نویسندگان

1 دانشجوی دکتری دانشگاه تبریز

2 عضو هیئت علمی دانشگاه تبریز

چکیده

هیدروکربن‌های آروماتیک چند حلقه‌ای (PAHs) از آلاینده‌های آلی می‌باشند که عمدتاً در نتیجه احتراق ناقص ترکیبات آلی آزاد می‌شوند. این آلاینده‌ها در غلظت‌های بالا در خاک‌های بعضی مناطق جهان یافت می‌شوند و اثرات زیان‌بار بر موجودات زنده مختلف از جمله گیاهان دارند. در این آزمایش گیاهان گندم در محیط هیدروپونیک تحت تیمار غلظت‌های مختلف پیرن و فنانترن کشت داده شدند و پس از تعیین غلظت‌های موثر این ترکیبات، تاثیر آنها بر برخی شاخص‌های فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی مورد بررسی قرار گرفت. فنانترن باعث کاهش معنی‌دار رنگیزه‌های فتوسنتزی و تمامیت غشاء سلولی، افزایش مالون دی‌آلدئید، افزایش پراکسید هیدروژن در ریشه و کاهش پراکسید هیدروژن در اندام‌های هوایی گردید، در حالیکه پیرن تاثیر معنی‌داری بر این شاخص‌ها نداشت. در اندام‌های هوایی فنانترن باعث کاهش معنی‌دار فعالیت آنزیم‌های کاتالاز (CAT)، آسکوربات پراکسیداز (APX)، سوپراکسید دیسموتاز (SOD) و پراکسیداز (POX) گردید، در حالیکه پیرن تنها باعث کاهش فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز شد. در ریشه هر دو آلاینده باعث کاهش فعالیت آنزیم‌های APX ، SOD و POX و افزایش فعالیت CAT گردیدند که البته تاثیر فنانترن بیشتر از پیرن بود. طبق این بررسی این دو ترکیب به‌خصوص فنانترن از طریق اختلال در عملکرد ریشه و کاهش فعالیت آنزیم‌های پاداکساینده باعث ایجاد تنش اکساینده و در نتیجه کاهش رنگیزه‌های فتوسنتزی، تمامیت غشاء و نهایتاً کاهش رشد گیاه می‌شوند.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Study of phenanthrene and pyrene effects on photosynthetic pigments, membrane stability and antioxidant enzymes activities in wheat (Triticum aestivum L.)

نویسنده [English]

  • Seyed Yahya Salehi Lisar 2

2 Academic member in university of Tabriz

چکیده [English]

Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are an important group of pollutants which are released into the environment mainly due to incomplete combustion of organic materials. PAHs frequently detected at relatively high concentrations in soils of some regions and are toxic for organisms including plants. In this study, wheat plants were grown hydroponically and treated by different concentrations of phenanthrene and pyrene. After determination of effective levels of two compounds, their effects on some physiological and biochemical parameters were evaluated. While pyrene showed no significant effect on studied parameters, phenanthrene significantly decreased photosynthetic pigments content and membrane stability index of shoot and root. Also, phenanthrene significantly increased malondialdehyde content of shoot and root; and hydrogen peroxidase content of root but decreased hydrogen peroxidase of shoot. Phenanthrene significantly decreased CAT, POD, SOD and APX activity in shoot, while pyrene only decreased APX activity. Both compounds decreased CAT, POD, SOD and APX activity in root, but the effect of phenanthrene was higher than that of pyrene. According to the results of this study, phenanthrene inhibited antioxidant enzymes activities and caused oxidative stress more than that of pyrene, and therefore led to higher reduction in photosynthetic pigments, plasma membrane integrity and ultimately plant growth.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Antioxidant enzymes
  • Phenanthrene
  • Pyrene
  • Wheat

بررسی تأثیر فنانترن و پیرن بر رنگیزه‌های فتوسنتزی، تمامیّت غشاء سلولی و فعالیت آنزیمهای پاداکساینده در گیاه گندم (Triticum aestivum L.)

ایوب سبحانی، سید یحیی صالحی لیسار* و علی موافقی

ایران، تبریز، دانشگاه تبریز، دانشکده علوم طبیعی، گروه علوم گیاهی

تاریخ دریافت: 30/3/95                تاریخ پذیرش: 13/9/96

چکیده

هیدروکربنهای آروماتیک چند حلقه‌ای (PAHs) از آلاینده‌های آلی می‌باشند که عمدتاً در نتیجه احتراق ناقص ترکیبات آلی آزاد می‌شوند. این آلاینده‌ها در غلظتهای بالا در خاکهای بعضی مناطق جهان یافت می‌شوند و اثرات زیان­بار بر موجودات زنده مختلف از جمله گیاهان دارند. در این آزمایش گیاهان گندم در محیط هیدروپونیک تحت تیمار غلظتهای مختلف پیرن و فنانترن کشت داده شدند و پس از تعیین غلظتهای مؤثر این ترکیبات، تأثیر آنها بر برخی شاخصهای فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی مورد بررسی قرار گرفت. فنانترن باعث کاهش معنی‌دار رنگیزه‌های فتوسنتزی و تمامیت غشای سلولی، افزایش مالون دی­آلدئید، افزایش پراکسید هیدروژن در ریشه و کاهش پراکسید هیدروژن در اندامهای هوایی گردید، در حالی که پیرن تأثیر معنی‌داری بر این شاخصها نداشت. در اندامهای هوایی فنانترن باعث کاهش معنی‌دار فعالیت آنزیمهای کاتالاز(CAT)، آسکوربات پراکسیداز (APX)، سوپراکسید دیسموتاز (SOD) و پراکسیداز (POX) گردید، در حالی که پیرن تنها باعث کاهش فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز شد. در ریشه هر دو آلاینده باعث کاهش فعالیت آنزیمهای APX ، SOD و POX  و افزایش فعالیت CAT گردیدند که البته تأثیر فنانترن بیشتر از پیرن بود. طبق این بررسی این دو ترکیب به­خصوص فنانترن از طریق اختلال در عملکرد ریشه و کاهش فعالیت آنزیمهای پاداکساینده باعث ایجاد تنش اکساینده و در نتیجه کاهش رنگیزه‌های فتوسنتزی، تمامیت غشاء و نهایتاً کاهش رشد گیاه می‌شوند.

