نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 اصفهان، دانشگاه صنعتی اصفهان، دانشکده کشاورزی، گروه زراعت واصلاح نباتات

2 عضو هیئت علمی/ دانشگاه اصفهان

چکیده

استفاده از گیاهان دارویی در مهار و درمان دیابت از طریق توقیف مکانیزم‌های تخریب زیست مولکول‌ها، موضوعی مهم در حیطه زیست پزشکی است. گیاه دارویی Achillea متعلق به خانواده کاسنی (Asteraceae) است و از گذشته‌های دور به‌ طور گسترده در طب سنتی استفاده می‌شود. گونه A. pachycephala یکی از گونه‌های ارزشمند بومادران است که به عنوان منبع غنی آنتی اکسیدان‌ها محسوب می‌شود. هدف از اجرای این پژوهش، بررسی اثر مراحل مختلف فنولوژیک شامل پنج برگی، غنچه دهی، %50 گلدهی و %100 گلدهی بر خاصیت آنتی‌اکسیدانی و ضددیابتی عصاره متانولی گل‌هایA. pachycephala بود. فعالیت آنتی‌اکسیدانی با استفاده از مدل سیستم آلفا و آلفا- دی فنیل- بتا- پیکریل هیدرازیل (DPPH) و قدرت احیاکنندگی آهن (FTC) سنجش شد. میزان گلایکه‌ شدن آلبومین نیز براساس درجه قهوه‌ای شدن و پاسخ‌دهی معرف قرمز کنگو ارزیابی گردید. نتایج نشان داد که خاصیت آنتی‌گلایکیشنی گیاه در مرحله 50% گلدهی بیشتر از سایر مراحل بود و بیشترین مقدار فنول تام، فلاونوئید تام و فعالیت آنتی‌اکسیدانی نیز در این مرحله مشاهده شد. نتایج همچنین نشان داد که بین خاصیت آنتی‌اکسیدانی و آنتی‌گلایکیشن ارتباط مستقیمی وجود دارد. احتمالاً A. pachycephala به ‌واسطه‌ خاصیت آنتی ‌اکسیدانی قوی خود از گلایکه شدن پروتئین جلوگیری می‌نماید و از ‌این‌رو می‌تواند کاندید مناسبی در کاهش عوارض دیابت معرفی گردد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Influence of different phonological stage of Achillea pachycephala Rech.f. on albumin glycation inhibition, an in vitro study.

نویسندگان [English]

  • Mahvash Afshari 1
  • Mehdi Rahimmalek 1
  • Mehran Miroliaei 2

1 Department, of Agronomy and Plant Breeding, College of Agriculture, Isfahan University of Technology, 8415683111 Isfahan , Iran

2 university of isfahan

چکیده [English]

From biomedicine point of view, the application of medicinal plants to prevent and treat diabetes via intervention in biomolecule degradation mechanisms, is an important issue. Achillea L. belongs to Asteraceae family and have traditional properties with different applications in folk medicine. A. pachycephala is one of the valuable species of Achillea which has been considered as a rich source of antioxidants. The present study aimed to investigate the effect of various phenological stages including five leaves appearance, sprouting, 50% and 100% flowering on antiglycative and antioxidant activity of A. pachycephala flowers extract. Antioxidant activity were evaluated based on 1,1-diphenyl 2-picrylhydrazyl (DPPH) and reducing power (FTC) methods. The inhibitory effect of the extracts was determined in albumin glycation model using Congo red binding and brown staining assays. The results showed that the extracts collected at 50% flowering stage had the highest antiglycative potential, the highest amounts of total phenols, total flavonoids and antioxidant activities. Besides, a direct correlation between antioxidant and anti-glycative activity was suggested. Most likely, A. pachycephala prevents albumin glycation originating from its strong antioxidant properties, therefore it can be considered as a good candidate for reducing complications of diabetes.

کلیدواژه‌ها [English]

  • "antioxidant activity"
  • " antiglycation"
  • "Achillea"
  • "phenological stages"

تأثیر مراحل فنولوژیک گیاه داروییAchillea pachycephala Rech.f. بر مهار گلایکه شدن آلبومین در شرایط in vitro

مهوش افشاری1، مهدی رحیم ملک1* و مهران میراولیایی2

1 ایران، اصفهان، دانشگاه صنعتی اصفهان، دانشکده کشاورزی، گروه زراعت واصلاح نباتات

2 ایران، اصفهان، دانشگاه اصفهان، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی

تاریخ دریافت: 27/4/97                تاریخ پذیرش: 23/10/97

چکیده

استفاده از گیاهان دارویی در مهار و درمان دیابت از طریق توقیف مکانیزم­های تخریب زیست مولکول­ها، موضوعی مهم در حیطه زیست پزشکی است. گیاه دارویی Achillea متعلق به خانواده کاسنی (Asteraceae) است و از گذشته‌های دور به‌ طور گسترده در طب سنتی استفاده می­شود. گونه A. pachycephala یکی از گونه­های ارزشمند بومادران است که به عنوان منبع غنی آنتی اکسیدان­ها محسوب می­شود. هدف از اجرای این پژوهش، بررسی اثر مراحل مختلف فنولوژیک شامل پنج برگی، غنچه دهی، %50 گلدهی و %100 گلدهی بر خاصیت آنتی­اکسیدانی و ضددیابتی عصاره متانولی گل­هایA. pachycephala بود. فعالیت آنتی­اکسیدانی با استفاده از مدل سیستم آلفا و آلفا- دی فنیل- بتا- پیکریل هیدرازیل (DPPH) و قدرت احیاکنندگی آهن (FTC) سنجش شد. میزان گلایکه­ شدن آلبومین نیز براساس درجه قهوه­ای شدن و پاسخ­دهی معرف قرمز کنگو ارزیابی گردید. نتایج نشان داد که خاصیت آنتی­گلایکیشنی گیاه در مرحله 50% گلدهی بیشتر از سایر مراحل بود و بیشترین مقدار فنول تام، فلاونوئید تام و فعالیت آنتی­اکسیدانی نیز در این مرحله مشاهده شد. نتایج همچنین نشان داد که بین خاصیت آنتی­اکسیدانی و آنتی­گلایکیشن ارتباط مستقیمی وجود دارد. احتمالاً A. pachycephala به ‌واسطه‌ خاصیت آنتی ‌اکسیدانی قوی خود از گلایکه شدن پروتئین جلوگیری می­نماید و از ‌این‌رو می­تواند کاندید مناسبی در کاهش عوارض دیابت معرفی گردد.

