نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 عضو هیئت علمی- سازمان پژوهش های علمی و صنعتی ایران

2 پژوهشکده زیست فناوری، سازمان پژوهش های علمی و صنعتی ایران، تهران، ایران

چکیده

سنتز زیستی خارج سلولی نانوذرات نقره، با استفاده از سیستم باکتریایی می تواند یک روش مناسب جهت عدم بکارگیری مواد شیمیایی باشد. بر این اساس، هدف این مطالعه سنتز زیستی نانوذرات نقره و مقایسه فعالیت ضدباکتریایی آنها علیه باسیلوس سرئوس و سراشیا مارسسنس بود. سنتز زیستی نانوذرات نقره با استفاده از سویه جدید قلیادوست ایزوپتریکولا واریابلیس IRSH1 و ضایعات سلولزی انجام شد. نانوذرات نقره بوسیله پراکندگی نوری پویا و میکروسکوپ الکترونی روبشی و DLS مشخصه‌یابی شدند. سپس نانوذرات تولیدی با طراحی آزمایش با استفاده از روش سطح پاسخ بهینه شدند. فعالیت ضدباکتریایی نانوذرات نقره با استفاده از روش انتشار دیسک (کربی_بائر) بر روی محیط مولر هینتون آگار بررسی شد. نتایج نشان داد که نانوذرات نقره بهینه شده با متوسط اندازه 3/77 نانومتر و شاخص پراکندگی 45/0 به دست آمدند. خواص ضدباکتریایی نانوذرات با افزایش غلظت آن‌ها افزایش یافت، حداکثر قطر هاله عدم رشد در غلظت 3000 میکروگرم بر میلی‌لیتر از نانوذرات نقره برای باسیلوس سرئوس و سراشیا مارسسنس به ترتیب66/9 و 66/10 میلی‌متر تعیین شد. اما با کاهش تراکم نانوذرات نقره تا غلظت های 500 و 100 میکروگرم بر میلی لیتر هم، فعالیت ضدباکتریایی علیه باکتری‌های باسیلوس سرئوس و سراشیا مارسسنس همچنان قابل مشاهده است. نتایج بدست آمده بیان‌گر حساسیت بیش‌تر سراشیا مارسسنس در مقایسه با باسیلوس سرئوس نسبت به نانوذرات نقره بود. بنابراین، نانوذره سنتز شده دارای خاصیت ضد باکتریایی موثر است و سراشیا مارسسنس نسبت به باسیلوس سرئوس در مقابل آن تقریبا پنج برابر حساستر است.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Biosynthesis of silver nanoparticles and the comparison of their antibacterial activity against Bacillus cereus and Serratia marcescens

نویسنده [English]

  • fariba Hajmohammadi 2

2 Biotechnology Department, Iranian Research Organization for Science and Technology (IROST), Tehran, Iran

چکیده [English]

The extracellular biosynthesis of silver nanoparticles (AgNPs) using a bacterial system could be a probable approach, avoiding using destructive chemicals. The aim of this study was the biosynthesis of silver nanoparticles and the comparison of their antibacterial activity against Bacillus cereus and Serratia marcescens. Biosynthesis of AgNPs was done using novel strains of alkalophile Isoptericola variabilis sp.IRSH1 and waste agriculture. AgNPs were characterized by dynamic light scattering (DLS) and scanning electron microscopy (SEM). Their synthesis was optimized by experimental design using response surface methodology (RSM). The antibacterial activities of the silver nanoparticles were examined by the standard Kirby–Bauer disc diffusion method on Muller–Hinton agar plates. The results showed the optimized silver nanoparticles were formed with an average size of 77.30 nm and 0.45 polydispersity index (PDI). The antibacterial property of the nanoparticles increased with their increasing concentrations and the maximum inhibition zones against Bacillus cereus and Serratia marcescens were found 9.66 mm and 10.66 mm in 3000 µg/ml concentration of silver nanoparticles, respectively. Despite reducing the density of AgNPs from 3000 µg/ml concentration to 500 and 100 µg/ml concentrations, antibacterial activity against Bacillus cereus and Serratia marcescens were still visible. Consequently, the biosynthesized AgNPs has efficient antibacterial activity against Bacillus cereus and Serratia marcescens. The results indicate that Serratia marcescens is approximately five times more sensitive than Bacillus cereus to silver nanoparticles.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Ag nanoparticle
  • Antibacterial activity
  • Isoptericola variabilis
  • response surface methodology (RSM)

سنتز زیستی نانوذرات نقره و مقایسه فعالیت ضدباکتریایی آنها علیه باسیلوس سرئوس و سراشیا مارسسنس