واژه‌های کلیدی: آنزیمهای پاداکساینده، پیرن، فنانترن، گندم

* نویسنده مسئول، تلفن: 09149003272، پست الکترونیکی: y_salehi@tabrizu.ac.ir

مقدمه

 

هیدروکربنهای آروماتیک چند حلقه‌ای (PAHs) گروهی از آلاینده‌های آلی پایدار در طبیعت می‌باشند که عمدتاً حاصل احتراق ناقص سوختهای فسیلی می‌باشند (16). امروزه به دلیل صنعتی شدن جوامع و افزایش فعالیت صنایع، آزادسازی این مواد به طبیعت بیش از ظرفیت محیط زیست گشته، بنابراین می­توانند یکی از عوامل به هم خوردن تعادل محیط زیست باشند. از آنجایی که اکثر این ترکیبات برای موجودات زنده، سمی و جهش زا بوده و همچنین از پایداری بالا در طبیعت برخوردار می‌باشند و روز به روز بر مقدار آنها درمحیط افزوده می‌شود، به همین دلیل از توجه ویژه‌ای به عنوان آلاینده در بین محققان برخوردار می‌باشند (5 و16).

مطالعات قبلی نشان داده‌اند که هیدروکربنهای آروماتیک چند حلقه‌ای می‌توانند از طریق فرآیندهای بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی، رشد گیاهان را هم از نظر کیفی و هم از نظر کمّی تحت تأثیر قرار دهند. این مواد باعث کاهش فتوسنتز و تنفس در گیاهان شده و همچنین باعث تغییرات هورمونی، تغییر در فعالیت آنزیمها و محتوای رنگیزه‌ها می‌شوند (24).

تجمع مواد سمی از جمله PAHs در گیاه سبب ایجاد تنش اکسایشی می‌شود. این مواد در غلظتهای زیاد، بر رشد و عملکرد گیاهان اثرات منفی بر جای می‌گذارند و سبب آزاد شدن گونه­های فعال اکسیژن نظیر رادیکال هیدروکسیل، سوپراکسید و پراکسید هیدروژن در گیاه شده، بر ساختار غشاء سلولی تأثیر گذاشته و با ایجاد آسیبهای غشایی سبب اختلال در فر‌آیندهای مختلف سلولی می‌گردند (8). در یک مطالعه روی آرابیدوپسیس نشان داده شده است که فنانترن باعث افزایش سطح رادیکالهای فعال اکسیژن می­گردد. از آنجایی که افزایش این رادیکالها باعث راه اندازی مرگ برنامه ریزی شده در سلول می‌شود، بنابراین گیاه مجبور است مقدار رادیکالهای فعال را توسط فرآیندهای مختلف آنزیمی تنظیم کند (6). آنزیمهایی پاداکساینده از جمله کاتالاز (CAT)، پراکسیداز (POX)، سوپراکسید دیسموتاز(SOD) و آسکوربات پراکسیداز (APX) می‌توانند در این امر نقش مهمی داشته باشند. در این فرآیند SOD باعث احیای سوپراکسید به پراکسید هیدروژن می‌شود که سپس توسط CAT و POX به آب احیاء می‌شود. آنزیم APX از طریق اکسیداسیون آسکوربات و تولید منو دی هیدروآسکوربات به این کار کمک می‌کند (18). مطالعات نشان داده است که تنشهای غیر زیستی باعث فراتنظیمی این فرآیندها می‌شوند (13). در یک پژوهش، صابونچی و همکاران (1393) نشان داده­اند که فنانترن تأثیری بازدارنده و معنی‌دار بر جوانه‌زنی و رشد گیاه گندم دارد (2). علی­رغم اثرات منفی شناخته شده هیدروکربنهای آروماتیک چند حلقه­ای در گیاهان، برخی گونه‌های گیاهی می‌توانند این مواد را جذب کرده و در خود انباشته سازند و یا حتی آنها را به ترکیبات غیر سمی تبدیل کنند. برای همین شناخت سازوکار‌های جذب، پاسخهای مولکولی گیاهان به این مواد و آنزیمهای خنثی کننده آنها در گیاهان از نظر گیاه پالایی نیز لازم به نظر می‌آید (18).

این پژوهش با هدف بررسی اثرات دو ترکیب فنانترن و پیرن که از جمله هیدروکربنهای آروماتیک چند حلقه‌ای فراوان در طبیعت می‌باشند، بر مقدار رنگیزه‌های فتوسنتزی، تمامیت غشاء و فعالیت آنزیمهای پاداکساینده گیاه گندم در شرایط آبکشت در بستر پرلیت انجام شد.

مواد و روشها

تیمار دهی: ابتدا ظرفیت مزرعه‌ای پرلیت مورد استفاده اندازه‌گیری شد، سپس به منظور تهیه غلظتهای مورد نظر از فنانترن و پیرن (100، 200، 300، 400 وmg kg-1 500)، مقادیر لازم از هر یک در اتانول حل گردید. محلولهای به­دست آمده به پرلیت‌ اسپری شدند و پس از مخلوط کردن به­مدت 48 ساعت در هوای آزاد قرار گرفت تا اتانول موجود در آن تبخیر شود. عمل تیمار کردن تنها یک مرتبه و در شروع آزمایش انجام شد.