واژه های کلیدی:خاصیت آنتی­اکسیدانی، آنتی­گلایکیشن، بومادران، مراحل فنولوژیک.

* نویسنده مسئول، تلفن: 0313313348 ، پست الکترونیکی:  mrahimmalek@cc.iut.ac.ir

مقدمه

 

بسیاری از بیماری­ها نظیر دیابت، سرطان، آترواسکلروز، آرتریت، اختلالات قلبی عروقی و همچنین صدمات فیزیکی و پیری، ارتباط اساسی با استرس اکسیداتیو دارند (4). رادیکال­های آزاد به دلیل داشتن الکترون آزاد، گونه هایی فعال و در نتیجه ناپایدار هستند. گونه­های فعال اکسیژن (ROS) شامل آنیون سوپراکسید، رادیکال­هیدروکسیل و پراکسید­هیدروژن به علت تمایل زیاد برای واکنش با سایر مولکول­ها می­توانند به سلول­ها و بافت­ها آسیب برسانند (4). این مولکول­ها در غلظت­های بالا موجب ایجاد وضعیتی به نام استرس اکسیداتیو می­شوندکه در اثر برهم خوردن تعادل بین تولید رادیکال­های آزاد از یک سو و تضعیف سیستم آنتی­اکسیدانی ازسوی دیگر ایجاد می­شود (2). گیاهان دارویی قادرند تحت استرس­های محیطی با سنتز مواد ﻣﺆثر ثانویه و فعال از جمله پلی فنول­ها، در پیشگیری و درمان بیماری­ها ﻣﺆثر واقع شوند. آن­ها همچنین قدرت پاک­کنندگی رادیکال­های آزاد و کلاته­کنندگی فلزات را دارند (32). شناسایی شاخص­های کلیدی جهت انجام مطالعات فیتوشیمیایی، آنتی­اکسیدانی و خواص درمانی گیاهان دارویی در مهار رادیکال­های آزاد، پیشگیری و درمان بسیاری از بیماری­های شایع التهابی از جمله دیابت و کاهش عوارض آنها امری ضروری است. به همین دلیل مطالعات اتنوفارماکولوژیکی، فیتوشیمیایی و آنتی­اکسیدانی در بررسی خواص آنتی­دیابتیک گیاهان دارویی مورد توجه ویژه محققین قرار­دارد (16). از طرفی، میزان و نوع مواد ﻣﺆثر موجود در گیاهان که عمدتاً متابولیت­های ثانویه هستند، در طول دوره رشد و نمو گیاه تغییر می­کند. بنابراین، خواص دارویی گیاهان که وابسته به حضور متابولیت­های ثانویه است، نیزممکن است دچار تغییر شوند (17). گیاه بومادران به علت داشتن خاصیت آنتی­اکسیدانی و خواص دارویی متنوع در طب سنتی و طب نوین کاربردهای فراوان دارد. نوزده گونه از این گیاه در ایران موجود است که برخی گونه­های آن انحصاری هستند (1). از مهم­ترین گونه­های آن می­توان به A. pachycephala اشاره نمود (26و35). گـزارش­ها حکایت از خواص فارماکولوژیک بومادران، مشتمل بر خصوصیات ضددیابت، ضدقارچ، ضدفشارخون، تب بری، ضدالتهابی و تنظیم کننده سیستم گوارشی دارد. تاکنون گزارشی مبنی بر اثر مراحل مختلف نموی بر فعالیت آنتی­اکسیدانی و بررسی خاصیت آنتی گلایکیشن گیاه بومادران گزارش نشده ­است. همچنین به دلیل آنکه، میزان کل ترکیبات فنولیک و فلاونوئید اثر مهمی روی خواص دارویی این گیاه می­گذارد، می­توان بهترین مرحله فنولوژیک را برای افزایش میزان کل ترکیبات فنولیک وآنتی اکسیدان و سایر متابولیت های ثانویه بومادران تعیین نمود. بنابراین، با توجه به اسـتفاده های فزاینـده ایـن گیـاه در طـب سنتی به­عنوان کاهش­دهنده قند خـون، در ایـن پـژوهش قدرت آنتی گلایکیشن عصاره A. pachycephalaو ارتباط آن با خاصیت آنتی اکسیدانی،در مراحل مختلف فنولوژیک گیاه ارزیابی شده است.

مواد و روشها

گیاه بومادران (Achillea pachycephala Rech.f.) از طول جغرافیایی'57°53 و عرض جغرافیایی '30°36 (استان گلستان) جمع آوری شد و با شماره نمونه (Voucher specimen number) 12334 در هرباریوم دانشگاه صنعتی اصفهان ثبت گردید. این آزمایش در محوطه کشت دانشگاه صنعتی اصفهان به اجرا درآمده است. عملیات کشت گونه­های بومادران در قالب یک طرح بلوک کامل تصادفی با 3 تکرار با تعداد 8 بوته با فواصل 20 سانتی­ متر و به صورت غیرجنسی(کلونی) درکرت­هایی به ابعاد 2×1، در عمق 10 سانتیمتری سطح خاک اجرا شد. بررسی­ها و نمونه­برداری­ها از ژنوتیپ A. pachycephala در چهار مرحله فنولوژیک (شامل پنج برگی، غنچه دهی، 50% گلدهی و 100% گلدهی) انجام گرفت.

نحوه تهیه عصاره از برگ: از ژنوتیپ A. pachycephala در چهار مرحله نموی مقدار 5/2 گرم نمونه خشک تهیه و پس از قرار­ دادن در متانول 80% عصاره­گیری شد. عصاره­های تهیه شده فیلتر شده و با استفاده از روش پرکولاسیون، عصاره­گیری و با روش تقطیر در خلأ تغلیظ گردیدند. عصاره­های خشک شده تا زمان انجام آزمایش در دمای چهار درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند.

