات زیست محیطی آینده شود، زیرا این تنوع خام برای تکامل با انتخاب طبیعی است. بنابراین غنای آللی یک شاخص قوی برای پتانسیل تکاملی جمعیت است. همچنین غنای آلل، تعداد واقعی آلل را در هتروزیگوسیت اندازه می‌گیرد، در حالی که تعداد آلل موثر، تعداد آلل هایی که انتظار می‌رود در جمعیت با همان هتروزیگوسیتی است. با توجه به عواقب بوم شناسی و تکاملی هتروزیگوسی در مقابل غنای آللی، هر دو اقدامات باید در تلاش‌های حفاظت و مدیریت با هدف حفظ تنوع ژنتیکی در نظر گرفته شود (به نقل از 16).

 

جدول 3- مقادیر شاخص‌های نشانگری آغازگرهای مورد مطالعه

اسم آغازگر

تعداد نوار تکثیر شده

تعداد نوار چندشکل

درصد نوارهای چندشکل

PIC

IM

eH

I

eN

aN

F1

11

10

9/90

244/0

217/2

302/0

462/0

508/1

2

F2

17

15

23/88

306/0

049/4

384/0

569/0

651/1

2

F3

13

12

30/92

302/0

344/3

386/0

562/0

687/1

2

F4

17

16

11/94

305/0

592/4

387/0

569/0

682/1

2

F5

20

19

95

350/0

317/6

456/0

647/0

853/1

2

F6

13

12

30/92

323/0

577/3

415/0

600/0

751/1

2

F7

10

10

100

166/0

166/0

198/0

325/0

303/1

2

F8

6

6

100

315/0

189/0

407/0

587/0

754/1

2

F9

20

16

80

304/0

891/3

309/0

453/0

544/1

8/1

F10

12

12

100

362/0

344/4

475/0

668/0

910/1

2

F11

13

11

61/84

315/0

931/2

401/0

586/0

713/1

2

F12

18

17

44/94

331/0

314/5

402/0

579/0

732/1

944/1

میانگین

13

166/14

657/92

301/0

410/3

376/0

550/0

674/1

978/1

 

 

صفری و همکاران (5) در بررسی تنوع ژنتیکی برخی از ژنوتیپ­های چچم دائمی (Lolium prenne) با استفاده از نشانگر مولکولی ISSR گزارش کردند که این نشانگر توانسته چندشکلی مطلوبی را بین ژنوتیپ­ها نشان دهد طوریکه محتوای اطلاعات چندشکلی نشانگرها بین 25/0 تا 45/0 متغیر بود.

خط برش در دندروگرام شکل 2 از محل فاصله ژنتیکی 411/0، بهترین گروه‌بندی را نشان داد که توسط آزمون T2هتلینگ و CCC تعیین گردید. بر این اساس، با رسم خط برش در محل تعیین شده بر روی نمودار، چهار گروه ایجاد گردید که شامل گروه­های: (1) داراب2، (2) قدس، امید و اترک، (3) سرداری و اروند و (4) شامل دو زیر گروه می‌باشد: الف) فلات، زرین، کارچیا، تجن، بولانی و کویر و ب) طبسی، سرخ‌تخم، سبلان، شعله، روشن، اینیا، الموت، نیک‌نژاد، میهن، مهدوی، ماهوت، گلستان، چمران، بزوستایا و آزادی می‌باشند. تجزیه خوشه‌ای یک روش آماری چند متغیره می‌باشد که هدف اولیه آن گروه‌بندی افراد براساس میزان تشابه می‌باشد، به طوریکه افراد مشابه از نظر صفات (نشانگرهای) مورد بررسی، در یک خوشه واحد کنار هم قرار می‌گیرند. یکی از نکات مهم در ارزیابی دندروگرام ترسیم شده، بررسی اطمینان نقاط شاخه‌های مختلف داخل یک درخت می‌باشد. آزمون‌های آماری متفاوتی برای ارزیابی درخت ترسیم شده وجود دارد، اما این آزمون‌ها پیچیده هستند زیرا درخت ترسیم شده بیشتر ژئومتریک است تا عددی. بنابراین صحت و دقت یک بخش از درخت ممکن است کمتر یا بیشتر از صحت بخش‌های دیگر باشد (13).