کشت گیاهان: گیاه مورد استفاده در این پژوهش گندم (Triticum aestivum L.) رقم پیشگام بود. بذرهای گندم از مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی آذربایجان شرقی (تبریز) تهیه گردیده و تا زمان کشت در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری شدند. بذرها به­ وسیله هیپوکلریت سدیم 5 درصد به مدت 10 دقیقه ضد عفونی شده و در گلدانهای حاوی پرلیت‌ تیمار نشده به عنوان شاهد و تیمار شده با غلظتهای مختلف از فنانترن و پیرن کشت داده شدند. سپس گلدانها به اندازه ظرفیت مزرعه‌ای توسط آب مقطر آبیاری گردیده و به مدت سه روز در تاریکی قرار گرفتند. بعد از جوانه‌زنی بذرها، گیاهان در شرایط فتوپریود 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی، دمای 30-25 درجه سانتی گراد، رطوبت 60-50 درصد و شدت نور 6000 لوکس قرار گرفتند. گلدانها به مدت 8 روز توسط آب مقطر، 8 روز محلول غذایی هوگلند 50 درصد و به مدت 14 روز توسط محلول غذایی هوگلند 100 درصد هر دو روز یکبار در حد ظرفیت مزرعه‌ای آبیاری ‌شدند. گیاهان از ابتدای جوانه‌زنی تا برداشت تحت تیمار دو آلاینده قرار داشتند و بعد از 30 روز به منظور انجام سنجشهای مورد نظر برداشت شدند. برای تعیین غلظتهای مؤثر و اندازه­گیری پارامترهای رشد، گیاهان در پنج سطح (100، 200، 300، 400 وmg kg-1 500) و برای سنجشهای بیوشیمایی در دو سطح (200 و mg kg-1 400) از فنانترن و پیرن کشت داده شدند.

سنجش رنگیزه‌های فتوسنتزی: غلظت رنگیزه‌های فتوسنتزی (کلروفیلa، b و کاروتنوئیدها) با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری شد (Analytic Jena, Specol 200). به­­طور خلاصه، 1/0 گرم از برگ گیاه در 3 میلی لیتر استون 80 درصد همگن شدند و بعد از صاف کردن جذب آنها در 470، 645 و 663 نانومتر اندازه­گیری شد و نهایتاً مقدار رنگیزه‌ها بر حسب میلی‌گرم بر گرم وزن ‌تر محاسبه گردید (7).

سنجش تمامیت غشای سلولی: 1/0 گرم از برگ گیاه به قطعاتی مساوی تقسیم گردید و داخل بشر 50 میلی لیتر منتقل گردید و 10 میلی­لیتر آب دوبار تقطیر روی آنها اضافه شد. برای هر گلدان دو بار نمونه برداری انجام گرفت. یک سری از نمونه‌ها داخل آون در دمای 40 درجه سانتی گراد و سری دیگر داخل بن ماری جوشان با دمای 100 درجه سانتی گراد به مدت 15 دقیقه قرار گرفتند. سپس به وسیله EC متر (HANNA9812) هدایت الکتریکی محلولها سنجش شد و طبق فرمول زیر شاخص تمامیّت غشاء محاسبه گردید که در آن MSI نشانگر شاخص تمامیت غشاء و c1 و c2 به ترتیب نشانگر هدایت الکتریکی عصاره برگی در دمای 40 و 100 درجه سانتی گراد می‌باشند (21).

14MSI=1-(c1c2)أ—100">

سنجش پروتئینهای محلول کل و فعالیت آنزیمهای پاداکساینده: تقریباً 1 گرم از نمونه‌ گیاهی در محلول بافر فسفات 50 میلی‌مولار سرد (pH = 7) در هاون چینی له شدند. مخلوط به­دست آمده در دمای 4 درجه در g10000 سانتریفیوژ گردید و روشناور بلافاصله برای سنجش پروتئینهای محلول با روش برادفورد (1976) و فعالیت آنزیمهای CAT، POD، SOD و APX مورد استفاده قرار گرفت.

فعالیت آنزیم CAT با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر طبق روش Chance و Meahly (1955) و با اندازه­گیری کاهش مقدار جذب نور در طول موج 240 نانومتر به­مدت 3 دقیقه اندازه‌گیری شد (11). محلول واکنش حاوی 5/2 میلی­لیتر بافر فسفات پتاسیم 50 میلی­مولار (7=pH)، 1 میلی­لیتر پراکسید هیدروژن 10 میلی­مولار و 5/0 میلی­لیتر عصاره آنزیمی بود. فعالیت آنزیم با استفاده از ضریب خاموشی پراکسید هیدروژن (mM-1 cm-1 04/0) محاسبه شد و یک واحد فعالیت، مقدار آنزیم لازم برای احیای 1 میکرومول پراکسید هیدروژن در یک دقیقه در نظر گرفته شد. فعالیت ویژه آنزیم به­ صورت واحد بر میلی‌گرم پروتئین (U mg-1 protein) بیان گردید.

فعالیت آنزیم POD با اندازه­گیری افزایش جذب نور در طول موج 470 نانومتر طی پلیمریزاسیون گایاکول و تشکیل تتراگایاکول انجام گرفت (20). یک میلی‌لیتر محلول واکنش حاوی 300 میکرولیتر گایاکول 4 میلی­مولار، 350 میکرولیتر بافر فسفات 10 میلی­مولار، 300 میکرولیتر پراکسید هیدروژن 50 میلی مولار و 50 میکرولیتر عصاره آنزیمی بود. واکنش با افزودن پراکسید هیدروژن به محلول شروع شد و تغییرات جذب به مدت 3 دقیقه ثبت گردید. فعالیت آنزیم با استفاده از ضریب خاموشی گایاکول (mM-1 cm-1 6/26) محاسبه گردید و یک واحد فعالیت، مقدار آنزیم لازم جهت اکسیداسیون 1 میکرومولار گایاکول به تتراگایاکول در دقیقه در نظر گرفته شد. فعالیت ویژه آنزیم به صورت واحد بر میلی‌گرم پروتئین (U mg-1 protein) بیان گردید.