تعیین ترکیبات فنولی: مقدار کل ترکیبات فنولی موجود در عصاره گیاهی بر اساس روش توحیدی و همکاران (33) اندازه­گیری شد. به طور خلاصه به 5/0 میلی­لیتر از عصاره­های مختلف رقیق شده (01/0 گرم در 10 میلی­لیتر متانول 80%) مقدار 5/2 میلی­لیتر محلول فولین سیوکالتیو 10% افزوده شد و پس از 3 تا 5 دقیقه مقدار 2 میلی­لیتر از کربنات سدیم 5/7% اضافه گردید. پس از 30 دقیقه انکوباسیون در دمای اتاق، جذب نمونه‌ها در مقابل محلول کنترل متانول در طول موج 765 نانومتر قرائت گردید. هم‏زمان با انجام آزمایش، رقت‌های مختلف اسید تانیک تهیه و مانند روش فوق آزمایش و منحنی استاندارد تهیه گردید. جذب نمونه‌ها با منحنی استاندارد مقایسه و مقدار فنول کل هر عصاره بر حسب میلی­گرم در هر گرم ماده خشک محاسبه گردید.

بررسی خاصیت آنتی­رادیکالی به روش :DPPH برای تعیین قدرت عصاره گیاهی در به دام انداختن رادیکال­های آزاد DPPH  بر اساس روش سلامی و همکاران (28) اندازه­گیری گردید. برای بررسی بهتر فعالیت آنتی­رادیکالی عصاره، از شاخص IC50 استفاده شد. IC50 بیان­گر مقدار میلی­گرمی از عصاره است که قادر به حذف 50 درصد از رادیکال­های DPPH موجود در محیط ­باشد. برای محاسبه آن ابتدا نموداری از رابطه میان مقادیر غلظت عصاره و درصد DPPH باقی­مانده رسم نموده و با توجه به نمودار حاصل و به صورت ترسیمی غلظتی از عصاره را که قادر است 50 درصد رادیکال­های آزاد را خنثی کند، تعیین می­شود. برای بررسی بهتر این فعالیت از آنتی­اکسیدان سنتزی (Butylated Hydroxy Toluene)BHT  به عنوان کنترل مثبت استفاده گردید.

بررسی قدرت احیاء­کنندگی آهن: برای تعیین قدرت احیاکنندگی آهن، محلولی از 1 میکروگرم عصاره در 1 میلی­لیتر آب مقطر تهیه گردید. یک میلی­لیتر از این محلول با 5/2 میلی­لیتر بافر فسفات 2/0 مولار (5/6pH:) و 5/2 میلی­لیتر محلول آبی یک درصد فری­سیانید پتاسیم [K3Fe(CN)6] مخلوط و سپس به مدت 30 دقیقه در دمای 50 درجه سانتی­گراد قرار داده شد. سپس 5/2 میلی­لیتر محلول 10 درصد اسید تری­کلرواستیک به مخلوط اضافه شد. محلول به­دست آمده به مدت 10 دقیقه با سرعت ×g1500 سانتریفوژ شد. در نهایت، 5/2 میلی­لیتر از محلول رویی با 5/2 میلی­لیتر آب مقطر و 5/0 میلی­لیتر محلول کلریدفریک (FeCl3) مخلوط و جذب نمونه­­ها توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (Hitachi F-2500) در طول موج 700 نانومتر قرائت گردید (11).

اندازه­گیری محتوی تام فلاونوئید: محتوی تام فلاونوئیدی با استفاده از معرف کلرید آلومینیم اندازه­گیری شد. به نیم میلی­لیتر از هر عصاره، 1/0 میلی­لیتر از محلول آلومینیم­کلراید 10 درصد در اتانول، 1/0 میلی­لیتر از استات­پتاسیم یک مولار و 8/2 میلی­لیتر آب مقطر اضافه شد. جذب مخلوط نیم ساعت بعد از نگهداری در دمای اتاق، در طول موج 415 نانومتر در مقابل نمونه شاهد  قرائت شد (کوئرستین به عنوان استاندارد برای رسم منحنی کالیبراسیون استفاده شد). سپس میزان فلاونوئید بر اساس میزان میلی­گرم کوئرستین در گرم عصاره ثبت گردید (28).

تعیین درجه گلایکه شدن پروتئین براساس میزان قهوه­ای شدن نمونه: طیف سنجی مرئی- فرابنفش روشی بسیار مناسب برای بررسی و مطالعه فرآیند قنددار شدن ماکرو­مولکول­ها به شمار می­آید. با مقایسه جذب نوری آلبومین گلایکه بدون حضور و در حضور عصاره­ها و متیل­گلی­اکسال، میزان مهارکنندگی مشخص شد. در این آزمون، آلبومین گاوی (5 میلی­گرم بر میلی­لیتر) با قند متیل­گلی­اکسال (10 میلی­مولار) و سدیم آزید (%02/0) در بافر فسفات 1/0 مولار) 4/7(pH= انکوبه شد. نمونه کنترل منفی (آلبومین)، کنترل مثبت (آلبومین و متیل گلی­اکسال)، نمونه­ها (آلبومین، متیل گلی اکسال و عصاره بومادران) به مدت سه روز در دمای 50 درجه سانتی­گراد انکوبه شدند. درجه قهوه­ای شدن نمونه ها شامل پروتئین قنددار شده، نمونه پروتئین قنددار شده در حضور عصاره و نمونه کنترل پروتئین، هر کدام جداگانه در طول موج 340 نانومتر بررسی شدند (7).

تعیین درجه گلایکه شدن پروتئین براساس روش قرمز کنگو: قرمز کونگو، معرف اختصاصی صفحه­های بتا است. میزان جذب نوری این ماده در 530 نانومتر در اثر اتصال به ساختار­های بتا افزایش می­یابد (21). برای انجام این آزمون 80 میکرولیتر نمونه با 20 میکرولیتر معرف قرمز کنگو مخلوط و پس از 5 دقیقه جذب آن در 530 نانومتر قرائت شد. برای آماده سازی معرف قرمز کنگو (100 میکرومولار) 003/0 گرم قرمز کنگو در 5 میلی لیتر اتانول حل و سپس با محلول PBS به حجم نهایی 50 میلی لیتر رسید و پس از فیلتر شدن در شیشه تاریک و در یخچال نگهداری شد.

تجزیه و تحلیل آماری دادهها: ارزیابی برای هرکدام از نمونه ها با سه تکرار انجام گردید و داده های به دست آمده با استفاده از نرم افزارver9.2  SAS, تجزیه و تحلیل شدند. میانگین ها با آزمون LSD در سطح احتمال پنج درصد مقایسه شدند. حروف غیر مشترک (d, c, b, a) بیانگر تفاوت معنی دار و حروف مشترک بیانگر عدم معنی داری بین نمونه ها است (05/0p≤). برای رسم شکل­ها از نرم افزار Excel و Graph pad استفاده گردید.