فریبا حاج­ محمدی و جعفر همت*

ایران، تهران،  سازمانپژوهش­هایعلمیوصنعتیایران،پژوهشکده زیست فناوری

تاریخ دریافت: 1/2/97                  تاریخ پذیرش: 25/10/97

چکیده

سنتز زیستی خارج سلولی نانوذرات نقره، با استفاده از سیستم باکتریایی میتواند یک روش مناسب جهت عدم به کارگیری مواد شیمیایی باشد. بر این اساس، هدف این مطالعه سنتز زیستی نانوذرات نقره و مقایسه فعالیت ضدباکتریایی آنها علیه باسیلوس سرئوس و سراشیا مارسسنس بود. سنتز زیستینانوذرات نقره با استفاده از سویه جدید قلیادوست ایزوپتریکولا واریابلیس IRSH1 و ضایعات سلولزی انجام شد. نانوذرات نقره بوسیله پراکندگی نوری پویا و میکروسکوپ الکترونی روبشی و DLS مشخصه­یابی شدند. سپس نانوذرات تولیدی با طراحی آزمایش با استفاده از روش سطح پاسخ بهینه شدند. فعالیت ضدباکتریایی نانوذرات نقره با استفاده از روش انتشار دیسک (کربی_بائر) بر روی محیط مولر هینتون آگار بررسی شد. نتایج نشان داد که نانوذرات نقره بهینه شده با متوسط اندازه 3/77 نانومتر و شاخص پراکندگی 45/0 بدست آمدند. خواص ضدباکتریایی نانوذرات با افزایش غلظت آن­ها افزایش یافت، حداکثر قطر هاله عدم رشد در غلظت 3000 میکروگرم بر میلی­لیتر از نانوذرات نقره برای باسیلوس سرئوس و سراشیا مارسسنس به ترتیب66/9 و 66/10 میلی­متر تعیین شد. اما با کاهش تراکم نانوذرات نقره تا غلظت های 500 و 100 میکروگرم بر میلی لیتر هم، فعالیت ضدباکتریایی علیه باکتری­های باسیلوس سرئوس و سراشیا مارسسنس همچنان قابل مشاهده است. نتایج بدست آمده بیان­گر حساسیت بیش­تر سراشیا مارسسنس در مقایسه با باسیلوس سرئوس نسبت به نانوذرات نقره بود. بنابراین، نانوذره سنتز شده دارای خاصیت ضد باکتریایی موثر است و سراشیا مارسسنس نسبت به باسیلوس سرئوسدر مقابل آن تقریبا پنج برابر حساستر است.

واژه­های کلیدی: اثرات ضد باکتریایی، ایزوپتریکولا واریابلیس، نانوذرات نقره

* نویسنده مسئول، تلفن: 09125759451، پست الکترونیکی: j.hemmat@gmail.com

مقدمه

 

قرون متمادی است که بشر به خاصیت ضدمیکروبی نقره دست پیدا کرده است، در حال حاضر نقره دارای کاربردهای متنوعی برای کنترل رشد باکتری­ها از جمله مصارف دندان پزشکی، کاتترها، سوختگی، استئومیلیت و عفونت­های دستگاه ادراری است. ظهور و افزایش ارگانیسم­های میکروبی مقاوم در برابر آنتی­بیوتیک­ها و تاکید مداوم بر هزینه­های درمانی، منجر به استفاده مجدد از ترکیبات آنتی­سپتیک نقره گردید، در مقایسه با آنتی­بیوتیک­ها این ترکیبات دارای طیف وسیعتری از فعالیت هستند و میل پایین‌تر به القاء مقاومت میکروبی دارند (26 و 11). از میان زمینه­های مختلف نانو فناوری، سنتز نانوذرات بویژه نانوذرات فلزی در مرکز توجه بسیاری از محققین قرار دارد. برخلاف مواد توده­ای، نانوذرات فلزی دارای خواص فیزیکی، شیمیایی، زیستی، الکتریکی، مکانیکی، مغناطیسی، حرارتی و دی­الکتریک منحصر به ‌فردی است(20). خواص منحصر بفرد نانوذرات فلزی نه تنها بدلیل ابعاد بسیار کوچک نانوذرات و افزایش نسبت سطح به حجم آنها بلکه بدلیل تغییر در شبکه کریستالی، انرژی پیوند بین اتمی و ساختار الکترونیکی در ابعاد نانومتری رخ می­دهد. در میان نانوذرات فلزی، نانو نقره بدلیل کاربردهای گسترده آن در زمینه­های مختلف زیست فناوری و پزشکی از اهمیت بالایی برخوردار است (25،7، 5).

امروزه رویکرد ساخت نانوذرات تغییر کرده و تلاش­های زیادی جهت سنتز زیستی آنها از جمله استفاده از توان باکتری­ها در حال انجام است(3، 1). اساس این روش احیای یون­های نقره توسط مولکول­های زیستی موجود در محلول­ رویی باکتری است. هدف این تحقیقات دستیابی به روشی ساده، سریع، سازگار با محیط زیست و از لحاظ اقتصادی مقرون بصرفه در تولید نانوذرات است(28).