بر اساس داده‌های علائم بیماری و همچنین گزارش­های فلاحی‌چرخابی (8) و تقوی و کشاورز (1)، رقم امید به عنوان رقم مقاوم به بیماری بلایت و رقم گلستان به عنوان رقم حساس به بلایت در مجموعه ارقام انتخابی قرار دارند. بر این اساس، گروه اول که شامل رقم داراب2 بود، در برخی آغازگرها باند تشکیل نداد و در خوشه‌ای جداگانه قرار گرفت. لذا گروه اول و دوم شامل ارقام مقاوم، گروه سوم شامل ارقام نیمه حساس و گروه چهارم شامل ارقام حساس می‌باشند.

صحراگرد (4) بررسی مقاومت ارقام تجاری گندم به Pss را در مرحله سه برگی ارزیابی و مشخص نمود که پس از 40 روز (مرحله به ساقه رفتن) در ارقام گندم روشن، امید، قدس و گاسپارت و ارقام جو علائم بیماری کاهش یافت و فقط لکه بافت‌ مرده کوچک باقی ماند. همچنین بر طبق گزارش تقوی و کشاورز (1)، ارقام فلات، TR80، C 73-5 و اروند جهش­یافته مصون و ارقام اروند، اترک، سرخ‌تخم، نیک‌نژاد، M-73-18 و Fr 319 به عنوان ارقام مقاوم گزارش شدند. در حالی که در پژوهش حاضر بر اساس داده‌های مولکولی و درصد آلودگی برگی محاسبه شده و نیز در پژوهش فلاحی چرخابی (8) ارقام سرخ‌تخم و نیک‌نژاد به Pss حساس بودند. همچنین در پژوهش فلاحی چرخابی (8) ارقام اترک، فلات، اروند نیز حساس معرفی شدند در حالیکه در این پژوهش رقم اترک در گروه‌ ارقام مقاوم به بیماری قرار گرفت. همچنین ارقام سرداری و اروند در گروهی جدا، مابین ارقام مقاوم و حساس قرار گرفتند. بیشترین فاصله ژنتیکی میان ارقام داراب2 و قدس با رقم آزادی به دست آمد. ارقام ماهوتی و مهدوی دارای کمترین فاصله ژنتیکی نسبت به یکدیگر بودند. ارقام قدس و امید و اترک را که از نظر مولکولی و مورفولوژیکی به عنوان والد مقاوم تشخیص داده شده‌اند را در صورت مناسب بودن صفات موردنظر، در برنامه به‌نژادی به عنوان والد دهنده مقاومت در روش اصلاحی تلاقی برگشتی می‌توان استفاده کرد. همچنین در سایر برنامه‌های به‌نژادی، مانند استفاده از هتروزیس و مهندسی ژنتیک در جهت سازگاری بیشتر با شرایط کشور می‌توان از این ارقام مقاوم استفاده نمود. بیشترین فراوانی ارقام در گروه 4 بود که این نشان دهنده تشابه ژنتیکی بسیار نزدیک این ارقام نسبت به یکدیگر می‌باشند. در ارقام حساس تفاوت اندکی بین گروه‌بندی مولکولی و مورفولوژیکی مشاهده گردید.