نتایج و بحث

ارزیابی ها مشخص نمود که مقدار فنول و فلاونوئید تام در طی مراحل رویشی به تدریج افزایش، در مرحله 50% گلدهی به بیشترین میزان و در مرحله 100% گلدهی با کاهش همراه بود. بیشترین میزان فنول و فلاونوئید تام در مرحله 50% گلدهی، بترتیب برابر با 01/90 میلی­گرم تانیک اسید بر گرم ماده خشک (شکل1)، و 10/12 میلی­گرم کوئرستین بر گرم ماده خشک (شکل2)، مشاهده شد.

 

a

 

شکل1- تأثیر مراحل مختلف فنولوژیک بر میزان فنول تام در A.pachycephala

مقایسه میانگین ها (میانگین سه تکرار ± انحراف معیار) براساس آزمون LSD است. حروف غیر مشترک (d, c, b, a) بیانگر تفاوت معنی دار بین نمونه ها است (05/0 p≤).

 

شکل2- تأثیر مراحل مختلف فنولوژیک بر میزان فلاونوئید تام در A. pachycephala

مقایسه میانگین ها (میانگین سه تکرار ± انحراف معیار) براساس آزمون LSD است. حروف غیر مشترک (d, c, b, a) بیانگر تفاوت معنی دار بین نمونه ها است (05/0 p≤).

 

عصاره­های گیاهی در دوره­های مختلف رشد، توانایی آنتی اکسیدانی متفاوتی را بروز دادند و شاخصIC50 تا مرحله 50% گلدهی کاهش و بعد از این مرحله میزان آن افزایش یافت (شکل 3). درحقیقت ارزیابی درجه آنتی اکسیدانی به این روش، در مرحله %50 گلدهی کمترین میزان خود (01/499 میکروگرم بر میلی­لیتر حجم عصاره) را نسبت به BHT نشان داد.

 

 

شکل3- تأثیر مراحل مختلف فنولوژیک بر میزان فعالیت آنتی اکسیدانی به روش (IC50) DPPH در

A. pachycephala.  BHTبه عنوان استاندارد استفاده شده است. مقایسه میانگین ها (میانگین سه تکرار ± انحراف معیار) براساس آزمون LSD است. حروف غیر مشترک (d, c, b, a) بیانگر تفاوت معنی دار بین نمونه ها است (05/0p≤).

 

 

نتایج حاکی از آن است که جذب نوری عصاره­های ژنوتیپ گلستان (گونه A. pachycephalla) در چهار غلظت متفاوت نیز تا مرحله 50% گلدهی افزایش و پس از این مرحله میزان آن کاهش یافت. کمترین میزان جذب نوری عصاره­­ها در هر چهار غلظت، در مرحله پنج برگی مشاهده شد (شکل 4). همه غلظت­های عصاره نسبت به ­اکسیدان سنتزی، خاصیت احیاکنندگی بیشتری از خود نشان دادند. غلظت­های 300 و 500 ppm نسبت به غلظت­های دیگر قوی­تر عمل کردند (شکل 4).

 

 

 
   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


شکل4- تأثیر مراحل مختلف فنولوژیک بر میزان فعالیت آنتی اکسیدانی به روشFTC  (قدرت احیاکنندگی آهن) در چهار غلظت متفاوت در
 A. pachycephala.  BHTبه عنوان استاندارد استفاده شده است. مقایسه میانگین ها (میانگین سه تکرار ± انحراف معیار) براساس آزمون LSD است. حروف غیر مشترک (d, c, b, a) بیانگر تفاوت معنی دار بین نمونه ها است (05/0p≤).

 

در طی بلوغ گیاهان، تغییرات فیتوشیمیایی بر فعالیت آنتی­اکسیدانی آن­ها مؤثر است وکیفیت غذایی انواع مختلف میوه و سبزیجات را در زمان­های خاص تحت تأثیر قرار می­دهد (20). اغلب، میزان فنول کل با رسیدگی کامل گیاه به طور پیوسته کاهش می­یابد که این حقیقت با نتایج حاصل از پژوهش حاضر مطابقت دارد. میزان فنول تام بعد از مرحله 50% گلدهی روند نزولی نشان داد. احتمالاً در مرحله رویشی این گونه گیاهی، ترکیب­های فنولی و یا سایر ترکیب­های آنتی­اکسیدانی ناچیز می­باشند و به تدریج تا رسیدن به مرحله گلدهی مقدار این ترکیبات به حداکثر خود می­رسند و سپس در طی رسیدگی بذر دوباره کاهش می­یابند (23). علت افزایش تجمع ترکیبات فنولیک و فلاونوئید در مرحله 50% گلدهی را می­توان مرتبط با سلول­ها و بافت­هایی مثل مزوفیل، اپیدرم و ضخامت کوتیکول، کلروپلاست، کرک و یا تغییرات مهم فیزیولوژیکی و ساختاری طی مراحل نموی دانست (36). همچنین این افزایش را می­توان به همزمانی این مرحله با دمای معتدل هوا در اواسط بهار مرتبط دانست و با نزدیک شدن به تابستان و افزایش دمای هوا و رسیدن گیاه به بلوغ کامل میزان این ترکیبات مجدداً کاهش می­یابند. این کاهش می­تواند ناشی از تجزیه متابولیت­های ثانویه به حد واسط­های متابولیت ساده اولیه باشد (23). از دیگر دلایل، جلب حشرات گرده افشان و پیشگیری از تأثیرعوامل بیماریزا بر گیاه است. بسیاری از گیاهان متابولیت هایی نظیر ترپن ها، پپتیدها، فنول ها و هورمون ها را به عنوان یک استراتژی دفاعی علیه محرک های ایجاد شده توسط حیوانات یا حشرات سنتز می کنند (14). میزان ترکیبات فنولی در اندام هوایی در مرحله گلدهی و افزایش فعالیت آنتی­اکسیدانی در این مرحله با مطالعات یسر و همکاران (36)، و ماریا جردن و همکاران (18)، در رزماری مطابقت داشت. در چندین گونه گیاهی نظیرOliveria decumbens(10)، Origanum vulgare (24)،  Mentha pulegium (29)، Sida cordifolia (34)،Boerhavia diffusa و Hypericum pruinatum (3)،Artemisia chamaemelifolia(12)، و Origanum majorana(30) نیز تأثیر مراحل فنولوژیک بر ترکیب شیمیایی و فعالیت آنتی­اکسیدانی بررسی و مشاهده شده است که در مرحله گلدهی کامل میزان پلی فنول­ها در این گیاهان افزایش می­یابد.