فعالیت آنزیم SOD براساس اندازه­گیری میزان ممانعت از احیای نوری نیترو بلو تترازولیوم (NBT) توسط عصاره آنزیمی صورت گرفت (25). محلول واکنش (3 میلی­لیتر) حاوی 7/2 میلی­لیتر بافر فسفات سدیم 60 میلی­مولار (8/7=pH)، 100 میکرولیتر NBT 05/0 میلی­مولار، 100 میکرولیتر EDTA با غلظت 6/7 میلی­مولارحاوی 02/0 میلی­مولار از KCN (به عنوان بازدارنده فعالیت آنزیم)، 50 میکرولیتر ریبوفلاوین 2 میکرو­مولار و 50 میکرولیتر عصاره آنزیمی بود. محلول واکنش در شدت نور 5000 لوکس به مدت 12 دقیقه قرار گرفت و سپس جذب آن در طول موج 560 نانومتر ثبت گردید. مقدار آنزیم لازم برای ممانعت 50 درصدی از احیای نوری NBT به عنوان یک واحد فعالیت آنزیم در نظر گرفته شد و فعالیت ویژه آنزیم به صورت واحد بر میلی‌گرم پروتئین (U mg-1 protein) بیان گردید.

فعالیت آنزیم SOD طبق روش Boominathan و  Doran(2002) بر اساس کاهش جذب در طول موج 290 نانومتر انجام گرفت (9). 1 میلی لیتر محلول واکنش حاوی 300 میکرولیتر بافر فسفات سدیم 50 میلی­مولار (7=pH)، 200 میکرولیتر EDTA با غلظت 2/0 میلی مولار، 200 میکرولیتر اسید آسکوربیک 5/0 میلی­مولار،200 میکرولیتر آلبومین سرم گاوی 50 میلی­مولار، 50 میکرولیتر عصاره آنزیمی و 50 میکرولیتر پراکسید هیدروژن 1/0 میلی­مولار بود. واکنش با افزودن پراکسید هیدروژن شروع شد و فعالیت آنزیم با استفاده از ضریب خاموشی اسید آسکوربیک (mM-1 cm-1 6/2) محاسبه گردید. یک واحد فعالیت آنزیم به‌ صورت مقدار آنزیم لازم برای احیای 1 میکرولیتر اسید آسکوربیک در دقیقه در نظر گرفته شد و فعایت ویژه آنزیم به صورت واحد بر میلی‌گرم پروتئین (U mg-1 protein) بیان گردید.

سنجش مالون دی­آلدئید: غلظت مالون دی­آلدئید (MDA) طبق روش Boominathan و  Doran(2002) اندازه گیری شد (9). 1/0 گرم از نمونه‌ها در 2 میلی­لیتر اسید تری‌کلرواستیک 1/0 درصد درصد همگن شده و به مدت 5 دقیقه در g10000 سانتریفیوژ گردید. 5/0 میلی­لیتر از محلول رویی با 2 میلی­لیتر اسید تری‌کلرواستیک 20 درصد حاوی 5/0 درصد اسید تیوباربیتوریک مخلوط گشت و به مدت 30 دقیقه در حمام آب گرم (95 درجه سانتی گراد) حرارت داده شد. محلول حاصل سریعاً به آب یخ منتقل شده و بعد از 5 دقیقه به مدت 15 دقیقه در g10000 سانتریفیوژ گردید. در نهایت جذب نوری نمونه‌ها در 532 نانومتر اندازه‌گیری شد و مقدار MDA با استفاده از منحنی استاندارد تهیه شده با غلظتهای مختلف از 3،1،1،3- تترا اتوکسی پروپان (100-1نانومول) محاسبه و بر حسب میکروگرم بر گرم وزن تر (g g-1 FWµ) بیان گردید.

سنجش پراکسید هیدروژن: غلظت پراکسید هیدروژن طبق روش  Harinasutو همکارن (2003) اندازه‌گیری شد (15). نمونه‌ها در اسید تری‌کلرواستیک 1/0 درصد همگن شده و به مدت 15 دقیقه در g12000 سانتریفیوژ گردیدند. بلافاصله 5/0 میلی­لیتر از روشناور با 5/0 میلی­لیتر بافر فسفات 10 میلی­مولار (7pH=) و یک میلی­لیتر یدور پتاسیم 1 میلی­مولار مخلوط شدند و در دمای 25 درجه به مدت 15 دقیقه قرار گرفتند. نهایتاً جذب نوری نمونه‌ها در 390 نانومتر اندازه‌گیری شد و غلظت پراکسید هیدروژن آنها براساس منحنی استاندارد تهیه شده از غلظتهای مختلف پراکسید هیدروژن (Merck, Schuchardt, Germany) (120-0 میکرومول) محاسبه شده و به­ صورت میکروگرم بر گرم وزن تر (g g-1 FWµ) بیان گردید.

محاسبات آماری: آزمایش در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار برای هر تیمار انجام شد. تجزیه واریانس نتایج با استفاده از نرم افزارMSTAT-C و مقایسه میانگینها با آزمون توکی در سطح احتمال 5 درصد انجام شد. ترسیم نمودارها با استفاده از نرم افزار Microsoft Excel 2007 انجام گرفت.

نتایج

تأثیر غلظتهای مختلف فنانترن و پیرن بر شاخصهای رشد: تیمار پیرن و فنانترن باعث کاهش رشد گیاه گندم شد (شکل1)، به­طوریکه این کاهش در وزن تر و خشک و همچنین طول اندامهای هوایی و ریشه گیاهان قابل مشاهده بود. کاهش رشد گیاهان در تیمارهای فنانترن بیشتر از تیمارهای پیرن بود. غلظتهای بالاتر از mg kg-1  100 از فنانترن و بالاتر از mg kg-1  300 از پیرن باعث کاهش معنی‌دار وزن تر، خشک و طول اندامهای هوایی گردیدند. اختلاف معنی‌داری بین غلظتهای مختلف پیرن مشاهده نشد، ولی افزایش غلظت فنانترن باعث کاهش معنی‌دار این شاخصها گردید (05/0≥p) (جدول 1).

 

 

شکل1- تأثیر غلظتهای مختلف (mg kg-1) پیرن (الف) و فنانترن (ب) بر رشد گیاهان 30 روزه‌ی گندم (Pyr: پیرن، Phe: فنانترن).

