نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه زابل، دانشکده کشاورزی، گروه بیوتکنولوژی، زابل، ایران

2 استادیار گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی دانشگاه زابل

3 عضو هیئت‌علمی پژوهشکده کشاورزی دانشگاه زابل، زابل، ایران

چکیده

زنیان گیاهی علفی یک‌ساله متعلق به تیره چتریان، دارای اثرات ضد میکروبی و قارچ‌کش بوده که عمده اثرات مربوط به ترکیب تیمول است. القاء پلی‌پلوئیدی با استفاده از مواد شیمیایی جهش‌زا به‌عنوان یکی از روش‌های اصلاح گیاهان دارویی به‌منظور افزایش قابلیت تولید متابولیت‌های ثانویه مورد استفاده قرار گرفته است. بدین منظور جهت بررسی اثرات القاء پلی‌پلوئیدی بر زنیان سیستان آزمایشی به‌صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با استفاده از کلشی‌سین (۲/۰، ۵/۰، ۷۵/۰ و ۱ گرم در لیتر) و مدت زمان اعمال تیمار (۶، ۱۲ و ۱۸ ساعت) انجام و بعد از به دست آوردن بهترین غلظت و بهترین زمان اعمال تیمار، گیاهان تتراپلوئید به همراه شاهد کشت و برای صفات مورفولوژیک، فیزیولوژیک و بیوشیمیایی بررسی شدند. نتایج حاصل از تجزیه واریانس نشان داد که القاء تتراپلوئیدی بر صفات ارتفاع بوته، قطر ساقه، تعداد گل، تعداد شاخه جانبی، قطر ریشه، وزن تر، کلروفیل a و b، کارتنوئید، پراکسیداز، کاتالاز، پروتئین کل و فلاونوئید معنی‌دار بود. نتایج این تحقیق نشان داد که غلظت ۵/۰ گرم در لیتر و مدت زمان ۶ ساعت، بهترین تیمار جهت القاء پلوئیدی در گیاه زنیان است. تعداد کروموزوم‌های گیاهان دیپلوئید برابر با ۱۸ عدد و در گیاهان تتراپلوئید برابر با ۳۶ عدد بود بنابراین می‌توان بیان کرد که کلشی‌سین به‌طور مؤثری قابلیت القاء پلی‌پلوئیدی در گیاه زنیان را دارد. در مجموع نتایج این تحقیق نشان داد گیاهان تتراپلوئید شده از نظر صفات کمی مخصوصاً آنتوسیانین، پراکسیداز، کاتالاز، فلاونوئید و پروتئین کل نسبت به گیاهان دیپلوئید برتری داشتند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Effects of polyploidy induction on morphological, physiological and biochemical characteristics of Carum carvi L.

نویسندگان [English]

  • Raheleh Akbari 1
  • leila fahmideh 2
  • Bahman Fazeli-Nasab 3

1 Department of plant Breeding and Biotechnology, University of Zabol, Zabol,

2 Assistant Professor of Department of Plant Breeding and Biotechnology, University of Zabol,

3 Research Dep. Of Agronomy and Plant Breeding, Agricultural Research Institute, University of Zabol, Zabol, Iran.

چکیده [English]

Carum carvi L., an herbaceous plant, one year old, belongs to the Chadian dwarf, has antimicrobial and fungicidal effects, which is mainly due to the effects of thymol composition. The induction of polyploidy using mutagenic chemicals has been used as one of the methods for modifying medicinal plants to increase the production capacity of secondary metabolites. In order to investigate the effects of polyploidy induction on Sistan seedlings, a factorial in a completely randomized format using Colchicine (0.2, 0.5, 0.75 and 1 g/l) and treatment duration (6, 12 and 18 hours) and after obtaining the best concentration and best treatment time, tetraploidy plants and control plants were studied for morphological, physiological and biochemical traits. The results of analysis of variance showed that tetraploid induction was significant on plant height, stem diameter, flower number, number of lateral branches, root diameter, fresh weight, chlorophyll a and b, carotenoid, peroxidase, catalase, total protein and flavonoid. The results of this study showed that 0.5 g/l concentration and 6 hours duration is the best treatment for ploidy induction in the plant. The number of chromosomes of the diploid plants was 18 and in the tetraploid plants was 36 Therefore, it can be argued that colchicine is effective in inducing polyploidy in a plant. In general, the results of this study showed that tetraploidy plants excelled in terms of quantitative traits, especially anthocyanin, peroxidase, catalase, flavonoids and total protein relative to diploid plants.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Ajowan
  • antioxidant
  • Colchicine
  • Flavonoid
  • Polyploidy

اثرات القاء پلی­پلوئیدی بر روی خصوصیات موروفولوژیکی، فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه زنیان (Carum carvi L.)

راحله اکبری1، لیلا فهمیده1* و بهمن فاضلی نسب2

1ایران، زابل، دانشگاه زابل، دانشکده کشاورزی، گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی

2ایران،زابل، دانشگاه زابل، پژوهشکده کشاورزی، گروه پژوهشی زراعت و اصلاح نباتات

تاریخ دریافت: 13/8/95                تاریخ پذیرش: 11/9/96

چکیده

زنیان گیاهی علفی یک­ساله متعلق به تیره چتریان، دارای اثرات ضد میکروبی و قارچ­کش بوده که عمده اثرات مربوط به ترکیب تیمول است. القاء پلی‌پلوئیدی با استفاده از مواد شیمیایی جهش‌زا به‌عنوان یکی از روش‌های اصلاح گیاهان دارویی به‌منظور افزایش قابلیت تولید متابولیت‌های ثانویه مورد استفاده قرار گرفته است. بدین منظور جهت بررسی اثرات القاء پلی­پلوئیدی بر جمعیت زنیان شیراز آزمایشی به‌صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با استفاده از کلشی­سین (2/0، 5/0، 75/0 و ۱ گرم در لیتر) و مدت زمان اعمال تیمار (۶، ۱۲ و ۱۸ ساعت) انجام و بعد از به دست آوردن بهترین غلظت و بهترین زمان اعمال تیمار، گیاهان تتراپلوئید به همراه شاهد کشت و برای صفات مورفولوژیک، فیزیولوژیک و بیوشیمیایی بررسی شدند. نتایج حاصل از تجزیه واریانس نشان داد که القاء تتراپلوئیدی بر صفات ارتفاع بوته، قطر ساقه، تعداد گل، تعداد شاخه جانبی، قطر ریشه، وزن تر، کلروفیل a و b، کارتنوئید، پراکسیداز، کاتالاز، پروتئین کل و فلاونوئید معنی‌دار بود. نتایج این تحقیق نشان داد که غلظت 5/0 گرم در لیتر و مدت زمان ۶ ساعت، بهترین تیمار جهت القاء پلوئیدی در گیاه زنیان است. تعداد کروموزوم­های گیاهان دیپلوئید برابر با ۱۸ عدد و در گیاهان تتراپلوئید برابر با ۳۶ عدد بود بنابراین می‌توان بیان کرد که کلشی­سین به‌طور مؤثری قابلیت القاء پلی­پلوئیدی در گیاه زنیان را دارد. در مجموع نتایج این تحقیق نشان داد گیاهان تتراپلوئید شده از نظر صفات کمی مخصوصاً آنتوسیانین، پراکسیداز، کاتالاز، فلاونوئید و پروتئین کل نسبت به گیاهان دیپلوئید برتری داشتند.