غلظت نسبی ترکیبات شیمیایی عصاره پلی فنولیک گیاه نقش مهمی در تعیین قدرت آنتی­اکسیدانی دارد که با نتایج این تحقیق همسو بود. چون در اندام هوایی بومادران وجود ترکیب­های فنولی و ارتباط این مواد با خاصیت آنتی­اکسیدانی به اثبات رسیده است، این امکان وجود دارد که مقدار این ترکیبات یا اشکال فعال آنها از نظر فعالیت آنتی­اکسیدانی در اندام­های مختلف گیاهی در مراحل مختلف نموی افزایش یا کاهش یابند (23). ترکیبات فنولیک دارای گروه عاملی هیدروکسیل متصل به یک هیدروکربن آروماتیک هستند، بنابراین این ویژگی ساختاری فعالیت آنتی اکسیدانی قوی آن ها را تأیید می کند (27). در غلظت های بالای ترکیبات فنولیک، امکان انتقال هیدروژن به رادیکال های آزاد افزایش می یابد و در نتیجه توانایی مهار کنندگی عصاره افزایش می یابد (10). افزایش فعالیت آنتی­اکسیدانی در مرحله گلدهی با مطالعات مقدم و همکاراندر گیاه ریحان (Ocimum ciliatum) (23) و گیاه شاهتره (Fumaria vaillantii) (22) و نیز پژوهش­های چن و همکاران (8)در گیاه نعناع چمنی(prunella vulgaris) ،مطابقت داشت. مطالعات انجام شده توسط ماریا جردنو همکاران (18)نشان داد که مرحله رشد بر ترکیب شیمیایی، خواص آنتی­اکسیدانی اسانس رزماری ﻣﺆثر است. بن فرهات و همکاران (5) فعالیت­ آنتی اکسیدانی گونه ای از مریم گلی (Salvia aegyptiaca) را در سه مرحله نموی بررسی نمودند و گزارش کردند که خاصیت آنتی­اکسیدانی در این گیاه در مرحله گلدهی بیشتر از  فازرویشی بود و پس از مرحله گلدهی میزان ترکیبات فنولیک کاهش یافت. بنابراین افزایش خاصیت آنتی­اکسیدانی در مرحله %50 گلدهی می­تواند به بالا بودن محتوای فنول و فلاونوئید در این مرحله مرتبط ­باشد و در مرحله 100% گلدهی احتمالاً این ترکیبات ثانویه تجزیه شده و در نتیجه خاصیت آنتی­اکسیدانی کاهش می­یابد. نتایج تجزیه و تحلیل­ همبستگی (جدول1) نشان داد که همبستگی مثبت و معنی داری بین محتوای فنول و فلاونوئید تام و همچنین سنجش فعالیت آنتی­اکسیدانی به روش FTC (در غلظت­های مختلف) وجود دارد. سنجش فعالیت آنتی­اکسیدانی براساس شاخص IC50 در سطح احتمال 5 درصد با محتوای فنول، فلاونوئید کل و میزان احیاکنندگی آهن همبستگی منفی و معنی­داری داشت. بنابراین کاهش شاخص IC50 به معنای افزایش خاصیت آنتی­اکسیدانی است. دهقان و همکاران (9) همبستگی مثبتی را بین ترکیبات فنولیک و فعالیت آنتی­اکسیدانی در مدل سیستم­های مختلف نظیر آزمون قدرت احیاء­کنندگی آهن مشاهده کردند که با نتایج این مطالعه هم­خوانی داشت. توحیدی و همکاران (33) همبستگی منفی را بین ترکیبات فنولیک و فعالیت آنتی­اکسیدانی در مدل سیستم DPPH براساس شاخص IC50 مشاهده نمودند که با نتایج این پژوهش مطابقت نشان داد.

 

 

جدول1- همبستگی بین پارامترهای مختلف اندازه گیری شده در مراحل مختلف نموی ژنوتیپ A. pachycephala

 

 (1)

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

(7)

7- FTC (غلظت500)

     *8819/0

    *9482/0

*9064/0-

     *9699/0

*9565/0

*8826/0

1  

6-FTC (غلظت300)

   *9439/0

    *9824/0

*9411/0-

   *9371/0

*9671/0

1

 

5-FTC (غلظت100)

   *9761/0

    *9787/0

*9838/0-

   **9950/0

 

 

4-FTC (غلظت50)

   *9699/0

    *9608/0

*9819/0-

1

 

 

 

3- IC50

   **9982/0-

    *9312/0-

1

 

 

 

 

2-محتوای فلاونوئید

   *9229/0

1

 

 

 

 

 

1-محتوای فنول

1

 

 

 

 

 

 

٭ و٭٭ به ترتیب معنی دار در سطح احتمال 5 و1 درصد.

  


تأثیر عصاره گیاه بر میزان گلایکه شدن آلبومین: طی واکنش میلارد نمونه­های حاصل از گلایکه شدن تغییر رنگ داده و با گذشت زمان به ترکیباتی با رنگ قهوه­ای تبدیل می­شوند. از این خاصیت می­توان برای تعیین میزان گلایکه شدن پروتئین­ها و همچنین تأثیر عصاره بومادران بر آلبومین گلایکه شده استفاده کرد (19). در این پژ‌وهش، نمونه های پروتئین­ آلبومین با متیل گلی اکسال (به عنوان عامل گلایکه­ کننده) در حضور و عدم حضور عصاره بومادران به مدت سه روز متوالی در دمای 50 درجه سانتی­گراد انکوبه شدند. پس از پایان دوره انکوباسیون، جذب نمونه­ها در طول موج 340 نانومتر قرائت شد. گلایکیشن، رنگ محلول آلبومین را بعد از سه روز به میزانی تغییر داد که با افزایش جذب در مقایسه با نمونه کنترل مشخص شد. نتایج حاصل از تست Brownish (قهوه­ای شدن) نشان داد که در طی زمان انکوباسیون، جذب محلول‌های پروتئین‌ آلبومین (شکل5، الف) در حضور عامل گلایکه‌کننده متیل­گلی­اکسال در قیاس با نمونه‌های شاهد به طور معنی‌داری افزایش یافت و به سمت قهوه‌ای شدن پیش رفت که تغییر رنگ ایجاد شده نمایانگر روند گلایکه شدن و تولید محصولات پیشرفته گلایکه بود. کاهش مقدار جذب در حضور عصاره بومادران در مقایسه با نمونه شاهد (آلبومین)، دلیل بر مهار فرآیند گلایکیشن است. کاهش قابل توجه گلایکیشن آلبومین، حاکی از عملکرد عصاره در کاهش واکنش میلارد و مراحل اولیه گلایکیشن پروتئین است. این بدان معنا است که عصاره بومادران از تغییر ساختار­های دوم آلبومین تحت فشار گلایکه شدن ممانعت کرده و این توانایی در A. pachycephala در مرحله %50 گلدهی به حداکثر میزان خود ­رسید.