 

جدول 1- تأثیر غلظتهای مختلف (100، 200، 300، 400 و mg kg-1 500) فنانترن و پیرن بر شاخصهای رشد گیاه گندم سی روزه. اعداد مربوط به هر شاخص که دارای حروف مشترک می‌باشند از نظر آماری تفاوت معنی‌داری با هم ندارند (05/0≥p و 3=n).

 

غلظت

اندام‌های هوایی

ریشه

وزن تر (mg)

وزن خشک (mg)

طول (cm)

وزن تر (mg)

وزن خشک (mg)

طول (cm)

شاهد

0

77/16 ± 11/151 a

83/2 ± 11/23 a

21/3 ± 00/36 a

84/3 ± 89/48 a

58/1 ± 89/9 a

80/4 ± 33/45 a

پیرن

100

47/13 ± 22/132 ab

45/2 ± 55/19 ab

34/1 ± 10/32 ab

84/3 ± 22/52 a

69/0 ± 55/8 ab

50/5 ± 21/36 b

200

38/8 ± 44/124 ab

20/1 ± 00/18 ab

14/2 ± 88/30 ab

09/5 ± 88/48 a

33/0 ± 66/7 b

85/1 ± 66/38ab

300

93/9 ± 89/118 b

26/1 ± 22/16 bc

45/1 ± 33/30 b

69/7 ± 77/47 a

19/0 ± 44/7 b

14/2 ± 77/35 b

400

71/10 ± 11/121b

96/2 ± 00/17 b

14/2 ± 21/30 b

09/5 ± 22/52 a

69/0 ± 89/7ab

43/4 ± 77/37 ab

500

66/6 ± 00/120 b

64/1 ± 22/16 bc

50/1 ± 44/30 ab

93/6 ± 11/51 a

19/0 ± 89/6 bc

15/1 ± 99/36 ab

فنانترن

100

00/10 ± 00/120 b

16/2 ± 44/17 b

60/2 ± 10/30 b

92/1 ± 11/41 ab

84/0 ± 78/6 bc

71/2 ± 22/35 b

200

09/5 ± 22/82 c

38/0 ± 44/11 cd

83/1 ± 22/23 c

33/3 ± 33/33 bc

33/0 ± 00/5 cd

38/1 ± 88/24 c

300

09/5 ± 88/78 c

50/0 ± 88/10 d

15/1 ± 66/19 cd

77/5 ± 66/26 c

77/0 ± 88/3 d

17/1 ± 22/23c

400

92/1 ± 11/71 c

33/0 ± 33/9 d

45/1 ± 33/19 cd

92/1 ± 55/25 c

58/0 ± 66/3 d

57/0 ± 32/22c

500

09/5 ± 77/67 c

19/0 ± 22/9 d

00/1 ± 66/16 d

92/1 ± 44/24 c

51/0 ± 44/3 d

20/1 ± 99/17 c

 


رنگیزه‌های فتوسنتزی: پیرن تأثیر معنی‌داری بر محتوای رنگیزه‌های فتوسنتزی نداشت، ولی فنانترن باعث کاهش معنی‌دار محتوای کلروفیل a، b و کاروتنوئیدها در مقایسه با گیاهان شاهد گردید (05/0≥p). هر چند اختلاف معنی‌داری بین تیمارهای مختلف فنانترن وجود نداشت (شکل2)، ولی فنانترن به ترتیب باعث کاهش 16/23، 36/24 و 98/19 درصدی در محتوای کلروفیل a، b و کاروتنوئیدها در غلظت 200، و همچنین کاهش 22/25، 25/24 و 21/23 درصدی در غلظتmg kg-1  400 شد.

 

 

شکل2- تأثیر فنانترن و پیرن بر محتوای کلروفیلa، b و کاروتنوئیدها در اندامهای هوایی گیاه گندم. حروف یکسان نشان دهنده عدم تفاوت معنی‌دار در سطح احتمال 5 درصد می‌باشد (3=n).


شاخص تمامیّت غشاء (MSI): پیرن تأثیر معنی‌داری بر شاخص تمامیت غشای اندامهای هوایی و ریشه نداشت، اما فنانترن باعث کاهش این شاخص هم در اندامهای هوایی و هم در ریشه گردید (05/0≥p). کاهش شاخص تمامیت غشاء تحت تیمار فنانترن در ریشه بیشتر از اندامهای هوایی بود. فنانترن در غلظت mg kg-1 400 باعث کاهش معنی‌دار شاخص تمامیت غشاء هم در اندامهای هوایی (08/22 درصد) و هم در ریشه (31/37 درصد) گردید (شکل3).

 

 

شکل3- تأثیر فنانترن و پیرن بر شاخص تمامیّت غشاء (MSI) در اندامهای هوایی (a) و ریشه (b) گیاه گندم. حروف یکسان نشان دهنده عدم تفاوت معنی‌دار در سطح احتمال 5 درصد است (3=n).

 


مالون دی آلدئید (MDA): هیچیک از دو ترکیب فنانترن و پیرن تأثیر معنی‌داری بر غلظت مالون دی­آلدئید اندامهای هوایی نداشتند (05/0≥p)، ولی در ریشه فنانترن باعث افزایش معنی‌دار غلظت مالون دی­آلدئید در مقایسه با گیاهان شاهد و تیمار شده با پیرن گردید. فنانترن به ترتیب باعث افزایش 89/20 و 44/28 درصدی غلظت مالون دی­آلدئید ریشه در غلظتهای200 و mg kg-1 400 نسبت به گیاهان شاهد گردید (شکل4).

 

 

شکل4- تأثیر فنانترن و پیرن بر غلظت مالون دی آلدئید در اندامهای هوایی (a) و ریشه (b) گیاه گندم. حروف یکسان نشان دهنده عدم تفاوت معنی‌دار در سطح احتمال 5 درصد است.