واژه­های کلیدی: آنتی‌اکسیدان، پلی­پلوئیدی، زنیان، کلشی­سین، فلاونوئید

* نویسنده مسئول، تلفن:  05431232100،پست الکترونیکی:  l.fahmideh@uoz.ac.ir

مقدمه

 

زنیان (Carum copticum L.) متعلق به تیره چتریان (Apiaceae) گیاهی علفی، یک‌ساله و بی­کرک به ارتفاع ۳۰ تا ۹۰ سانتی­متر، پر شاخ و برگ (24) که به‌طور عمده در مناطق خشک و نیمه‌خشک شرق هند، بخش شمال غربی، مرکزی و شرقی ایران و همچنین در مصر رشد می­کند (44). ارزش دارویی گیاه زنیان وابسته به متابولیت­های ثانویه از جمله تیمول، پاراسیمن، آلفا پینن و کارواکرول است (5) که حدود ۵۰ درصد آن را تیمول تشکیل داده و دارای اثرات ضد میکروبی، ضد اسپاسم و قارچ­کش است (8). خاصیت ضد میکروبی زنیان مربوط به ترکیب تیمول و خاصیت ضد اسپاسم آن مربوط به اسانس فرار آن است (26).

القاء پلی‌پلوئیدی با استفاده از مواد شیمیایی جهش‌زا به‌عنوان یکی از روش‌های اصلاح گیاهان دارویی به‌منظور افزایش قابلیت تولید متابولیت‌های ثانویه مورد استفاده قرار می­گیرد (12). از میان روش‌های اصلاحی مهم‌ترین و کاربردی‌ترین روش‌ها شامل دورگ‌گیری، موتاسیون و پلی‌پلوئیدی است که روش پلی‌پلوئیدی به‌عنوان یک روش اصلاحی بیشتر مورد توجه قرار گرفته و در اصلاح گیاهان و قارچ‌ها استفاده شده است (15, 21). یکی از روش­های اصلاح گیاهان دارویی، انگیزش گیاهان تتراپلوئید از گیاهان دیپلوئید و منشأ آن­ها است که می­تواند در رشد و نمو و عملکرد و همچنین کمیت و کیفیت مواد مؤثره گیاهان دارویی تأثیر داشته باشد (20). دورگ­گیری بین و درون گونه­ای در گیاهان به بروز صفات مطلوب کمک نموده است، اما ژرم پلاسم­های موجود هنوز نمی­توانند جواب­گوی نیاز مصرف­کنندگان تنوع‌طلب باشند؛ بنابراین به نژاد گران و محققان همواره به دنبال منابع دیگر ایجاد تنوع هستند (12).

از آنجا که جهش­های خود به خودی به‌ندرت اتفاق می‍افتند، تولید جهش یافته­های القایی راه مناسبی برای ایجاد تنوع در گیاهان محسوب می­شود، لذا دست ورزی سطح پلوئیدی امکان برنامه­های به­نژادی به‌منظور تولید واریته­های برتر در بسیاری از گونه­های گیاهی را موفقیت‌آمیز نموده است (31). گیاهان تتراپلوئید نسبت به انواع دیپلوئید خود به‌طور معمول رشد رویشی بیشتر، ساقه­های درشت‌تر، برگ­های کلفت­تر، گل­های بزرگ‌تر و پایداری طولانی­تر دارند (15). برای این منظور از مواد مختلفی مانند کلشی­سین و اوریزالین برای القای پلی­پلوئیدی استفاده شده است (22). برای القای پلی­پلوئیدی از بخش­های مختلف گیاه مانند بذور در حال جوانه­زنی، غنچه­های بسیار جوان یا مناطق مریستمی نوک جوانه­ها می­توان استفاده کرد (1).

کلشی‌سین یک ترکیب آلکالوئیدی است که از غده گل حسرت پائیزه برای اولین بار توسط Zeisle در سال ۱۸۸۳ استخراج و دارای ساختار سه‌حلقه‌ای با فرمول C22H25O6N است (37, 46) که مانع از تشکیل شدن دوک در هنگام تقسیم سلولی شده و کروموزوم‌ها را در مرحله متافاز متوقف می‌کند و مانع از وقوع آنافاز می‌شود، در نتیجه باعث دو برابر شدن تعداد کروموزوم‌ها در سلول می­شود. تیمار با کلشی‌سین یکی از رایج‌ترین روش‌هایی است که برای القای پلی‌پلوئیدی در گیاهان از آن استفاده می­شود و نسبت به بقیه مواد جهش‌زا تغییرات مورفولوژیک بیشتری ایجاد می‌کند (44).

در موارد زیادی گزارش شده است که گیاهان تتراپلوئید گوشتی­تر بوده و میزان آب بیشتری دارند به همین خاطر وزن تر آن­ها بیشتر از نمونه­های دیپلوئید است(54). برای مثال در بررسی امکان القاء پلوئیدی در بنفشه آفریقایی ارزیابی صفات ظاهری نشان داد گیاهان دیپلوئید و تتراپلوئید از نظر خصوصیات مورفولوژیکی رویشی و صفات زایشی با یکدیگر متفاوت هستند به‌طوری‌که گیاهچه­های تیمار شده با ماده­ی القایی، پا کوتاه­تر، برگ­های پهن­تر و ضخیم­تر، دم برگ قطورتر، پر گل­تر، پر برگ­تر و دارای گل­های درشت­تر بودند که علت این تفاوت­ها در مقدار هورمون اکسین که مسئول رشد می­باشد است (7). در بررسی کشت بافت و القاء پلی­پلوئیدی کالوس گیاه Morinda officinalis بیشترین میزان القاء پلی­پلوئیدی از تیمار ۵۰۰ میلی‌گرم در لیتر کلشی‌سین به مدت ۵ روز به‌دست‌آمده و در مقایسه با گیاهان پلی­پلوئید و دیپلوئید، رشد ریشه در پلی­پلوئیدها افزایش یافته است (36). در تحقیقی  به‌منظور بررسی تأثیر تیمار کلشی‌سین بر گیاه شنبلیله گزارش شد که غلظت و مدت زمان تیمار کلشی­سین و اثر متقابل آن‌ها به‌صورت معنی­داری بر اتو تتراپلوئید شدن شنبلیله تأثیر داشت و غلظت 5/0 گرم در لیتر با مدت تیمار 12 ساعت بهترین نتیجه را داشت همچنین نتایج نشان داد که تغییر سطح پلوئیدی با کلشی­سین از دیپلوئیدی به تتراپلوئیدی به‌صورت معنی­داری بر کلیه صفات مورفولوژیکی و فیزیولوژیکی شنبلیله (به‌جز وزن تر و خشک گیاه ) اثر داشت (11).

بر این اساس هدف از تحقیق حاضر مطالعه اثر ماده موتاژن

کلشی­سین بر القاء پلی­پلوئیدی و خواص سیتوژنتیکی (تعداد کروموزوم)، مورفولوژیکی (ارتفاع بوته، قطر ساقه اصلی و فرعی، تعداد گل، تعداد شاخه جانبی، ارتفاع گیاه، قطر ریشه، وزن تر، طول برگ و عرض برگ) و آنتی‌اکسیدانی (پروتئین کل، کاتالاز، پراکسیداز، فنل کل، فلاونوئید، آنتوسیانین، کارتنوئید، کلروفیل) گیاه زنیان در شرایط کشت گلخانه‌ای انجام شد.

مواد و روشها

ﺑﺬر جمعیت شیراز ﮔﻴﺎه زنیان از از ﺷﺮﻛﺖ ﭘﺎﻛﺎن ﺑﺬر اﺻﻔﻬﺎن تهیه و جهت ﻣﻄﺎﻟﻌﺎت ﺳﻴﺘﻮژﻧﺘﻴﻜﻲ در سال 1396 در پژوهشکده زیست‌فناوری دانشگاه زابل مورد ارزیابی قرار گرفت. به‌منظور به دست آوردن ﻣﺮﻳﺴﺘﻢ اﻧﺘﻬﺎﻳﻲ رﻳﺸﻪ، ﺑﺬرﻫﺎ ﺑﻪ ﻇﺮوف ﭘﺘﺮی­دﻳﺶ ﺣﺎوی ﻛﺎﻏﺬ ﺻﺎﻓﻲ ﻣﺮﻃﻮب ﻣﻨﺘﻘﻞ و ﭘﺲ از اﻓﺰودن آب ﻣﻘﻄﺮ، در ژرمیناتور تحت شرایط کنترل رطوبت ۳۸ درصد، دمای ۲۴ درجه سانتی­گراد و ­نور ۱۴ ساعت قرار داده شدند. پس از چهار روز بذرهای جوانه زده با ریشه­هایی به طول 5/1 تا ۲ سانتی‌متر آماده تیمار شدن بودند. برای تیمار کردن از محلول کلشی­سین با غلظت­های 2/0، 5/0، 75/0 و ۱ گرم در لیتر در سه مدت زمان ۶، ۱۲ و ۱۸ ساعت استفاده شد (6).