قرمز کنگو (CR) معرف اختصاصی شناسایی فیبر­های آمیلوئیدی و تشکیل توده­های لخته مانند است (6). افزایش جذب نوری این ماده در 530 نانومتر می­تواند ناشی از اتصال آن به ساختار­های بتا در پروتئین باشد. محققین نشان داده­اند که معرف قرمز کونگو به ساختار­های آمیلوئیدی موجود در قسمت­های بافتی اتصال پیدا می­کند. این معرف رنگی، آزوسولفات­دار متقارن با مرکز هیدروفوبیک (شامل یک گروه بی­فنیل) است که بین گروه­های سولفات باردار قرار دارد. CR همچنین برای توصیف فیبر­های آمیلوئیدی در لوله آزمایش به کار می­رود (25). هرچند مکانیسم واکنش بین CR و فیبر­های آمیلوئیدی هنوز به خوبی توصیف نشده است، ولی پیشنهاد شده که برخورد فضائی بین مولکول رنگ و صفحات بتای فیبر­های آمیلوئیدی، باعث ایجاد اتصالات هیدروژنی، اندرکنش­های هیدروفوبیکی و الکترواستاتیکی بین رنگ و فیبر­های آمیلوئیدی می­شود. از آنجایی که ساختارهای بتا تشکیل شده در پروتئین های گلایکه شده، تمایل زیادی به معرف قرمز کنگو نشان می دهند (6)، در نتیجه این معرف برای تشخیص ساختارهای  Cross-در پروتئین قند­دار­شده مورد استفاده قرار گرفت. نتایج حاصل نشان داد که در غیاب عصاره، یعنی نمونه آلبومین گلایکه شده با متیل­گلی­اکسال در قیاس با نمونه شاهد پروتئین، تشکیل ساختار­های بتا در پروتئین قنددار شده به طور معنی داری تشدید شد و به صورت افزایش جذب قابل مشاهده بود (شکل5، ب). همچنین کاهش معنی‌دار جذب در حضور عصاره می‌تواند دلیلی بر تأثیر مهارکنندگی عصاره در ممانعت از قنددار شدن آلبومین و تشکیل ساختارهای بتا (تشکیل فیبر­های آمیلوئیدی) در آن ­باشد. از طرفی، مشاهدات مبتنی بر اثر مهارکنندگی عصاره در تشکیل ساختارهای بتا آمیلوئیدی را که با کاهش جذب قرمز کنگو مشخص شد، با درجه آنتی­اکسیدانی عصاره همسو بود. این همسوئی با مشاهدات آزمایش های قرمز کنگو و ارزیابی تغییرات خواص آنتی­اکسیدانی در طی مراحل مختلف  فنولوژیک ژنوتیپ
A.pachycephalaدر مرحله %50 گلدهی به بیشترین میزان خود ­­رسید و خاصیت آنتی گلایکیشن نیز تا مرحله %50 گلدهی به طور قابل ملاحظه­ای افزایش و پس از این مرحله نموی مجدداً کاهش یافت (شکل5، ب). 

از آنجا که واکنش های غیرآنزیمی گلیکوزیلاسیون پروتئین‌ها در دیابت، عوارض مزمن ناشی از حضور ترکیبات اکسیدکننده (رادیکال‌های آزاد)را تشدید می­کنند، بنابراین شناسایی گیاهان دارویی با خواص آنتی‌اکسیدانی بالا در کاهش عوارض مذکور، بسیار مفید خواهد بود. از مجموع نتایج به دست آمده می­توان استنباط کرد که عصاره هیدروالکلی بومادران اثر مهاری قابل ملاحظه­ای بر گلایکیشن پروتئین آلبومین داشته که از نقطه نظر مکانیسمی با فعالیت آنتی­اکسیدانی عصاره­ها همسو بود. درحقیقت­، عصاره­ با به دام انداختن رادیکال­های آزاد ایجاد شده در واکنش­های گلی­اکسیداسیون، اثر آنتی­گلایکیشن خود را اعمال می­کند و بدین ترتیب یکی از مهم­ترین عوارض دیابت، یعنی گلایکیشن پروتئین­ها را می تواند مهار کند. در پژوهش­های مختلف قدرت آنتی اکسیدانی عصاره گیاهان با خواص آنتی گلایکیشن آن ها بررسی و رابطه تنگاتنگی بین این دو خاصیت پیشنهاد شده است. یزدان پرست و همکاران (35) دریافتند که رابطه مستقیمی بین میزان فلاونوئید و خاصیت آنتی­اکسیدانی گیاه بومادران (A. santolina) و درجه آنتی ­گلایکیشن گیاه وجود دارد. تفسیر ارائه شده در تحقیق حاضر، همچنین با یافته های آنتی­اکسیدانی و آنتی­گلایکیشن 23 گونه رازیانه و ارائه رابطه مستقیم بین میزان خاصیت آنتی­اکسیدانی و آنتی گلایکیشن گیاه مطابقت دارد (28). مطالعات بر روی گونه های گیاه رازیانه نشان داده است که ترکیبات پلی فنولی با به دام اندازی رادیکال­های آزاد، باعث فعالیت ضد­گلایکیشنی این گیاه هستند(28). در مریم گلی(Salvia sahendica) (31)، توت وحشی (wildberry) (15) و Houttuynia cordata (37) نیز چنین رابطه مستقیمی بین خاصیت آنتی­اکسیدانی و خاصیت آنتی­گلایکیشن مشاهده شده است.