 

 

 

شکل 2- دندروگرام حاصل از تجزیه خوشه‌ای 27 ژنوتیپ گندم مورد مطالعه بر مبنای مشاهدات مولکولی

 

به نقل از نظری و عبدالشاهی (12) عدم تشابه بین نشانگرهای مورفولوژیکی و مولکولی در مطالعات مختلف گزارش و دلایل مختلفی برای آن بیان شده است. علت عدم مطابقت دندروگرام‌های حاصل از صفات مختلف را شاید بتوان در تعداد کم نشانگر ریزماهواره مورد استفاده در تحقیق دانست. همچنین از آنجا که منابع ژنی می‌توانند فنوتیپ‌های مشابهی را برای ژن‌های متفاوت آشکار کنند، این نتایج دور از انتظار نیست. نمودارهای دو بعدی (شکل 3) و سه بعدی (شکل 4) پراکنش ارقام نیز تا حدودی نتایج حاصل از تجزیه خوشه‌ای را تایید کردند.


 

شکل 3- نمودار دو بعدی مربوط به 27 ژنوتیپ گندم مورد مطالعه: اسامی ارقام با اعداد جایگزین گردیده اند: 1- آزادی، 2- الموت،          3- الوند، 4- اترک، 5- امید، 6- اینیاء، 7-بزوستایا، 8- بولانی، 9- تجن، 10- چمران، 11- داراب2، 12- روشن، 13- زرین، 14- سبلان، 15- سرخ‌تخم، 16- سرداری، 17- شعله، 18- طبسی،   19- فلات، 20- قدس، 21- کارچیا، 22- کویر، 23- گلستان، 24- ماهوتی،           25- مهدوی، 26- میهن و 27- نیک‌نژاد.

 

شکل 4- نمودار سه بعدی مربوط به 27 ژنوتیپ گندم مورد مطالعه: اسامی ارقام با اعداد جایگزین گردیده اند: 1- آزادی، 2- الموت، 3- الوند، 4- اترک، 5- امید، 6- اینیاء، 7-بزوستایا، 8- بولانی، 9- تجن، 10- چمران، 11- داراب2، 12- روشن، 13- زرین، 14- سبلان، 15- سرخ‌تخم، 16- سرداری، 17- شعله، 18- طبسی،  19- فلات، 20- قدس، 21- کارچیا، 22- کویر، 23- گلستان، 24- ماهوتی،        25- مهدوی، 26- میهن و 27- نیک‌نژاد.

 

تعداد زیاد مکان‌های تکثیر شده در این آزمایش نشان می‌دهد که تعداد کمی از آغازگرهای ISSR با میزان اطلاعات چندشکل بالا، می‌تواند تعداد زیادی نمونه و جمعیت‌های مختلف گندم را تفکیک کند. چندشکلی بالا در پژوهش حاضر را می‌توان به کارایی بالای نشانگر ISSR، پراکندگی جغرافیایی و تعداد ژنوتیپ مورد بررسی نسبت داد. این میزان چندشکلی از یک طرف نشان دهنده کارایی کاربرد این نشانگرها در مطالعه ژرم‌پلاسم گندم ایرانی و از طرف دیگر نشان دهنده توزیع جغرافیایی و تنوع ژنتیکی وسیع این گیاه در ایران می‌باشد. همچنین می‌توان از این ارقام و لاین‌ها جهت معرفی ژن‌های جدید در داخل خزانه ژنی گندم استفاده کرد. در این پژوهش، 12 آغازگر مورد استفاده 170 مکان قابل ارزیابی تولید کردند که از این تعداد 156 باند چندشکل ایجاد گردید. نتایج این پژوهش بیان کرد که یافتن مارکر ISSR مرتبط با ژن مقاومت به بلایت باکتریایی در گندم به اصلاح‌گران این گیاه کمک می‌نماید تا ژنوتیپ‌ها را با سرعت و کارایی بالا برای این ژن مورد غربالگری قرار دهند. همچنین این مارکر به تکمیل نقشه ژنتیکی گندم کمک می‌نماید و از میان آغازگرهای استفاده شده، آغازگرهای F5و F10 به دلیل نشان دادن He و PIC بالا مناسب‌ترین آغازگرها برای مطالعات بعدی تشخیص داده شدند.