به‌منظور مشاهده و شمارش کروموزوم­ها، به ترتیب مراحل پیش تیمار از محلول (002/0 میکرو مولار) ۸- هیدروکسی کینولین به مدت ۵ ساعت، تثبیت (محلول کارنوی-۲ مرکب از اتانول ۹۶ درصد، کلروفرم ۱۰ درصد و اسید استیک ۳۰ درصد به نسبت 1: 3: 6 به مدت ۲۴ ساعت در دمای اتاق، هیدرولیز اسید کلریدریک 1N به مدت ۲۰ دقیقه و سپس رنگ­آمیزی ریشه­ها با استو اورسئین برای مشاهدات میکروسکوپی استفاده شد. قسمت انتهایی نوک ریشه با یک قطره اسید استیک ٪۴۵ روی اسلاید گذاشته و لامل روی آن گذاشته می­شود تا ضمن خروج رنگ­های اضافی سلول­های مریستمی نیز در یک سطح پخش شوند (34).

عکس‌برداری از نمونه­های تهیه شده با استفاده از روش تحلیل تصویری با بزرگنمایی ۱۸۷۷ برابر انجام شد، به‌طوری‌که تصاویر کروموزومی از طریق دوربین رنگی که بر روی میکروسکوپ Olympus نصب شده بود به مانیتور منتقل شد و ضبط گردید. تصاویر تهیه شده به برنامه فتوشاپ نسخه 04/1 منتقل شد؛ و سپس برای بررسی صفات مورفولوژی (از قبیل ارتفاع بوته، طول و عرض برگ، قطر ساقه اصلی و فرعی، تعداد شاخه جانبی، قطر ریشه، تعداد گل وزن تر و وزن خشک در هر بوته نسبت به گیاهان دیپلوئید) فیزیولوژیکی و آنتی‌اکسیدانی (میزان کلروفیل a، کلروفیل b، کارتنوئید، آسکوربات پراکسیداز، کاتالاز، محتوای آنتوسیانین، فنل کل، پروتئین کل و فلاونوئید) گیاه زنیان، بذور تیمار شده به گلدان­های حاوی کوکوپیت، خاک‌برگ و خاک معمولی منطقه منتقل شدند. در هر گلدان پنج بذر قرار داده شد. گیاهان با فاصله دو روز آبیاری شدند و در شرایط گلخانه رشد و نمو یافتند.

تهیه بافر Ice–Cold :  این محلول شامل؛ 2000 میکرو لیتر محلول بافر پتاسیم فسفات 100 میلی مولار با 7 pH= (برای تهیه محلول پتاسیم فسفات از دو نمک K2HPO4 (جرم حجمی 2/174) و KH2PO4 (جرم حجمی 086/136) استفاده و به این صورت که ابتدا محلول 1 مولار از هر کدام از این نمک­ها تهیه شد. سپس 10 سی‌سی از هر کدام برداشته، مخلوط و به حجم 100 سی‌سی رسانده شد و pH آن روی 7 تنظیم شد.)، 20 میکرو لیتر EDTA 0.1 mM و سپس 1980 میکرو لیتر آب دو بار تقطیر بود (18).

استخراج عصاره آنزیمی: جهت اندازه‌گیری آنزیم­ها، 1/0 گرم از بافت سبز برگ برداشت و با 4 سی­سی بافر Ice – cold در هاون سرد کاملاً ساییده و به‌صورت همگن درآورده شدند. مخلوط همگن از کاغذ صافی عبور و به مدت 15 دقیقه در 16000 دور با استفاده از دستگاه سانتریفیوژ یخچال دار سانتریفیوژ شدند. سپس فاز بالایی به‌عنوان عصاره آنزیمی (پروتئینی) برای سنجش فعالیت آنزیمی استفاده گردید (19).

آنزیم کاتالاز: به این منظور مخلوط واکنش شامل 750 میکرو لیتر عصاره آنزیمی و ۱۵۰۰ میکرو لیتر آب دو بار تقطیر به کووت کوارتز اضافه شد و به هنگام اندازه­گیری آنزیم، ۷۵۰ میکرو لیتر پراکسید هیدروژن ۷۰ میلی­مولار به مخلوط واکنش اضافه گردید. تغییرات جذب در ۲۴۰ نانومتر به مدت ۶۰ ثانیه در ۲۵ درجه سانتی‌گراد با استفاده از اسپکتروفتومتر قرائت شد. تغییرات جذب به‌دست‌آمده در زمان یک دقیقه، به ضریب خاموشی مولی این واکنش که برابر mM-1cm-136 است تقسیم شد و فعالیت آنزیمی بر حسب واحد در گرم وزن‌تر بیان شد (10, 48).

آنزیم پراکسیداز (PX): جهت اندازه‌گیری فعالیت آنزیم پراکسیداز، سه میلی­لیتر مخلوط واکنش شامل؛ 2390 میکرو لیتر بافر فسفات سدیم ۵۰ میلی مولار (5/6PH=)؛ 240 میکرو لیتر گایاکول 1 درصد و 240 میکرو لیتر پراکسید هیدروژن 3/0% و 130 میکرو لیتر عصاره آنزیمی استفاده شد. فعالیت آنزیم پراکسیداز بر اساس میزان اکسید شدن گایاکول در طول‌موج ۴۷۰ نانومتر و با استفاده از ضریب خاموشی mM-1cm-1 26/6 تعیین گردید (45).

اندازه‌گیری میزان فنل کل و فلاونوئید: 1/0 گرم اندام هوایی در 5 میلی‌لیتر اتانول 95 درصد سائیده و به مدت 72-24 ساعت در تاریکی به‌منظور سنجش ترکیبات فنلی کل و فلاونوئید کل نگه‌داری و سپس در 4000 دور به مدت 20 دقیق سانتریفیوژ شدند.

برای سنجش میزان فنل کل به یک میلی‌لیتر محلول رویی سانتریفیوژ شده، یک میلی‌لیتر اتانول 95 درصد اضافه گردید و با آب مقطر، حجم محلول به 5 میلی‌لیتر رسانده شد. سپس 5/0 میلی‌لیتر معرف فولین 50 درصد و یک میلی‌لیتر کربنات سدیم 5 درصد به آن اضافه گردید. مخلوط حاصل به مدت یک ساعت در تاریکی نگهداری شد و سپس جذب هر نمونه در طول‌موج 725 نانومتر خوانده شد و با استفاده از منحنی استاندارد گالیک اسید (شکل 1 بخش A)، غلظت ترکیبات فنلی کل برحسب میلی‌گرم در گرم وزن‌تر محاسبه گردید. رسم منحنی استاندارد فنل کل در غلظت‌های 0، 50، 100، 250 و 350 میلی‌گرم در لیتر صورت گرفت (40).

برای سنجش میزان فلاونوئید کل به 500 میکرو لیتر از هر عصاره­ 5/1 میلی­لیتر متانول (80%)، 100 میکرو لیتر محلول آلومینیوم کلراید (10%)، 100 میکرو لیتر محلول استات پتاسیم 1 مولار و 8/2 میلی­لیتر آب مقطر اضافه شد. جذب مخلوط بعد از گذشت 40 دقیقه در طول‌موج 415 نانومتر نسبت به بلانک اندازه­گیری گردید. بلانک حاوی تمام ترکیبات ذکر شده در بالا بود اما بجای عصاره، همان حجم متانول 80% به آن اضافه‌شده بود. برای رسم منحنی استاندارد از کوئرستین استفاده شد (شکل 1 بخش B). میزان فلاونوئید کل عصاره­ها بر اساس میلی­گرم معادل کوئرستین بر گرم وزن خشک گیاه گزارش شد (14).