 

 

شکل 5- الف) طیف سنجی مرئی- فرابنفش در طول موج 340 نانومتر و ب) طیف سنجی 530 نانومتر در حضور معرف کنگوقرمز نمونه­های آلبومین کنترل، آلبومین گلایکه شده با متیل­ گلی­اکسال و آلبومین گلایکه شده در حضورA.pachycephala  در مراحل مختلف فنولوژیک


نتیجه گیری

بالا بودن قند خون به عنوان اصلی­ترین عامل در شروع و پیش­روی عوارض دیابت معرفی شده است. غلظت بالا و پیوسته قند خون منجر به گلایکه شدن  غیر آنزیمی و غیر قابل کنترل تمامی ماکرومولکول های حیاتی شامل پروتئین­ها، چربی ها و اسید های نوکلئیک می­شود. پروتئین­های گلایکه شده نقشی اساسی درتشدید عوارض دیابت ایفا می­کنند. در این راستا یافتن مهار­کننده­هایی با منشأ طبیعی برای ممانعت از فرآیند گلایکیشن ماکرومولکول ها با هدف کاهش این عوارض، ضروری بنظر می­رسد. در پژوهش حاضر، با استفاده از روش­های ارزیابی درجه گلایکیشن در شرایط آزمایشگاهی، مشاهده گردید که عصاره هیدروالکلی بومادران بعنوان منبع غنی از آنتی اکسیدان، تأثیر  قابل ملاحظه­ای بر مهار­ فرآیند گلایکیشن آلبومین دارد. از طرفی فعالیت آنتی اکسیدانی و آنتی گلایکیشن عصاره همسو با یکدیگر عمل نموده و در نتیجه خاصیت آنتی­گلایکیشن نمونه­های حاوی عصاره با فعالیت آنتی­اکسیدانی آن­ها در ارتباط هستند. مقایسه ویژگی آنتی­گلایکیشنی مراحل مختلف نمونه­برداری نشان داد همانگونه که خاصیت آنتی­اکسیدانی در طی مراحل فنولوژیکی متغیر است و در مرحله %50 گلدهی به بیشترین میزان خود می­رسد، خاصیت آنتی­گلایکیشن نیز تا %50 گلدهی بطور قابل ملاحظه­ای افزایش و پس از این مرحله نموی مجدداً کاهش می­یابد. با توجه به این که گیاه بومادران درطب سنتی وگیاهان داروئی بسیار مورد توجه است، زمان برداشت مناسب برای بهره وری بیشتر به ­عنوان روش مکمل در پیشگیری از بیماری­های ناشی از استرس اکسیداتیو و به ویژه جلوگیری از عوارض وخیم دیابت از اهمیت بالایی برخوردار است.

سپاسگزاری

بدین وسیله از دانشگاه صنعتی اصفهان برای فراهم آوردن هزینه­های پژوهش قدردانی می­ گردد.

1- ضابط، م، افشاری، ف. 1394. تجزیه و تحلیل کاریوتیپی ژنوتیپهای بومادران با استفاده از روشهای آماری چند متغیره. مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران). 28(3): 383-371.

2- منتشلو، ج، دلجو، ع، پیری، خ. 1396. بررسی میزان فنول و فلاونوئید ها و فعالیت آنتی اکسیدانی عصاره های اتانولی، متانولی، کلروفرمی و اتیل استاتی پوست تنه و شاخه درخت بید (Salix alba. L.). مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران). 30(3): 391-381.

 

3. Ayan, A. K., Yanar, P., Cirak, C., & Bilgener, M. 2007. Morphogenetic and diurnal variation of total phenols in some Hypericum species from Turkey during their phenological cycles, Bangladesh Journal of Botany. 36, 39-46.

4. Bains, Y., & Gugliucci, A. 2016. Ilex paraguariensis and its main component chlorogenic acid inhibit fructose formation of advanced glycation endproducts with amino acids at conditions compatible with those in the digestive system, Fitoterapia. 117, 6–10.

5. Ben Farhat, M., Jordan, M. J., Chaouch-Hamada, R., Landoulsi, A., & Sotomayor, J. A. 2015. Changes in phenolic profiling and antioxidant capacity of Salvia aegyptiaca L. by-products during three phenological stages, Journal of Food Science and Technology. 63, 791-797.

6. Bouma, B., Kroon-Batenburg, L., Wu, Y., Brunjes, B., Posthuma, G., & Kranenburg, O. 2003. Glycation induces formation of amyloid cross-b structure in albumin, Journal of Biological Chemistry. 278, 41619–41810.

7. Btissam, R., Rajae, R., Amina, A., Brigitte, V., & Mohamed, N. H. I. R. I. 2015. In vitro study of anti-glycation and radical scavenging activities of the essential oils of three plants from Morocco: Origanum compactum, Rosmarinus officinalis and Pelargonium asperum. Pharmacognosy Journal. 7, 124-135.

8. Chen, Y., Zhu, Z., Guo, Q., Zhang, L., & Zhang, X. 2012. Variation in concentrations of major bioactive compounds in Prunella vulgaris L. related to plant parts and phenological stages. Biological Research. 45, 171-175.

9. Dehghan, G., Torbati, S., Mohammadian, R., Movafeghi, A., & Talebpour, A. H. 2018. Essential Oil Composition, Total Phenol and Flavonoid Contents and Antioxidant Activity of Salvia sahendica at Different Developmental Stages. Journal of Essential Oil Bearing Plants. 21(4), 1030-1040.

10. Esmaeili, H., Karami, A., & Maggi, F. 2018. Essential oil composition, total phenolic and flavonoids contents, and antioxidant activity of Oliveria decumbens Vent. (Apiaceae) at different phenological stages. Journal of cleaner production. 198, 91-95.

11. Gharibi, S., Tabatabaei, B.E.S., Saeidi, G., Goli, S.A.H. & Talebi, M. 2013. Total phenolic content and antioxidant activity of three Iranian endemic Achillea species. Industrial Crops and Products. 50, 154-158.

12. Ghasemi Pirbalouti, A., Firoznezhad, M., Craker, L., & Akbarzadeh, M. 2013. Essential oil compositions, antibacterial and antioxidant activities of various populations of Artemisia chamaemelifolia at two phenological stages. Revista Brasileira de Farmacognosia. 23, 861-869.

13. Gonçalves, S., Gomes, D., Costa, P., & Romano, A. 2013. The phenolic content and antioxidant activity of infusions from Mediterranean medicinal plants. Industrial Crops and Products. 43, 465-471.

14. Guajardo, J., Gastaldi, B., González, S., & Nagahama, N. 2018. Variability of phenolic compounds at different phenological stages in two populations of Valeriana carnosa Sm. (Valerianoideae, Caprifoliaceae) in Patagonia. Boletin Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromaticas. 17(4), 381-393.