پراکسید هیدروژن (H2O2): پیرن تأثیر معنی‌داری بر محتوای پراکسید هیدروژن اندامهای هوایی و ریشه گیاهان نداشت، اما فنانترن باعث کاهش معنی‌دار پراکسید هیدروژن اندامهای هوایی و برعکس افزایش معنی‌دار این ماده در ریشه در مقایسه با شاهد گردید (05/0≥p). فنانترن در اندامهای هوایی باعث کاهش 14/34 و 98/44 درصدی و در ریشه باعث افزایش 00/31 و 70/46 درصدی مقدار پراکسید هیدروژن به ترتیب در غلظت 200 و mg kg-1 400 در مقایسه با گیاهان شاهد گردید (شکل5).

 

 

شکل5- تأثیر فنانترن و پیرن بر غلظت پراکسید هیدروژن در اندامهای هوایی (a) و ریشه (b) گیاه گندم. حروف یکسان نشان دهنده عدم تفاوت معنی دار در سطح احتمال 5 درصد است.


محتوای پروتئین محلول کل: پیرن هم در اندامهای هوایی و هم در ریشه تأثیر معنی‌داری بر محتوای پروتئین محلول کل نداشته، اما فنانترن باعث افزایش معنی‌دار محتوای پروتئین کل در اندامهای هوایی و با شدت بیشتر در ریشه گردید (05/0≥p) (شکل6). فنانترن در سطح mg kg-1 400 باعث افزایش 96/20 و 33/58 درصدی پروتئین محلول کل به ترتیب در اندامهای هوایی و ریشه شد.

فعالیت آنزیمهای پاداکساینده: پیرن تأثیر معنی‌داری بر فعالیت آنزیم CAT در اندامهای هوایی و ریشه نداشت، اما فنانترن باعث کاهش فعالیت این آنزیم در اندامهای هوایی و افزایش فعالیت آن در ریشه گردید. کاهش فعالیت این آنزیم در اندامهای هوایی (27/28 درصد) و افزایش فعالیت آن در ریشه (25/52  درصد) در سطح mg kg-1400 معنی‌دار بود (05/0≥p) (شکل7).

 

 

شکل6-تأثیر فنانترن و پیرن بر محتوای پروتئین محلول (mg gr-1 FW) در اندامهای هوایی (a) و ریشه (b) گیاه گندم. حروف یکسان نشان دهنده عدم تفاوت معنی دار در سطح احتمال 5 درصد است.

 

شکل7- تأثیر فنانترن و پیرن بر فعالیت آنزیم CAT  در اندامهای هوایی(a) و ریشه (b) گیاه گندم. حروف یکسان نشان دهنده عدم تفاوت معنی‌دار در سطح احتمال 5 درصد می‌باشد.


هر دو تیمار باعث کاهش فعالیت آنزیمهای APX، SOD و POD هم در اندامهای هوایی و هم در ریشه گیاه گردیدند که این تغییر در ریشه شدیدتر از اندامهای هوایی بود. در اندامهای هوایی پیرن و فنانترن در سطح mg kg-1 400 باعث کاهش به ترتیب 53/50 و 97/32 درصدی و در ریشه به ترتیب باعث کاهش فعالیت 91/59 و 99/69 درصدی آنزیم APX گردیدند (شکل8). تأثیر پیرن در اندامهای هوایی بر فعالیت آنزیمهای SOD و POD معنی‌دار نبود ولی فنانترن به طور معنی‌داری باعث کاهش فعالیت این دو آنزیم گردید (05/0≥p)(شکل a9 و a10). الگوی تغییرات دو آنزیم SOD و POD در ریشه نیز شبیه تغییرات APX تحت تیمار دو آلاینده بود (شکل b8، b9 و b10).

 

 

شکل8- تأثیر فنانترن و پیرن بر فعالیت آنزیم APX  در اندامهای هوایی(a) و ریشه (b) گیاه گندم. حروف یکسان نشان دهنده عدم تفاوت معنی‌دار در سطح احتمال 5 درصد می‌باشد.

 

شکل9- تأثیر فنانترن و پیرن بر فعالیت آنزیم SOD  در اندامهای هوایی(a) و ریشه (b) گیاه گندم. حروف یکسان نشان دهنده عدم تفاوت معنی‌دار در سطح احتمال 5 درصد می‌باشد.

 

 

شکل10- تأثیر فنانترن و پیرن بر فعالیت آنزیم POD  در اندامهای هوایی(a) و ریشه (b) گیاه گندم. حروف یکسان نشان دهنده عدم تفاوت معنی‌دار در سطح احتمال 5 درصد می‌باشد.