تهیه معرف بیوره: به‌منظور تهیه معرف بیوره، 1/0 گرم کوماسی بریلیانت بلو G250 در 50 میلی‌لیتر اتانول 96 درجه به مدت یک ساعت با کمک همزن مغناطیسی (مگنت) در تاریکی به‌خوبی حل گردد. سپس 100 میلی‌لیتر اسید فسفریک 85 درصد قطره‌قطره به آن افزوده شود. در پایان حجم کل محلول به کمک آب مقطر به یک لیتر رسانده شود محلول حاصل با کاغذ صافی واتمن شماره یک صاف گردد (18).

سنجش پروتئین استاندارد و ارزیابی میزان پروتئین کل: برای ارزیابی و تعیین میزان فعالیت آنزیم، لازم است ارزیابی دقیقی از میزان کل پروتئین موجود در عصاره مورد آزمایش، صورت گیرد. بدین منظور از روش بردفورد (13) به شرح زیر استفاده گردید. یک گرم بافت تر در یک ‌ها‌ون چینی محتوی سه میلی‌لیتر بافر فسفات 50 میلی‌مولار با 2/7 pH سائیده شد. عصاره حاصل به مدت 15 دقیقه در سانتریفیوژ یخچال دار در g 14000 و دمای 4 درجه سانتی‌گراد قرار گرفت. سپس مقدار 1/0 میلی‌لیتر عصاره پروتئینی (محلول رویی) به لوله‌ها‌ی آزمایش منتقل و پنج میلی‌لیتر معرف بیوره ‌افزوده و سریعاً ورتکس شد. پس از دو دقیقه و قبل از یک ساعت جذب آن‌ها ‌با دستگاه ‌اسپکتروفتومتر در طول‌موج ۵9۵ نانومتر خوانده شد و غلظت پروتئین با استفاده از منحنی استاندارد آلبومین گاوی (شکل 1 بخش C) محاسبه و بر حسب میلی‌گرم بر گرم وزن‌تر محاسبه گردید.

 

 

شکل 1- منحنی استاندارد؛ گالیک اسید جهت اندازه‌گیری مقادیر فنل (A)؛ کوئرستین جهت اندازه‌گیری مقادیر فلاونوئید (B)؛ آلبومین سرم گاوی جهت اندازه‌گیری مقادیر پروتئین کل (C)

 

اندازه­گیری آنتوسیانین: جهت اندازه­گیری آنتوسیانین 1/0 گرم از بافت برگی تازه را در هاون چینی با ۱۰ میلی­لیتر متانول اسیدی (متانول خالص و اسید کلریدریک خالص به نسبت حجمی 1: 9) کاملاً ساییده و عصاره در لوله آزمایش سرپیچ­دار ریخته شد و به مدت ۱۰ دقیقه با سرعت ۴۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفیوژ و جذب محلول رویی در طول‌موج nm۵۵۰ اندازه­گیری شد. غلظت با استفاده از فرمول زیر و با در نظر گرفتن ضریب خاموشی (ε) ۳۳۰۰۰ سانتی­متر بر مول و نتایج بر حسب میکرو مول بر گرم وزن تر ارائه شد (41).

اندازه‌گیری ﻛﻠﺮوﻓﻴﻞ و کارتنوئید: جهت اندازه‌گیری ﻛﻠﺮوﻓﻴﻞ و کارتنوئید ﻣﻘـﺪار 125/0 ﮔﺮم از ﺑﺎﻓﺖ ﺗﺮ برگ ﺑﺎ ۵ میلی‌لیتر اﺳﺘﻮن ۸۰ درﺻﺪ ﺧﺮد ﺷﺪ. ﻣﺨﻠﻮط به‌دست‌آمده ﺑﻪ ﻣﺪت ۱۰ دﻗﻴﻘﻪ در ۶۰۰۰ دور در دﻗﻴﻘﻪ ﺳﺎﻧﺘﺮﻳﻔﻴﻮژ ﮔﺮدﻳﺪ و در ﻧﻬﺎﻳﺖ، ﻗﺴﻤﺖ ﺑﺎﻻﻳﻲ ﻋﺼﺎره ﺟﺪا و ﺣﺠﻢ آن ﺑﻪ ۸ میلی‌لیتر رﺳﺎﻧﺪه ﺷﺪ. اندازه‌گیری ﺑﺎ اﺳﺘﻔﺎده از روش اﺳـﭙﻜﺘﺮوﻓﺘﻮﻣﺘﺮی اﻧﺠﺎم ﮔﺮﻓﺖ و برای کلروفیل a، b و کارتنوئید به ترتیب در طول‌موج‌های ۶۶۳ و ۶۴۵ و ۴۷۰ نانومتر خوانده شد. جهت تنظیم دستگاه، از استون ۸۰ درصد به‌عنوان کنترل استفاده شد. غلظت رنگیزه با استفاده از رابطه­های صفحه بعد محاسبه گردید (33).

 

 

 

 

V ضخامت کووت می‌باشد

 

تجزیه ‌وتحلیل آماری: داده­های حاصله از این تحقیق به‌صورت فاکتوریل بر پایه طرح کاملاً تصادفی با 3 تکرار با استفاده از نرم‌افزارهای SAS (نسخه 1/9) و Excel ارزیابی شدند. داده­های حاصله از بررسی­های کروموزومی، داده‌های مورفولوژیکی و فیزیولوژیکی تجزیه آماری شدند و از نرم‌افزار جهت رسم نمودار استفاده شد. با توجه به اینکه اکثر داده­های حاصل از شمارش پلی‌پلوئیدی به‌دست‌آمده در این تحقیق بر اساس درصد بودند، برای اینکه داده­ها دارای توزیع نرمال باشند، از تبدیل داده جذری=X1 استفاده شد. در مواردی هم که صفر وجود داشت از تبدیل=X1 استفاده گردید. مقایسه میانگین نیز بر اساس حداقل تفاوت معنی‌داری (LSD) انجام شد.

نتایج و بحث

نتایج پلی­پلوئیدی حاصل از تیمار با کلشی­سین: پس از مطالعه و عکس‌برداری از اسلاید نمونه شاهد، عدد کروموزومی در زنیان ۱۸=n۲ به دست آمد (شکل A2) که مشابه با نتایج تعدادی از محققان می­باشد (17, 44). نتایج حاصل از بررسی سطح پلوئیدی گیاه تیمار شده با سطوح مختلف کلشی­سین در سه زمان مختلف با استفاده از شمارش کروموزومی بررسی شد (شکل B2).

نتایج حاصل از تجزیه واریانس نشان داد که غلظت­های مختلف کلشی­سین و مدت زمان اعمال تیمار بر درصد احتمالی گیاهان تتراپلوئید زنیان شیراز معنی­دار بود (جدول ۱). نتایج مقایسه میانگین داده‌ها نشان داد که بیشترین میزان تترا­پلوئیدی برای جمعیت شیراز مورد مطالعه، در غلظت 5/0 گرم بر لیتر در مدت زمان ۶ ساعت مشاهده و سایر غلظت­های پایین­تر و بالاتر تأثیر کمتری بر این فاکتور داشتند (شکل 3)در تحقیقی (38) نیز بهترین زمان اعمال تیمار (6 ساعت) و بهترین غلظت کلشی‌سین (5/0 گرم) جهت القاء پلی­پلوئیدی در ریحان ذکر شده است که با تحقیق حاضر مشابهت داشت. همچنین در تحقیق دیگری (11) بهترین غلظت کلشی‌سین (5/0 گرم در لیتر) به‌صورت معنی­داری بر اتو تتراپلوئید شدن شنبلیله تأثیر داشت که با تحقیق حاضر مشابهت داشت. همچنین در سایر تحقیقات نیز غلظت مؤثر برای القای پلوئیدی را در گیاهان مختلف بین 0006/0 تا 3 درصد گزارش کرده‌اند و غلظت مؤثر بسته به نوع گیاه، روش تیمار و مدت زمان تیمار متفاوت می‌باشد (17). در تحقیقات دیگر نیز غلظت مؤثر برای القای پلوئیدی را در گیاهان مختلف بین 0006/0 تا 3 درصد گزارش کرده‌اند و غلظت مؤثر بسته به نوع گیاه، روش تیمار و مدت زمان تیمار متفاوت می‌باشد (23).