15. Harris, C. S., Cuerrier, A., Lamont, E., Haddad, P. S., Arnasun, T. J., Bennet, S. A. L., & Jones, T. 2014. Investigating wild berries as a dietary approach to reducing the formation of advanced glycation endproducts: Chemical correlates of in vitro antiglycation activity. Plant Foods for Human Nutrition. 69, 71–77.

 16. Jafaria, A.A., Miroliaei, M., Angelovac, V.T., Emamzadeha, R., Djukicd, M.M., Djuricd A., & Saso, L. 2016. Antioxidant activity and protective role on protein glycation of synthetic aminocoumarins, Electronic Journal of Biotechnology.24, 43-48.

 17. Jamali, C.A., Kasrati, A., Bekkouche, K., Hassani, L., Wohlmuth, H., Leach, D. & Abbad, A. 2013. Phenological changes to the chemical composition and biological activity of the essential oil from Moroccan endemic thyme (Thymus maroccanus Ball). Industrial Crops and Products. 49, 366-372.

18. Jordan, M. J., Lax, V., Rota, M. C., Loran, S., & Sotomayor, J. A. 2013. Effect of the phenological stage on the chemical composition, andantimicrobial and antioxidant properties of Rosmarinus officinalis L. essential oil and its polyphenolic extract.Industrial Crops and Products. 48, 144-152.

19. Khazaei, M. R, Bakhti, M., & Habibi-Rezaei, M. 2010. Nicotine reduces the cytotoxic effect of glycated proteins on microglial cells. Neurochemical Research. 35, 548-58.

20. Mazandarani, M., Makri, S., & Bajian, G. 2011. Evaluation of phytochemical and antioxidant activity in different parts of Heracleumgor ganicumrech F. in golestanprovince, north of Iran. Iranian Journal of Plant Physiology. 2, 381-388.

21. Miroliaei, M., Khazaei, S., Moshkelgosha, S., & Shirvani, M. 2011. Inhibitory effects of Lemon balm (Melissa officinalis, L.) extract on the formation of advanced glycation end products. Food Chemistry. 129, 267-271.

22. Moghaddam, M., Khaleghi Miran, S. N., & Mehdizadeh, L. 2018. Total Phenolic Content and Antioxidant Activity of Fumaria vaillantii extract at three phenological stages assayed by various methods. International Journal of Horticultural Science and Technology. 5(1), 105-114.

 23. Moghaddam, M., Pirbalouti, A. G., Mehdizadeh, L., & Pirmoradi, M. R. 2015. Changes in composition and essential oil yield of Ocimum ciliatum at different phenological stages. European Food Research and Technology.240, 199-204.

24. Morshedloo, M. R., Mumivand, H., Craker, L. E., & Maggi, F. 2018. Chemical composition and antioxidant activity of essential oils in Origanum vulgare subsp. gracile at different phenological stages and plant parts. Journal of Food Processing and Preservation. 42(2), e13516.

25. Pennathur, S., & Heinecke, J. W. 2007. Mechanisms for oxidative stress in diabetic cardiovascular disease. Antioxidants & Redox Signaling. 9, 955-969.

26. Pirbalouti, A. G., Hamedi, B., Malekpoor, F., Rahimi E., & Nasrinejhad, R. 2011. Inhibitory activity of Iranian endemic medicinal plants against Vibrio para-haemolyticus and Vibrio harveyi, Journal of Medicinal Plants Research. 5, 7049–7053.

 27. Pretti, I. R., da Luz, A. C., Jamal, C. M., & Batitucci, M. D. C. P. 2018. Variation of biochemical and antioxidant activity with respect to the phenological stage of Tithonia diversifolia Hemsl. (Asteraceae) populations. Industrial Crops and Products. 121, 241-249.

28. Salami, M., Rahimmalek, M., & Ehtemam, M. H. 2016. Inhibitory effect of different fennel (Foeniculum vulgare) samples and their phenolic compounds on formation of advanced glycation products and comparison of antimicrobial and antioxidant activities. Food Chemistry. 213, 196-205.

29. Salem, N., Sriti, J., Bachrouch, O., Msaada, K., Khammassi, S., Hammami, M., Selmi, S., Boushih, E., Ouertani, M., Hachani, N., & Abderraba, M. 2018. Phenological stage effect on phenolic composition and repellent potential of Mentha pulegium against Tribolium castaneum and Lasioderma serricorne. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine. 8(4), 207-216.

30. Sellami, I. H., Maamouri, E., Chahed, T., Aidi Wannes, W., Kchouk, M. E., & Marzouk, I. 2009. Effect of the growth stage on the content and composition of the essential oil and phenolic fraction of sweet marjoram (Origanum majorana L.). Industrial Crops and Products. 30, 395-402.

31. Shaerzadeh, F., Ahmadiani, A., Esmaeili, M. A., Ansari, N., Asadi, S., Tusi, S. K., Sonboli, A., Ghahremanzamaneh, M., & Khodagholi, F. 2011. Antioxidant and antiglycating activities of Salvia sahendica and its protective effect against oxidative stress in neuron-like PC12 cells. Journal of Natural Medicines. 65, 455-465.

32. Subhashini, N., Thangathirupathi, A., & Lavanya, N. 2011. Antioxidant activityof trigonella foenum graecum using various in vitro and ex vivo models. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 3, 96-102.

33. Tohidi, B., Rahimmalek M., & Arzani, A. 2017. Essential oil composition, total phenolic, flavonoid contents, and antioxidant activity of Thymus species collected from different regions of Iran, Food Chemistry, 220, 153-161.

34. Verma, V., & Kasera, P. K. 2007. Variations in secondary metabolites in some arid zone medicinal plants in relation to season and plant growth. Indian Journal of Plant Physiology. 12, 203-206.

35. Yazdanparast, R., Ardestani, A., & Jamshidi, S. 2007, Experimental diabetes treated with Achillea santolina next term: Effect on pancreatic oxidative parameters. J. Ethnopharmacology. 30, 13-18.

36. Yosr, Z., Hnia, C., Rim, T., & Mohamed, B. 2013. Changes in essential oil composition and phenolic fraction in Rosmarinus officinalis L. var. typicus Batt. organs during growth and incidence on the antioxidant activity, Industrial Crops and Products. 43, 412-419.

37. Yoon, S. R., & Shim, S. M. 2015. Inhibitory effect of polyphenols in Houttuynia cordata on advanced glycation end-products (AGEs) by trapping methylglyoxal. LWT- Food Science and Technology.61, 58-163.