در سال­های اخیر گروه های تحقیقاتی اثر ضدباکتریایی نانوذرات نقره را مورد بررسی قرار دادند(8،3). گزارش­های متعددی در زمینه بررسی اثر ضدباکتریایی نانوذرات نقره علیه باکتری­های گرم مثبت و گرم منفی مانند استافیلوکوکوس اورئوس(Staphylococcus aureus)،ویبریو کلرا(Vibrio cholera) و سودوموناس آئروژینوزا (Pseudomon asaeruginosa) و اشرشیاکلی(E. coli) موجود است(26،19،16). در مطالعه کیم و همکاران فعالیت ضدقارچی نانوذرات نقره برعلیه چهل و چهار سویه از شش گونه‌ی بالینی از قارچ تریکوفیتون منتاگروفیتس (Trichophyton mentagrophytes)و گونه­ی کاندیدا آلبیکانس(Candida albanicans) بررسی شد که نتایج از اثرات ضد قارچی نانوذرات حکایت داشت(17). تحقیقات معدودی در مورد اثر ضد میکروبی نانوذرات نقره علیه ویروس‌ها انجام ‌گرفته است، از جمله بررسی اثر ضد میکروبی نانوذرات نقره علیه ویروس نقص ایمنی اکتسابی انسان(HIV) ، ویروس هپاتیت ب و ویروس آنفولانزا A/H1N1(29،18،9). این مطالعات نشان داد برخلاف آنتی‍بیوتیک­ها که معمولاً تنها دارای اثرات کشنده و مهاری علیه باکتری­ها هستند، نانوذرات نقره علاوه بر اثر مهارکننده علیه طیف گسترده­ای از باکتری­ها، دارای اثر  مهارکننده

علیه قارچ­ها و حتی ویروس­ها میباشد(28).

هدف از این مطالعه، سنتززیستی نانوذرات نقره بوسیله سویه قلیادوست ایزوپتریکولا واریابلیس IRSH1، و مقایسه اثرات ضدباکتریایی نوع بهینه شده آنها برعلیه باکتری­های باسیلوس سرئوس(Bacillus cereus) و سراشیا مارسسنس (Serratia marcescens) بود.

مواد شیمیایی و سویه­های باکتریایی: نیترات نقره (1/0 مولار) و تمامی محیط­های کشت مورد استفاده در این پژوهش از شرکت مرک آلمانخریداری شد. دیسک­های استاندارد از شرکت پادتن طب خریداری شد. جهت سنتز خارج سلولی نانوذرات نقره از محلول رویی کشت سویه‌ی جدید IRSH1 که قبلاً از چشمه آبگرم رامسر واقع در شمال ایران جداسازی و به عنوان ایزوپتریکولاواریابلیس(Isoptericola variabilis sp. IRH1) (Genbank accession number KR856182) شناسایی شده بود، (1) استفاده شد. سویه­های باسیلوس سرئوس (PTCC1247) و سراشیا مارسسنس(PTTC1111) از مرکز کلکسیون میکروارگانیسم­های صنعتی ایران تهیه شد. در تمامی مراحل آزمایش سنتز زیستی نانوذرات نقره با استفاده از آب مقطر دوبار تقطیر انجام شد.

سنتز خارج سلولی نانوذرات نقره و تعیین خصوصیات آنها: سویه ایزوپتریکولا واریابلیس IRSH1 در ارلن مایر با حجم 250 میلی­لیتر حاوی محیط کشت مایع و ضایعات که پیش از این نحوه تهیه آن در مقاله عزیزی و همکاران توصیف شد (6)، کشت داده شد. باکتری سپس با استفاده از محلول رویی کشت آن به عنوان عامل احیاء و به روش قبلا شرح داده شده کلوئید نانوذرات نقره ساخته شد. به طور خلاصه باکتری در محیط کشت ترکیبی و با استفاده از ضایعات سلولزی به عنوان منبع کربن در دمای 50 درجه سلسیوس و دور شیکر 170 دور بر دقیقه بمدت 48 ساعت کشت داده شد. پس از سانتریفیوژ در دور 6000 دور بر دقیقه و بمدت 15 دقیقه، به محلول رویی باکتری، محلول نیترات نقره 0.5 مولار افزوده شد تا عوامل احیاء موجود در آن ( قند و پروتئین ها) با احیای یون های نقره، نانوذرات نقره را تولید نمایند (13،1). میانگین اندازه و شاخص پراکندگی(Polydispersity index (PDI)) نانوذرات نقره با استفاده از دستگاه تفرق نور پویا(Dynamic Light Scattering instrument (DLS)) (Malvern, UK) در محدوده 1/0 نانومتر تا 104 نانومتر و در دمای 25 درجه سانتی­گراد تعیین شد. به منظور بررسی شکل ظاهری نمونه­های ساخته شده از میکروسکوپ الکترونی روبشی (VEGA3.Tescan, Czech) استفاده شد. نانوذارت نقره در دمای محیط با لایه نازکی از طلا پوشانده شد و درنهایت در ولتاژ 20 کیلووات با میکروسکوپ الکترونی مطالعه شد(14). برای تعیین ترکیبات عنصری نمونه کلوئیدی از میکروسکوپ الکترونی روبشی مدل VEGA3.Tescan مجهز به طیف‌سنج توزیع انرژی (EDX) استفاده شد. برای آماده‌سازی نمونه، نانوذرات کلوئیدی توسط خشک‌کن انجمادی به ذرات جامد تبدیل شد. سپس نمونه جامد نانوذرات نقره روی پایه آلومینیومی قرار داده شد. در نهایت برای ایجاد رسانایی با لایه‌ای از طلا پوشانده شد.