ارزیابی ویژگی­های مورفولوژیک گیاه زنیان: نتایج حاصل از تجزیه واریانس تحقیق حاضر نشان داد که تأثیر تتراپلوئیدی بر صفات مورفولوژیک و فیزیولوژیک گیاه زنیان بررسی و مشخص شد که بر صفات تعداد گل، تعداد شاخه جانبی، ارتفاع گیاه، تعداد برگ، قطر ریشه و وزن تر و خشک بوته معنی‌دار اما بر صفات قطر ساقه اصلی و فرعی، طول و عرض برگ بی‌تفاوت بوده است (جدول 2).

مقایسه میانگین داده‌ها نشان داد که تعداد گل در گیاه تتراپلوئید نسبت به دیپلوئید کمتر شده است (جدول 3). در گیاه ریحان گزارش شده (28) تعداد گل در گیاهان تتراپلوئیدی که با دو برابر کردن کروموزوم­های گیاهان دیپلوئید به‌دست‌آمده بود، کاهش یافته بود که با تحقیق حاضر مشابهت داشت اما در برخی منابع (25) نیز ذکر شده مرحله گلدهی در گیاهان پلی­پلوئید در مقایسه با انواع دیپلوئید دیرتر آغاز می‌شود اما طول مدت گلدهی در آن­ها بیشتر است که در تحقیق حاضر این موضوع بررسی نشد.

 

 

 شکل 2- تصاویر کروموزومی قبل و بعد از تیمار با کلشی­سین: A؛ دیپلوئید و B؛ تتراپلوئید

 

جدول ۱- نتایج تجزیه واریانس القاء پلی­پلوئیدی در گیاه زنیان پس از تیمار با کلشی­سین در زمان‌های مختلف

منابع تغییرات

درصد پلی­پلوئیدی

زمان

**63/23

غلظت

**60/17

زمان×غلظت

**64/8

خطا

1147/0

ضریب تغییرات

30/10

ns، * و **: به ترتیب عدم اختلاف معنی‌دار، اختلاف معنی‌دار در سطح 5 و 1 درصد

 

شکل 3- اثر متقابل غلظت و مدت زمان تیمار کلشی­سین بر درصد پلی‌پلوئیدی گیاه زنیان

حروف مشابه برای هر تیمار نشان‌دهنده تفاوت غیر معنی‌دار بین آن‌هاست

(با توجه به کم بودن برخی اعداد و عدم نمایش آن‌ها در نمودار لذا سعی شد از تمامی اعداد لگاریتم بر مبنای 2 گرفته شود  ؛ x همان عدد اصلی می‌باشد)

 

مقایسه میانگین داده‌ها نشان داد که تعداد شاخه جانبی و تعداد برگ در گیاه تتراپلوئید نسبت به دیپلوئید بیشتر شده است (جدول 3). افزایش تعداد شاخه فرعی در اثر افزایش سطوح پلوئیدی در گیاه Colophospermum mopan (53) و انگیزش پلوئیدی سبب افزایش تعداد برگ‌های بیشتر، دفرمه، قطور و به رنگ سبز تیره در گیاه دارویی بنگدانه شده است (25).

بر اساس نتایج مقایسه میانگین داده­ها، تیمار با کلشی­سین روی ارتفاع گیاهتأثیر گذار و با افزایش سطح پلوئیدی ارتفاع گیاه افزایش یافت (جدول 3). تأثیر پلی­پلوئیدی بر ارتفاع گیاهان متفاوت است به‌طوری‌که در برخی موارد انگیزش پلی­پلوئیدی در گیاهان ارتفاع بوته را افزایش(27)، اما در برخی موارد سبب کاهش ارتفاع گیاهان شده است (30, 38). بررسی اثر کلشی­سین روی گیاه مختلف نشان داده که افزایش ارتفاع در گیاهان تتراپلوئید نسبت به دیپلوئید می‌تواند به دلیل افزایش اندازه سلول‌ها باشد که این افزایش ارتفاع بسته به نوع گیاه و رقم نیز متفاوت است (35, 43). در کل القای پلی­پلوئیدی ضمن افزایش میزان DNA الگو، با تحریک مکانیسم­هایی در سلول، نسخه­برداری و ترجمه را تحت تأثیر قرار داده و با افزایش یا کاهش بیان و یا حتی خاموشی ژن­ها، بسیاری از صفات فیزیولوژیک و مورفولوژیک گیاه را تغییر می­دهد (2).

مقایسه میانگین داده‌ها نشان داد که برگ­های گیاهان زنیان تتراپلوئید از نظر اندازه دارای طول و عرض بیشتری نسبت به گیاهان زنیان دیپلوئید بودند در حالیکه اختلاف از نظر آماری معنی‌دار نبود (جدول 3) که با نتایج ارائه‌شده توسط چن و همکاران (16) در گیاه چای مشابهت داشت.

در این پژوهش با افزایش پلی­پلوئیدی، وزن‌تر و خشک بوته گیاهان تتراپلوئید در سطح بالاتر از گیاهان دیپلوئید قرار گرفت (جدول 3). افزایش وزن تر و خشک گیاهان تتراپلوئید نسبت به گروه شاهد می­تواند به دلیل دو یا سه شاخه بودن درصد بالایی از گیاهان تتراپلوئید، بیشتر بودن میانگین سطح و ضخامت برگ­ها باشد که باعث افزایش مواد ذخیره­ای بالاتر در برگ­ها باشد (29). در تحقیقی (30) نیز افزایش سطح پلوئیدی به‌طور معنی­داری وزن‌تر و خشک اندام هوایی در گیاه تتراپلوئید پراونش افزایش داده است.

مقایسه میانگین داده‌ها نشان داد که قطر ریشه و قطر ساقه اصلی گیاهان زنیان تتراپلوئید از نظر اندازه دارای ضخامت بیشتری نسبت به گیاهان زنیان دیپلوئید بودند در حالیکه اختلاف از نظر آماری معنی‌دار نبود (جدول 3)، که با نتایج ارائه‌شده برای قطر ساقه اصلی در اثر افزایش سطح پلوئیدی بر گیاه­چه پروانه (Colophospermum mopane) (53) و قطر ریشه (36, 49) مشابهت داشت.

 

 

جدول ۲- نتایج تجزیه واریانس صفات مورفولوژیک گیاه زنیان پس از تیمار با کلشی­سین

قطر ساقه اصلی

قطر ریشه

تعداد برگ

ارتفاع گیاه

تعداد شاخه جانبی

تعداد گل

df

منابع تغییر

ns 015/0

** 281/0

*۲۴

**6/640

*66/16

*1/2360

۱

تیمار

0083/0

011/0

3/19

16/2

16/3

1/429

۴

خطا

35/13

07/15

6/11

01/4

26/14

1/10

-

ضریب تغییرات

 

 وزن خشک

وزن تر

عرض برگ

طول برگ

قطر ساقه فرعی

df

منابع تغییر

 

* 033/0

**417/0

ns 0816/0

ns 135/0

ns 006/0

۱

تیمار

 

007/0

010/0

288/0

37/0

0016/0

۴

خطا

 

91/8

07/6

02/16

61/10

42/9

-

ضریب تغییرات

ns، * و **: به ترتیب عدم اختلاف معنی‌دار، اختلاف معنی‌دار در سطح 5 و 1 درصد

جدول ۳- مقایسه میانگین صفات مورفولوژیک گیاهان دیپلوئید و تتراپلوئید

قطر ساقه اصلی (mm)

قطر ریشه

(mm)