1-       تقوی، س. م. و کشاورز، ک. 1381. شناسایی عامل سوختگی برگ گندم و واکنش ارقام مختلف گندم نسبت به آن‌ها در استان فارس و استان کهگیلویه و بویراحمد. علوم آب و خاک (علوم و فنون کشاورزی و منابع طبیعی). 6: 179-171.

2-       رحیمیان، ح. 1368. وقوع سوختگی برگ باکتریایی در گندم. نهمین کنگره گیاهپزشکی ایران، مشهد، ایران. ص 146.

3-       شفیعی، ا.، ملکی زنجانی، ب.، کرمی، ث. و ایمانی خواه، ف. 1389. ردیابی ژن مقاومت به زنگ قهوه‌ای Lr32 در ارقام و لاین‌های گندم ایرانی با استفاده از آزمون تیپ آلودگی و نشانگرهای مولکولی پیوسته به ژن Lr32. مجله پژوهش‌های تولید گیاهی. 7(3): 37-21.

4-       صحراگرد، ن. 1379. مقاومت گندم به بلایت برگی باکتریایی. مجموعه مقالات چهاردهمین کنگره گیاهپزشکی ایران، اصفهان. صفحه 243.

5-       صفری، ه.، شیروانی، ه. و فریدونی ل. 1396. بررسی تنوع ژنتیکی برخی از ژنوتیپ­های چچم دائمی (Lolium prenne) با استفاده از نشانگرهای مولکولی و بیوشیمیایی. مجله پژوهش­های سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران). 30(4): 523-533.

6-       عبدمیشانی، س. و شاه‌نجات بوشهری، ع. ا. 1377. اصلاح‌نباتات تکمیلی (جلد دوم). انتشارات دانشگاه تهران. 352 صفحه.

7-       فتحی، ط.، سوهانی، م. م.، سمیع‌زاده‌ لاهیجانی، ح. ا. و  مهرابی، ع. ا. 1393. بررسی تنوع ژنتیکی توده‌های Aegilops triuncialis L. در مناطق غربی ایران با استفاده از نشانگر مولکولی ISSR. علوم گیاهان زراعی ایران. 45(1): 93-85.

8-       فلاحی چرخابی، ن.، شمس‌بخش، م.، رحیمیان، ح.، خدایگان، پ. و رستگار، م. ح. 1394. تعیین ویژگی جدایه‌های Pseudomonas syringae pv. Syringae (Pss) عامل بیماری بلایت باکتریایی گندم در استان کرمان و ارزیابی واکنش ژنوتیپ‌های ایرانی گندم نسبت به آن. آفات و بیماری‌های گیاهی، 83(1): 50-39.

9-       قره‌یاضی، ب. 1375. کاربرد نشانگرهای DNA در اصلاح‌نباتات. مجموعه مقالات کلیدی چهارمین کنگره علوم زراعت و اصلاح‌نباتات. اصفهان. صفحات 328-330.

10-    کیا، ش. و ترابی، م. 1387. تاثیر آلودگی به سپتوریوز برگ (Septoria tritici Rob. Ex Desm.) در مراحل مختلف رشد بر عملکرد و اجزای عملکرد ارقام گندم در گرگان. به نژادی نهال و بذر. 24(2): 237-250.

11-    مسعودی، ح.، صبوری، ح.، طلیعی، ف. و آلت‌جعفر بای، ج. 1396. بررسی تنوع ژنتیکی و ارتباط برای صفات مورفوفنولوژیک و مقاومت به بیماری سفیدک پودری در ژرم‌پلاسم گندم با استفاده از نشانگرهای ISSR، IRAP، iPBS. زیست‌فناوری گیاهان زراعی. 7(18): 56-41.

12-     نظری، م. و عبدالشاهی، ر. 1393. بررسی تنوع ژنتیکی ارقام گندم نان (Triticum aestivum L.) از طریق صفات مورفوفیزیولوژیک و نشانگر مولکولی SSR. بیوتکنولوژی کشاورزی. 6(1): 215-231.