طراحی آزمایش به منظور بهینه‌سازی ساخت نانوذرات نقره انجام شد. ابتدا جهت شناسایی فاکتورهایی که اثر قابل‌توجهی در سنتز زیستی نانوذرات نقره دارند، پنج فاکتور شامل: غلظت نیترات نقره، نور، دما، pH محلول واکنش و منبع نیتروژن محیط کشت باکتریایی با استفاده از روش پلکت برمن(10) مورد غربالگری قرار گرفت. پس از غربالگری فاکتورها و تعیین سه فاکتور موثر بر ساخت نانوذرات نقره، بهینه‌سازی سنتز نانوذرات با استفاده از روش سطح پاسخ انجام شد، به منظور انجام بهینه‌سازی با استفاده از طراحی پلکت برمن و روش سطح پاسخ به ترتیب از نرم‌افزارهایMinitab 17 و Design Expert7 استفاده­شد (21،10).

بررسی اثر ضدباکتریایی نانوذرات نقره سنتز شده برعلیه

میکروارگانیسم­ها: فعالیت ضدباکتریایی نانوذرات نقره بهینه­سازی شده با استفاده از روش انتشار دیسک (کربی_بائر) برعلیه سویه­های باسیلوس سرئوس (PTCC1247) و سراشیا مارسسنس (PTTC1111)  به ترتیب به عنوان نماینده باکتری های گرم مثبت و منفی و دو عامل آلودگی مواد غذایی، بر روی پلیت­های حاوی محیط مولر هینتون آگار مورد بررسی قرار گرفت. به منظور انجام مطالعه­های میکروبی، سویه­های باکتریایی­ بر روی محیط نوترینت آگار شیبدار کشت داده شده و در دمای 4 درجه سانتی­گراد نگهداری شدند. هنگام تهیه کشت مایع، یک لوپ پر از هر نمونه از باکتری­ در شرایط کاملا سترون در 10 میلی­لیتر محیط کشت مولر هینتون براث بصورت جداگانه کشت داده شد، سپس به مدت 24 ساعت در دمای 35 درجه سانتی­گراد گرماگذاری شد. رقت مناسب از هر بـاکتری بر اساس اسـتاندارد 5/0 مک فارلند که معادل 106-105 واحد تشکیل دهنده کلونی در هر میلی­لیتر است؛ با استفاده از محلول سرم فیزیولوژی (NaCl  %0.9) تهیه شـد. بـرای افزایش دقت عمـل، میـزان جـذب نـوری 5/0 مـک فارلنـد توسـط دستگاه اسپکتروفتومتر (Lambda25, USA) تعیین شد. در نهایت هریک از باکتری­های مورد بررسی بر روی پلیت­های جداگانه با استفاده از روش کشت چمنی بـ­صورت یکنواخت گسترش یافت. سپس بر روی هریک از دیسک‌ها 25 ماکرولیتر از محلول نانوذرات نقره بهینه­سازی شده با رقت مناسب ریخته شد و در نقطه‌های مشخص شده بر روی محیط کشت مولر هینتون آگار قرار گرفت. سپس بر روی یکی از دیسک‌های خام 25 ماکرولیتر از محلول نیترات نقره به عنوان کنترل ریخته شد؛ در نهایت پلیت­ها بمدت 18 ساعت در دمای 35 درجه سانتی­گراد در انکوباتور گرماگذاری شد. قطر هاله عدم رشد باکتری­ها با استفاده از کولیس ورنیه اندازه گیری و ثبت شد(25،24،23). تمام آزمایشهای مربوط به تعیین قطر هاله عدم رشد با سه بار تکرار انجام شدند. تمامی نتایج این پژوهش بصورت میانگین ± خطای استاندارد گزارش شد. داده­ها با استفاده از نرم افزار Minitab17 و آزمون­های آماری واریانس یک طرفه (One­-way ANOVA) و توکی(Tukey) تحلیل شدند.

نتایج و بحث

مواد و ترکیبات فعال زیستی موجود در محلول رویی باکتریها همچنین ترکیبات موجود در عصاره­های گیاهان از جمله فلاونوئیدها میتوانند برای احیا یون­های فلزی به نانوذرات مورد استفاده قرارگیرند(3،2،1). از این رو در این تحقیق سنتز زیستی نانوذرات نقره با استفاده از محلول رویی سویه قلیادوست ایزوپتریکولا واریابلیس IRSH1، انجام شد و اثرات ضدباکتریایی آن مورد بررسی قرار گرفت.