تعداد برگ

ارتفاع گیاه (mm)

تعداد شاخه جانبی

تعداد گل

غلظت کلشی­سین

a011/0±633/0

b018/0±5/0

b29/2±33/18

b58/3±26

b42/1±66/5

a16/7±67/122

شاهد

a013/0±733/0

a017/0±93/0

a44/3±33/22

a66/3±۴۷

a84/1±۹

b95/6±۸۳

5/0 گرم بر لیتر

 

 وزن خشک (g)

وزن تر (g)

عرض برگ (cm)

طول برگ (cm)

قطر ساقه فرعی (mm)

غلظت کلشی­سین

 

b021/0±86/0

b21/0±40/1

a94/0±23/3

a61/0±8/2

a09/0±40/0

شاهد

 

a028/0±016/1

a19/0±92/1

a98/0±46/3

a62/0±10/3

a092/0±46/0

5/0 گرم بر لیتر

حروف مشابه برای هر صفت بین نمونه شاهد و تیمار داده شده نشان‌دهنده تفاوت غیر معنی‌دار بین آن‌هاست

 

 

بررسی اثر تغییر سطح پلوئیدی بر خصوصیات بیوشیمیایی: تأثیر تتراپلوئیدی ناشی از تأثیر غلظت­های مختلف کلشی­سین و مدت زمان اعمال تیمار بر صفات فیتوشیمیایی گیاه زنیان بررسی شده و مشخص گردید که بر صفات کلروفیل a و b، کارتنوئید، پراکسیداز، کاتالاز، پروتئین کل و فلاونوئید معنی‌دار اما بر صفات آنتوسیانین و فنل کل غیر معنی‌دار بوده است (جدول 4).

نتایج مقایسه میانگین داده­ها نشان داد (جدول 5) که میزان کلروفیل a در برگ نمونه­­های تترا­پلوئید (02/191 میلی­گرم در گرم وزن تر برگ) نسبت به نمونه­های دیپلوئید (1/122 میلی­گرم در گرم وزن تر برگ) بیشتر و همچنین میزان کلروفیل b در برگ نمونه­های تترا­پلوئید (7/243میلی­گرم در گرم وزن تر برگ) نسبت به نمونه­های دیپلوئید (5/118میلی­گرم در وزن تر برگ) بیشتر بود. ازآنجاکه فرض بر آن است با دو برابر شدن ژنوم فعالیت متابولیکی، سنتز rRNA و نسخه­برداری افزایش می­یابد این افزایش می­تواند بر میزان تنفس، فعالیت ژنی، تنوع و میزان فعالیت آنزیم­ها و انتقال الکترون در فتوسنتز تأثیر داشته باشد (25, 32, 42). گیاهان تتراپلوئید و دیپلوئید Acacia mearnsii از نظر میزان کلروفیل a و b با یکدیگر مقایسه شدند، مشاهده شد که میزان کلروفیل در گیاهان تتراپلوئید به‌طور معنی­داری بیشتر از گیاهان دیپلوئید بود (32).

بر اساس نتایج حاصله، در گیاه زنیان، افزایش سطح پلوئیدی بر میزان فنل کل گیاهان تیمار شده با کلشی­سین نسبت به گیاهان شاهد بی‌معنی اما بر میزان فلاونوئید مؤثر (جدول 5) و مشخص شد که میزان فلاونوئید در برگ نمونه­­های تترا­پلوئید (86/2 میلی­گرم در گرم وزن تر برگ) نسبت به نمونه­های دیپلوئید (34/1 میلی­گرم در گرم وزن تر برگ) بیشتر بود. در گل اطلسی القاء پلی­پلوئیدی سبب افزایش دو نوع فلاونول (46) و در گیاهان زرین تیمار شده با کلشی‌سین میزان فلاونوئید بیشتری نسبت به گیاهان شاهد داشتند(9) و همچنین القاء پلی­پلوئیدی در گیاه لیمو ترش (3) تاثیری بر میزان فنل کل نداشته است که با نتایج این آزمایش مشابهت داشت. اما در کل میتوان استدلال کرد که گیاه مورد تیمار و گونه آن در میزان تغییر متابولیت­های ثانویه در اثر القای پلوئیدی مؤثر است. افزایش تعداد کروموزوم‌ها و مقدار ژن­های وابسته می­تواند در بعضی موارد بیان و غلظت متابولیت­های ثانویه و مواد شیمیایی دفاعی را افزایش دهد، با این حال این مورد در همه گیاهان صادق نیست و ممکن است در بعضی موارد ارتباط مشخصی بین مقدار ژن، خاموش شدن ژن و بیان متابولیت­های ثانویه وجود نداشته باشد (51).

تجزیه‌وتحلیل داده­های حاصل از اثر تیمار با کلشی­سین بر میزان فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی زنیان نشان داد که با افزایش سطح پلوئیدی میزان فعالیت کاتالاز و پراکسیداز افزایش یافت (جدول 5). گزارش شده که روش دو برابر کردن کروموزوم­ها می­تواند با افزایش فعالیت ژنی و در نتیجه افزایش تنوع آنزیم­ها، افزایش نسبت فتوسنتز، کاهش میزان تعرق و سرعت رشد کمتر گیاه باعث مقاومت بیشتر نسبت به تنش­های تغذیه­ای و شرایط محیطی گردد (50). در سورگوم آنزیم­های آنتی­اکسیدانی در گیاهان تتراپلوئید افزایش معنی­داری نسبت به گیاهان دیپلوئید داشته‌اند (56).

نتایج نشان داد که با افزایش سطح پلوئیدی میزان پروتئین کل (57/1 میلی­گرم در گرم ماده تر) در زنیان افزایش اما میزان کارتنوئید کاهش یافته است (جدول 5). افزایش اندازه سلول­ها در نتیجه افزایش سطح پلوئیدی می­تواند به‌عنوان عاملی جهت افزایش مواد ذخیره­ای در سلول تلقی شود (42). نتایج تحقیقات انجام شده نشان داد که محتوای پروتئینی در آندوسپرم لاین­های اتوتتراپلوئید برنج خیلی بیشتر از انواع دیپلوئید آن بود (55) که با تحقیق حاضر مشابهت اما ذکر شده که گیاهان تیمار شده با کلشی­سین میزان کارتنوئید بیشتری نسبت به گیاهان دیپلوئید داشتند(52) که با تحقیق حاضر متفاوت و می‌تواند به این دلیل باشد که کارتنوئید تحت تأثیر عواملی از جمله دما، شدت نور و میزان آب در دسترس در طول فصل رشد قرار می‌گیرد(4, 47). در تحقیقی (39) گزارش شده کارتنوئید در جلبک سبز تحت تاثیر شوری بوده و همبستگی مثبتی با شوری داشته است.

 

 

جدول ۴- نتایج تجزیه واریانس صفات فیزیولوژیک گیاه زنیان پس از تیمار با کلشی­سین

پراکسیداز

آنتوسیانین

کارتنوئید

کلروفیل b

کلروفیل a

df

منابع تغییر

**4/2

ns66/2

**6/3441

**7/13493

**۹9/7113

1

تیمار

33/1

06/5

39/13

99/7

9/36

4

خطا

64/14

13/12

31/15

۵۶/1

۸۷/3

-

ضریب تغییرات

 

فلاونوئید

پروتئین کل

فنل کل

کاتالاز

df

منابع تغییر

 

*47/3

**23/0

ns005/0

**66/1

1

تیمار

 

67/2

0023/0

0036/0

66/6

4

خطا

 

67/7

۳۷/3

۴۲/2

42/9

 

ضریب تغییرات

ns، * و **: به ترتیب عدم اختلاف معنی‌دار، اختلاف معنی‌دار در سطح 5 و 1 درصد

جدول ۵- مقایسه میانگین صفات فیزیولوژی گیاهان دیپلوئید و تتراپلوئید

سطح پلوئیدی

کلروفیل a (mg/gFW)

کلروفیل b (mg/gFW)

کارتنوئید (mg/gFW)