13-    نقوی، م. ر.، قره یاضی، ب. و حسینی سالکده، ق. 1392. نشانگرهای مولکولی. انتشارات دانشگاه تهران. 338 صفحه.

 

14-    Carvalho, A., Lima Brito, J., Macas, B. and Guedes-Pinto, H. (2009). Genetic diversity and variation among botanical varieties of old Portuguese wheat cultivars revealed by ISSR assays. Biochemistry Genetics, 47: 276-294.

15-   FAO. 2009. Statistical database. Available online: Http//www. FAO.org.

16-   Greenbaum, G., Templeton, A. R., Zarmi, Y. and Bar-David, S. 2014. Allelic Richness following Population Founding Events – A Stochastic Modeling Framework Incorporating Gene Flow and Genetic Drift. PLOS ONE, 1-23.

17-   Haji Allahverdipoor, K., Bahramnejad, B. and Amini, J. 2011. Selection of Molecular markers associated with resistance to Fusarium wilt disease in chickpea (Cicer arietinum L.) using multivariate statistical techniques. Australian Journal of crop science, 5(13): 1801- 1809.

18-   Li, Q., Liu, Q.C., Zhai, H., Ma, D.F., Wang, X., Li, X.Q. and Wang, Y.P. 2008. Genetic diversity in main parents of sweet potato in china as revealed by ISSR Markers. Acta Agronomica Sinicia, 34 (6): 972-977.

19-   Mengoni, A., Gori, A. and Bazzicalupo, M. 2000. Use of RAPD and microsatellite (SSR) variation to assess genetic relationships among populations of tetraploid alfalfa, Medicago sativa. Plant Breeding, 119: 113-117.

20-   Milus, E. A. and Chalkley, D. B. 1994.Virulence of Xanthomonas campestris pv. translucens on selected wheat genotypes. Plant Disease, 78: 612-615.

21-   Mirzaei, K. and Mirzaghaderi, G. 2015. Genetic diversity analysis of Iranian Nigella sativa L. Iandraces using SCoT markers and evaluation of adjusted polymorphism information content. Plant Genetic Resources, 15(1): 64-71.

22-   Niknejad Kazempour, M., Kheyrgoo, M., Pedramfar, H. and Rahimian, H. 2010. Isolation and identification of bacterial glum blotch and leaf blight on wheat (Triticum aestivum L.) in Iran. African Journal of Biotechnology, 9: 2860-2865.

23-   Toben, H., Mavridis, A. and Rudolph, K. 1991. Zum Vorkommen der basalen Spelzenfäule and Weizen und Gerste, hervorgerufen durch Pseudomonas syringae pv. atrofaciens, in West-Deutschland. Zeitschrift für P flanzenkrankheiten und P flanzenschutz. 98: 225–235.

24-   Valencia Botin, A. J., Mendoza Onofre L. E., Silva Rojas, H. V., Valadez Moctezuma, E., Cordova Tellez, L. and Villase Nor Mir, H. E. 2011. Effect of Pseudomonas syringae subsp. syringaeon yield and biomass distribution in wheat. Spanish Journal of Agricultural Research, 9: 1287–1297.

25-   Valencia Botin, A. J., Mendoza Onofre, L. E., Silva Rojas, H. V., Cordova, L., EspinosaVictoria, D., Valadez Moctezuma, E. and Villasenor Mir, H. E. 2007. Aggressiveness estimates and inoculation methods of pathogenic bacteria on seeds and seedlings of wheat 'Seri M82'. Revista Fitotecnia Mexicana, 30 (3): 255–259.

26-   Younis, R. A. A., Ismaeil O. M. and S.Soliman, S. 2008. Identification of Sex- specific DNA Markers for Date Palm (Phoenix dactylifera L.) Using RAPD and ISSR Techniques. Research Journal of Agriculture and Biological Sciences, 4: 278-284.