حضور رنگ قهوه‌ای در محلول نیترات نقره تیمار شده با محلول رویی باکتری نشان دهنده ساخت نانوذرات نقره است. تغییر رنگ مخلوط واکنش به رنگ قهوه­ای از ویژگی‌های رزونانس پلاسمون سطح نانوذرات نقره و شاهدی بر ساخت خارج سلولی نانوذرات نقره است(13،3). این نتایج نشان‌داد که محلول رویی باکتری ایزوپتریکولا واری ابلیس توانایی ساخت خارج سلولی نانوذرات نقره را دارد (شکل1-ب).

 برای تائید تشکیل نانوذرات نقره توسط محلول رویی باکتری، کلوئید نانوذرات نقره با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر در محدوده nm700-300 اسکن شد. پیک جذب قوی در nm 411 با جذب 85/0 نیز نشان دهنده تولید نانوذرات نقره با استفاده از محلول رویی باکتری ایزوپتریکولا واری ابلیس می­باشد (شکل1-ج). بیشینه جذب نانوذرات نقره معمولاً در محدوده nm 390 تا nm 460 است، این  قابلیت  جذب  بعلت  رزونانس  پلاسمون

سطح نانوذرات نقره است.

پس از آن که ساخت نانوذرات نقره بر اساس طیف جذب UV-Vis و تغییر رنگ محیط واکنش(شکل 1) محرز شد، به منظور تعیین فاکتورهای موثر در سنتز نانوذرات نقره، برای غربالگری فاکتورها از طراحی آزمایش
Plackett- Burman در دو سطح استفاده شد. پنج فاکتور شامل غلظت نقره نیترات، نور، دما، منبع نیتروژن محیط کشت باکتریایی و pH محلول واکنش مورد بررسی قرار گرفت. نرم افزار برای بررسی این پنج فاکتور دوازده Run را بصورت تصادفی طراحی کرد. پس از انجام آزمایش ها از طیف سنجی UV-Vis برای تعیین مساحت زیر سطح نمودار در محدوده 460-400 (غلظت نانوذرات سنتز شده) استفاده شد. برای آنالیز داده ها از مقدار 0.2=α استفاده شد. بر اساس نتایج حاصل از آنالیز به ترتیب سه فاکتور نور، غلظت نقره نیترات، pH محلول واکنش بیشترین تاثیر را در سنتز نانوذرات نقره داشته (شکل 2) و به عنوان فاکتورهای موثر برای انجام طرح آزمایش RSM به کار گرفته شد. سنتز زیستی نانوذرات نقره در شرایط بهینه بدست آمده از طرح آزمایشی انجام شد(12).

 

 

ج

شکل 1- ارلن حاوی محلول رویی محیط کشت باکتری ایزوپتریکولا

واریابلیس الف) قبل از انجام واکنش ب)48 ساعت پس ‌از اینکه در معرض محلول نقره نیترات قرار گرفت. ج) طیف جذب کلوئید نانوذرات نقره حاصل از واکنش محلولmM 5 نیترات نقره با محلول رویی باکتری  پس  از  48 ساعت

 

 

شکل 2 - نمودار اثرات اصلی 5 فاکتور دخیل در فرآیند ساخت نانوذرات نقره، خروجی برنامه Plackett-Burman

 

جهت بررسی میانگین اندازه و شاخص پراکندگی نانوذرات نقره بهینه شده آنالیز DLS انجام شد. بر اساس نتایج بدست آمده میانگین اندازه نانوذرات سنتز شده 3/77 نانومتر و شاخص پراکندگی آنها 45/0 تعیین شد(شکل 3). تصاویر بدست آمده از میکروسکوپ الکترونی روبشی(SEM)، سنتز نانوذرات نقره بهینه شده با ابعاد کمتر از 100 نانومتر و بصورت کروی شکل را نشان داد(شکل4).

 

 

شکل 3- آنالیز DLS کلوئید نانوذرات نقره حاصل از مخلوط واکنش در شرایط بهینه الف) توزیع اندازه نانوذرات بر اساس شدت پراکندگی ب) توزیع اندازه نانوذرات بر اساس تعداد.

(الف)

       
(ب)

شکل 4- تصویر SEM نانوذرات نقره بهینه شده به روش سطح پاسخ(الف)و  آنالیز EDX حاصل از کلوئید نانوذرات نقره ساخته شده از محلول رویی محیط کشت باکتری(ب).

 

در آنالیز EDX پیک مربوط به فلز نقره به وضوح دیده ‌شد، این پیک نشان‌دهنده آن است که نانوذرات مشاهده شده در تصاویر SEM از جنس نقره است (شکل 4). مشاهده باند جذب نوری در 3Kev نشان‌دهنده وجود نانوذرات فلزی از جنس نقره است(23). البته وجود پیک عناصر S, Cl, C, O در طیف EDX مربوط به بقایای ناشی از مواد موجود در سوپرناتانت باکتری از قبیل بقایای آنزیمی یا پروتئینی است.