آنتوسیانین (mg/gFW)

پراکسیداز (mg/gFW)

۰ (شاهد)

b52/9±1/122

b71/8±5/118

a75/2±4/38

a000013/0±0008/0

b000015/0±00013/0

5/0گرم بر لیتر

a66/10±02/191

a94/9±7/243

b69/2±۴۹/۹

a000014/0±0009/0

a000017/0±00053/0

سطح پلوئیدی

کاتالاز (mg/gFW)

فنل کل (mg/gFW)

پروتئین کل (mg/gFW)

فلاونوئید (mg/gFW)

 

۰ (شاهد)

b00017/0±0007/0

a028/0±475/2

b098/0±174/1

b083/0±346/1

 

5/0گرم بر لیتر

a00018/0±0010/0

a027/0±534/2

a096/0±572/1

a091/0±868/2

 

حروف مشابه برای هر صفت بین نمونه شاهد و تیمار داده شده نشان‌دهنده تفاوت غیر معنی‌دار بین آن‌هاست

 

 

نتیجه­گیری کلی

نتایج این مطالعه نشان داد با استفاده از محرک­های مختلف از جمله کلشی­سین می­توان باعث ایجاد تغییر در تولید متابولیت­های ثانویه شد. در مجموع نتایج این تحقیق نشان داد که غلظت 5/0 گرم در لیتر و مدت زمان ۶ ساعت، بهترین تیمار جهت القاء پلوئیدی در گیاه زنیان می­باشد. همچنین بررسی­های بیشتر و مقایسه بین خصوصیات مورفولوژیک و فیزیولوژیک گیاهان دیپلوئید و تتراپلوئید نشان داد که گیاهان تتراپلوئید از نظر صفات کمی از قبیل تعداد شاخه جانبی، ارتفاع گیاه، تعداد برگ، قطر ریشه، وزن تر و وزن خشک گیاه و همچنین کلروفیل a، کلروفیل b، پراکسیداز، کاتالاز، پروتئین کل و فلاونوئید نسبت به گیاهان دیپلوئید برتری داشتند، بنابراین می­توان گفت که پلی­پلوئیدی با ایجاد تنوع در صفات مختلف گزینه­های جدیدی برای اصلاح­گران ایجاد می­کند تا بسته به هدف که ممکن است کاربردهای دارویی، زینتی، مقاومتی و غیره باشد، گیاهان مطلوب گزینش شوند.

1- Acquaah G (2009) Principles of plant genetics and breeding. John Wiley & Sons. 560 Pages

2- Adams KL, Wendel JF (2005) Novel patterns of gene expression in polyploid plants. TRENDS in Genetics 21: 539-543. doi: 10.1016/j.tig.2005.07.009

3- Afshar Mohammadian M, Omidi Z, Purakbari kasmaei R, Asadi Abkenar A (2013) The effect of polyploidy on some anatomical and antioxidant characteristics of Citrus ourantifulia A. Journal of Plant Researches 26: 238-246. 2631

4- Afshar Mohammadian M, Pour Akbari R, Omidi Z, Ghanati F, Torang A (2012) The effect of induced polyploidy on morphological and physiological traits of lemon (Citrus aurantifolia L.). Plant Biology Journal 12: 13-24.

5- Akbarinia A, Sefidkon F, Ghalavand A, Tahmasbi SZ, Sharifi AE (2005) A study on chemical composition of Ajowan (Trachyspermum ammi) essential oil produced in Qazvin. The journal of gazvin university of medical sciences 9: 22-25.

6- Altrock S, Fonseca A, Pedrosa-Harand A (2011) Chromosome identification in the Andean common bean accession G19833 (Phaseolus vulgaris L., Fabaceae). Genetics and molecular biology 34: 459-463. 10.1590/S1415-47572011005000029

7- Amiri A, Taghizadeh M, Shoor M, Nemati H, Tehranian Far A (2013) Investigating the Possibility of Inducing Polyploidy in African Violets Using Colchicine in Reciprocal Seedlings of the African Violet (Saintpaulia ionantha). In: Proceedings of the Eighth Iranian Horticultural Sciences Congress, Hamadan|. Conference Location|. pp. Pages|.

8- Ashraf M, Orooj A (2006) Salt stress effects on growth, ion accumulation and seed oil concentration in an arid zone traditional medicinal plant ajwain (Trachyspermum ammi [L.] Sprague). Journal of Arid Environments 64: 209-220.

9- Ayyobi n, Hosseini B, Fattahi m (2017) induction Effects of Colchicine and Chitosan on Rosmarinic Acid Production in Hairy Root Cultures of Zarrin-Giah (Dracocephalum kotschyi Boiss). Journal of Cellular and Molecular Researches 30 (1): 1-13.

10- Beers RF, Sizer IW (1952) A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase. J Biol chem 195: 133-140.

11- Birami kohi A, Fahmideh L, Riasat M (2016) Evaluation of Morphologic and Physiologic Traits of Sistan's Native Fenugreek (Trigonellafoenum graecum) under Colchicine Treatments. Journal of Crop Breeding 8: 153-159.

12- Borgheei SF, Sarikhani H, Chaichi M, Kashi A (2010) In vitro induction of polyploidy in lemon balm (Melissa officinalis L.). Scientific Journal Management System 26: 283-295. doi: 10.22092/ijmapr.2010.6688

13- Bradford MM (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry 72: 248-254.

14- Chang C-C, Yang M-H, Wen H-M, Chern J-C (2002) Estimation of total flavonoid content in propolis by two complementary colorimetric methods. Journal of food and drug analysis 10.

15- Cheema AK (2018) Plant Breeding its Applications and Future Prospects. International Journal of Engineering Technology Science and Research 5: 88-94.

16- Chen B, Li J, Zhang J, Fan H, Wu L, Li Q (2016) Improvement of the tissue culture technique for Melaleuca alternifolia. Journal of forestry research 27: 1265-1269.

17- Das AB, Das A, Pradhan C, Naskar SK (2015) Genotypic variations of ten Indian cultivars of Colocasia esculenta var. antiquorom Schott. evident by chromosomal and RAPD markers. Caryologia 68: 44-54.

18- Davari A, Solouki M, Fazeli-Nasab B (2018) Effects of jasmonic acid and titanium dioxide nanoparticles on process of changes of phytochemical and antioxidant in genotypes of Satureja hortensis L. Eco-Phytochemical Journal of Medicinal Plants 5: 1-20.

19- de Azevedo Neto AD, Prisco JT, Enéas-Filho J, de Abreu CEB, Gomes-Filho E (2006) Effect of salt stress on antioxidative enzymes and lipid peroxidation in leaves and roots of salt-tolerant and salt-sensitive maize genotypes. Environmental and Experimental Botany 56: 87-94. doi: 10.1016/j.envexpbot.2005.01.008

20- De Smet R, Sabaghian E, Li Z, Saeys Y, Van de Peer Y (2017) Coordinated Functional Divergence of Genes after Genome Duplication in Arabidopsis thaliana. The plant cell 29: 2786-2800.

21- Dehdari A (2014) Cytogenetical evaluation of canola cultivars and two wild species of Brassica. Journal of Cellular and Molecular Researches 26 (4): 446-461.

22- Escandón AS, Alderete LM, Hagiwara JC (2007) In vitro polyploidization of Mecardonia tenella, a native plant from South America. Scientia Horticulturae 115: 56-61.

23- Estaji A, Hosseini B, Ravandi EG, Dehghan E, Sefidkon F (2017) The effects of colchicine-induced autotetraploidy on selected characteristics of nuruozak (Salvia leriifolia). Cytology and genetics 51: 74-81. doi: 10.3103/S0095452717010042

24- Fazeli-nasab B, Fooladvand Z (2016) A Review on Iranian Carum copticum (L.): Composition and Biological Activities. European Journal of Medicinal Plants 12: 1-8. 10.9734/EJMP/2016/17584

25- Ghotbi Ravandi E, Dehghan E, Estaji A, Naghdi Badi H (2014) Increasing the Production of Valuable Phytopharmaceutical Compounds by Chromosome Manipulation: Perspectives and Techniques of Induction and Selection of Polyploid Plants. Journal of Medicinal Plants 2: 11-26.