بحث

فنانترن و پیرن باعث کاهش رشد گیاه گندم شدند، ولی اثر بازدارند‌گی ترکیب فنانترن بسیار بیشتر از پیرن بود. پیرن در غلظتهای بالاتر از mg kg-1 300 اثرات معنی‌داری در بازدارند‌گی رشد گیاه گندم نسبت به شاهد از خود نشان داد، در حالی که فنانترن اثرات بازدارندگی خود را حتی از سطح mg kg-1 100 نیز نشان داد. در تیمار پیرن بین غلظتهای مختلف اعمال شده تفاوت معنی‌داری وجود نداشت، ولی این اختلاف بین تیمارهای فنانترن مشاهده شد که حاکی از اثرات بازدارند‌گی قوی‌تر فنانترن متناسب با افزایش غلظت می‌باشد. کاهش رشد گیاهان در حضور ترکیبات آروماتیک چند حلقه‌ای (PAHs) در گیاه گندم (22 و 24)، برنج (Oryza sativa L.) (17)، یونجه
(Medicago sativa) (19)، ذرت (Zea mays)، نخود (Cicer arietinum) (16) و آرابیدوپسیس تالیانا (18) قبلاً نیز گزارش شده است. از طرفی، در مطالعات دیگر بعضی گیاهان از جمله سورگوم (Sorghom vulgare) در برابر فنانترن مقاوم می‌باشند و کاهش رشد معنی‌دار نشان نمی‌دهند (3). پیرن تأثیر معنی‌داری در مقدار رنگیزه‌های فتوسنتزی نداشت، اما فنانترن باعث کاهش معنی‌دار این رنگیزه‌ها گردید. کاهش معنی‌دار رنگیزه‌های فتوسنتزی در تیمار فنانترن در گیاه گندم (20و22) و آرابیدوپسیس تالیانا (18) قبلاً مشاهده شده است. از آنجایی که محتوای کلروفیل، مشخصه مؤثری در فعالیتهای فتوسنتزی می­باشد و عموماً به عنوان شاخصی برای نشان دادن شدت تنش در گیاهان استفاده می‌شود (3)، بنابراین براساس داده‌های به­دست آمده از این پژوهش می‌توان گفت که فنانترن در مقایسه با پیرن برای گیاه گندم بیشتر تنش‌زا می‌باشد. پیرن تأثیر معنی‌داری بر شاخص تمامیت غشای اندامهای هوایی و ریشه نداشت ولی فنانترن باعث کاهش معنی‌دار این شاخص در اندامهای هوایی، به­خصوص ریشه گردید. تغییر در شاخص تمامیّت غشاء دارای همبستگی منفی و معنی­داری با میزان تغییرات در غلظت مالون دی­آلدئید در اندامهای هوایی (0548/0=p و 992/0= r2) و ریشه (158/0=p و 939/0= r2) بود. همچنین همبستگی منفی معنی‌داری نیز بین غلظت H2O2 ریشه و کاهش در شاخص تمامیت غشاء (048/0=p و 994/0= r2) وجود داشت. صدمه ناشی از عوامل تنش زای محیطی نظیر گرما، سرما، خشکی، شوری و بسیاری از عوامل تنش زای محیطی در مرحله اول بر روی غشاهای سلولی قابل مشاهده است (4). این نتایج نشان می­دهند که تنش اکساینده ناشی از سمیّت این ترکیبات باعث آسیب به غشاهای سلولی و در نتیجه کاهش تمامیّت آنها گردیده است. از طرف دیگر چون محتوای پروتئین کل درگیاهان تیمار شده با فنانترن که بیشتر علائم تنش را نشان دادند، به طور معنی‌داری افزایش یافت، به نظر می‌رسد که احتمالاً این عمل یک سازوکار سازشی در برابر تنش باشد که هم پروتئینهای آسیب دیده را جایگزین می‌کند و هم آنزیمهای پاداکساینده زیادی را تولید کند (24).

پیرن در اندامهای هوایی تأثیر معنی‌داری بر فعالیت آنزیمهای پاداکساینده نداشت، اما فنانترن باعث کاهش فعالیت هر چهار آنزیم بررسی شده در اندامهای هوایی گردید. در ریشه هر دو ترکیب باعث کاهش فعالیت سه آنزیم APX، POD و SOD و افزایش فعالیت آنزیم CAT گردیدند که تأثیر فنانترن در این تغییرات نیز بیشتر از پیرن بود. نتایج متفاوتی از تأثیر PAHs بر فعالیت آنزیمهای پاداکساینده در گیاهان گزارش شده است. Liu و همکاران (2008) در آرابیدوپسیس تالیانا نشان داده‌اند که فنانترن باعث افزایش فعالیت سه آنزیم APX، POD و SOD گردیده ولی تأثیری در فعالیت آنزیم CAT نداشته است (18). در یونجه (Medicago sativa) فنانترن باعث افزایش فعالیت آنزیم POD (19و22) گردیده و کاهش فعالیت CAT در گندم، یونجه و آفتاب‌گردان (Helianthus annuus) تیمار یافته با فنانترن قبلاً گزارش شده است (22).

عموماً شرایط تنش باعث افزایش رادیکالهای اکسیژن فعال و فعال شدن فرآیندهای مخرب غشاء گردیده و منجر به اکسایش لیپیدهای غشاء می‌شود (1، 8 و 23). طبق نتایج حاصل از سنجش غلظت H2O2، MDA، شاخص تمامیت غشاء و فعالیت آنزیمهای پاداکساینده در این پژوهش می‌توان نتیجه گرفت که فنانترن و تا حدودی پیرن از طریق ایجاد تنش اکساینده باعث اختلال در رشد گیاه گندم می‌شوند که علائم تنش در ریشه شدیدتر از اندامهای هوایی می‌باشد. از آنجایی که حلالیّت فنانترن در آب (mg l-1 18/1 در 25 درجه سانتی گراد) بیشتر از پیرن (mg l-1 12/0 در 25 درجه) می‌باشد، بنابراین به نظر می‌رسد که فنانترن بیشتر از پیرن می‌تواند جذب گیاه شود. از سوی دیگر، در داخل گیاه نیز پیرن به علت چربی دوستی بیشتر تمایل به باقی ماندن در ریشه دارد و کمتر به اندامهای هوایی انتقال می‌یابد (14)، بنابراین فنانترن بیشتر از پیرن می‌تواند در گیاه باعث ایجاد تنش گردد. در یک بررسی دیگر نشان داده شده که فنانترن باعث اختلال در رشد و تکامل ریشه می‌شود و از این رو به ­واسطه ایجاد اختلال در جذب مواد باعث اختلال در متابولیسم و به تبع آن ایجاد تنش و کاهش رشد گیاه می‌شود (12).

نتیجه گیری نهایی

نتایج این پژوهش نشان داد که فنانترن و تا حدودی پیرن به عنوان دو ماده سمی می‌توانند توسط ریشه، جذب  گیاه گندم شوند و از طریق ایجاد اختلال در عملکرد ریشه که از یکی علائم آن می‌تواند کاهش تمامیّت غشای ریشه باشد، باعث ایجاد تنش در اندامهای هوایی گردد. علائم این تنش به­صورت کاهش رنگیزه‌های فتوسنتزی و به تبع آن فتوستنز، اختلال در عملکرد آنزیمهای پاداکساینده و در نتیجه آن افزایش مواد اکساینده و در نهایت کاهش رشد گیاه ظاهر می‌گردد. با توجه به نتایج به دست آمده از این پژوهش، چون گیاه گندم یک گیاه حساس در برابر حداقل فنانترن می‌باشد، این موضوع در کشت گندم در خاکهای آلوده به هیدروکربنهای آروماتیک چند حلقه باید مورد توجه قرار گیرد.