ارزیابی اثرات ضد باکتریایی نانوذرات نقره بهینه­سازی شده با استفاده از روش انتشار دیسک (کربی-بائر) انجام شد. به عنوان کنترل مثبت، برای باکتری گرم منفی(سراشیا مارسسنس) و برای باکتری گرم مثبت (باسیلوس سرئوس به ترتیب دو آنتی بیوتیک استاندارد آزیترومایسین و ونکومایسین همزمان مورد ارزیابی قرار گرفت. از دیسک آغشته به محلول نقره نیترات با غلظت mM ۱۰ نیز به عنوان کنترل استفاده شد.

جهت ارزیابی اثرات ضدباکتریایی نانوذرات نقره ساخته شده تحت شرایط بهینه، رقت‌های µg/mL۱۰۰، µg/mL۵۰۰، µg/mL۱۰۰۰، µg/mL۲۰۰۰ و µg/mL۳۰۰۰ تهیه شد. نتایج (جدول 1) نشان داد که نانوذرات نقره بهینه‌سازی شده دارای اثر بازدارندگی و مهارکنندگی معنی داری بر روی باکتری‌های گرم مثبت باسیلوس سرئوس و باکتری­های گرم منفی سراشیا مارسسنس است (p<0.05). در این مطالعه خواص ضدباکتریایی نانوذرات نقره بهینه شده با افزایش غلظت این ذرات افزایش یافت، بعلاوه در حضور غلظت­های مختلف نانوذرات نقره بهینه شده قطر هاله عدم رشد بزرگتری برای سراشیا مارسسنس در مقایسه با باسیلوس سرئوس بدست آمد(p<0.05)(شکل 5). مقایسه نسبی نتایج بدست آمده، بیان­گر حساسیت بیش­تر سراشیا مارسسنس در مقایسه با باسیلوس سرئوس نسبت به نانوذرات نقره بود (جدول 1).

 

 

(ب)                                                                (الف)

شکل 5- اثر ضد باکتریایی نانوذرات نقره بهینه‌شده علیه( الف) باکتری سراشیا مارسسنس. در غلظت­های 100، 500، 1000، 2000 و  µg/mL 3000، کنترل مثبت آزیترومایسین و (ب) باکتری باسیلوس سرئوس. در غلظت­های 100، 500، 1000، 2000 و µg/mL 3000، ، کنترل مثبت ونکومایسین.

جدول 1- مقایسه میانگین قطر هاله عدم رشد در غلظتهای مختلف نانوذرات نقره

3000 µg/ml

2000 µg/ml

1000 µg/ml

500 µg/ml

100 µg/ml

نیترات نقره

باکتری­ها

9.66±0.5

9±1

8.33±0.5

8

0

8

Bacillus cereus

10.66±0.57

10.33±0.57

9.33±0.57

9

8

8.33±0.57

Serratia marcescens

 

در سال­های اخیر اثر ضدباکتریایی نانوذرات نقره توسط گروه­های تحقیقاتی مختلف مورد بررسی قرار گرفته است. در مطالعه اوتاری و همکاران(22) نانوذرات نقره به روش سنتز زیستی از محلول ­رویی باکتری اکتینوباکتر رودوکوکوس (Actinobacteria Rhodococcus) با میانگین اندازه 30 نانومتر تولید شد، نانوذرات مذکور دارای اثر مهارکنندگی بر روی رشد باکتری­های اشرشیاکلی، استافیلوکوکوس اورئوس و باسیلوس سرئوس بود، قطر هاله عدم رشد برای این باکتری­ها به ترتیب 21، 20 و 19 میلی­متر بود(22). در مطالعه حاضرحداکثر هاله عدم رشد برای باکتری­های باسیلوس سرئوس و سراشیا مارسسنس به ترتیب 9.66 و 10.66 میلی­متر تعیین شد. اما با کاهش تراکم نانوذرات نقره تا غلظت­های  500 و 100 میکروگرم بر میلی لیتر، به ترتیب فعالیت ضدباکتریایی علیه باکتری­های باسیلوس سرئوس و سراشیا مارسسنس قابل مشاهده است. تا به امروز مطالعات زیادی در مورد اثرات ضد باکتریایی نانوذرات نقره علیه جدایه­های مختلف باکتریایی گزارش ‌شده است. اگرچه مقالات متعدد روش‌های مختلفی را برای توضیح عملکرد ضد باکتریایی نانوذرات نقره پیشنهاد داده­اند اما مکانیسم دقیق این فرآیند بطور کامل درک نشده است. بطور خلاصه رایج­ترین مکانیسم برای اثر ضدباکتریایی نانوذرات نقره عبارت از این است که نانوذرات نقره از طریق آزاد کردن نقره بصورت یونی و غیرفعال کردن گروه‌های تیول موجود در آنزیم­ها که باعث غیرفعال کردن آنزیم­های باکتریایی می شوند. یون‌های نقره آزادشده همانندسازی DNA باکتری را مهار می­کنند، منجر به آسیب سیتوپلاسم سلولی می­شوند، باعث کاهش سطح آدنوزین تری­ فسفات(ATP) و در نهایت مرگ سلول باکتریایی را بهمراه دارند. افزایش نسبت سطح به حجم نانوذرات باعث افزایش سطح اتصال نانوذرات به سلول باکتری می‌شود و افزایش میزان انتشار یون‌های نقره به باکتری و در نتیجه بهبود اثر ضدباکتریایی نقره می‌شود (11).