26- Haghiroalsadat F, Azhdari M, Oroojalian F, Omidi M, Azimzadeh M (2015) The Chemical Assessment of Seed Essence of Three Native Medicinal Plants of Yazd Province (Bunium Premium, ‌Cuminum Cyminum, Trachyspermum Copticum) and the Comparison of Their Antioxidant Properties. SSU_Journals 22: 1592-1603.

27- Harbard J, Griffin A, Foster S, Brooker C, Kha L, Koutoulis A (2012) Production of colchicine-induced autotetraploids as a basis for sterility breeding in Acacia mangium Willd. Forestry: An International Journal of Forest Research 85: 427-436. doi: 10.1093/forestry/cps041

28- Hasani MA, Mirzaie M, Omidbaigi R, Fathi Qarebaba M (2010) The effect of the amount of oil and some characteristics of qualitative and quantitative autotetraploid Ocimum basilicum L. Journal of Horticultural Science 41: 111-118.

29- Hosseini B, Javanbakht S (2017) Effects of in vitro polyploidy induction on some morphological, physiological and biochemical traits of Salvia leriifolia Benth. Scientific Journal Management System 25: 24-42. 10.22092/ijrfpbgr.2017.109815

30- hosseini h, chehrazi m, nabati ahmadi d, mahmoodi sorestani m (2015) Induction of autotetraploidy in Madagascar periwinkle (Catharanthus roseus cv. Rosea) by colchicine treatment in order to induce diversity of morph-physiological and phenology traits. journal of plant process and function 3: 1-10.

31- Jafar Khani kermani M, Jokar A, Habashi AA (2008) A Review of Modern Breeding Methods of Ornamental Flowers and Ornamental Plants. Modern Genetics 3: 14-15.

32- Kasperbauer MJ (2018). In: Physiology and Biochemistry: Potential Use of Haploids and Doubled Haploids Biotechnology in Tall Fescue Improvement. (ed)^(eds). CRC Press. pp. 147-172.

33- Khalili H, Baghbani-arani F (2017) Green Synthesized of Silver Nanoparticles Using Artemisia tschernieviana Extract and Evaluation of Cytotoxicity Effects on Human Colon Cancer (HT29) and Normal (HEK293) Cell Lines. journal of ilam university of medical sciences 25: 91-100.

34- Lacerda LP, Malaquias G, Peron AP (2014) Antiproliferative action of aqueous extracts of Hymenaea stigonocarpa Mart. (Fabaceae) on the cell cycle of Allium cepa L. Anais da Academia Brasileira de Ciencias 86: 1147-1150.

35- Levin DA, Soltis DE (2018) Factors promoting polyploid persistence and diversification and limiting diploid speciation during the K–Pg interlude. Current opinion in plant biology 42: 1-7.

36- Lin M, Wu Q, Zheng S, Tian H (2011) Tissue culture and polyploidy induction of Morinda officinalis. Zhongguo Zhong yao za zhi" Zhongguo zhongyao zazhi" China journal of Chinese materia medica 36: 2325-2328.

37- Liu B, Liu B (2009) Theory and practice of uncertain programming. Springer.

38- Malekzadeh Shafaroudi S, Ghani A, Habibi M, Amiri A (2012) The Study of Autotetraploidy Induction in Basil (Ocimum basilicum) by Colchicines Treatment. Journal Of Horticulture Science 25: 461-469. doi:10.22067/jhorts4.v1390i0.11781

39- Mansouri H, Nezhad FS (2017) Effects of polyploidy on response of Dunaliella salina to salinity. bioRxiv: 219840. doi: 10.1101/219840

40- Meda A, Lamien CE, Romito M, Millogo J, Nacoulma OG (2005) Determination of the total phenolic, flavonoid and proline contents in Burkina Fasan honey, as well as their radical scavenging activity. Food chemistry 91: 571-577. doi: 10.1016/j.foodchem.2004.10.006

41- Nadernejad N, Ahmadimoghadam A, Hossyinifard J, Poorseyedi S (2013) Study of the rootstock and cultivar effect in PAL activity, production of phenolic and flavonoid compounds on flower, leaf and fruit in Pistachio (Pistacia vera L.).

42- Nagymihály M, Veluchamy A, Györgypál Z, Ariel F, Jégu T, Benhamed M, Szűcs A, Kereszt A, Mergaert P, Kondorosi É (2017) Ploidy-dependent changes in the epigenome of symbiotic cells correlate with specific patterns of gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences 114: 4543-4548.

43- Nilanthi D, Chen X-L, Zhao F-C, Yang Y-S, Wu H (2009) Induction of tetraploids from petiole explants through colchicine treatments in Echinacea purpurea L. BioMed research international 2009: Article ID 343485, 343487 pages. doi: 10.1155/2009/343485

44- Noori SAS, Norouzi M, Karimzadeh G, Shirkool K, Niazian M (2017) Effect of colchicine-induced polyploidy on morphological characteristics and essential oil composition of ajowan (Trachyspermum ammi L.). Plant cell, tissue and organ culture (pctoc) 130: 543-551.

45- Normohammadi S, Ghaderi N, Javadi T (2018) Morpho-physiological Responses of Strawberry (Fragaria× ananassa) to Exogenous Salicylic Acid Application under Drought Stress.

46- Oliveros Bastidas AdJ, Chinchilla N, Molinillo JM, Elmtili NE, Macias FA (2018) Qualitative study on the production of the allelochemicals benzoxazinones by inducing polyploidy in Gramineae with colchicine. Journal of agricultural and food chemistry 66: 3666–3674. DOI: 10.1021/acs.jafc.7b05489

47- Palii A, BATÎRU G (2016) Amino-acid content in grain protein of tetraploid opaque-2 maize. Food and Environment Safety Journal 13: 1-7.

48- Panahi Y, Alishiri GH, Parvin S, Sahebkar A (2016) Mitigation of systemic oxidative stress by curcuminoids in osteoarthritis: results of a randomized controlled trial. Journal of dietary supplements 13: 209-220.

49- Piromya R, Kermanee P (2013) Occurrence of tetraploidy in colchicine-treated physic nut (Jatropha curcas Linn.). Kasetsart Journal (Nat Sci) 47: 23-29.

50- Qi-Qing L, ZHANG J, Ji-Hua L, Bo-Yang Y (2018) Morphological and chemical studies of artificial Andrographis paniculata polyploids. Chinese journal of natural medicines 16: 81-89.

51- Ranney TG (2006) Polyploidy: From evolution to new plant development. In: Combined Proceedings International Plant Propagators’ Society(ed)^(eds). pp. 137-142.

52- Rodríguez-Suárez C, Mellado-Ortega E, Hornero-Méndez D, Atienza SG (2014) Increase in transcript accumulation of Psy1 and e-Lcy genes in grain development is associated with differences in seed carotenoid content between durum wheat and tritordeum. Plant molecular biology 84: 659-673.

53- Rubuluza T, Nikolova RV, Smith M, Hannweg K (2007) In vitro induction of tetraploids in Colophospermum mopane by colchicine. South African journal of Botany 73: 259-261.

54- Selmecki AM, Maruvka YE, Richmond PA, Guillet M, Shoresh N, Sorenson AL, De S, Kishony R, Michor F, Dowell R (2015) Polyploidy can drive rapid adaptation in yeast. Nature 519: 349.

55- Singh A, Matta N (2010) Characterization Studies on Seed Storage Proteins in Rice Autotetraploids. Research Journal of Agriculture and Biological Sciences 6: 1078-1086.

56- Sotude Ardabili G, Asgari Zakaria R, Zare N (2014) Polyploidy induction and its effects on some morpho-physiologic characteristics in sorghum (Sorghum bicolor cv. KFS2). Iranian Journal of Crop Sciences 16: 151-164.