1- رحیمی تشی، ط. و نیکنام، و. (1394). بررسی تأثیر پیش تیمار سالیسیلیک اسید بر برخی پاسخ های فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی گندم  (Triticum aestivum L.) به تنش شوری. مجله پژوهشهای گیاهی. جلد 28: 306-297.

2- صابونچی محمدی، ف.، صالحی لیسار س.ی. و مسن هرزندی، ا. (1393). اثرات فیزیولوژیک تنش ناشی از سمیّت فنانترن در گیاه گندم رویش یافته در خاکهایی با بافت متفاوت. مجله فیزیولوژی تنش گیاهان. جلد1: 10-1.

3- علایی، ا.، وکیلی، ف. و مهردادشریف، ا.ع. (1389). گیاه‌پالایی خاکهای آلوده به "فنانترن" با استفاده از گیاه سورگوم. محیط شناسی. جلد 53: 88-79.

4- عمو آقایی، ر.، قربان نژاد نی ریزی، ه. و مستاجران، ا. (1393). بررسی اثر شوری بر رشد گیاهچه، میزان کلروفیل، محتوای نسبی آب و پایداری غشا در دو رقم کلزا. مجله پژوهشهای گیاهی. جلد 27: 268-256.

 

5- Aina, R., Palin, L. and Citterio, S. (2006). Molecular evidence for benzo[a]pyrene and naphthalene genotoxicity in Trifolium repens L.. Chemosphere. 65: 666-673.

6- Alkio, M., Tabuchi, T.M., Wang, X. and Colon-Carmona A. (2005). Stress responses to polycyclic aromatic hydrocarbons in Arabidopsis include growth inhibition and hypersensitive response-like symptoms. Journal of Experimental Botany. 56: 2983–2994.

7- Arnon, D.J. (1949). Copper enzymes in isolated chloroplasts.Polyphenyloxidase in Beta vulgaris. Plant Physiology. 24: 1–15.

8- Artetxe, U., Garcia–Plazaola, J.I., Hernandez, A. and Becerril, J.M. (2002). Low light grown duckweed plants are more protected against the toxicity induced by Zn and Cd. Plant Physiology and Biochemistry. 40: 859-863.

9- Boominathan, R. and Doran, P.M. (2002). Ni-induced oxidative stress in roots of the Ni hyperaccumulator, Alyssum bertoloni. New Phytologist. 156: 205-215.

10- Bradford, M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantization of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72: 248-254.

11- Chance, B. and Maehly, A.C. (1955). Assay of catalases and peroxidases: methods in enzymology, pp. 764-775. New York, Academic Press.

12- Dupuy, J., Leglize, P., Vincent, Q., Zelko, I., Mustin, C., Ouvrard, S. and Sterckeman, T. (2016). Effect and localization of phenanthrene in maize roots. Chemosphere. 149: 130-136.

13- Foyer, C.H. and Noctor, G. (2005). Oxidant and antioxidant signalling in plants: a re-evaluation of the concept of oxidative stress in a physiological context. Plant Cell and Environment. 28: 1056–1071.

14- Fuxing K, Dongsheng C, Yanzheng G, Yi Z. 2010 . Distribution of polycyclic aromatic hydrocarbons in subcellular root tissues of ryegrass. BMC Plant Biology.10 : 210-216.

15- Harinasut, P., Poonsopa, D., Roengmongkol, K. and Charoensalaporn, R. (2003). Salinity effects on antioxidant enzymes in mulburg cultivar. Science Asia. 29: 109-113.

16- Kummerova, M., Zezulka, S., Vanova, L. and Fiserova, H. (2012). Effect of organic pollutant treatment on the growth of pea and maize seedlings. Central European Journal of Biology. 7: 159-166.

17- Li, J.H., Gao, Y., Wu, S.C., Cheung, K.C., Wang, X.R. and Wong, M.H. (2008). Physiological and biochemical responses of rice (Oryza sativa L.) to phenanthrene and pyrene. International Journal of Phytoremediation. 10: 106–118.

18- Liu, H., Weisman, D., Yuan-bei, Y., Cui, B., Huang, Y., Colon-Carmona, A. and Wang, Z. (2008). An oxidative stress response to polycyclic aromatic hydrocarbon exposure is rapid and complex in Arabidopsis thaliana. Plant Science. 176: 375- 382.

19- Muratova, A.Y., Kapitonova, V.V., Chernyshova, M.P. and Turkovskaya, O.V. (2009). Enzymatic Activity of alfalfa in a phenanthrene-contaminated environment. World Academy of Science, Engineering and Technology. 3: 545-550.

20- Obinger, C., Maj, M., Nicholls, P. and Loewen, P. (1997). Activity, peroxide compound formation, and heme d synthesis in Escherichia coli HPII catalase. Archives of Biochemistry and Biophysics. 342: 58-67.

21- Sairam, R.K., Veerabhadra Rao, K. and Srivastava, G.C. (2002). Differential response of wheat genotypes to long term salinity stress in relation to oxidative stress, antioxidant activity and osmolyte concentration. Plant Science, 163: 1037-1046.

22- Salehi-Lisar, S.Y. and Deljoo S. (2015). Physiological effect of phenanthrene on Triticum aestivum, Helianthus annus and Medicago sativa. EurAsian Journal of BioSciences. 9: 29-37.

23- Sofo, A., Dichio, B., Xiloyannis, C. and Masia, A. (2004). Effects of different irradiance levels on some antioxidant enzymes and on malondialdehyde content during rewatering in olive tree. Plant Science. 106: 293-300.

24- Tomar, R.S. and Jajoo, A. (2014). Fluoranthene, a polycyclic aromatic hydrocarbon, inhibits light as well as dark reactions of photosynthesis in wheat (Triticum aestivum L.). Ecotoxicology and Environmental Safety. 109: 110-115.

25- Winterbourn, C.C., Mc Grath, B.W. and Carrell, R.W. (1976). Reactions involving superoxide and normal unstable hemoglobins. Biochemical Journal. 155: 493-502.