نتایج این پژوهش ضمن تایید کارآمدی نانوذرات نقره ساخته شده به روش زیستی، نشان­دهنده تأثیر قوی­تر نانوذرات نقره در مهار رشد باکتری­های گرم منفی در مقایسه با باکتری­های گرم مثبت بود. گزارش­های متعددی مبنی بر خاصیت ضدمیکروبی قوی­تر نانو ذرات نقره علیه باکتری­های گرم منفی در مقایسه با باکتری­های گرم مثبت وجود دارد(15،27). بر اساس مطالعه لین(Lin) و همکاران با توجه به اینکه بار منفی بیشتری در لایه لیپوپلی­ساکاریدی باکتری­های گرم منفی وجود دارد، یون­های نقره آزاد شده از نانو ذرات نقره به بار منفی موجود در دیواره سلولی متصل می­شود که منجر به دناتوره شدن پروتئین‌های موجود در دیواره سلولی، از هم گسیختگی دیواره و در نهایت منجر به مرگ سلول باکتری می­شود(30).

نتیجه گیری

این مطالعه نشان داد نانوذرات نقره سنتز شده، برعلیه سویه­های باسیلوس سرئوس و سراشیا مارسسنس دارای فعالیت ضدمیکروبی است. نتایج بدست آمده بیان­گر حساسیت بیش­تر سراشیا مارسسنس در مقایسه با باسیلوس سرئوس نسبت به نانوذرات نقره بود. و سراشیا مارسسنس نسبت به باسیلوس سرئوس در مقابل نانوذره سنتز شده پنج برابر حساستر است.

با توجه به استفاده از روش زیستی همچنین استفاده از محیط کشت مبتنی بر ضایعات کشاورزی جهت سنتز نانو ذرات و عدم استفاده از مواد شیمیایی و حلال‌های سمی در این روش، نانو ذرات نقره دارای پتانسیل کاربرد در حوزه های زیستی، بهداشت و درمان است.

تشکر و قدردانی

بدین وسیله از سازمان پژوهش­های علمی و صنعتی جهت مساعدت در انجام این پژوهش تشکر و قدردانی می­شود.

 

  1. حاج محمدی ف، ﺳﻠﯿﻤﺎﻧﯽ ز، همت ج، 1396، بررسی اثرات ضدباکتریایی نانوذرات نقره سنتز شده توسط سویه جدید مقاوم حرارت  ایزوپتریکولا واریابلیس  IRSH1علیه باکتری­های استافیلوکوکوس اورئوس و سودوموناس آئروژینوزا"،  مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی قزوین،  شماره 3 ،30-23. 
  2. رضایی آ ، پورعلی پ، یحیایی ب، 1395، بررسی اثرات سمیت سلولی نانوذرات طلای تولیدی توسط Bacillus cereus بر روی رده های سلولی هپاتوسیت و فیبروبلاست. مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران)، شماره 3 ،301-291.
  3. کاوسی س، هاشم یعقوبی ه. 1396، سنتز نانو ذرات نقره به روش سبز با استفاده از عصاره گیاه مرزنجوش اروپایی
    (majorana Origanum) بررسی اثرات ضد میکروبی آن. مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران)، شماره 2 ،311-299.

4- Abd-Elnaby, H. M., Abo-Elala, G. M., Abdel-Raouf, U. M., & Hamed, M. M. (2016). Antibacterial and anticancer activity of extracellular synthesized silver nanoparticles from marine Streptomyces rochei MHM13. The Egyptian Journal of Aquatic Research, 42(3), 301–312.

5- Anthony, K. J. P., Murugan, M., & Gurunathan, S. (2014). Biosynthesis of silver nanoparticles from the culture supernatant of Bacillus marisflavi and their potential antibacterial activity. Journal of Industrial and Engineering Chemistry, 20(4), 1505-1510.

6-Azizi, M., Hemmat, J., Seifati, S. M., Torktaz, I., & Karimi, S. (2015). Characterization of a thermostable endoglucanase produced by Isoptericola variabilis sp. IDAH9. Brazilian Journal of Microbiology, 46(4), 1225-1234.

7-Cao, G. (2004). Nanostructures and Nanomaterials: Synthesis, properties and Application. London, Imperial College, 7-1132-69.

8-Devi, L. S., & Joshi, S. (2012). Antimicrobial and synergistic effects of silver nanoparticles synthesized using soil fungi of high altitudes of Eastern Himalaya. Mycobiology, 40(1), 27-34.

9-Elechiguerra, J. L., Burt, J. L., Morones, J. R., Camacho-Bragado, A., Gao, X., Lara, H. H., & Yacaman, M. J. (2005). Interaction of silver nanoparticles with HIV-1. J nanobiotechnol, 3(6), 1-10.

10-Fathima, B. S., & Balakrishnan, R. M. (2014). Biosynthesis and optimization of silver nanoparticles by endophytic fungus Fusarium solani. Materials Letters, 132, 428-431.

11-Feng, Q., Wu, J., Chen, G., Cui, F., Kim, T., & Kim, J. (2000). A mechanistic study of the antibacterial effect of silver ions on Escherichia coli and Staphylococcus aureus. Journal of biomedical materials research, 52(4), 662-668.

12-Fowlkes, W. Y., & Creveling, C. M. (1995). Engineering methods for robust product design: Addison-Wesley.

13-Gurunathan, S., Kalishwaralal, K., Vaidyanathan, R., Venkataraman, D., Pandian, S. R. K., Muniyandi, J., . . . Eom, S. H. (2009). Biosynthesis, purification and characterization of silver nanoparticles using Escherichia coli. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 74(1), 328-335.

14-Hamedi, S., Shojaosadati, S. A., Shokrollahzadeh, S., & Hashemi-Najafabadi, S. (2014). Extracellular biosynthesis of silver nanoparticles using a novel and non-pathogenic fungus, Neurospora intermedia: controlled synthesis and antibacterial activity. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 30(2), 693-704.

15-Kalpana, D., & Lee, Y. S. (2013). Synthesis and characterization of bactericidal silver nanoparticles using cultural filtrate of simulated microgravity grown Klebsiella pneumoniae. Enzyme and microbial technology, 52(3), 151-156.

16-Kim, J. S., Kuk, E., Yu, K. N., Kim, J.-H., Park, S. J., Lee, H. J., . . . Hwang, C.-Y. (2007). Antimicrobial effects of silver nanoparticles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine, 3(1), 95-101.

17-Kim, K.-J., Sung, W. S., Moon, S.-K., Choi, J.-S., Kim, J. G., & Lee, D. G. (2008). Antifungal effect of silver nanoparticles on dermatophytes. J Microbiol Biotechnol, 18(8), 1482-1484.

18-Lu, L., Sun, R., Chen, R., Hui, C.-K., Ho, C.-M., Luk, J. M., . . . Che, C.-M. (2008). Silver nanoparticles inhibit hepatitis B virus replication. Antiviral therapy, 13(2), 253.

19-Morones, J. R., Elechiguerra, J. L., Camacho, A., Holt, K., Kouri, J. B., Ramírez, J. T., & Yacaman, M. J. (2005). The bactericidal effect of silver nanoparticles. Nanotechnology, 16(10), 2346.

20-Narayanan, K. B., & Sakthivel, N. (2010). Biological synthesis of metal nanoparticles by microbes. Advances in colloid and interface science, 156(1), 1-13.

21-Nyakundi, E. O., & Padmanabhan, M. N. (2015). Green chemistry focus on optimization of silver nanoparticles using response surface methodology (RSM) and mosquitocidal activity: Anopheles stephensi (Diptera: Culicidae). Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 149, 978-984.

22-Otari, S., Patil, R., Nadaf, N., Ghosh, S., & Pawar, S. (2014). Green synthesis of silver nanoparticles by microorganism using organic pollutant: its antimicrobial and catalytic application. Environmental Science and Pollution Research, 21(2), 1503-1513.

23-Priyadarshini, S., Gopinath, V., Meera Priyadharsshini, N., MubarakAli, D., & Velusamy, P. (2013). Synthesis of anisotropic silver nanoparticles using novel strain, Bacillus flexus and its biomedical application. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 102, 232-237.

24-Reller, L. B., Weinstein, M., Jorgensen, J. H., & Ferraro, M. J. (2009). Antimicrobial susceptibility testing: a review of general principles and contemporary practices. Clinical infectious diseases, 49(11), 1749-1755.

25-Shahverdi, A. R., Fakhimi, A., Shahverdi, H. R., & Minaian, S. (2007). Synthesis and effect of silver nanoparticles on the antibacterial activity of different antibiotics against Staphylococcus aureus and Escherichia coli. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine, 3(2), 168-171.

26-Shrivastava, S., Bera, T., Roy, A., Singh, G., Ramachandrarao, P., & Dash, D. (2007). Characterization of enhanced antibacterial effects of novel silver nanoparticles. Nanotechnology, 18(22), 225103.

27-Sondi, I., & Salopek-Sondi, B. (2004). Silver nanoparticles as antimicrobial agent: a case study on E. coli as a model for Gram-negative bacteria. Journal of colloid and interface science, 275(1), 177-182.

28-Tran, Q. H., & Le, A.-T. (2013). Silver nanoparticles: synthesis, properties, toxicology, applications and perspectives. Advances in Natural Sciences: Nanoscience and Nanotechnology, 4(3), 033001.

29-Xiang, D.-x., Chen, Q., Pang, L., & Zheng, C.-l. (2011). Inhibitory effects of silver nanoparticles on H1N1 influenza A virus in vitro. Journal of virological methods, 178(1), 137-142.

30-Yu-sen, E. L., Vidic, R. D., Stout, J. E., McCartney, C. A., & Victor, L. Y. (1998). Inactivation of Mycobacterium avium by copper and silver ions. Water Research, 32(7), 1997-2000.